Isosorbide와 polyether segment를 포함하는 polyurethane 합성 및 그들의 생체적합성 특성조사

김효진 단국대학교 대학원 2014 국내석사

생체적합성 폴리우레탄은 hexamethylene diisocyanate에 isosorbide와 polytetramethylene glycol의 다양한 비율로 촉매 없이 one-shot방법으로 합성하였다. 폴리우레탄의 성공적인 합성을 확인하기 위해서 Fourier transform-infrared spectroscopies, gel permeation chromatography, 그리고 1H-nuclear magnetic resonance을 측정하였고, 열적 특성을 확인하기 위해서 differential scanning calorimetry, Thermogravimetirc analysis를 측정하였다. phosphate buffer solution (약 pH 7.3)를 통한 분해도 테스트로 4주쯤 되었을 때 4-9%의 분해가 일어난 것을 확인 할 수 있었고, isosorbide의 함량이 많을수록 빠르게 분해가 일어나는 것을 확인하였다. 또한 MC3T3-E1 세포를 이용하여 폴리우레탄 membrane 세포 생존 특성을 확인하였다. 또 다른 폴리우레탄 합성으로 hexamethylene diisocyanate에 diol로써 isosorbide와 서로 다른 분자량의 poly(ethylene glycol) (Mw 200, 600, 1000)을 one-shot 벌크 중합으로 합성하였다. 합성을 확인하기 위해서 Fourier transform-infrared spectroscopies, gel permeation chromatography, 그리고 1H-nuclear magnetic resonance를 측정하였고, 열적 특성을 확인하기 위해서 differential scanning calorimetry, Thermogravimetirc analysis를 측정하였다. 앞서 실험과 같이 생분해성 테스트로 phosphate buffer solution (약 pH 7.3)를 통해 분해도를 확인하였다.

Isosorbide와 polycarbonate diol을 이용한 고탄성 PU 의 합성과 그들의 생체적합성질

오소연 단국대학교 대학원 2013 국내석사

본 연구에서는 체내에서 안정하고 혈액 적합성이 우수한 polyurethane을 제조하였다. 고탄성 폴리우레탄을 합성하기 위하여 soft segment로서 무독성이며 내충격성 및 약산에 강한 polycarbonatediol과 hard segment로서 경직한 구조이며 생분해성 역할을 하는 1,4:3,6-dianhydro-D-sorbitol(isosorbide)을 diol로 사용하고 hexamethylene diisocyanate (HDI)와 중축합하여 다양한 비율의 polyurethane을 합성하였다. polycarbonate diol 분자량 1000과 isosorbide, hexamethylene diisocyanate를 one-step 방법으로 합성하여 PU1, PU2, PU3을 합성하였고, polycarbonate diol 분자량 2000과 isosorbide, hexamethylene diisocyanate diol을 one-step 방법으로 합성하여 PU4, PU5, PU6을 합성하였다. 합성을 확인하기 위해 NMR과 FT-IR을 측정하고 두 성분의 조성에 따라서 GPC에 의한 분자량, DSC 및 TGA 등의 열분석과 인장강도 및 신장율 등의 기계적 분석을 통해 평가하였다. 생분해도는 PBS 용액 내에서 진행하여 물성 변화를 조사하였고 세포독성 분석을 통해 생체재료로서의 특성을 조사하였다. 또한 전기방사 실험을 통하여 나노섬유가 만들어졌는지 확인하기 위해서 SEM으로 측정하였다. Interest in biocompatible polymers has increased greatly over the past decade. Biocompatible urethane have extensive applications in medical field and scaffolds for tissue repair. In the study, biocompatible polyurethane consists of hexamethylene diisocyanate (HDI) and isosorbide as hard segment and polycarbonate diol(Mw 1000, 2000) as soft segment. Polyurethane foams were characterized by NMR, FT-IR, GPC, DSC, TGA, mechanical properties, cytotoxicity test, electro spinning test. NMR and FT-IR confirmed that the urethane linkages were formed between polycarbonate diol and hexamethylene diisocyanate. In mechanical properties, the Young’s modulus and Ultimate tensile stress increased with isosorbide content. Cytotoxicity test was performed to evaluate the suitability as biomaterials.

AREL-1에 의한 Hind limb ischemia 손상의 회복 및 혈관신생 효과

조예진 단국대학교 2013 국내석사

하지동맥 허혈유도 시에 조직이 괴사되는데, 동맥 혈류압 감소와 모세혈관 혈류의 정체로 인하여 혈관내피에 손상을 입히고 결국 국소적인 저산소증과 대사변화를 초래한다. 혈관 내에서 회복을 하기위해 혈관신생, 적혈구 생성, 세포사멸, 세포 분화, 세포생존, glucose 대사, pH 조절작용, 단백질분화 등의 반응이 일어난다. 그중에 혈관 신생은 새로운 혈관이 생성되는 것이며, 기존에 존재 하고 있는 혈관으로부터 새로운 혈관의 생성되는 과정을 포함한 생리학적 과정을 말한다. 혈관 신생에 관여하는 유도 인자에는 EGF(epidermal growth factor) , TGF-α (transforming growth factor α), TGF-β (transforming growth factor β) , TNF-α (tumor necrosis factor α), angiogenin, platelet -derived endothelial cell growth factor , bFGF(basic fibroblast growth factor) , VEGF (vascular endothelial growth factor) 등이 있다. 이러한 혈관 신생에 관여 하는 유도 인자가 증가함에 따라서 혈관 신생이 활성화 된다. 혈관신생의 차이를 앞선 연구에서 만든 형질 전환 생쥐인 AREL-1(Apotosis resistance E3 ubiquitin ligase)와 AREL-1의 도입 모델인 FVB를 통해서 확인하고자 하였다. AREL-1은 Anti-apoptotic한 유전자로 C-terminus에 E3 ubiquitin ligase 활성화가 되는 Hect 도메인을 가지고 있으며 anti-apoptotic한 유전자이다. 이번 연구에서 우리는 세포사멸에 저항성이 있는 AREL-1로 만든 형질전환 생쥐와 일반 생쥐에서 결찰 후 1일 2일 3일 7일 14일 후에 조직을 적출하여 시간에 따른 차이를 염색을 통해서 확인 하고자 하였다. 염색은 혈관 marker중에 CD31, SMA-alpha을 선택하여 발현 양과 시간적 변화를 통해서 두 유전자의 차이를 확인하고자 하였다. 또한 허혈을 유도 후에 혈관신생에 관련된 조절 전사자 중에 HIF-1α, NF-kB를 선택하여 염색을 통해 조절 전사자의 증가에 따른 회복에 관련된 물질이 유도되는 발현 양과 시간의 변화로 차이를 보고자 한다. 그리고 Hif-1α의 발현을 통해서 VEGF의 유도의 증가와 시간에 따른 차이 역시 확인 하였다.

Epigenetic regulation of Glutamate carboxypeptidase II

김종호 단국대학교 대학원 2015 국내석사

유사분열기 특이적 단백질 인산화 효소 polo-like kinase 1의 serine-137 인산화가 세포분열 과정에 미치는 영향 연구

김효주 단국대학교 대학원 2013 국내석사

Polo-like kinase 1 (Plk1) plays various roles in cell division cycle, especially during mitosis. Threonine-210 (Thr-210) of Plk1 is a major phosphorylation site and this residue is conserved in Polo-like kinase family members. Phosphorylation of Thr-210 on Plk1 is essential for its kinase activation. Additionally, phosphorylation of serine-137 (Ser-137), which is surrounded by homologous sequences with Thr-210 is induced during mitotic DNA damage repair response. To discriminate the cellular roles of each phosphorylation of Plk1 during mitosis, we investigate here the phenotypes of cells overexpressing ectopically Plk1 mutant constructs. Ser-137 or Thr-210 was substituted to aspartate, alanine or valine for phosphor-mimic or phosphor-defective, respectively. Cells overexpressed with Plk1-S137D and S137D/T210D is accumulated with 2N DNA contents. When cells overexpressed with Plk1-S137D were observed by confocal microscopy, two centrosomes were slightly separated by successful replication, indicating that overexpression of Plk1-S137D induce cell arrest in early S phase. Additionally when these cells were treated with nocodazole, cells are not accumulated at prometaphase, because of a dominant effect of overexpression of Plk1-S137D. When cells overexpressed Plk1-S137D were treated with mimosine, these cells were accumulated and underwent cell death without restart of cell cycle and cell division during release after late G1 arrest. In summary, phosphorylation of Ser-137 in Plk1 might be involved in a repair process of mitotic DNA damage through re-activation of Plk1 but not in normal mitotic progression in cell cycle. Polo-like kinase 1 (Plk1)은 세포분열주기, 특히 유사분열기 동안 일어나는 다양한 현상에 관여하며 중요한 역할을 수행한다. Plk1의 주요 인산화 자리는 threonine-210이며 이 자리는 다양한 생물종의 Plk1에 모두 보존되어 있다. Threonine-210의 인산화는 Plk1의 활성에 필수과정이다. 본 연구에서는 prometaphase 세포에 doxorubicin을 처리하여 DNA 손상을 유발한 뒤 DNA 손상 회복 과정에서 threonine-210과는 다른 부위인 serine-137의 인산화가 유발됨을 관찰하였다. Plk1-T210과 S137을 각각 aspartate, valine 그리고 aspartate, alanine으로 치환하여 Plk1의 인산화를 모방하거나 불가하도록 다양한 돌연변이 Plk1을 제조하여 세포에 과발현 한 후 세포의 표현형을 분석하였다. Serine-137을 aspartate로 치환한 인산화를 모방한 돌연변이 Plk1 (Plk1-S137D) 및 serine-137과 threonine-210을 동시에 aspartate로 치환한 돌연변이 Plk1 (Plk1-S137D/T210D)을 과발현하였을 경우 거의 대부분의 세포가 2N DNA content를 가진 상태에서 멈추었다. Plk1-S137D를 과발현시킨 세포를 공초점 현미경을 통하여 관찰한 결과 centrosome 복제가 완결되어 분리되어 있음을 발견하였다. 따라서 Plk1-S137D의 과발현이 세포를 초기 S기에 멈추게 했음을 예측하였다. 또한 Plk1-S137D가 과발현 된 세포는 nocodazole을 처리하였을 때에도 prometaphase에서 세포가 축적되지 않고, 과발현 효과가 우선적으로 나타났고, mimosine 처리에 의해 말기 G1기에 축적시킨 후에는 재배양 동안 세포분열이 일어나지 않고 세포사멸이 유발됨을 관찰하였다. 결론적으로, serine-137의 인산화는 정상적인 세포분열기 과정에서 일어나기 보다는 유사분열기에서 발생한 DNA 손상을 회복하는 과정에서 이미 불활성화된 Plk1을 다시 활성화하여 세포 분열을 진행할 수 있도록 하는 것으로 사료된다.

소엽의 베타-아밀로이드 응집 억제 효과

김다정 단국대학교 대학원 2013 국내석사

알츠하이머 병(Alzheimer’s Disease, AD)은 1906년 독일의 정신과 의사인 Alois Alzheimer 박사에 의해 최초로 보고된 질환으로, 이 질환이 치매 환자의 절반 이상을 차지하고 있다. 알츠하이머 병의 발병 원인으로는 Amyloid cascade 가설이 가장 유력한데, 베타 아밀로이드 펩타이드(amyloid-β peptide, Aβ)가 뇌혈관과 신경조직 내에 침착됨으로써 발생하는 질환으로, Aβ가 형성되는 양과 제거 되는 양 간의 만성적 불균형에 의해 초래되는 것이다. oligomer나 fibril은 Aβ monomer의 분자 간 응집에 의해 β-sheet 형태를 갖게 됨으로 형성 하게 된다. Aβ monomer 그 자체로는 독성이 없는 것으로 알려져 있으며, 여러 가지 요인들에 의해 oligomer 형태로 응집됨으로써 세포 독성을 나타내게 된다고 알려져 있다. 반면 Aβ fibril은 Aβ의 신경세포 유발과는 관계가 적다. in vivo실험들 중에 Aβ-derived diffusible ligands(ADDL)이 AD와 관계가 있다는 보고들은 AD유발에 있어 Aβ oligomer의 중요성을 나타낸다. 따라서 AD치료제로 Aβ 응집의 시작 단계부터 억제할 수 있는 물질을 찾는 것에 초점을 두고 있다. 본 연구에서는 Aβ의 응집 억제능을 확인하기 위해 Thioflavin T(Th T) 형광 분석법을 이용하였다. Th T는 Aβ 응집체에 높은 친화력을 갖고 결합한다. Aβ oligomer 및 fibril에 대한 Th T의 결합 방식은 아직 밝혀지지 않았지만, Aβ oligomer 또는 fibril과 Th T가 결합한 물질은 형광 스펙트럼이 장파장 쪽으로 이동되는 특성이 있으나 Aβ monomer에는 결합하지 않는다. 따라서 Th T 형광 세기 변화는 Aβ 응집체의 양 변화에 비례하며, 따라서 본 실험에서는 실험 약물이 Aβ 응집을 어느 정도 억제하는지 Th T 형광법으로 분석 하였다. 423개의 천연물에 대한 Th T 형광 실험법을 통해 꿀풀과에 속하는 1년생 초본식물 차조기(Perilla frutescens var. acuta KUDO.) 잎인 소엽을 선택하게 되었다. 소엽 메탄올 추출물을 용매의 극성에 따라 분획하였으며 각 분획 층의 Aβ 응집 억제 활성을 측정한 결과 소엽 헥산 침전물 층이 가장 좋은 활성을 보였다. 또한 소엽 헥산 침전물 층의 Aβ 응집 억제능은 Native gel을 이용한 Western blot 실험으로 검증하였다. 뿐만 아니라 소엽 헥산 침전물 층에 의한 Aβ 응집 억제가 Aβ 응집체의 신경독성유발에 미치는 영향을 PC12 세포를 이용하여 실험하였다. 그 결과 Aβ 처리에 의한 PC12세포의 세포독성이 소엽 헥산 침전물 층을 처리한 경우에는 침전물 층의 농도 의존적으로 감소하였다. 이는 소엽 헥산 침전물 층에 의한 Aβ 응집 억제가 Aβ의 독성을 줄여 신경 세포의 세포 생존율을 증가시킨 것을 의미한다. 따라서 소엽 헥산 침전물 층은 AD 치료 및 예방약으로 발전할 가능성을 가지고 있다. Alzheimer's disease (AD) was first reported by German psychiatrist, Alois Alzheimer in 1906 and AD accounts for more than half of dementia patients. One of the well-known causes of Alzheimer's disease is the Amyloid Cascade Hypothesis, which is that AD is caused by the deposition of beta-amyloid peptide (amyloid-β peptide, Aβ) in the brain blood vessels and nervous system and by chronic imbalance between Aβ formation and clearance. Aβ fibrils and oligomers is formed by the agregation of Aβ monomer into β-sheet form. Aβ monomer itself is known to be non-toxic, but aggregation of Aβ into oligomers induced by several factors can cause neuronal cytotoxicity. However, Aβ fibrils are less toxic to nerve cells than Aβ oligomers. A spherical oligomers which is called as Aβ-derived diffusible ligands (ADDL), is associated with AD confirmed by in vivo experiments. Therefore, it is important to find substances which can suppress Aβ aggregation from the early stages as AD therapeutics or preventatives. In this study, Thioflavin T(Th T) fluorescence analysis is employed in order to verify the ability of substances to suppress aggregation of Aβ. Th T has a high affinity for Aβ aggregates with β-sheet structure, but it doesn't bind to monomers. How Th T binds to Aβ oligomer or fibril is still not known. The binding of Th T with Aβ oligomer or fibril shifts Th T fluorescence spectrum towards longer wavelength and Th T fluorescence intensity change is proportional to the amount of Aβ aggregates. Therefore in this study, the effect of natural product extracts on Aβ aggregation was determend using Th T fluorescence analysis. Among 423 natural product extracts, Perilla frutescens var. acuta (Lamiaceae) exhibited the strongest inhibitory effects on Aβ aggregation. Methanol extract of P. frutescens was partitioned depending on solvent polarity and allowed 5 fractions. Among them, hexane precipitate showed the best inhibitory effect. The inhibitory effect of hexane precipitate of P. frutescens was confirmed by Western blot analysis using Native gels. In order to verify the effect of Aβ aggregation on neuronal cell viability, Aβ was pre-aggregated in the presence or absence of hexane precipitate of P. frutescens. As the results, Aβ aggregated in the presence of hexane precipitate of P. frutescens significantly increased the viability of PC12 cells compared to the cells treated with Aβ only. This result suggest that inhibition of Aβ aggregation by hexane precipitate of P. frutescens rescued the neuronal cells from Aβ-induced toxicity which is caused by Aβ oligomers. Therefore, P. frutescens has the potential to be developed as the preventatives or therapeutics agasint AD.

다중벽 탄소나노튜브 (MW-CNTs)에 의한 생쥐 대뇌피질 별아교세포의 가바 (GABA)의 분포 및 형태-기능학적 변화

민주옥 단국대학교 대학원 2015 국내석사

다중벽 탄소나노튜브 (Multi-walled carbon nanotubes; MW-CNTs)는 그라핀층이 말리면서 형성된 실린더 형태의 튜브로 신경계에서 광범위하게 사용될 수 있는 잠재적 활용성이 큰 물질이다. 특히 전기전도성이 높아 뉴런의 성장 및 전기적인 성질을 향상시키며 줄기세포를 신경계 세포로 분화하도록 조절가능하다. 최근 논문에서는 뉴런 뿐만 아니라 아교세포 역시 시냅스 전달 조절에 능동적으로 관여하며 아교세포들 중 가장 많은 비율을 차지하는 별아교세포 (astrocyte)는 tripartite synapse를 형성하며 신경활성을 조절할 수 있다고 밝혀졌다. 최근 아교세포를 다양한 나노구조물질 위에 배양하며 효과를 입증하는 연구들이 많이 이루어지고 있다. 그러나 다양한 길이의 MW-CNTs 위에 초대배양한 별아교세포 (astrocyte)의 특성에 관해서는 알려진 바가 없다. 따라서, 본 연구는 MW-CNTs 위에 배양한 astrocyte의 형태, 세포간 상호작용 및 세포 내 가바 (gamma-amino butyric acid; GABA)의 분포에 미치는 효과에 대해 연구하였다. MW-CNT 50 nm로 코팅된 커버슬립 위에 초대배양한 대뇌피질 astrocyte의 형태는 PDL (poly-D-lysine)로 코팅된 커버슬립 위에 배양한 astrocyte와 비교하였을 때, 둥근 형태를 가지며 세포의 프로세스 수 증가에 따른 세포간 상호작용이 증가하는 것을 확인하였다. 또한, MW-CNTs로 코팅된 커버슬립 위에 배양한 astrocyte 내 GABA는 세포의 프로세스 쪽으로 분포하는 것을 확인하였다. GABA의 세포체에서 프로세스 쪽으로의 이동은 PDL 위에 배양한 astrocyte에 비해 GABA 방출이 용이하고 많은 양을 방출할 수 있다. 본 연구는 MW-CNTs가 astrocyte의 형태 및 프로세스 수 증가에 따른 세포간 상호작용을 조절하며 세포내 GABA의 분포를 조절하는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 MW-CNTs는 뇌 세포에 다양한 영향을 미칠 수 있고, 나아가 뇌신경의학 및 연구 분야에서 유망한 물질임을 시사한다. Multi-walled carbon nanotubes (MW-CNTs) have been extensively explored for their possible beneficial use in the nervous system. CNTs have shown to modulate neuronal growth and electrical properties, but its effect that varying length of MW-CNTs on primary astrocyte roles have not been clearly demonstrated yet. We investigate here the effect of MW-CNTs on astrocytic morphology, cell-cell interaction and the distribution of intracellular GABA (gamma-amino butyric acid). Primary cultured cortical astrocytes on MW-CNT-coated glass coverslips grow rounder and make more cell-cell interactions, with many cell processes, compared to astrocytes on poly-D-lysine (PDL) coverslips. In addition, intracellular GABA spreads into the cell processes of astrocytes on MW-CNT coverslips. When this GABA spreads into cell processes from the cell body GABA can be released more easily and in larger quantities compared to astrocytes on PDL coverslips. Our result confirm that MW-CNTs modulate astrocytic morphology, the distribution of astrocytic GABA, cell-cell interactions and the extension of cell processes. CNTs look to be a promising material for use neuroprosthetics such as brain-machine interface technologies.

만성 구금 스트레스 마우스 모델의 선조체에서 FoxO3a의 발현 연구

이연희 단국대학교 2015 국내석사

The expression and roles of FoxO3a was reported previously in brain. However, expression of FoxO3a not been studied in the striatum under stress. We examined expression of FoxO3a in striatum at repeated restraint stress mouse model. We examined the change of stress-related factors; body weight, blood glucose, and plasma corticosterone and performed behavior test through photobeam activity system open field (PAS-OF) in repeated restraint stress-exposured ICR mice. The body weight decreased significantly repeated-restraint stress (RS) group (2 hr/day for four weeks) compared with no stress (NS) group, but blood glucose and plasma corticosterone increased. Mice of RS group had low locomotion and rearing compared with NS group, and they had a depression-like behavior. The dopamine level examined in striatum of RS mice because the striatum distribute mostly the dopaminergic neuron. The striatum in mice of RS group increased dopamine level. We examined mRNA and protein expression of FoxO3a, AMPK, and TH in striatum of repeated restraint stress-exposured mice. RS group was increased expressions of FoxO3a, AMPKα, and TH compared with NS group in both mRNA and protein expression. In addition, the phosphorylation of ERK1/2 and p38 was increased in a striatum of the mice of RS group. In summary, Increase of FoxO3a in striatum of RS mice inducted indirectly expression of TH and increased dopamine level. The study of the molec㎕ar mechanism is needed more, this increase of dopamine level was considered physiological responses for recovery of significantly declineed depressed-like behavior under chronic restraint stress. Further, our finding suggests that the possibility about the correlation between FoxO3a signaling associated gene and the dopamine control system. 뇌에서 FoxO3a는 광범위하게 발현되며 세포사멸과 산화손상과의 연관성은 알려졌지만, 스트레스 조건 하에서 선조체 (striatum)에서 FoxO3a의 발현과 역할은 아직 규명되지 않았다. 본 연구에서는 만성 구금 스트레스 마우스 모델의 선조체에서 FoxO3a의 발현을 알아보고자 한다. 반복된 구금 스트레스 (repeated restraint stress; RS)에 노출된 ICR 생쥐에서 스트레스 조건 하에서 생리적으로 변화가 나타나는 스트레스 인자인 체중, 혈당, 혈장 코르티코스테론의 변화와 photobeam activity system open field (PAS-OF)를 이용하여 자발운동평가를 조사하였다. 체중은 스트레스를 받지 않은 (no stress; NS)군과 비교하여 반복된 구금 스트레스를 받은 (repeated restraint stress; RS, 2 hr/day for four weeks)군에서 현저하게 감소한 반면, 혈당과 혈장 코르티코스테론은 유의하게 증가하였다. RS 군의 3주차에서 잔행한 자발운동평가는 구금을 풀고 24시간 후에 NS 군과 비교하여 현저하게 낮은 움직임을 보이며 우울증 유사 행동을 확인하였다. 선조체는 도파민성 신경이 주로 분포되어 있는 영역으로, 도파민 농도를 분석한 결과, NS 군과 비교하여 RS 군의 선조체에서 도파민 수준은 증가하였다. 더불어, 도파민 합성 효소인 TH (tyrosine hydroxylase)의 mRNA와 단백 발현 또한 증가한 것을 확인하였다. 구금 스트레스를 받은 생쥐의 선조체에서 NS 군과 비교하여 RS 군에서 FoxO3a와 이와 관련된 인자인 AMPKα (AMP-activated protein kinase α)의 mRNA 발현이 증가되었다. 단백 발현에서는 FoxO3a와 AMPKα의 인산화가 증가되었으며 ERK1/2와 p38의 인산화 또한 증가되었다. 요약하면, 만성 구금 스트레스 조건 하에 생쥐의 선조체에서 도파민 농도와 TH의 발현이 증가하였고, FoxO3a 신호전달경로와 관련하여 FoxO3a와 AMPKα의 발현과 인산화, 그리고 ERK1/2와 p38의 인산화 또한 증가하였다. 이는 더 나아가, 좀 더 분자적 기전에 대한 연구가 필요하지만, FoxO3a가 간접적으로 TH의 발현 증가를 유도하여 도파민 농도를 증가시키고, 이러한 증가는 스트레스 상황에서 현저히 저하된 우울증 행동 양상을 회복시키기 위한 생리적 반응으로 연관되어 있을 것이라고 제안한다.

선회생쥐 가쪽위올리브핵에서의 뇌유래 신경성장인자 (BDNF)와 신경아교세포유래 신경영양인자 (GDNF)의 분포에 관한 면역염색학적 연구

김혜진 단국대학교 대학원 2012 국내석사

Brain-derived neurotrophic factor (BDNF), a member of neurotrophin family (Hyman et al., 1991) is abundant in the brain and provides neurotrophic support to neuronal types such as septal cholinergic neurons, mesencephalic dopaminergic neurons, septal cholinergic neurons, striatal GABAergic neurons and cerebellar neurons. Glial-derived neurotrophic factor (GDNF) a glycosylated, disulfide bonded related to members of transforming growth factor-β superfamily is considered a trophic factor for adult midbrain dopaminergic neurons. Taking the changes in neurotrophin alteration after injury in the auditory pathways and the pathological findings of circling mice, the present study was conducted to investigate the possible changes in the BDNF and GDNF immunoreactivity (IR) and histopathological changes in the superior olivary complex (SOC) between adult heterozygous (+/cir) and homozygous (cir/cir) mice. Therefore, present study investigated the BDNF and GDNF distribution in the LSO, MSO, SPN, MNTB region of mice. BDNF immunostaining was observed in the different nuclei of the SOC in the +/cir and cir/cir. Compared with BDNF IR in the MSO, LSO, MNTB, very weak labeling was observed in SPN of both the groups. A significant difference of BDNF IR was observed in the SPN (p<0.005) of cir/cir as compared with +/cir. All the nuclei of SOC displayed GDNF IR with varying density of IR. In +/cir, the LSO displayed highly stained neuropil with GDNF immunopositive neurons detectable through out the nuclei. GDNF IR was observed to be significantly lower in all the three regions of superior olivary complex of the cir/cir than those of +/+. Significant difference was observed in the SPN of cir/cir (p<0.005)as well as the MSO of cir/cir(p<0.001) and MNTB(p<0.05) when compared with +/+. The result of the present study are likely to be relevant to understand the central underlying human deafness. 뇌유래 신경성장인자(BDNF)와 신경아교세포유래 신경영양인자(GDNF)는 신경세포의 주요한 인자로 잘 알려져 있어, 선회생쥐의 이형접합체와 동형접합체의 분포 변화를 면역염색을 통해 형태학적으로 분석하고자 하였다. BDNF는 청각주변부와 청각 뇌줄기핵에도 분포하며, 신경세포 손상 시 재생과 분화에도 관여하는 것이 잘 알려져 있다. 생쥐 달팽이관의 BDNF 감소는 신경자극전달에 의한 청력손실과 관련 있다고 한다. GDNF는 손상된 신경계통의 재생과 신경 보호 효과를 가지며, transforming growth Factor β(TGF-β)의 일부로, 뇌와 척수에 풍부하게 분포하는 것으로도 잘 알려져 있다. 선회생쥐 중 이형접합체 수컷과 동형접합체 암컷에서 얻은 성체로부터 얻은 선회생쥐의 꼬리에서 유전자를 추출하여 PCR로 유전자형을 동정하였고, 뇌는 전처리 후 냉동절편을 만들어 냉동고에 보관했다. 만든 절편은 anti-rabbit-BDNF, anti-rabbit--GDNF 특이항체를 이용하여 면역염색을 시행하였고, 이를 현미경으로 관찰하였다. BDNF의 면역반응성은 이형접합체와 동형접합체 모두에서 중간위올리브핵, 가쪽위올리브핵, 마름섬유체안쪽핵과 위올리브주변핵의 BDNF 면역반응성면역반응성을 비교했을 때, 위올리브주변핵에서 더 약하게 관찰되었다. 동형접합체에서 신경그물에서의 염색반응성이 확연히 감소되었고, 염색된 신경세포의 수도 적게 관찰되었다. 이형접합체의 위올리브주변핵 영역의 신경세포는 대부분 밝게 염색되고, 신경세포체와 수상돌기의 시냅스 부분 주변은 반점으로 염색된 것이 관찰되었다. GDNF의 면역반응성은 이형접합체 가쪽위올리브핵에서 신경그물과 신경세포에서 관찰되었다. 동형접합체 가쪽위올리브핵에서도 신경그물에서 면역반응성이 관찰되었다. 이형접합체의 위올리브주변핵에는 그물모양의 구조물과 둥글고 작은 신경세포에서 면역반응성이 관찰되었는데, 동형접합체에서는 크게 감소하였다. 전체적으로 BDNF와 GDNF가 이형접합체보다 동형접합체의 면역염색성이 감소한 것을 관찰할 수 있어 이들이 청각 기능에 관여함을 알 수 있었다. 이 결과들은 선회생쥐의 뇌줄기 청각핵에서 BDNF와 GDNF의 면역반응성 변화를 나타낸 것으로 인간 귀먹음의 병태생리 파악의 기본 자료로 사용할 수 있을 것이다.

인간 치주인대줄기세포의 백악모세포 분화 과정에서 Galectin-3 단백질의 기능에 관한 연구

최민정 단국대학교 대학원 2023 국내석사

인간의 치아 및 주변 조직에는 자기재생 능력 및 다분화능을 가지는 여러 성체줄기세포가 존재한다. 이 중 하나인 치주인대줄기세포는 치근의 표면에서 얻을 수 있는 줄기세포로 주변 환경이나 분화 자극을 달리함으로써 골아세포 (osteoblasts), 섬유아세포 (fibroblasts), 백악모세포 (cementoblasts) 등으로 분화할 수 있다. 이 중 백악모세포는 치주인대 부착에 필수적인 백악질을 형성하는 전구세포이다. 백악모세포에 대한 연구는 치아조직 재생 분야에서 활발히 진행되고 있다. 백악모세포 분화여부를 확인하기 위해서는 백악모세포 특이적 마커가 필요하지만 현재까지 백악모세포임을 확인하기 위한 특이 마커에 대한 연구 결과는 많지 않은 편이다. 본 연구에서는 치주인대줄기세포를 백악모세포로 분화 시킨 후 분화된 세포를 항원으로 이용하여 미끼 면역법 (decoy immunization)을 진행하였으며, 이를 통해 백악모세포 표면에만 특이적으로 발현하는 인자들을 인식하는 단일클론항체군을 얻었다. 이 중 하나인 CM3 항체는 인간 치주인대줄기세포에서 분화된 백악모세포와 마우스에서 확립된 백악모세포주에서 약 30 kDa의 단백질을 인식하였고, CM3 항체가 인식하는 항원은 치근의 백악질 부위에 축적됨을 확인하였다. 질량분석법 (mass spectrometry)을 통해 CM3 항체가 인식하는 항원이 Galectin-3 (LGALS3) 임을 발견했다. Galectin-3는 β-galactoside 구조를 인식하여 결합하는 동물 렉틴 계열의 단백질로 비렉틴 도메인인 N-말단과 탄수화물 인식 도메인 (CRD, Carbohydrate recognition domain)인 C-말단으로 구성되어 있다. Galectin-3는 비고전적인 분비 경로를 통해 세포 외 공간으로 분비된 후 N-말단끼리의 결합으로 올리고머를 이루고 CRD 영역이 ECM 단백질과 같은 리간드와 상호작용을 하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 galectin-3가 과발현 될 때 백악모세포 마커의 발현량이 증가하며, 발현이 억제 될 때 백악모세포 마커의 발현량이 감소하는 것을 확인하였다. 또한, galectin-3 특이적 저해제인 GB1107을 처리함으로써 백악모세포 분화 및 백악질의 미네랄화가 감소하는 것을 관찰하였다. Co- immunoprecipitation 실험을 통해 galectin-3가 백악모세포 분화와 관련 있는 laminin α2 또는 백악모세포 분화인자인 BMP7과 상호작용함을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 치주인대줄기세포가 BMP7에 의해 백악모세포로 분화될 때 galectin-3가 세포 표면에 축적될 뿐만 아니라 세포-ECM 간 상호작용에서 기능적으로 중요한 백악모세포 특이적 세포 표면 마커 중 하나로써 사용할 수 있을 것으로 기대한다. There are adult stem cells with self-renewal ability and multipotency in pulp and periodontal ligament tissues of human teeth. One of these postnatal stem cells, human periodontal ligament stem cells (hPDLSCs), are obtained from the surface of the tooth root and can differentiate into osteoblasts, ligamento fibroblasts, and cementoblasts according to the surrounding environment or differentiation factors. Cementoblasts are progenitor cells that form cementum, which are essential for adhesion of dentin and periodontal ligament. Research on cementoblasts is being actively conducted in the field of tooth tissue regeneration. In order to confirm the differentiation of cementoblasts, a cementoblasts-specific marker is required, but not much research has been done on the discovery of specific markers that needed to determine whether or not cementoblastic differnetiation is successful or not. For this purpose, we already set up the condition of BMP7-mediated cementoblastic differentiation from hPDLSCs, and then decoy immunization was performed using this cementoblast-like cells as immunogens. One of the novel monoclonal antibodies recognizing cementoblast-specific cell surface molecules, the CM3 antibody, recognized a protein of about 30 kDa in cementoblasts differentiated by BMP7 hPDLSCs and mouse cementoblast cell line. In immunohistochemistry, the antigen recognized by the CM3 antibody was highly accumulated in the cementum of the tooth root. Through mass spectrometry, it was found that the antigenic molecule Galectin-3 (LGALS3). Galectin-3 is an animal lectin family protein that recognizes β-galactoside, and is composed of a non-lectin N-terminal domain and a carbohydrate recognition domain (CRD) of C-terminus. Galectin-3 is secreted into the extracellular space through a non-classical secretion pathway, forms an oligomer by combining N-terminals, and interacts with ligands such as ECM proteins in the CRD region. When galectin-3/CM3 was overexpressed, the expression level of the representative cementoblastic markers increased. Reversely, when galectin-3 was depleted by siRNA, the expression level of cementoblastic markers decreased. In addition, cementoblastic differentiation and mineralization were reduced by treatment with GB1107, a galectin-3 specific inhibitor. Through co-immunoprecipitation experiments, galectin-3 interacted with laminin α2, has been known to be related to cementoblastic differentiation, and BMP7, which is the main cementoblast differentiation factor. These results suggested that when hPDLSCs are differentiated into cementoblasts by BMP7, galectin-3 accumulates on the cell surface of cementoblasts to build up the proper environment for cementoblastic differentiation through cell-ECM and cytokine accumulation.