Pseudomonas sp. G11이 생산하는 생물학적 계면활성제의 특성

심소희 韓南大學校 大學院 2006 국내석사

대전일원의 유류오염 지역의 토양으로부터 crude oil을 탄소원으로 이용하는 322균주를 순수분리 하였고, 분리된 균주 중 생물학적 계면활성제 생성능이 가장 우수한 균주를 선별하여 형태·생리학적 및 생화학적 특성을 조사하고 16S rRNA 염기서열을 분석을 통하여 최종 선별 균주로 Pseudomonas sp.를 동정하였고, Pseudomonas sp. G11이라 명명하였다. Pseudomonas sp. G11이 생성하는 생물학적 계면활성제의 초기 표면장력은 72 dyne/cm이였으나, 배양 7시간 후부터는 최대감소 표면장력이 25 dyne/cm 까지 감소되었다. Pseudomonas sp. G11이 생산한 생물학적 계면활성제를 회수하고 농축하기 위해서, 산 침전 후에 Chloroform : Methanol=2:1의 solvent system으로 배양액을 추출하고 유기 용매층만을 회수하여 감압농축한 뒤 남은 갈색 분말을 생물학적 계면활성제의 시료로 사용하였다. 생물학적 계면활성제 시료를 이용하여 측정한 CMC(critical micelle concentration) 값은 20 mg/L인 것으로 나타났다. Pseudomonas sp. G11의 최적 온도와 pH는 30℃이와 pH는 7.0이다. Pseudomonas sp. G11은 kanamycin (5 ㎍/㎖)과 tetracycline(10 ㎍/㎖)에 대해서만 약한 내성을 나타냈으며, Li, Cr, 와 Mn과 같은 중금속에서는 강한 내성을 가지는 것으로 조사되었다. Thin layer chromatography를 이용한 성분분석에서 Pseudomonas sp. G11은 Bial's reagent와 rhodamine 6G에서 발색반응을 나타내 당과 지질 성분이 포함된 glycolipid 계열의 생물학적 계면활성제임이 밝혀졌다. Three hundred thirty two bacterial colonies which were able to degrade crude oil were isolated from soil samples that were contaminated with oil in Daejon area. Among them, one bacterial strain was selected for this study based on its low surface tension ability, and this selected bacterial strain was identified as Pseudomonas sp. G11 through physiological-biochemical tests and analysis of its 16S rRNA sequence. After seven hours of inoculated, the activity reached the maximum, and surface tension of the culture broth was decreased from 72 to 25 dyne/㎝. The crude biosurfactant was obtained from the culture broth by acid precipitation, followed by solvent extraction, evaporation and then freeze drying. The CMC (critical micelle concentration) value of the crude biosurfactant was 20 mg/L. It was found that the optimal pH and temperature for biosurfactant production of Pseudomonas sp. G11 were 7.0 and 30℃, respectively. Pseudomonas sp. G11 showed antibiotic activity with weak resistance to kanamycin (5㎍/㎖) and tetracycline (10㎍/㎖), high resistance to heavy metals such as Li, Cr, and Mn. Based on TLC analysis, the biosurfactant produced by Pseudomonas sp. was identified as a glycolipid.

염색 폐수 내 난분해성 물질 및 질산염의 생물학적처리에 관한 연구

김진수 경기대학교 대학원 2003 국내석사

본 연구에서는 염색폐수(반월 염색 폐수 공단 공동 폐수 처리장) 내 균주를 분리하여 Genus Agromyces, Micrococcus, Cellulomonas, Pseudomonas, Bacteriode, Hafnia, Flavobacterium, Xanthomonas 등 638개를 분리 동정하였으며, Screening을 통해 난분해성 고효율 균주 Pseudomonas sp. KD36과 질산염 제거 고효율 균주 Pseudomonas sp. KN148을 선별하였다. 난분해성 물질 제거 고효율 균주 KD36, 질산염 제거 고효율 균주 KN148을 회분식 실험을 통해, 기질과 cell농도 비(COD_(Cr)(g/L)tell mass weight(g/L)비) 0.7로 기질에 따른 최적 균주량을 선정하였으며, 호기/ 혐기 조건에서의 growth rate(μ_(max))는 KD36은 0.11hr^(-1)/0.08hr^(-1)로 나타났으며, KN148은 0.080hr^(-1)/0.05hr^(-1)로 나타났다. KD36은 호기 조건에서 난분해성 물질 제거가 70.7%(혐기 60.8%)로 높게 나타났으며, 혐기 조건에서 색도 제거가 72.7%(호기 31.2%)로 높게 나타났다. 또한 KN148은 혐기 조건에서 92.0%의 높은 질산염 제거능을 확인하였다. 조건별 회분식 배양을 통해 KD36, KN148의 배양인자를 도출하여, 변형된 활성 슬러지법의 모형 생물학적 처리시스템에 적용하였다. 모형 생물학적 처리 시스템에서 최적 운전 조건을 유지하기 위하여 운전 조건별로 실험을 하였으며, HRT 8hr, SRT 25-30 day, F/M 0.8 ㎎COD/㎎MLVSS/d, 포기조 DO2.0-3.0 조건에서 최적 조건으로 나타났으며, 난분해성 물질 제거를 측정하는 COD_(Cr)의 평균 제거율은 80.9% 로 나타났으며, 화학적 처리의 효율이나, 다른 생물학적 처리의 효율 60∼70%(환경부, 1998)보다 훨씬 더 높은 효율을 보였다. 질소는 T-N 93.4%, NH_(3)^(-)-N 82.4% 제거율을 보였으며, 특히, NO_(3)^(-)-N 100.0%의 제거 효율로 기존의 처리보다 훨씬 높은 효율을 보였다, Color ADMI 65.0%, T-P 86.3%의 결과를 나타냈다. 본 연구에서 선별한 고효율 균주 Pseudomonas sp. KD36, KN148 strain을 이용하여 생물학적 처리 시스템을 적용한다면, 현재 화화적 처리에 드는 약품비를 줄여 경제적으로 큰 보탬이 될 수 있으며, 염색 폐수 처리 시 독성을 가진 2차 오염 물질을 발생시키지 않으므로, 독성에 의한 동식물 및 인간의 질병을 방지할 수 있으리라 본다. 결국, 본 연구와 같이 방대한 산업폐수에서의 생물학적 처리 연구가 활발히 진행된다면, 누적되는 영양물질에 의한 부영양화와 적조를 장기적으로 치유할 수 있을 것이며, 물론 생물학적 처리를 할 수 있는 처리량이 문제로 대두되기는 하고 있지만, 이들의 생물학적 처리와 현재의 화학적·물리학적 처리와 접목된다면, 경제적으로도 많은 보탬에 되리라 본다. The dye wastewater of industrial wastewater is more than 70%. And dye stuff has used of a wide industries; food, cosmetic, pharmaceutical, leather, plastics industry. The principal ingredient of dye wastewater is xenobiotics, benzen, phenol, ethylene, amin, toluene, etc. and azo dye. And product of degrading dye wastewater is nitrate, etc. These compounds are caused of toxic, color, eutrophic of nutrient. Now, dye wastewater treatment system includes various combinations of biological, physical and chemical methods. but these methods require high operating costs. This study focused bacteria of degrading xenobiotics in dye wastewater. Degradation mechanism of xenobiotics is bacterial degradation with extracellular enzyme(oxygenase, peroxidase) and their cometabolism. And Nitogen source forms organic nitogen, ammonia nitrogen, nitrate nitrogen, et al. And it transforms nitrate (NO_(3)^(-)) with oxygen and xenobiotics with aromatic compound in industrial wastewater. Until now, it was reported that this nitrogen compound including nitrate was degraded by bacterial enzyme (nitrate reductase). We isolated bacteria in dye wastewater. We have isolated Genus Agromyces, Genus Micrococcus, Genus Cellulomonas, Genus Pseudomonas, Genus Bateriode, Genus Hafinia, Genus Flavobacterium, et al. (698 strains) from Banwol dye wastewater. In screening, we acquired Pseudomonas sp. KD36, KN148 which is xenobiotics removal, nitrate nitrogen removal bacteria. In batch culture, KD36 was 70.7% xenobiotic removal efficiency in 24hr. aerobic condition-bacteria. And KN148 was 92.0% nitrate nitrogen removal efficiency during 24hr anaerobic condition (initial nitrate is 40mg/L). In application lab scale biological treatment reactor, It have been COD_(Cr), 80.9%, Color 65.0%. T-N 93.4%, NH_(3)^(-)-N 92.4%, NO_(3)^(-)-N 100.0%, T-P 86.3% removal efficiency. We have used dye waste water which is COD_(Cr), 700.0-990.0mg/L, T-N 28.0- 35.0mg/L, NH_(3)-N 20.0- 25.0mg/L, NO_(3)^(-)-N 5.0 - 8.0mg/L, PO_(4)^(3-)-P 5.2 - 8.0mg/L, Color 130- 1600 unit (ADMI value). Result of our study may contribute to treatment of dye wastewater.

토양/지하수에 오염된 PCE의 생물학적 분해연구

최명훈 경기대학교 2009 국내석사

본 연구에서는 토양/지하수에 오염된 PCE를 효과적인 생물학적 방법으로 분해하기 위하여 호기적 조건에서 PCE를 분해하는 균주를 순수분리 하였다. 경기도내의 PCE/TCE가 오염된 토양 및 지하수로부터 총 438균주를 순수분리 하였으며 그 중 29균주가 toluene을 에너지원으로 분해하여 성장하였다. PCE분해 고효율 균주를 선정하기 위해 29균주를 이용한 스크린테스트(PCE 10 mg/L, toluene 50 mg/L)결과, PCH225균주가 15일 동안 PCE 10 mg/L를 72.5%분해하여 가장 높은 PCE분해효율을 보였다(초기 균 농도 1.0 g/L, pH 7, 30℃). PCH225는 형태학적 특징, 생리·생화학적 테스트, 16S rDNA염기서열분석, 지방산 분석 결과 Pseudomonas putida로 동정되었다. Pseudomonas putida PCH225에 의한 PCE분해 시 최적조건은 PCE 10 mg/L toluene 200 mg/L, pH 7, 30℃, 균농도 1.0 g/L(w/v)이었다. 최적조건 적용 하에 P. putida PCH225은 PCE 9.4 mg/L를 12일 동안 85%분해하였고 이때의 PCE분해율은 0.016 μmol/hr이었다. P. putida PCH225에 의한 PCE/TCE(10/10 mg/L)복합기질 분해 결과, PCE/TCE는 각각 27일 후 87.6, 86.3%분해되었다(toluene 50 mg/L, 초기 균 농도 1.0 g/L, pH 7, 30℃). P. putida F1을 이용하여 P. putida PCH225와 동시에 PCE분해를 실험한 결과 두 균주 모두 PCE를 분해하였으며 이때 P. putida F1의 PCE분해율은 0.009 μmol/hr이었다(PCE 10 mg/L, toluene 50 mg/L, 초기 균 농도 1.0 g/L, pH 7, 30℃). Heat killed P. putida PCH225를 이용한 PCE분해 실험에서는 PCE의 분해를 확인할 수 없었다. P. putida PCH225에 의한 PCE가 분해되는 동안(0∼9일) dioxygenase activity를 측정한 결과 평균 3.07 CPS(count per second)/min의 효소활성을 확인하였다. PCE분해에 따른 P. putida PCH225의 성장패턴을 확인하기 위하여 두 조건(PCE+toluene, toluene)에서 P. putida PCH225의 OD600를 확인한 결과, PCE가 분해되는 동안 PCE+toluene조건에서는 toluene만 주입한 조건보다 OD가 더 빨리 감소하였다. 또한 PCE가 분해된 후 24일째에 두 조건의 생균수(CFU)를 비교한 결과 PCE+toluene 조건(2.6×106)에서는 toluene만 주입한 조건(5.0×107)보다 생균수가 약 19.2배 감소한 것을 확인하였다. P. putida PCH225에 의해 12일 동안 7.0 mg/L의 PCE가 분해된 후, 배지에서의 염소이온 측정 결과 2.44 mg/L의 염소이온(Cl-)이 생성된 것을 확인하였다. P. putida PCH225를 이용하여 PCE단일 기질분해 실험을 실시한 결과 총 17회의 반복실험(PCE 10 mg/L, 초기 균농도 5.0 g/L, pH 7, 30℃)중 8회의 실험에서 PCE가 분해되었고 이때의 PCE분해율은 평균 0.0038 μmol/hr이었고 PCE제거율은 0.114 μmol/mg-DCW/hr이었다. P. putida PCH225를 이용하여 호기적 조건의 토양에서 PCE분해를 확인하였으나 PCE는 분해되지 않았다.

기내 검정법을 이용한 국내 과수 화상병 방제제 선발 연구

이민수 강원대학교 일반대학원 2018 국내석사

Enterobacteriaceae에 속하는 Erwinia amylovora라는 세균에 의해 발생하는 식물세균병인 화상병은 2015년 이전에는 국내에서 발병이 보고되지 않았고 금지병해충으로 지정되어있다. E. amylovora는 장미과 식물을 기주로 삼으며 사과, 배 등 과수에 큰 피해를 주며 보통 감염된 기주는 5년 내에 나무 전체가 고사하게 된다. 국내에서는 2015년 천안, 안성의 사과 과수원에서 최초로 발생하였다. 2015년 발병 이후 농촌진흥청에서는 감염의심 나무는 즉시 매몰하고 감염 확진 시 과수원 전체와 감염 된 나무의 반경 100m이내 기주식물 매몰, 발견지점 반경 2km 이내 약제살포, 발견지점 반경 5km 이내 주기적 예찰을 실시한다. 예방 방법으로는 배나무는 3월 하순부터 4월 상순, 사과는 4월 상순에 동제 화합물 살포를 하고 병 발생 지역은 개화기에 항생제를 살포하도록 권장하고 있다. 그러나 국내에 발병된 적이 없었던 병이므로 사전 연구가 이루어지지 않아 적절한 방제약제 선정 및 방제체계가 확립되어 있지 않다. 외국의 경우 화상병을 방제하기 위하여 항생제인 streptomycin을 많이 사용하였는데 저항성을 가지는 화상병원세균 균주가 발생함에 따라 대체 항생제와 생물학적 제제를 이용한 방제를 많이 이용한다. 따라서 본 연구는 이러한 방제 방법과 다른 식물세균병에 대하여 등록되어있는 살세균제와 생물학적 제제를 활용하여 국내 화상병에 적용하기에 적절한지 검증하고 외국의 사례와 같이 streptomycin과 대체 항생제에 대해 저항성 유전자 또는 저항성 획득이 가능한지 검정하였다. 먼저 화상병 방제 후보 방제제들의 최소억제농도(MIC)를 통하여 oxytetracycline, streptomycin, sxytetracycline+streptomycin, kasugamycin, oxolinic acid와 동제 화합물인 tribasic copper sulfate와 생물학적 제제인 Bye-mycin®, Blossom protect®와 신규 길항미생물 DF49, DF52를 효과적인 화상병방제 후보 방제제로 선별되었다. in planta 실험에서는 화상병원세균의 기주인 사과의 꽃, 신초, 유과를 이용하여 각 후보 방제제들의 화상병 억제 효과와 적절한 처리시기를 제시 하고자 하였다. 그 결과 꽃에서는 항생제와 copper hydroxide가 효과가 좋았고 Blossom protect®는 효과가 있지만 항생제나 copper hydroxide보다는 효과가 떨어졌고 신초와 유과에서는 항생제와 tribasic copper sulfate가 효과적이고 생물학적 제제의 경우 효과를 보이지 않았다. 또한 미국의 화상병원세균과 같이 항생제에 대하여 저항성을 가지는지 확인하였다. Streptomycin에 대한 저항성의 경우 streptomycin을 불활성화 시키며 접합에 의하여 이동 가능한 strA-strB라는 저항성 유전자와 streptomycin의 작용부위인 ribosome의 구성성분인 12s protein을 암호화 하고 있는 rpsL에 돌연변이가 생길 경우 저항성을 가지게 되는데 두 유전자를 검정한 결과 국내 화상병원세균은 strA-strB를 가지지 않고 rpsL에 돌연변이는 발생하지 않아 streptomycin에 대하여 저항성을 가지지 않았다. 화상병원세균과 동일 서식처를 가지는 부생균이 strA-strB를 가질 경우 접합에 의해 화상병원세균이 streptomycin에 대하여 저항성을 획득 할 수 있으므로 사과 신초에서 분리된 부생균에 대하여 strA-strB를 검정하였고 그 결과 strA-strB를 가지고 있지 않았다. 기존 연구에 의하면 매개충에 의해 화상병이 전반 된다고 알려져 있지만 확인 결과 매개충들의 표면에는 발병 가능한 정도의 화상병원세균은 검출되지 않았다. 마지막으로 효과적인 항생제와 동제 화합물이 화분 매개충에 대하여 부정적 영향에 대하여 검정하였다. 접촉독성, 경구독성 및 활동성에 대한 부작용이 없는 것을 확인하였다. Fire blight, caused by the enterobacterial pathogen Erwinia amylovora, is a major disease of rosaceous plants include apple and pear. Fire blight has been not reported in Korea until 2015 but apple orchard in Anseong and Cheonan was occurred fire blight in early May 2015. Because fire blight was not exist in Korea, suitable control agent and control system was not established. In Rural Development Administration(RDA), the suspect tree is buried immediately and when suspected tree confirmed fire blight the entire orchard and host plant within 100 m are buried, sprayed within 2 ㎞ radius of disease occur site, and periodically monitored within 5 ㎞ radius of disease occur site. RDA proposes to treat copper compounds in late March to early April on apple, early April on pear and antibiotics in blossoming season on orchard which confirmed to fire blight. In other countries where streptomycin resistant E. amylovora occur, alternative antibiotics and biological agent are uesd to control. This study was performed to test whether Korea control system is suitable for Korea fire blight and to confirm whether E. amylovora has a resistance gene for streptomycin or other antibiotics. MIC was tested to screen oxytetracycline, steptomycin, oxytetracycline+streptomycin, kasugamycin, oxolinic acid, tribasic copper sulfate, Bye-mycin®, Blossom protect™, DF49 and DF52 as effective fire blight control agent, and in planta test have suggested appropriate application period for each agents. Antibiotics and tribasic copper sulfate were effective in controlling fire blight from so we confirmed same gene in E. amylovora which isolated in Korea. Epiphyte bacteria which isolated on apple shoots has no transposable resistance gene. Surface of the insect vectors was no detectable E. amylovora Finally, effective control agents were not have side effects on pollinators.

한국산 개별꽃속(Pseudostellaria Pax)의 분류, 생태 및 보전생물학적 연구

조현 전북대학교 일반대학원 2019 국내박사

The genus Pseudostellaria (Caryophyllaceae) in Korea was investigated in order to clarify their taxonomic position and scientific name among species based on morphological characteristics. Pseudostellaria sylvatica (Maxim.) Pax can be distinguished from the others by its subulate or linear-lanceolate leaf blades and five petals with deep marginate apex. P. japonica (Korshinsky) Pax has leaves pubescent on the margin, surface and on the midrib beneath, and five petals with swallow marginate apex. P. baekdusanensis M. Kim, described firstly from Mt. Baekdu, was also discovered in the Yongneup wetland. P. baekdusanensis found in Mt. Baekdu was distinguished from those in Yongneup having cleistogamous flowers, although they shares the characteristics of small plant size, pubescent margin and base of leaf, and five petals with deeply marginate apex. P. davidii (Franchet) Pax, P. davidii (Franch.) Pax x P. okamotoi var. longipedicellata (S. Lee, K.I. Heo & S.C. Kim) H. Jo, and P. x seoraksanensis M. Kim & H. Jo share the following characteristics: trichome on sepal margin and midvein, five petals, and stem recline to the ground after flowering. But P. davidii bears fertile fruit. P. davidii x P. okamotoi var. longipedicellata, resulting from a natural hybridization of P. davidii and P. okamotoi var. longipedicellata (S. Lee, K.I. Heo & S.C. Kim) H. Jo, has sterile fruit and a long pedicel (2.2-6.0 cm). P. x seoraksanensis, a natural hybrid of P. davidii and P. palibiniana (Takeda) Ohwi has sterile fruit and a short pedicel (1.1-1.8 cm). P. bulbosa (Nakai) Nakai with sub-globose root tubers was synomized to related taxa P. davidii by its overlapping root tuber shapes. P. okamotoi Ohwi is distributed in Mt. Jiri, Mt. Deogyu, Mt. Gaya, and Mt. Baekun (Jeonnam). It has five petals, 1-2 rows of trichomes on its pedicel, and long pedicel of chasmogamic flowers that elongate to the ground when bearing fruit. P. okamotoi var. longipedicellata shares several characteristics (long pedicel of chasmogamic flowers that elongate to the ground when bearing fruit and cleistogamic flowers with a long pedicel) with related taxa P. okamotoi. P. okamotoi var. longipedicellata has slender root tubers, glabrous pedicel, and 5-9 petals. P. okamotoi var. longipedicellata for. daegwallyeongensis H. Jo is described from Daegwallyeong. It has leaves pubescent on the upper surface, margins, and beneath the midrib. P. okamotoi var. longipedicellata for. palgongmolongiana H. Jo is described from Mt. Palgong. This taxa related to P. okamotoi var. longipedicellata is characterised by short style, short stamen, and spiral style. P. palibiniana (Takeda) Ohwi and P. okamotoi var. longipedicellata show similarity in their appearance, but P. palibiniana is easily distinguished by its short pedicel of chasmogamic and cleistogamic flowers. P. palibiniana for. hallasanensis H. Jo is described from Mt. Halla. It has leaves pubescent on the upper surface, margins, and beneath the midrib. P. monantha Ohwi and P. coreana (Nakai) Ohwi are conspecific to P. palibiniana. P. palibiniana var. gageodoensis M. Kim & H. Jo is described from Gageo island. It is similar with P. palibiniana having chasmogamic flowers at the stem terminal, 5-7 petals, and a short pedicel, but P. palibiniana var. gageodoensis is distinguished by 1-2 rows of trichomes on the pedicel, large sepal size, large petal size, and branched stem at its base. P. setulosa Ohwi has rhizome with root tubers, six petals, and leaves pubescent on margins and beneath the midrib. P. heterophylla (Miquel) Pax has pubescent pedicels, five petals, 1-many chasmogamic flowers at the end of the stem, and a solitary aerial stem. P. heterophylla for. puberula (Ohwi) Mizushima has leaves pubescent on upper surface, margins, and beneath the midrib. P. heterophylla (Miq.) Pax x P. okamotoi var. longipedicellata (S. Lee, K.I. Heo & S.C. Kim) H. Jo from natural hybrid of P. heterophylla and P. okamotoi var. longipedicellata has a solitary aerial stem, a chasmogamic flower at the stem terminal, shallow marginate or bitten petal apex, 1 row of trichomes on the pedicel, and sterile fruit. P. x segeolsanensis M. Kim & H. Jo from natural hybrid of P. palibiniana and P. okamotoi is described from Mt. Segeol. It has numerous aerial stems, a chasmogamic flower at the stem terminal, 1-2 rows of trichomes on the pedicel, and fertile fruit. Consequently, the genus Pseudostellaria in Korea has been classified into eight species, four hybrids, two varieties, and five forms. An ecological study was conducted to identify the natural environment, as well as to plan conservation strategies for the Korean endemic Pseudostellaria species. Pseudostellaria species were distributed along slopes or on the forest roadside with an altitude range of 324 m to 1621 m (mainly 601 m to 1237 m) and a slope range of 0° to 42° (mainly 6° to 26°). A total of 293 taxa were identified from 64 quadrates of natural populations in the Korean peninsula including Mt. Baekdu. Direct threats were observed to be human activities, competition among plants, and disturbance from fallen leaves. Based on the conservation biology study, the conservation status of Korean endemic Pseudostellaria species were classified according to the IUCN Red List Categories and Criteria-Version 3.1 second edition. The extend of occurrence (EOO) and area of occupancy (AOO) were calculated by distribution maps based on field surveys and specimen information. Only mature individuals were considered in the population size. P. baekdusanensis was classified as Critically Endangered B1ab(ⅲ) + B2ab(ⅲ), C2a(ⅰ), D1. P. okamotoi was classified as Endangered B1ab(ⅲ) + B2ab(ⅲ). P. okamotoi var. longipedicellata was classified as Endangered B2ab(ⅲ). P. palibiniana var. gageodoensis was classified as Critically Endangered B1ab(ⅲ) + B2ab(ⅲ). P. setulosa was evaluated as Endangered B1ab(ⅲ) + B2ab(ⅲ). P. davidii x P. okamotoi var. longipedicellata was classified as Critically Endangered B1ab(ⅲ) + B2ab(ⅲ), C2a(ⅰ), D1. P. heterophylla x P. okamotoi var. longipedicellata was classified as Critically Endangered B1ab(ⅲ) + B2ab(ⅲ), C2a(ⅰ), D1. P. x seoraksanensis was classified as Critically Endangered B1ab(ⅲ) + B2ab(ⅲ), C2a(ⅰ), and D1. P. x segeolsanensis was classified as Critically Endangered B1ab(ⅲ) + B2ab(ⅲ), C2a(ⅰ), D1. 본 연구는 한국에 분포하는 개별꽃속(Pseudostellaria Pax)의 종간 유연관계를 형태학적인 측면에서 재검토하기 위해 수행되었다. 가는잎개별꽃 Pseudostellaria sylvatica (Maxim.) Pax은 잎이 침형 또는 선상피침형이며, 꽃잎은 5장으로 깊은 요두라는 점에서 다른 분류군과 뚜렷하게 구별된다. 긴개별꽃 P. japonica (Korshinsky) Pax은 잎 표면과 엽연, 잎 이면 중륵에 털이 있고, 꽃잎이 5장이고 얕은 요두라는 점에서 다른 분류군과 구별된다. 애기개별꽃 P. baekdusanensis M. Kim은 백두산에서 채집되어 신종 기재된 이후 대암산 용늪에서도 생육이 확인되었다. 두 지역 개체는 폐쇄화 유무에서 특징을 달리하나, 식물체의 크기가 작고, 잎 기부에만 털이 있으며, 꽃잎은 5장이고 깊은 요두라는 점에서 공통된 특징을 보인다. 덩굴개별꽃 P. davidii (Franchet) Pax, 보현개별꽃 P. davidii (Franch.) Pax x P. okamotoi var. longipedicellata (S. Lee, K.I. Heo & S.C. Kim) H. Jo과 설악개별꽃 P. x seoraksanensis M. Kim & H. Jo은 꽃받침 가장자리와 중륵에 털이 있고, 꽃잎은 5장이며, 개화기 이후 줄기가 덩굴성으로 되는 특징을 공유한다. 덩굴개별꽃은 종자 결실되나, 두 교잡종은 종자 결실되지 않는다. 보현개별꽃은 화경이 길고, 설악개별꽃은 화경의 길이가 짧아 구별된다. 덩이뿌리개별꽃 P. bulbosa (Nakai) Nakai은 덩굴개별꽃 괴경의 변이로 보아 덩굴개별꽃의 이명으로 처리하는 견해를 따랐다. 지리산개별꽃 P. okamotoi Ohwi은 지리산과 덕유산, 가야산, 백운산에서 자생이 확인되었다. 꽃잎은 5장이고 화경에 1~2줄의 털이 있으며, 결실기에 화경이 길어져 줄기 기부까지 굽는다는 점이 특징이다. 태백개별꽃 P. okamotoi var. longipedicellata (S. Lee, K.I. Heo & S.C. Kim) H. Jo은 결실기 화경의 길이와 줄기 기부까지 굽는 특징, 폐쇄 화경의 길이가 길다는 점에서 지리산개별꽃과 유사하나 괴경이 가는 방추형이고, 화경에 털이 없고, 꽃잎이 5~9장이라는 점에서 구별된다. 대관령개별꽃은 잎 표면과 엽연, 잎 이면 맥에 털이 있어 품종(P. okamotoi var. longipedicellata for. daegwallyeongensis H. Jo)으로 기재하였다. 팔공산개별꽃 P. okamotoi var. longipedicellata for. palgongmolongiana H. Jo은 태백개별꽃과 유사하나, 암술대와 수술대가 짧고, 암술대가 나선형으로 꼬여 있어 품종으로 기재하였다. 큰개별꽃 P. palibiniana (Takeda) Ohwi은 태백개별꽃과 유사하나 결실기 화경 길이와 형태, 폐쇄 화경 길이에서 차이를 보인다. 영선큰개별꽃은 잎 표면과 엽연, 잎 이면 맥에 털이 있어 품종(P. palibiniana for. hallasanensis H. Jo)으로 기재하였다. 산개별꽃 P. monantha Ohwi과 참개별꽃 P. coreana (Nakai) Ohwi은 큰개별꽃과 외형이 같아 이명 처리하는 견해를 따랐다. 가거개별꽃 P. palibiniana var. gageodoensis M. Kim & H. Jo은 꽃의 수와 위치, 꽃잎의 수, 화경의 길이 등에서 큰개별꽃과 유사하나 화경에 1~2줄의 털이 있고, 꽃받침 길이와 너비, 꽃잎의 길이와 너비가 더 크고, 개화기에 줄기 기부에서 가지가 분지되는 특징을 보여 신변종으로 기재하였다. 숲개별꽃 P. setulosa Ohwi은 지하경이 있고, 꽃잎은 6장이고, 엽연과 잎 이면 중륵에 털이 있어 다른 분류군과 구별된다. 개별꽃 P. heterophylla (Miquel) Pax은 화경 전체에 털이 있어 1~2줄 털이 있는 다른 분류군과 구별되며, 꽃잎이 5장이고, 줄기 정단부에서 1~다수의 꽃이 피며, 괴경과 연결된 지상부 개체가 하나라는 점에서 구별된다. 털개별꽃은 개별꽃과 유사하나 잎 표면과 엽연, 잎 이면 맥에 털이 있어 품종(P. heterophylla for. puberula (Ohwi) Mizushima)으로 보는 견해를 따랐다. 비슬개별꽃 P. heterophylla (Miq.) Pax x P. okamotoi var. longipedicellata (S. Lee, K.I. Heo & S.C. Kim) H. Jo은 태백개별꽃과 개별꽃의 중간형으로 괴경과 연결된 지상부 개체가 하나이고 정단부에 꽃이 한송이만 피며, 꽃잎은 요두 또는 결각상이며, 화경에 1줄의 털이 있고, 종자가 결실되지 않는다. 정영개별꽃 P. x segeolsanensis M. Kim & H. Jo은 지리산개별꽃과 큰개별꽃의 중간형으로 괴경과 연결된 지상부 개체가 다수이고, 정단부에 꽃이 한송이 피며, 화경에 털이 1~2줄 있고, 종자 결실된다는 점에서 비슬개별꽃과 구별된다. 따라서 한국산 개별꽃속 식물은 이번 연구를 통해 8종 4교잡종 2변종 5품종으로 정리되었다. 생태학적 연구는 보전 전략 수립을 위한 기초 자료로 활용하기 위해 수행되었다. 개별꽃속 식물이 분포하는 해발고도는 324~1621 m이고, 601~1237 m에서 가장 많이 분포하는 것으로 나타났고, 경사도는 0~42°에서 생육하였으며, 6~26°에서 가장 많이 분포하는 것으로 나타났다. 64개의 야장에서 총 293종의 식물이 관찰되었으며, 산지 경사면과 등산로 주변에 위치하여 인위적인 간섭 우려와 주변 식물과의 경쟁 및 피압, 잘 부식되지 않는 낙엽에 의한 생육환경의 질 저하가 있는 것으로 관찰되었다. 보전생물학적 연구는 IUCN RED LIST에 근거한 종지위평가를 수행하고, 보전 전략 수립을 위한 기초자료로 활용하기 위해 수행되었다. 한국 특산식물을 중심으로 출현범위와 점유면적, 개체군 크기와 감소 및 성숙 개체수를 조사하여 종지위평가를 수행하였으며, 애기개별꽃은 CR B1ab(ⅲ) + B2ab(ⅲ), C2a(ⅰ), D1, 지리산개별꽃은 EN B1ab(ⅲ) + B2ab(ⅲ), 태백개별꽃은 EN B2ab(ⅲ), 가거개별꽃은 CR B1ab(ⅲ) + B2ab(ⅲ), 숲개별꽃은 EN B1ab(ⅲ) + B2ab(ⅲ), 보현개별꽃은 CR B1ab(ⅲ) + B2ab(ⅲ), C2a(ⅰ), D1, 비슬개별꽃은 CR B1ab(ⅲ) + B2ab(ⅲ), C2a(ⅰ), D1, 설악개별꽃은 CR B1ab(ⅲ) + B2ab(ⅲ), C2a(ⅰ), D1, 정영개별꽃은 CR B1ab(ⅲ) + B2ab(ⅲ), C2a(ⅰ), D1으로 평가되었다.

과학계 고등학교, 일반계 고등학교, 일반생물학 교과서 비교 분석

한미혜 성균관대학교 2008 국내석사

오이 형질전환체 제작 및 생물/비생물학적 조건에서 CsLOX 유전자 발현 분석

장현아 忠南大學校 大學院 2014 국내석사

肺結核診斷에서 遺傳子再組合 抗原 및 分子 生物學的診斷의 有用性에 관한 硏究

김승철 檀國大學校 大學院 2002 국내박사

현재의 결핵을 진단하는데 도말 및 배양검사등을 통한 미생물학적 검사법의 제한점을 보완 할 수 있는 신속하고 간편한 결핵진단방법으로 분자생물학적 방법 및 혈청학적인 방법이 연구되어 왔는데, 결핵의 효과적인 퇴치를 위해 결핵환자를 조기에 발견하기 위한 결핵진단 기술의 개발을 목적으로 하였으며, 그 일환으로 결핵균의 항원을 다양한 방법으로 준비하여그 특성을 조사하는 한편, 이들 항원을 이용하여 결핵진단의 가능성을 조사하고자 하였다. Purified protein derivative (PPD), lipoarabinomannan (LAM) 및 diacyltrehalose (DAT) 항원을 준비하여 결핵균 항체 검출 진단 실험으로 세브란스 병원 호흡기 내과에 내원한 환자등을 상대로 enzyme- linked immunosorbent assay (ELISA)를 실시하였다. 결핵환자 124명에 대한 결과는 치료중인 결핵 환자를 포함한 활동성 결핵환자의 70% 정도가 PPD 항원에 대한 항체반응을 보였다. 비활동성 결핵환자의 경우 PPD에 대한 항체양성율이 낮아짐을 보아 치료후에는 항체가가 낮아짐을 알수 있었다. LAM에 대한 항체양성율도 PPD에 대한 항체검사 결과와 크게 다르지 않았다. 도말검사 결과는 15%에서만 양성을 보여 매우 낮은 양성율을 보였으나 반면에 배양검사 결과는 60%가 양성이었다. PPD와 LAM에 대한 항체 검사 양성율은 65%로 배양검사의 민감도와 거의 대등하였다. 배양검사 양성인 객담 24개중 도말검사에서 양성인 경우는 4예 (16.7%)였다. 결핵균 culture filtrate protein (CFP) 항원의 혈청진단 결과에서 활동성 결핵환자 76명 가운데 57명에서 양성 반응을 보여 비교적 높은 민감도를 보였으나 건강대조군 30명중 8명에서 양성기준 흡광도를 초과하여 특이도는 73.3%이었다. 이렇게 특이도가 낮은 이유는 CFP 항원이 정제되지 않아 LAM 항원이나 arabinogalactan등 mycobacteria에 공통항원인 다당류가 일부 포함되어 있기 때문일 것으로 사료되었다. Diacyltrehalose (DAT) 항원의 혈청진단 효과를 알아보기 위하여 159명의 결핵환자를 대상으로 DAT 항원에 대한 항체를 ELISA로 검사하였다. 검사를 마친 159명의 결핵환자중 110명이 IgG 항체 양성에서 69.2 %의 민감도를 나타냈다. DAT 항원에 대한 주요 항체가는 주로 IgG 항체임을 확인하였다. 유전자재조합 단백질 16 kDa, 19 kDa, 32 kDa, 38 kDa 항원을 준비하여 그 중 r38 kDa 항원의 혈청진단 결과에서는 경증결핵환자 25명, 중등증 결핵 환자 36명, 중증결핵환자 14명의 환자군과 tuberculin음성인 건강대조군 90명을 대상으로 했을 때 경증인 경우의 민감도는 69.2%, 중등증은 88.9%, 그리고 중증은 100%였으며, 건강대조군의 r38 kDa 항원에 특이도는 97%를 보였다. 이는 결핵균 항원에 대한 항체가가 질병의 진행과 밀접한 관련이 있음을 보여주는 결과였다. 또한 r38 kDa 항원을 활동성 결핵환자 76명을 대상으로 배양검사 결과와 비교하기 위해 IgG 항체검사를 실시하였는데, 64명(84.2%)에서 양성 반응을 나타내 비교적 높은 민감도를 나타내었다. Tuberculin음성인 75명으로 BCG 접종후 2주, 2개월, 4개월, 1년후에 혈청을 채취 하여 항체가에 변동 여부를 조사한 결과 일반적으로 평균 흡광도의 변동이 미미함을 보였다. 이 결과로 결핵균의 감염이 어느 정도 진행된 경우에만 항체가 형성됨을 암시하고 있었다. r38 kDa 항원과 CFP 항원과의 항체반응 상관관계를 비교하기위해 76명의 활동성 결핵환자 를 대상으로 항체흡광도를 조사한 결과 상관계수�가 0.69로 통계적으로 유의성은 있었으며, 결핵균 감염시 r38 kDa 항원 이외의 다른 항원에 많은 항체가 형성되는 것으로 보였다. 그리고 r16 kDa 항원과 19 kDa 항원의 혈청진단 실험에서 r16 kDa 항원에 대한 항체가 건강대조군에서는 검출되지 않아 특이도는 매우 높았으나 결핵환자 73명중 31명에서만 항체가 검출되어 민감도는 42.5%로 비교적 낮았다. r19 kDa 항원에 대해서도 환자들의 민감도가 낮았고, 12명(16.4%)정도만 높았는데 그 결핵환자들의 r19 kDa 항원에 대한 항체반응정도가 r16 kDa, r32 kDa, 그리고 r38 kDa 항원에 대한 항체반응 보다 높음을 보여주었다. 선별된 항원을 이용하여 입원 후 치료중인 환자를 대상으로 한 활동성 폐결핵 환자군 400명과 비활동성 폐결핵 환자군 100명과 건강대조군 60명을 대상으로 실험하였다. r38 kDa 항원에 대한 폐결핵 환자군의 민감도는 70%로 약간 낮은 결과를 보이고 있으나 특이도는 93.8%로 높은 결과를 보여 주었다. r14 kDa와 r16 kDa 항원에 대한 폐결핵 환자군의 민감도는 42.1%와 43.9%였으며, 양성예측도는 각각 92.3%와 92.6%로 높았으며, 특이도는 95.8%로 상당히 높았다. r19 kDa와 r23 kDa 항원에 대한 폐결핵 환자군의 민감도는 15.8%와 28.1%로 낮았으나 특이도는 91.7%와 89.6%로 높았다. r14 kDa, r16 kDa, r19 kDa와 r23 kDa 항원의 경우는 단독보다는 r38 kDa 항원등과 적절한 혼합를 통해 사용 된다면, 민감도 및 특이도가 보완된다면 결핵진단에 도움이 된다고 보여주었다. 혼합항원을 이용한 혈청학적 진단과 환자 객담을 이용한 PCR 진단과의 비교 실험으로 결핵 진단에 대한 정확성을 살펴보고자 하였다. 대상별 결핵환자는 활동성 폐결핵환자 114명을 대상으로 하였다. 그 대상 중 A군은 입원환자로 도말검사에서 양성 결과가 나온 환자들로 41명이었고, B군은 입원환자로 도말검사에서 균음전화 직후인 환자들(1개월 이내)로 40명이었으며, C군은 입원환자로 도말검사에서 균음전화가 3회이상 결과가 나온 환자들로 33명이었다. 환자접촉군은 80명이었으며, 건강대조군은 61명을 대상으로 하였다. 혈청학적 진단과 객담을 이용한 polymerase chain reaction (PCR) 진단과의 비교 실험에서 환자 군의 남녀 성별 분포는 대상 환자 114명중 남성은 96명, 여성 환자는 18명으로 남자환자 의 비율이 약 5배 많았다. 결핵환자 접촉군의 평균 나이는 약 37세로 결핵 환자군이 평균 8세 정도 많았다. 결핵환자군의 결핵 이환기간은 평균 약 6년(71.8개월) 정도였다. ELISA 결과에서 결핵환자 A 군의 경우 혼합 항원에 대한 민감도가 90.2%였으며, B 군은 혼합 항원에 대한 민감도가 70.0%였고, C 군은 혼합 항원에 대한 민감도가 75.8%였다. 전체적으로 A, B, C 결핵환자군의 평균민감도는 78.9%였다. 건강대조군은 80명 가운데 2명 이 양성반응을 보여 특이도가 97.5%였으며, 환자 접촉군은 61명중 9명이 양성반응을 보여 특이도가 85.2%로 조금 낮았다. Rapid TB 결과에서 결핵환자 A 군은 혼합 항원에 대한 민감도가 90.2%였으며, B 군은 혼합 항원에 대한 민감도가 77.5%였고, C 군의 경우는 혼합 항원에 대한 민감도가 93.9%였다. 전체적으로 A, B, C 결핵환자군의 평균민감도는 86.8% 였다. 건강대조군은 80명 가운데 2명이 양성 반응을 보여 특이도가 97.5% 였으며, 환자 접촉군은 61명중 5명이 양성반응을 보여 특이도 가 91.8%를 보였다. PCR 진단 결과에서 결핵환자 A 군의 경우는 혼합 항원에 대한 민감도가 68.3%였으며, B 군의 경우는 혼합 항원에 대한 민감도가 47.5%였고, C 군은 혼합 항원에 대한 민감도가 군의 경우 63.6%였다. 전체적으로 A, B, C 결핵환자 군의 평균민감도는 59.6%였다. 건강대조군은 80명 가운데 8명이 양성반응을 보여 특이도가 90.0% 였으며, 환자 접촉군은 61명중 10명이 양성반응을 보여 특이도가 83.6%로 조금 낮았다. 결과를 종합해보면, 최근에 결핵으로 진단 받고 균이 배출되는 결핵환자들의 경우 결핵의 효과적인 퇴치를 위해 결핵환자를 조기에 발견하기 위한 결핵진단 기술의 개발을 목적으로 결핵균의 항원을 다양한 방법을 이용하여 준비하고 r38 kDa 항원등에 다른 항원들을 첨가하여 혼합항원으로 제조된 Rapid TB의 민감도 결과가 86.8%, ELISA TB의 민감도 결과는 78.9%로 현재 임상에서 이용되는 도말, 배양 검사에 혈청학적 진단도 이용된다면 결핵 진단 및 치료에 도움을 줄 것으로 보였다. In recent years, Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) infection has re-emerged as a major health problem in the world. So rapid and accurate detection of M. tuberculosis is very important for treatment and respiratory care. Laboratory diagnosis of pulmonary tuberculosis (TB) still relies on detection of M. tuberculosis from sputum specimens from patients clinically compatible with TB. Sputum-smear microscopy for acid-fast bacilli (AFB) and culture of M. tuberculosis have limitations due to low sensitivity, low specificity and long incubation period up to 8 weeks. Recently, therefore, sensitive and specific laboratory diagnostic tests including polymerase chain reaction (PCR) and serological tests have been developed, and some of them are used in clinical mycobacteriology laboratory. During the first stage of the study, several native M. tuberculosis antigens including culture filtrate protein (CFP), lipoarabinomannan (LAM), diacyltrehalose (DAT), and PPD were examined for use in the serodiagnosis of tuberculosis. In overall, the sensitivity of serological test ranged from 60% to 85%, and its specificity from 88% to 93%. In addition, recombinant protein antigens such as r16 kDa, r19 kDa, r23 kDa, and r38 kDa were also evaluated for their sensitivity. The result were similar to those obtained by using the native antigens above and ranged from 16% to 87% in sensitivity and 73% to 100% in specificity. Among the native and recombinant antigens, DAT and r38 kDa antigens look promising for use in the serodiagnosis of tuberculosis. To compare the efficacy of different mycobacterial specific antigen and to assess the applicability of the combination of several different antigens in the diagnosis of tuberculosis, five E.coli derived 14kDa, 16 kDa, 19 kDa, 23 kDa, 38 kDa were evaluated in 400 active pulmonary patient and 100 inactive post-therapy follow up patient and 60 healthy control. The opical densities of ELISA with r14 kDa, 16 kDa, 19 kDa, 23 kDa, 38 kDa were significantly higher in active tuberculosis cases than in healthy controls and those with r16 kDa, 38 kDa were significantly higher in active tuberculosis cases than in inactive post-therapy follow up cases and those of r14 kDa, 16 kDa, 23 kDa, 38 kDa were significantly higher in inactive post-therapy follow up cases than in healthy control. The sensitivity of r14kDa, 16 kDa, 19 kDa, 23 kDa, 38 kDa in active pulmonary patient cases were 95.8%, 95.8%, 91.7%, 89.6%, 93.8%, respectively. The sensitivity and specificity of combination r38 kDa with r16 kDa was 87% and 93.7%. We also attempted to evaluate a available PCR test, ELISA TB and Rapid TB. Serological and Molecular Diagnostic Tests were performed upon 255 individuals, including 114 tuberculosis patients, 80 healthy group, 61 contact group. Respiratory sputa were obtained from 114 TB patients at National Masan Tuberculosis Hospital. They were divided into 3 groups. All sputa were pretreated with 4% NaOH. After centrifugation, they were stained with Ziehl-Neelsen and cultured on 3% Ogawa media. ELISA TB, serological assays based on the immunodominant complex antigen mixture were employed, and the absorbance was read in 450nm. Rapid TB is a rapid in vitro immunoassay for the detection of antibodies to M. tuberculosis in human serum. Using PCR test, 16S rRNA gene sequence was amplified, and the absorbance (450 nm) was read after hybridization with M. tuberculosis complex specific probe. In TB patients A group, sensitivity of ELISA TB, Rapid TB, PCR test, were 90.2 %, 90.2 %, and 68.3 % respectively. In TB patients B group, sensitivity of ELISA TB, Rapid TB, PCR test were 70.0 %, 77.5 %, and 47.5 % respectively. In TB patients C group, sensitivity of ELISA TB, Rapid TB, PCR test were 75.8 %, 93.9 %, and 63.6 % respectively. In healthy group, specificity of ELISA TB, Rapid TB, PCR test were 97.5 %, 97.5 %, and 90.0 %, and respectively. In contact group, specificity of ELISA TB, Rapid TB, PCR test were 85.2%, 91.8%, and 83.6%, and respectively. This study showed that three M. tuberculosis diagnostic methods give diverse and different results during the anti-M. tuberculosis treatment and that ELISA TB, Rapid TB, PCR test are rapid and sensitive methods for detecting TB.

Functional characterization of interactor and suppressor of Arabidopsis thaliana RING Zinc Finger 1 (AtRZF1) in abiotic stress response

민지희 전남대학교 대학원 2019 국내박사

비생물학적 스트레스 반응에서 단백질 유비퀴틴화는 세포 내 다양한 과정을 조절하는 중요한 단백질 번역 후 조절 과정 중의 하나이다. 애기장대 식물체에서 E3 ubiquitin ligase AtRZF1은 가뭄 민감성을 증가시킨다고 보고된 바 있다. 비생물학적 스트레스 반응에서 AtRZF1의 기능을 심도 있게 살펴보기 위해서 yeast two hybrid screen 및 T-DNA tagging mutagenesis를 이용, AtRZF1의 상호결합인자와 억제인자를 분리하였다. Yeast two-hybrid screen 결과, AtRZF1 상호결합인자 AtRZF1-Associtaed Protein 1 (AtRAP1)을 분리할 수 있었으며, AtRAP1은 ubiquitin-associated (UBA) 도메인을 포함하고 있었고, 세포 내 핵에 위치함을 알 수 있었다. AtRAP1 전사 발현은 앱시스산과 비생물학적 스트레스에 의해 유도 증가됨을 알 수 있었고, 유식물체 발달 과정에서 atrap1 RNAi 형질전환 식물체들은 야생형 보다 삼투스트레스에서 덜 민감한 반응을 보였다. 반면에, AtRAP1 과발현 형질전환체들은 삼투스트레스에 대해 과민감 반응으로 나타났으며, 이러한 결과로 인하여 AtRAP1은 수분 결핍 신호 전달경로를 음성적으로 조절함을 알 수 있었다. AtRAP1 과발현 및 atrap1 RNAi 형질전환체들간의 스트레스 혹은 프롤린 대사 관련 유전자들의 전사 발현은 서로 다른 양상으로 나타났으며, 생화학적 연구 결과, AtRAP1은 Ub chain과 결합하였고 동시에 유비퀴틴화 된 AtRZF1 단백질의 양을 증가시킴을 알 수 있었다. 이중 형질전환 식물체로부터 유전학적 연구 결과, E3 ubiquitin ligase AtRZF1은 AtRAP1에 상위유전자임을 알 수 있었다. AtRZF1-AtRAP1 상호결합에 의한 건조 신호전달경로 기작은 유비퀴틴화 따른 프롤린 대사와 건조스트레스 반응을 조절하는 새로운 경로임을 밝혀냈다. 더불어 AtRAP1과 상동단백질인 AtRAP2 단백질의 특성에 대해 실험한 결과, AtRAP2 단백질도 UBA 도메인을 포함하고 있었으며, AtRAP1단백질과 달리 세포질에 위치함을 알 수 있었다. AtRAP2 유전자의 전사 발현은 앱시스산, 삼투, 염해, 및 산화스트레스에 대해 강하게 유도 증가됨을 알 수 있었고, 이러한 스트레스들에 의해 AtRAP2 promoter-GUS 형질전화체의 주근, 잎 및 유관속 조직에서 GUS 발현을 강하게 유도함을 알 수 있었다. AtRAP2 과발현 형질전환체는 삼투스트레스 내성이 감소되었으며, 반면에 atrap2 RNAi 형질전환체는 내성이 증가하였다. 더군다나 atrap1/atrap2 이중 RNAi형질전환체들은 각 유전자의 single RNAi 형질전환체보다 내성이 더 증가함을 알 수 있었다. 이러한 결과들로 보아 AtRAP1과 AtRAP2는 같은 삼투스트레스 반응 경로에서 작용함을 나타낸다. 유비퀴틴 결합 분석 결과, AtRAP2는 소수성 결합을 통해 Ub chain과 결합함을 알 수 있었고, pull down assay를 통해 AtRAP2 단백질 또한 AtRZF1과 결합 함을 알 수 있었다. AtRAP2와 AtRZF1 간의 유전학적 상호관계를 알아보기 위하여, atrzf1 돌연변이체에 AtRAP2 유전자를 과발현 시킨AtRAP2-OX/atrzf1 식물체에 삼투스트레스를 처리한 결과, 유식물체들은 삼투-내성 생리적 표현을 나타내었다. 이러한 결과들은 수분 결핍 스트레스 신호전달에서 E3 ubiquitin ligase AtRZF1은 AtRAP2에 상위유전자임을 알 수 있었고, 이러한 결과들을 토대로, AtRZF1-AtRAP2 경로 기작 또한 유비퀴틴화 따른 삼투스트레스 반응을 조절하는 새로운 경로임을 밝혀냈다. 프롤린 대사 조절은 환경스트레스 반응, 식물 발달 및 생장에 중요하다고 보고되어 있으나, 비생물학적 및 생물학적 스트레스 반응에 대한 프롤린 기작은 자세히 밝혀지지 않았다. atrzf1 돌연변이체를 이용, T-DNA tagging mutagenesis를 통해 atrzf1의 억제인자 proline content alterative 31 (pca31)를 분리하였다. 가뭄스트레스 조건에서 생리적 실험 결과, pca31 돌연변이체는 atrzf1의 가뭄 내성 및 프롤린 축적 표현형을 억제함을 알 수 있었고 genomic DNA TAIL-PCR을 통해 pca31 돌연변이체의 T-DNA 삽입 위치는 At2g22620 유전자 promoter 부분임을 알 수 있었다. At2g22620 유전자는 세포벽 효소인 Rhamnogalacturonan lyase 1 (RGlyase1)을 암호화하며 GFP 단백질을 이용, RGlyase1 단백질은 세포벽에 위치함을 알 수 있었다. 삼투스트레스 조건에서 complementary line들의 표현형 분석 결과, pca31 돌연변이체 표현형과 유사하였으며, 즉 atrzf1 돌연변이체의 At2g22620 유전자 전사 발현의 감소는 atrzf1의 가뭄 내성 표현형을 억제함을 알 수 있었다. RGlyase1 유전자의 전사 발현 양상은 앱시스산, 삼투, 염해, 및 산화스트레스에 대해 유도 증가됨을 알 수 있었으며, 이러한 스트레스들은 RGlyase1 promoter-GUS 형질전화체의 뿌리와 정단분열 조직에서 GUS 발현을 유도함을 알 수 있었다. RGlyase1 과발현 형질전환체는 삼투스트레스 내성이 증가 되였으며, 반면에 rglyase1 RNAi 형질전환체는 내성이 감소하였다. 또한, 효소 활성 실험 결과, RGlyase1 단백질은 rhamnogalacturonan lyase 활성이 있음을 확인할 수 있었다. 세포벽 효소의 하나인 RGlyase1이 생물학적 스트레스에 미치는 영향을 조사하기 위해 Botrytis cinerea (B. cinerea)를 이용, 야생형, atrzf1 및 pca31 식물체에 접종한 결과, pca31 돌연변이체는 병 저항성이 나타난 반면, 야생형 식물체와 atrzf1 돌연변이체는 감수성 병징을 보였다. 이러한 결과들은 비생물학적 및 생물학적 스트레스 반응에서 RGlyase1은 프롤린 대사 및 세포벽 반응 조절을 통한 AtRZF1의 억제인자임을 제시한다. Ubiquitination is one of the most frequently occurring post-translational modification and is essential for regulating diverse cellular processes in plants during abiotic stress response. Mutation in E3 ubiquitin (Ub) ligase Arabidopsis thaliana Ring Zinc Finger 1 (AtRZF1) enhances drought stress tolerance by increasing the proline accumulation in Arabidopsis. To further investigate the function of AtRZF1 in abiotic stress response, I isolated an interactor and a suppressor of AtRZF1 using yeast two hybrid screen and T-DNA tagging mutagenesis, respectively. First, I characterized AtRZF1-Associated Protein 1 (AtRAP1), which contains ubiquitin-associated (UBA) domain and interacts with AtRZF1. The AtRAP1-Green Fluorescent Protein fusion protein (AtRAP1-GFP) was observed exclusively in the nuclei of the root cells in the transgenic seedlings. The expression of AtRAP1 was strongly induced by abscisic acid (ABA) and abiotic stresses compared to the wild-type (WT). The atrap1 RNAi transgenic plants were less sensitive to osmotic stress than WT, whereas the AtRAP1-overexpressing transgenic lines were more hypersensitive during early seedling development, indicating that AtRAP1 negatively regulates water deficit stress signaling. The expression levels of the stress- or proline metabolism-related genes were altered in both AtRAP1-overexpressing and atrap1 RNAi transgenic lines. Biochemical studies revealed that AtRAP1 interacted with Ub chains and increased the amount of ubiquitinated AtRZF1. Moreover, genetic studies showed that the atrzf1 mutation could rescue the osmotic sensitive phenotype of AtRAP1-overexpressing plants, suggesting that the E3 Ub ligase AtRZF1 is epistatic to AtRAP1 in water deficit stress signaling. Taken together, our findings provide a new insight into the AtRZF1-AtRAP1 pathway which controls proline metabolism and drought response in Arabidopsis. Second, AtRAP2, which is highly homologous to AtRAP1 and contains a UBA domain, was characterized. AtRAP2 is localized in the cytosol of the root cells in the transgenic seedlings expressing GFP-fused AtRAP2 (AtRAP2-GFP). Expression level of AtRAP2 was strongly induced by ABA, and osmotic, salt and oxidative stresses. AtRAP2 promoter-β-glucuronidase (GUS) construct revealed substantial gene expression in the primary root, leaves, and leaf vascular system, in which GUS activity was induced by ABA, and osmotic and oxidative stresses. Overexpression of AtRAP2 decreased tolerance to osmotic stress, whereas atrap2 RNAi exhibited insensitive phenotype to osmotic stress. Moreover, the atrap1/atrap2 RNAi double transgenic plants were more insensitive to osmotic stress than each single RNAi plant, indicating that AtRAP1 and AtRAP2 are agonistic. Biochemical studies with ubiquitin binding assay implied that AtRAP2 binds to ubiquitin chains via hydrophobic interaction. Since correlation between AtRAP1 and E3 ubiquitin ligase AtRZF1 was studied, pull down assay was conducted with AtRAP2 and AtRZF1 protein, indicating that AtRAP2 interacted with AtRZF1. Furthermore, genetic studies with AtRAP2 and AtRZF1 were performed, showing that atrzf1 mutation could rescue the osmotic-sensitive phenotype of AtRAP2-overexpressing plants, suggesting that E3 ubiquitin ligase AtRZF1 is epistatic to AtRAP2 in water deficit stress signaling. Taken together, our findings provide a new insight into the AtRZF1-AtRAP2 pathway which controls dehydration stress response in Arabidopsis. Proline metabolism is important for environmental responses, plant development and growth. However, the mechanism of proline in abiotic and biotic stress processes still remain to be elucidated. Using the atrzf1 mutant as a parental line for T-DNA tagging mutagenesis, I identified a suppressor of atrzf1 mutant, designated as proline content alterative 31 (pca31). The pca31 suppressed insensitivity of atrzf1 to water deficit stress during germination and early seedling growth. In addition, proline content in pca31 was lower than that of atrzf1 under drought stress condition. By the Thermal Asymmetric Interlaced (TAIL)-PCR, it was found that T-DNA of pca31 was inserted into the promoter region of At2g22620 gene, which encodes a cell wall enzyme Rhamnogalacturonan lyase 1 (RGlyase1). The complementary lines showed sensitive phenotype similar to pca31 mutant under osmotic stress condition. RGlyase1-GFP is localized in the cell wall of the root cells of the transgenic seedlings. Expression level of RGlyase1 was strongly induced by ABA, and osmotic, salt and oxidative stresses. Additionally, RGlyase1 promoter-β-glucuronidase (GUS) construct revealed substantial gene expression in the root tissues and apical meristem, in which GUS activity was induced by ABA, and osmotic and oxidative stresses. Overexpression of RGlyase1 increased tolerance to osmotic stress, whereas rglyase1 RNAi displayed sensitive phenotype to osmotic stress. Furthermore, enzymatic assay indicated that RGlyase1 has rhamnogalacturonan lyase activity. Under biotic stress condition, pca31 was insusceptible to Botrytis cinerea (B. cinerea) by producing less ROS compared to WT and atrzf1. Taken together, these findings prove that pca31 acts as a suppressor of atrzf1 in the abiotic and biotic stress responses by regulating proline and cell wall metabolisms.

부착규조류를 이용한 남한강의 달천과 복하천의 생물학적 수질평가

김용진 경기대학교 일반대학원 2009 국내석사

The physicochemical environmental factors, DAIpo and TDI were investigated and analyzed statistically to assess the biological water quality at Dal-steam and Bkha-stream of South-Han river in from Jun. 2008 to Mar. 2009 . As the result, both rivers were mostly in good condition having BOD concentrations of below 3㎎·ℓ-1 except for some sites. The values of DAIpo and TDI were ranged from 3.4 to 93.1 and from 28.2 to 99.9 respectively. From the biological water quality assessment, DAIpo and TDI in both rivers showed fair to fairly poor quality of water. The two values showed to be in more polluted conditions than the values of BOD. Also, because the result of DAIpo has wider range of difference, DAIpo appears to be more sensitive to the change in water quality. The main physicochemical factors of two rivers were Chl. a, TN, and TP, having the value of 0.92 in the statistical analysis, showed to have the greatest correlation with TDI and DAIpo. Reexamination of indicators, Nitzschia palea and Diatoma vulgare is suggested due to having low correlation with other indicators from the result of Principle Component Analysis.