갈색지방조직에서의 자가포식작용의 기능 연구

김동환 울산대학교 대학원 2019 국내석사

급격한 식생활양식의 변화로 인한 비만인구의 급증에 따라 2016년 기준 국내 비만인구는 34.5 %에 육박하게 되었다. 비만은 인체에서 흡수된 에너지와 소비된 에너지의 불균형이 계속적으로 지속되는 상황에서 인체 잉여에너지가 지방조직에 과다하게 축적되어 생기는 의학적 현상으로 알려져 있다. 이러한 비만의 예방 및 치료를 위하여 에너지 섭취와 에너지 소비의 조절 기전 이해에 연구의 관심이 집중되고 있다. 본 연구에서는 세포의 항상성 유지에 중요한 역할을 하는 자가포식작용 (autophagy)의 갈색지방에서의 에너지 대사 조절에 초점을 맞춘 연구를 진행하였다. 아직 분화된 갈색지방 (brown adipose tissue)에서의 자가포식작용을 억제하였을 때 어떠한 변화가 일어나는지 알려지지 않았기에 갈색지방 특이적 자가포식작용 억제를 통한 에너지 소비의 변화를 알아보기 위해 autophagosome 형성에 필수적인 유전자로 알려진 ATG knockout(KO) 생쥐를 모델로 연구를 진행하였다. 흥미롭게도 갈색지방에서 특이적으로 자가포식작용을 억제하였을 때 생쥐의 몸무게 감소를 보였으나 사료섭취량은 대조군과 변화가 없었다. 메타볼릭 케이지 실험을 통한 대사작용을 측정한 결과 자가포식작용이 억제된 생쥐에서 산소 소비량, 이산화탄소 배출량, 에너지 소비량이 증가하는 것을 확인하였다. 갈색지방에서 자가포식작용을 억제시켰을 때 에너지 소비량이 증가한다고 확인하여 조직을 통한 분석을 진행하였고 자가포식작용이 억제된 생쥐의 갈색지방에서 미토콘드리아 관련 mRNA와 단백질들이 증가하는 것을 확인하였다. 연구결과로 유추해 보았을 때 갈색지방에서 자가포식작용은 기능을 다한 미토콘드리아 뿐만 아니라 온전한 미토콘드리아까지도 제거하는 것으로 보여지며 따라서 자가포식작용의 억제에 의해 미토콘드리아의 제거가 줄어들어 미토콘드리아 막 단백질인 uncoupling protein 1 (UCP1)의 열발생에 의한 에너지 소비가 증가되었을 것으로 사료된다. 계속되는 연구를 통하여 갈색지방에서의 자가포식작용 억제에 의한 에너지 대사 변화의 정확한 메커니즘을 파악하는 것이 중요할 것으로 보인다.

양전자방출단층촬영 영상을 이용한 아밀로이드 단일광자방출단층촬영 모사영상 개발과 임상성능예측 : PET Image-based Simulation of Amyloid SPECT (SA-SPECT) and Prediction of Clinical Performance

문효정 울산대학교 일반대학원 2017 국내석사

Purpose: Amyloid-β (Aβ) positron emission tomography (PET) imaging is an important clinical tool for the diagnosis of Alzheimer’s disease (AD). We performed spatial resolution- and noise level matching-based creation of simulated amyloid single photon emission computed tomography (SPECT) images using phantom and clinical PET images, to explore the clinical feasibility of Tc-99m-based amyloid SPECT imaging. Methods: To match the resolution and noise level of PET onto those of SPECT, we acquired PET and SPECT images of Hoffman 3D Brain Phantom using radioisotopes of Fluorine-18 (18F) and Technetium-99m. For the spatial resolution matching of PET and SPECT, we used CT-based tissue label map method. For noise level matching of PET and SPECT, we added various amplitudes of Gaussian noises before PET smoothing to create more realistic SPECT. Using these matching parameters, we created simulated amyloid-SPECT (SA-SPECT) images from 18F-florbetaben PET of twenty patients with subjective memory impairment (SMI), 20 patients with mild cognitive impairment (MCI), and 20 patients with AD. Taken together, we had three versions of Aβ images; PET without post Gaussian smoothing (PET-0 mm), PET with clinically-used post Gaussian smoothing (PET-4 mm), and SA- SPECT. Three Nuclear Medicine board-certified physicians assigned BAPL scores for Aβ positivity, resulting in intraobserver agreement of three modalities and resulting in interobserver agreement of each modality. For the quantitative analysis, we defined Freesurfer-based global gray matter SUVR using corresponding T1 MR where cerebellar cortex was selected as the reference region. We compared global SUVRs among three modalities in each diagnosis, and in both Aβ positive and negative groups. Receiver operating characteristic (ROC) curve analysis was performed to determine the optimal cutoff value of SUVR of Aβ positivity in each modality. Results: Using the results of Hoffman phantom experiments, we found the optimal smoothing factor of 7.5 mm FWHM and the optimal additive noise level of 70% mean amplitude of gray matter count. In qualitative analysis, intraobserver agreement and interobserver agreement were almost perfect (κ≥0.9, P<0.001 for all), and percentage of Aβ positivity of PET-0mm, PET-4mm, and SA-SPECT were exactly same (10% in SMI, 45% in MCI, and 80% in AD). In quantitative analysis, there were no significant differences of global SUVR between modalities in SMI and MCI groups (but AD group, P < 0.05). There were no significant SUVR differences between modalities in both Aβ positive and negative groups. Based on ROC curve analysis, we found that SUVR of 1.45, 1.44, and 1.25 was the optimal cutoff for Aβ positive image prediction in PET-0mm, PET-4mm, and SA-SPECT, respectively. Conclusion: We created SA-SPECT images, which may be non-inferior to Aβ PET in terms of both visual and quantitative analysis. We suggest that 99mTc-based amyloid SPECT may be non-inferior to amyloid PET in the assessment of amyloid positivity in patients with abnormal cognition if the pharmacodynamic and kinetic characteristics of SPECT tracer are optimal 목적: 아밀로이드 양전자방출단층촬영(PET) 영상은 알츠하이머병 진단에 중요한 역할을 하는 진단법으로서 현재 임상에 이용되고 있다. PET에 비해 단일광자방출단층촬영(SPECT) 는 공간해상도와 감도가 떨어지는 단점이 있으나, 검사비용이 저렴하고 임상적 접근성이 좋아 조기진단 및 검진용으로 유리할 것으로 기대되어 아밀로이드 SPECT영상용 방사성의약품이 일부 개발 중에 있다. 본 연구에서는 팬텀 영상을 이용하여 PET과 SPECT의 공간해상도와 영상잡음을 보정한 아밀로이드 SPECT 모사영상을 개발하여, PET영상용 방사성의약품과 약리, 약동학적 특성이 유사한 아밀로이드 SPECT 영상용 방사성의약품이 개발되었을 때, 아밀로이드 SPECT영상의 임상적 진단능을 예측해보고자 하였다. 방법: PET 영상과 SPECT 영상의 공간해상도와 영상잡음의 차이를 보정하기 위해, 플루오린-18 (18F)과 테크네슘-99m (Tc-99m)을 호프만 팬텀 (Hoffman 3D Brain Phantom)에 각각 채우고 PET과 SPECT 영상을 촬영하였다. 공간해상도의 차이를 보정하기 위해 CT 기반의 조직라벨맵(CT-based Tissue Label Map) 방법을 이용하였고 영상잡음의 차이를 보정하기 위해 다양한 진폭의 가우스 잡음을 임상적으로 얻은 아밀로이드 PET 영상에 적용함으로써 아밀로이드 SPECT 모사영상을 구현하였다. 임상진료를 위해 18F-Florbetaben 아밀로이드PET 검사를 시행한 주관적기억장애, 경도인지장애, 그리고 알츠하이머병 환자 각각 20명에서 후평활화 (post-smoothing)를 시행하지 않고 재구성한 PET 영상과 4mm 반치폭의 가우스 필터로 후평활화한 PET 영상 및 아밀로이드 SPECT 모사영상 등 세가지 영상을 다음과 같이 비교하였다. 정성적으로 3명의 핵의학 의사들이 모든 영상을 육안으로 BAPL(Brain amyloid plaque load) 점수화하고 아밀로이드 양성여부를 판정하였고, 관찰자간과 관찰자내 일치도도 평가하였다. 정량분석을 위해 각 환자의 자기공명영상(MRI)에서 Freesurfer 소프트웨어 기반의 전체적인 관심영역 (global volume-of-interests)를 정의하고 소뇌피질이 참조영역인 표준섭취값비 (Standard uptake value ratio, SUVR) 값을 측정하여 각 질환군에서 세 영상간 차이, 육안으로 구분한 베타 아밀로이드 양성•음성 군에서 세 영상간 차이, 그리고 수신자조작 특성곡선 (ROC) 분석을 시행하였다. 결과: PET과 SPECT 호프만 팬텀 영상의 공간해상도 및 영상잡음차이를 확인하고 이를 보정하기 위해서 아밀로이드 PET영상에 회백질 평균 계수의 70% 진폭의 가우스 잡음을 더하고 7.5mm 반치폭으로 평활화함으로써 아밀로이드 SPECT 모사영상을 만들었다. 육안분석에서 아밀로이드 PET과 SPECT 모사영상 모두 육안적으로 아밀로이드 양성율(주관적기억장애, 10%; 경도인지장애, 45%; 알츠하이머병, 80%)이 일치하였고, 각 영상의 BAPL score도 관찰자간과 관찰자내 일치도가 매우 높았다(κ≥0.9, P<0.001 for all). 정량분석의 결과, 주관적기억장애와 경도인지장애 군의 SUVRs은 유의한 차이가 없었지만 알츠하이머병 군은 두 질환군보다 유의하게 높은 SUVRs을 보였다. 육안으로 구분한 아밀로이드 양성 및 음성 군에서 SUVRs는 세 영상간 유의한 차이가 없었고, ROC 분석에서 세 영상 모두 SUVRs로 아밀로이드 양성여부를 판정하는데 훌륭한 진단성능을 보였다 (AUC > 0.9). 결론: 본 연구에서는 아밀로이드SPECT 모사영상을 개발하여 임상적 성능을 평가하였고, PET용 방사성의약품과 비슷한 약리/약동학적 성능을 갖는 Tc-99m 기반 아밀로이드 SPECT영상은 PET에 비해 아밀로이드 섭취여부를 판정하는데 열등하지 않으리라 기대된다.

랫드 심근 허혈/재관류 손상 동물모델에서 좌심실 이완기능 장애 완화에 대한 메트포르민 또는 사파논A의 심장보호 효과

조우리 울산대학교 대학원 의학과 2021 국내박사

The increased incidence of myocardial infarction (MI) has emerged globally as a leading cause of cardiovascular morbidity and mortality. In the development of new drugs, the evaluation of cardiac function is important factor in the withdrawal of drug candidates. In addition, as life expectancy increases, the prevalence of metabolic syndrome is gradually increasing, and metabolic syndromes such as diabetes, abdominal obesity, dyslipidemia, and hypertension are the main causes of cardiovascular disease. The aim of this study was to establish a rat myocardial ischemia and reperfusion (I/R) injury model similar to human acute MI and investigate cardiac function commonly referred to as left ventricular (LV) function including LV systolic and diastolic function using echocardiographic evaluation. Male Sprague-Dawley rats, 8-9-week-old, were ligated and reperfused the left anterior descending coronary artery (LAD) for 30 minutes under ventilation. Echocardiography was performed under anesthesia after the induction of MI according to the experimental plan. Among the echocardiographic indices, EF and FS represent the left ventricular systolic function in tree-dimensional and two-dimensional meanings respectively. To assess the left ventricular diastolic function, the values of peak velocity of the transmitral flow at early filling (E), the early diastolic mitral annular velocity (E’) at the medial mitral annulus, and E/E’ ratio were measured. In the preliminary study, the EF and FS values of rats with MI were significantly decreased compared with those of the sham group at 2 hours and on day 1 (P<0.01). However, the significantly decreased E’ and increased E/E’ values of MI group were shown compared with those of sham group during the entire experimental period. These results indicate that, unlike left ventricular systolic function, left ventricular diastolic function does not recover at the early phase of rat myocardial I/R injury model. Moreover, this acute myocardial infarction animal model and echocardiographic assessment of cardiac function show the importance of the left ventricular diastolic function, which is currently highlighted in patients with heart failure in human. In this study, in a rat myocardial I/R injury model, we can evaluate the efficacy study of candidates for new drug development especially using echocardiographic evaluation of left ventricular diastolic function, and applied metformin and sappanone A. Metformin, dimethyl biguanide as a first-line treatment for type Ⅱ diabetes, significantly improved left ventricular systolic function including EF and FS values on days 3 and 7 after MI surgery. In addition, metformin resulted in recovery of left ventricular diastolic function in the early phase of rat ischemic reperfusion injury in this model. It was also possible to confirm the cardioprotective effect of metformin in histopathological results, in line with echocardiographic results. Sappanone A, isolated from heartwood Caesalpinia sappan, homoisoflavanone, has proven anti-inflammatory effects with cells and LPS-induced bone loss mouse model. Sapannone A administration significantly attenuated left ventricular systolic and diastolic dysfunction in a rat myocardial I/R injury model in the early phase of MI. Also, myocardial infarct size, serum cardiac marker assay, histopathological assessment of inflammatory cells infiltration of rat hearts, transcriptome analysis of rat left ventricles showed that 50 mg/kg sappanone A has a cardioprotective effect. Therefore, this rat myocardial I/R injury model using multimodal assessment of cardiac function including echocardiographic evaluation of left ventricular systolic and diastolic function, serum cardiac marker, myocardial infarct size, histopathologic evaluation, and mRNA sequencing can be widely used in translational research and in the development of new heart failure-related drugs.

한국 성인 남성의 체력에 따른 대사증후군 유병률과 임계값

문여진 울산대학교 2011 국내석사

대뇌 허혈 / 재관류 모델에서 황화수소 투여 시점에 따른 신경보호 효과

권재임 울산대학교 의학과 2018 국내석사

Hydrogen sulfide (NaHS) may reduce the extent of cellular damage related with cerebral ischemia/reperfusion (I/R) injury. We assumed that the NaHS administration time influences its neuroprotective effects, and aimed to prove this hypothesis using magnetic resonance imaging (MRI) and 1H magnetic resonance spectroscopy (1H-MRS). Rats were introduced to transient (60 min) middle cerebral artery occlusion (MCAO). MRI was acquired from 4 groups: sham, control (I/R), and sodium hydrosulfide (NaHS)-30 and NaHS-1 (NaHS injection 30 and 1 min before reperfusion, respectively) at baseline, 3, 9, and 24 h after ischemia. And Terminal transferase d-UTP nick-end labelling (TUNEL) assay was performed for histologic analysis including apoptosis rate at 24 h post-ischemia. In the NaHS-1 group was highest relative apparent diffusion coefficient (ADC) value and lowest relative T2 value of the peri-infarct region at 24 h post-ischemia. On serial 1H-MRS of the ischemic core and peri-infarct regions, no significant difference in the N-acetyl-L-aspartate (NAA) levels or in the combination score of NAA, glutamate, and taurine was observed between the NaHS-1 and NaHS-30 groups. Both the total infarct volume and midline shift (MLS) at 24 h post-ischemia were lowest in the NaHS-1 group. The apoptosis rate was lowest in the ischemic core and peri-infarct regions in the NaHS-1 group. The results suggest that NaHS administration timing influences its neuroprotective effects. Furthermore, this neuroprotective effect may be related to the alleviation of oedema and apoptosis and protection afforded by neuronal metabolites.

허혈-재관류 신손상 후 조직수선에서 CD137L 신호의 역할

이새롬 울산대학교 일반대학원 2019 국내석사

신장은 체내 노폐물을 배출하고 체내 수분의 양을 조절하는 기관이다. 급성 신손상은 갑자기 신기능이 상실되는 것을 말하며 제대로 회복되지 못하면 만성 신손상으로 진행될 위험이 높아 후유증 없이 회복하는 것이 임상적으로 중요하다. 최근 연구에 의하면 대식세포에서의 CD137L 신호 전달은 대식 세포가 제 2형 대식세포로 분화하는 것을 유도한다. 이 세포는 조직수선과 염증해소에 관여하는 것으로 알려져 있다. 따라서 우리는 허혈 재관류 신손상 이후 CD137L 신호 전달이 조직수선을 촉진할 수 있을 것이라는 가설 하에 본 연구를 진행하였다. 본 연구에서 우리는 in vitro실험을 통해 CD137-Fc를 이용한 대식세포의 CD137L 신호 활성화는 제 2형 대식세포 표지인자 Arg1, 염증해소 사이토카인 IL-1Rn, SOCS1 등과 조직 수선 사이토카인 PDGFα의 유전자 발현을 증가시키는 것을 확인하였다. 이는 CD137L 신호가 제 2형 대식세포로의 분화를 유도하여 신손상 후에 조직 수선 과정에 CD137L가 관여 할 수 있음을 시사한다. 생쥐 허혈 재관류 신손상 모델에서 신손상 유도 1일 후 CD137-Fc를 투여를 통해 CD137L 신호를 자극하면 호중구의 침윤이 줄어들고, 제 2형 대식세포의 수가 증가하는 것을 확인하였다. 또한 CD137-Fc를 투여한 생쥐에서 염증해소 관련 유전자(IL-10), 조직수선 관련 유전자(PDGFα, IGF-1, IL-22 등)의 mRNA 발현양이 증가되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 CD137L 신호가 대식세포를 제 2형 대식세포로 분화시켜서 허혈-재관류 신손상 이후 수복을 촉진할 수 있음을 보여주며 허혈-재관류 신손상의 임상적 표적 치료로 개발될 수 있는 것을 시사한다.

CRISPR-매개 염기 편집 개선을 위한 소분자 약물 스크리닝

신하림 울산대학교 대학원 2023 국내석사

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) system, which was originally designed as an adaptive immune system to defend against viral genomes, is now more commonly known as a genome editing tool termed RNA-guide engineered nucleases (RGENs). The mechanism of the CRISPR-Cas9 system is that Cas9 protein and gRNA form a complex, recognize a target DNA sequence, and induce a DNA double-strand break (DSBs). Cleaved DNA is repaired through an intracellular DNA repair pathway, non-homologous end joining (NHEJ), or homology-directed repair (HDR). NHEJ induces gene disruption through small insertions and deletions, whereas HDR induces homologous recombination in the presence of a donor template, thus assisting with gene correction and insertion. Recently, CRISPR-based genome editing has applications in a variety of fields, including agriculture, drug discovery, medicine, and biotechnology. Especially it is attracting attention as a promising tool to treat disease, and clinical trial development is currently accelerating. However, despite having enormous potential for treating disease, there are several problems. Recently, p53-mediated toxicity, large chromosomal deletions and rearrangements, and the occurrence of unwanted byproducts and indels caused by DSBs caused by Cas9-based genome editing have been continuously reported. In addition, since many pathogenic genetic diseases are caused by point mutations, Cas9 nuclease-based disease-related mutation correction is inefficient and has safety issues. In this manner, an approach to precisely correct the target base was required, prompting the development of a base editor capable of correcting the base without DSBs. Base editors currently have two major types, cytosine base editor (CBE) and adenine base editor (ABE). CBE fused with cytidine deaminase to nCas9 (nickase Cas9, catalytically inactive D10A mutation) induces C:G to T:A conversion and ABE fused with adenine deaminase to nCas9 induces A:T to G:C conversion. The present generation of base editors has evolved and refined to optimize efficiency; however, their activity is highly variable depending on cell type and target sequences. Previous studies have demonstrated an attempt to improve the efficiency of the base editor. Notably, the efficiency of CBE was improved by fusing uracil glycosylase inhibitor (UGI) which inhibits the activity of uracil N-glycosylase (UNG). Therefore, this study aimed to investigate the effect of inhibition of certain endogenous protein functions of base editors. To inhibit certain protein functions, small molecule drugs have been adopted, and these strategies have been used to improve the efficiency of Cas9-based genome editing but have not been investigated in base editors. In this study, a fluorescence-based reporter system was developed to identify novel small molecules. 414 small molecule drug libraries were screened in the HAP1 cell line, which was integrated with a reporter system, and histone deacetylase (HDAC) inhibitors were ranked high. Romidepsin with the highest-ranking increased adenine base editing efficiency up to 3.8-fold at the endogenous target sites. These effects verified that romidepsin enhances the expression levels of ABE7.10 protein and gRNA. Additionally, HDAC inhibitors can convert euchromatin through histone hyperacetylation. To evaluate the effect of chromatin status on base editing efficiency, ABE7.10 ribonucleoprotein (RNP), a complex of purified ABE7.10 protein and gRNA that excludes expression-enhancing effect, was electroporated, and romidepsin increased the adenine base editor efficiency up to 4.9-fold. These results suggest that chromatin was converted to an open state throughout the ChIP assay, leading to improved adenine base editing efficiency due to improved RNP accessibility. In conclusion, the HDAC inhibitor can increase the efficiency of CRISPR-mediated base editing based on enhanced expression and improved RNP accessibility. These results may provide insights into further studies to improve the efficiency of CRISPR-mediated genome editing and support strategies to increase the efficiency of in vivo genome editing in therapeutic applications. Clustered regular interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) 시스템은 원래 바이러스 게놈을 방어하기 위한 적응 면역 시스템으로 설계되었으며, 이제는 RNA-guide engineered nuclease (RGENs)으로 불리는 게놈 편집 도구로 더 잘 알려져 있다. CRISPR-Cas9 시스템의 기작은 Cas9 단백질과 gRNA가 복합체를 형성하여 표적 DNA 서열을 인식하고 DNA의 이중 가닥 손상 (DSB, double strand break)을 한다. 절단된 DNA는 세포 내 DNA 복구 경로인 비상동말단연결 (NHEJ. Non-homologous end joining) 또는 상동성 유도 복구 (HDR, Homology-directed repair)를 통해 복구된다. NHEJ는 작은 삽입과 결실을 통해 유전자 파괴를 유도하는 반면 HDR은 기증자 주형의 존재 하에서 상동 재조합을 유도하여 유전자 수정과 삽입을 돕는다. 최근 CRISPR 기반 게놈 편집은 농업, 신약 개발, 의학, 생명 공학 등 다양한 분야에서 응용되고 있다. 특히 질병을 치료하는 유망한 도구로 주목받고 있으며 현재 임상시험을 위한 개발이 가속화되고 있다. 이러한 CRISPR 기술이 질병을 치료할 수 있는 큰 잠재력을 가짐에도 불구하고 몇 가지 우려되는 문제가 있다. 최근에는 Cas9 기반 게놈 편집에 따른 DSB에 의해 p53 매개 세포 독성, 대규모 염색체 결실 및 재배열, 원하지 않는 부산물 및 인델 (Indel, insertion and deletion)의 발생이 지속적으로 보고되고 있다. 또한 많은 병원성 유전 질환이 점 돌연변이에 의해 발생하기 때문에 Cas9 뉴클레아제를 기반으로 한 유전 질환 관련 돌연변이 교정은 비효율적이며 안전성 문제가 있다. 이와 같이 표적 염기를 정밀하게 교정하는 전략을 필요로 했고 DSB 없이 염기를 교정할 수 있는 염기 편집기 (BE, base editor)의 개발이 요구되었다. 염기 편집기는 현재 사이토신 기본 편집기 (CBE, cytosine base editor)와 아데닌 기본 편집기 (ABE, adenine base editor)의 두 가지 유형이 있다. nCas9에 시토신 탈아미노화효소 (cytidine deaminase) 와 융합된 CBE (nickase Cas9, 촉매적으로 불활성인 D10A 돌연변이)는 C:G에서 T:A로의 전환을 유도하고, ABE는 nCas9에 대한 아데닌 탈아미노화효소 (adenine deaminase)와 융합되어 A:T에서 G:C로의 전환을 유도한다. 현재 세대의 염기 편집기는 효율성을 최적화하기 위해 진화하고 개선되었지만 그 활동은 세포 유형 및 대상 시퀀스에 따라 매우 다양하다. 이전 연구에서는 염기 편집기의 효율성을 개선하기 위한 여러 노력들이 있었다. 특히, 우라실 N-글리코실라아제 (UNG, uracil DNA glycosylase )의 활성을 억제하는 우라실 글리코실라아제 억제제 (UGI, uracil DNA glycosylase inhibitor)를 융합하여 CBE의 효율이 개선되었다. 따라서 본 연구에서는 특정 내인성 단백질 기능 억제가 염기 편집기에 미치는 효과를 조사하고자 하였다. 특정 단백질 기능을 억제하기 위해 소분자 약물이 적용되었으며 이러한 전략은 Cas9 기반 게놈 편집의 효율성을 향상시키는 데 사용되었지만 아직까지는 염기 편집기에서는 그 효과가 조사되지 않았다. 따라서 이 연구에서는 염기 편집기 효율성에 영향을 미치는 새로운 소분자를 식별하기 위해 형광 기반 리포터 시스템을 개발했다. 리포터 시스템이 통합된 HAP1 세포주에서 항암 특성을 가진 414개의 소분자 약물 라이브러리를 스크리닝 했고, 히스톤 탈아세틸화효소 (HDAC, Histone deacetylase) 억제제가 높은 순위에 기록되었다. 순위가 가장 높은 로미뎁신은 내인성 표적 부위에서 아데닌 염기 편집 효율을 최대 3.8배까지 증가시켰다. 이러한 효과는 로미뎁신이 ABE7.10 단백질 및 gRNA의 발현 수준의 향상에 기여함을 확인하였다. 또한 HDAC 억제제는 히스톤 과아세틸화를 통해 열린 염색질 상태로 전환시킬 수 있다. 따라서 ABE7.10의 접근성이 향상되었을 거라 추측했고, 발현 강화 효과를 배제하기 위해 정제된 ABE7.10 단백질-gRNA 복합체인 RNP (ribonucleoprotein)을 전기 천공 후 로미뎁신을 처리했을 때 염기 편집 효율이 최대 4.9배 증가했다. 이러한 결과는 ChIP 분석에 의해 염색질이 열린 상태로 전환됨에 따라 RNP 접근성 향상에 의해 염기 편집 효율이 향상되었음을 시사한다. 결론적으로 HDAC 억제제는 개선된 발현 및 향상된 RNP 접근성을 기반으로 CRISPR 매개 염기 편집의 효율성을 높일 수 있다. 또한 이러한 결과는 CRISPR 매개 게놈 편집의 효율성을 개선하기 위한 추가 연구에 대한 통찰력을 제공하고, 치료 응용 분야에서 생체 내 게놈 편집의 효율성을 높이기 위한 전략을 지원할 수 있다.

섭식 및 체중 조절에 있어서 시상하부 Angiopoietin like peptide-4 의 역할

김현경 울산대학교 2009 국내석사

연구배경 Angptl-4(fasting-induced adipose factor)는 angiopoietin-like protein familty에 속하는 약 70Kd 크기의 단백질로 N-terminal domain은 cioiled coil domain으로, C-ternimal은 fibringen like domain으로 구성되어 있다 Angptl-4는 간, 지방, 근육, 신경, 뇌하수체 등 다양한 조직에 발현되며, 혈액에서도 풍부하게 존재한다. Angptl-4는 공복 상태에서 지방 조직에 그 발현이 증가하여 이름이 붙여졌으며, 전사조절 인자인 PPAR-alpha의 ligand를 처리하면 그 발현이 증가하는 것으로 알려져 있다. 현재까지 알려진 Angptl-4의 작용으로는 신생혈관생성(angiogenesis)의 억제 및 지질대사 조절 작용이 있다. 지방세포 특이 (aP2)-promoter를 이용하여 Angptl-4 발현을 증가시킨 transgenic mouse에서는 체지방량이 감소한다고 보고되어 있으며, 이는 혈액의 중성 지방의 지방세포로의 저장의 감소 및 지질 산화의 감소에 기인한다고 알려져 있다. 선행연구를 통하여 본 연구자는 Angptl-4가 식욕과 체중 조절 중추인 시상하부에 발현이 되었음을 확인하였다. 따라서 본 연구자는 Angptl-4가 식욕 및 체중 조절에 관여할 것이다 라는 가설을 세우고, 본 연구를 진행하였다. 한편 AMP-activated protein kinase (AMPK)는 세포내 에너지가 부족한 상황에서 활성화되는 효소로, AMPK 활성화는 ATP를 소비하는 동화 작용에 관련되는 효소들의 활성을 억제하고, ATP 생산에 관련되는 효소들의 활성을 촉진함으로써 에너지 부족 상태로부터 회복을 도와주는 역할을 한다. AMPK 활성화는 운동에 의한 골격근에서의 포도당 섭취 및 지방산 산화 증가, 간에서의 지방합성 및 포도당 신생억제 및 췌장에서의 인슐린 분비를 조절하는 중요한 매개인자로 작용한다. 또한 AMPK는 중추신경계, 특히 식욕조절 중추인 시상하부에도 풍부하게 존재하며, 최근 시상하부 AMPK 활성이 먹이섭취 상태에 따라서 변화함이 보고되었다. 식욕억제 인자인 렙틴, 인슐린 및 알파-리포산 투여시 시상하부 Angptl-4의 활성이 증가하며, 그 결과 감소한 시상하부 AMPK 활성이 섭식 억제 작용의 중요한 중간 매개인자임이 보고되면서, 시상하부 AMPK가 전신의 에너지 상태를 감지하여 먹이섭취와 에너지 대사를 조절하는 "whole body enengy sensor"로 작용한다는 가설이 제시되었다. 따라서 먹이섭취 조절과 체중조절에 있어서 Angptl-4와 AMPK의 관련성에 대해서도 연구하였다. 연구목적 시상하부에서 Angptl-4의 섭식 및 체중 조절에 있어서의 역할을 규명하고, 그 분자생물학적 기전을 규명하며, Angptl-4 knockout mouse에서 섭식 및 에너지 대사의 변화를 연구하였다. 연구방법 및 내용 1) 제 3뇌실로 Angptl-4의 투여가 먹이섭취와 체중에 미치는 효과를 관찰하였다. 2) 제 3뇌실로 Angptl-4의 투여가 에너지 대사율에 미치는 효과를 관찰하였다. 3) 제3 뇌실로 Angptl-4의 투여가 섭식조절에 관여하는 시상하부 뉴로펩타이드 (neuropeptide Y, proopiomelanocortin, Agouti-related peptide, coccain amphetamine regulated peptide)의 mRNA 발현에 미치는 효과를 관찰하였다. 4) 제 3뇌실로 Angptl-4의 투여가 시상하부 및 골격근의 AMPK 활성에 미치는 효과를 관찰하였다. 5) 공복과 식사에 따른 시상하부 Angptl-4의 protein 및 mRNA의 양적인 변화를 관찰하였다. 6) Wild type mouse와 Angptl-4 knockout mouse에서 먹이섭취, 체중, 체지방량 및 에너지대사율을 비교하였다. 연구결과 시상하부에서 Angptl-4를 투여하거나 유전자를 과발현 시키면 먹이섭취와 체중이 감소하였다. Angptl-4 KO mosue에서 체중과 금식후 먹이섭취량이 증가하였다. 시상하부 Angptl-4 발현은 음식물, 영양소 및 렙틴 투여 후 증가하였다. Angptl-4 투여는 시상하부 AMPK 활성을 감소시켰고, AMPK activator 투여는 Angptl-4 의 먹이섭취 및 체중 감소 효과를 차단하였다. 결론 시상하부의 Angptl-4가 영양소에 의하여 조절을 받으며, AMPK 활성 조절을 통하여 섭식과 체중을 조절하는 새로운 섭식 조절 인자임을 제시해 준다.

EW-7197, a novel TGF-β inhibitor: Suppression of Granulation Tissue Formation after Bare Metallic Stent Placement in a Rat Esophageal Model

박정훈 울산대학교 일반대학원 2015 국내박사

Background and Purpose: Placement of self-expandable metallic stents (SEMSs) for benign esophageal strictures in patients with a relatively long life expectancy has not gained widespread acceptance because of the formation of excessive exuberant fibrosis triggered by mechanical injury after stent placement. Transforming growth factor (TGF)-β signaling appears to be a potential target for the prevention and treatment of fibrotic diseases, and direct inhibition of activin receptor–like kinase 5 (ALK5), a type 1 receptor of TGF-β, might be an attractive method to prevent the detrimental profibrotic effects of TGF-β. The purpose of this experimental study was to investigate the efficacy of EW-7197 in preventing granulation tissue formation caused by bare metallic stent placement and to evaluate the anti-fibrotic potential of blocking TGF-β in a rat esophageal model. Materials and Methods: All experiments were approved by the committee of animal research. In 24 Sprague-Dawley male rats (weight range, 300-350 g), a self-expanding metallic bare stent was placed in the esophagus under fluoroscopic guidance. The rats were randomly divided into three groups after stent placement. Group A received control treatment, group B received orally EW-7197 (10 mg/kg) two times per day for 4 weeks, and group C received orally EW-7197 (20 mg/kg) once per day for 4 weeks. All rats were sacrificed 4 weeks after stent placement. The therapeutic effectiveness of EW-7197 was assessed by comparing the results of esophagography, histologic examination, and quantitative analysis of TGF-β among the three groups. The cell counting kit 8 (CCK-8) assay was used to evaluate the toxicity and relative cell death caused by EW-7197 in rat fibroblast cells. Inhibition of TGF- β/Smad signaling in rat and human fibroblast cells was assessed by Western blot analysis. Results: Stent placement was technically successful in all rats. The overall luminal diameter of the stented esophagus in group A was significantly lower than those in groups B and C. The mean percentage of granulation tissue area, mean number of epithelial layers, and mean thickness of submucosal fibrosis were significantly higher in group A than in groups B and C (P < 0.001 and P < 0.001, respectively), without drug toxicity. However, there was no significant difference between groups B and C. The mean density grade of inflammatory cell infiltration did not differ among the three groups. The TGF-β level estimated by Real-time PCR was significantly higher in the granulation tissue formation area in group A than in those of groups B and C. The growth ratios of rat fibroblast cells gradually decreased in a dose-dependent manner. EW-7197 inhibited TGF-β induced phosphorylation of Smad2 and Smad3 in rat and human fibroblast cells. Conclusion: EW-7197 was effective and safe for the suppression of granulation tissue formation after stent placement in a rat esophageal model indication that it could have potential as an anti-fibrosis therapeutic agent via its ability to inhibit TGF-β.

용적 CT를 이용한 삼차원 이차함수 기반 횡경막 모델의 개발: COPD 환자에서 폐기능검사와의 상관연구

박주영 울산대학교 2014 국내석사

만성폐쇄성폐질환 환자에서 줄어든 근섬유 길이로 인해 횡경막 기능이 감소되며 횡경막의 형태에 변화를 가져 온다. 그러므로 횡경막의 형태에 따른 정량적 파라미터의 분석은 중요하다. 본 연구에서, 우리는 꼭지점에서의 형태지수(SIA), 꼭지점에서의 곡률(CA), 꼭지점에서 아래 평면 사이의 높이(H), x, y, z 축 방향의 횡격막 길이(XL,YL,ZL), 횡경막 모델 Z축 방향 길이(FZL), 평균 곡률(C), 표면적(SA)을 포함한 횡경막 파라미터를 자동 추출하기 위하여, 용적 CT 데이터에서 만성폐쇄성폐질환 환자에 대한 횡경막의 정량적 분석방법을 개발하였다. 또한 추출된 횡경막 파라미터에 대하여 폐기종 지수(EI) 및 FEV1, FEV1/FVC, DLco 등 3가지 폐기능 검사(PFT)와 대응하는 상관관계를 분석하였다. 이를 위하여 만성폐쇄성폐질환 환자 30명과 정상대조군 10명에 대한 용적 CT 데이터를 16채널 다중검출전산화촬영기기(Somatom Sensation:Siemens Medical system, Erlangen, Germany)에서 획득하였다. 폐 영상에서 횡경막 데이터를 추출하기 위하여 문턱값을 이용한 폐 분할 및 광선투사법(ray projection)를 기반으로 한 횡경막 분할을 수행하였다. 그리고 횡경막 데이터를 기반으로 분할 오류를 최소화하기 위하여 강인회귀분석(robust regression)을 이용한 삼차원 이차 함수 모델링을 수행하였다. 영상 분할 결과는 흉부영상의학과 전문의로부터 평가되었고, 분할의 전체 정확도는 95.58 ± 2.52 %(평균±표준편차)로 나타났다. 횡경막의 형태 특징을 고려하기 위하여 위에서 언급한 횡경막 파라미터들을 내부 소프트웨어를 이용하여 자동적으로 측정하였다. SIA, CA, H, XL, YL, ZL, FZL, C, SA를 포함한 정량적 형태학적 파라미터의 값은 각각 0.85±0.05, 0.01±0.00, 17.93±10.78, 129.80±11.66, 163.19±13.45, 71.27±17.52, 61.59±16.98, 0.01±0.00, 34380.75±6680.06 (평균±표준편차)이다. 통계분석에서 횡경막 파라미터는 만성폐쇄성폐질환 환자군과 정상대조군을 합한 모든 데이터에 대하여 횡경막 지수는 폐기종 지수와 폐기능검사 값들과의 유의한 상관관계를 보여주었다. 본 연구에서는, 기존 연구에서 이용하였던 길이와 표면적 측정을 자동으로 수행하였을 뿐만 아니라, 삼차원 이차함수 표면 모델을 기반으로 한 횡경막 지수 및 형태 특징을 정의하였고, 이들 파라미터들과 폐기종 지수 및 폐기능검사 값들 간의 상관관계에 대하여 조사함으로써 횡경막 파라미터의 유용성을 연구하였다. 이 연구는 삼차원 용적 흉부 CT를 이용하여 감소된 근섬유길이와 횡경막의 형태 변화에 관련된 만성폐쇄성폐질환의 병인과 진행과정을 평가하는데 유용할 것으로 기대된다. 또한 제안한 방법은 만성폐쇄성폐질환 환자들의 추적검사에서 횡경막의 형태학적 변화를 평가하는데 도움이 될 것으로 예상된다.