Isosorbide와 polyether segment를 포함하는 polyurethane 합성 및 그들의 생체적합성 특성조사

김효진 단국대학교 대학원 2014 국내석사

생체적합성 폴리우레탄은 hexamethylene diisocyanate에 isosorbide와 polytetramethylene glycol의 다양한 비율로 촉매 없이 one-shot방법으로 합성하였다. 폴리우레탄의 성공적인 합성을 확인하기 위해서 Fourier transform-infrared spectroscopies, gel permeation chromatography, 그리고 1H-nuclear magnetic resonance을 측정하였고, 열적 특성을 확인하기 위해서 differential scanning calorimetry, Thermogravimetirc analysis를 측정하였다. phosphate buffer solution (약 pH 7.3)를 통한 분해도 테스트로 4주쯤 되었을 때 4-9%의 분해가 일어난 것을 확인 할 수 있었고, isosorbide의 함량이 많을수록 빠르게 분해가 일어나는 것을 확인하였다. 또한 MC3T3-E1 세포를 이용하여 폴리우레탄 membrane 세포 생존 특성을 확인하였다. 또 다른 폴리우레탄 합성으로 hexamethylene diisocyanate에 diol로써 isosorbide와 서로 다른 분자량의 poly(ethylene glycol) (Mw 200, 600, 1000)을 one-shot 벌크 중합으로 합성하였다. 합성을 확인하기 위해서 Fourier transform-infrared spectroscopies, gel permeation chromatography, 그리고 1H-nuclear magnetic resonance를 측정하였고, 열적 특성을 확인하기 위해서 differential scanning calorimetry, Thermogravimetirc analysis를 측정하였다. 앞서 실험과 같이 생분해성 테스트로 phosphate buffer solution (약 pH 7.3)를 통해 분해도를 확인하였다.

TGF-β1 에 의한 치주인대줄기세포의 인대섬유아세포 분화 과정에서 ENPP1 과 ENPP2 단백질의 기능에 관한 연구

주온유 단국대학교 대학원(천) 2024 국내석사

인간 치주인대줄기세포는 자기 재생 및 다분화능을 지닌 성체줄기세포로, 치주인대섬유아세포, 백악모세포, 골모세포로 분화할 수 있다. 그 중 치주인대를 형성하는 치주인대섬유아세포는 치아를 보호하고 지지하며, 손상된 조직의 재생에 중요한 역할을 한다. 이전의 연구에서 저농도의 transforming growth factor-β1 (TGF-β1)의 처리를 통해 인간 치주인대줄기세포에서 치주인대섬유아세포로의 성공적인 분화 조건을 확립하였고, 치주인대섬유아세포에서 특이적으로 발현하는 마커를 발굴하기 위한 연구를 진행하여 왔다. Decoy immunization을 통해 분화된 치주인대섬유아세포에서 특이적으로 발현된 extracellular matrix (ECM) 및 세포 표면 분자에 대한 단일클론항체를 얻었다. 본 연구에서 이들 항체 중 anti-PDL13 항체가 인식하는 항원분자가 ecto-nucleotide pyrophosphate/phosphodiesterase 1 (ENPP1)이라는 것을 밝혔다. ENPP1은 type Ⅱ transmembrane 단백질로, 조직의 석회화를 조절한다. 조직의 immunostaining을 통해 ENPP1이 치주인대 부분에 축적되고 분화된 치주인대섬유아세포의 표면에 위치하는 것을 확인하였다. ENPP2는 ENPP1과 동일한 ENPP family에 속하는 분비 단백질로, ENPP 활성과 더불어 lysophosphatidic acid (LPA)를 생성하는데 관여하는 효소로 알려져 있다. TGF-β1을 처리하여 분화 유도한 치주인대섬유아세포에서 ENPP1의 발현은 크게 증가하였고, ENPP2의 발현은 감소하였다. ENPP1의 과발현 및 반응 산물인 pyrophosphate (PPi)를 처리한 세포에서 치주인대섬유아세포로의 분화가 유도되었다. 반면에 ENPP2의 과발현 세포에서는 인대 분화가 억제되었다. 또한 siRNA를 이용한 ENPP1의 발현 억제 및 anti-PDL13 항체를 이용한 antibody blocking 실험에서 ENPP1의 기능이 차단된 경우, 치주인대섬유아세포로의 분화가 억제되었다. ENPP1과 ENPP2의 발현을 억제한 세포에서는 cell proliferation이 감소하였다. 따라서 ENPP1은 치주인대줄기세포의 치주인대섬유아세포 분화를 유도하는 인자이며, ENPP2는 이 과정에서 반대 효과를 주는 것으로 밝혀졌다. ENPP1은 효소 산물인 PPi를 축적하며 치주인대줄기세포의 다른 분화경로인 백악모/골모세포 분화와 석회화 과정을 직접적으로 억제하였다. 다만 ENPP1에 의해 억제된 석회화 과정은 ENPP2의 발현에 따라 활성화되지는 않았다. 결론적으로, ENPP1은 인간 치주인대줄기세포의 TGF-β1에 의한 치주인대섬유아세포 분화에 필수적이며, ENPP2는 ENPP1의 반대 역할을 수행한다. 다만, ENPP1이 석회화 과정을 억제하는 반면, ENPP2는 경조직세포 분화를 유도하지만 석회화 과정을 직접적으로 촉진하지는 않는 것으로 보인다. Human periodontal ligament stem cells (hPDLSCs) are adult stem cells with self-renewal and multipotent. hPDLSCs can be differentiated into PDL fibroblasts, cementoblasts, and osteoblasts. PDL fibroblasts, which form the periodontal ligament, contribute significantly to the regeneration of damaged tissues. In a previous study, monoclonal antibodies against extracellular matrix (ECM) and cell surface molecules were developed from induce PDL fibroblasts through decoy immunization. Among these monoclonal antibodies, the anti-PDL13 antibody specifically recognized ecto-nucleotide pyrophosphate/phosphodiesterase 1 (ENPP1). ENPP1 is a type Ⅱ transmembrane protein that regulates mineralization in tissues. ENPP1 was accumulated in the periodontal ligament region and localized on the surface of PDL fibroblasts. ENPP2 also belongs to the ENPP family and is a secretory protein that forms lysophosphatidic acid (LPA). In TGF-β1-induced PDL fibroblasts, the expression of ENPP1 was significantly increased, while the expression of ENPP2 was decreased. Overexpression of ENPP1 and PPi treatment induced TGF-β1-induced fibroblastic differentiation. On the contrary, overexpression of ENPP2 inhibited periodontal ligament fibroblastic differentiation. ENPP1 depletion by siRNA and antibody blocking with anti-PDL13 antibodies inhibited TGF-β1-induced fibroblastic differentiation. Depletion of both ENPP1 and ENPP2 decreased cell proliferation. Thus, ENPP1 is a factor of periodontal ligament fibroblastic differentiation of hPDLSCs and ENPP2 is a negative factor of this process. ENPP1 accumulated pyrophosphate (PPi) and directly inhibited osteo/cementoblastic differentiation of hPDLSCs and mineralization. Inhibited mineralization through ENPP1 were not activated by ENPP2 expression. In conclusion, ENPP1 is essential for TGF-β1-induced PDL fibroblasts, ENPP2 is inhibitors of ENPP1.

Isosorbide와 polycarbonate diol을 이용한 고탄성 PU 의 합성과 그들의 생체적합성질

오소연 단국대학교 대학원 2013 국내석사

본 연구에서는 체내에서 안정하고 혈액 적합성이 우수한 polyurethane을 제조하였다. 고탄성 폴리우레탄을 합성하기 위하여 soft segment로서 무독성이며 내충격성 및 약산에 강한 polycarbonatediol과 hard segment로서 경직한 구조이며 생분해성 역할을 하는 1,4:3,6-dianhydro-D-sorbitol(isosorbide)을 diol로 사용하고 hexamethylene diisocyanate (HDI)와 중축합하여 다양한 비율의 polyurethane을 합성하였다. polycarbonate diol 분자량 1000과 isosorbide, hexamethylene diisocyanate를 one-step 방법으로 합성하여 PU1, PU2, PU3을 합성하였고, polycarbonate diol 분자량 2000과 isosorbide, hexamethylene diisocyanate diol을 one-step 방법으로 합성하여 PU4, PU5, PU6을 합성하였다. 합성을 확인하기 위해 NMR과 FT-IR을 측정하고 두 성분의 조성에 따라서 GPC에 의한 분자량, DSC 및 TGA 등의 열분석과 인장강도 및 신장율 등의 기계적 분석을 통해 평가하였다. 생분해도는 PBS 용액 내에서 진행하여 물성 변화를 조사하였고 세포독성 분석을 통해 생체재료로서의 특성을 조사하였다. 또한 전기방사 실험을 통하여 나노섬유가 만들어졌는지 확인하기 위해서 SEM으로 측정하였다. Interest in biocompatible polymers has increased greatly over the past decade. Biocompatible urethane have extensive applications in medical field and scaffolds for tissue repair. In the study, biocompatible polyurethane consists of hexamethylene diisocyanate (HDI) and isosorbide as hard segment and polycarbonate diol(Mw 1000, 2000) as soft segment. Polyurethane foams were characterized by NMR, FT-IR, GPC, DSC, TGA, mechanical properties, cytotoxicity test, electro spinning test. NMR and FT-IR confirmed that the urethane linkages were formed between polycarbonate diol and hexamethylene diisocyanate. In mechanical properties, the Young’s modulus and Ultimate tensile stress increased with isosorbide content. Cytotoxicity test was performed to evaluate the suitability as biomaterials.

AREL-1에 의한 Hind limb ischemia 손상의 회복 및 혈관신생 효과

조예진 단국대학교 2013 국내석사

하지동맥 허혈유도 시에 조직이 괴사되는데, 동맥 혈류압 감소와 모세혈관 혈류의 정체로 인하여 혈관내피에 손상을 입히고 결국 국소적인 저산소증과 대사변화를 초래한다. 혈관 내에서 회복을 하기위해 혈관신생, 적혈구 생성, 세포사멸, 세포 분화, 세포생존, glucose 대사, pH 조절작용, 단백질분화 등의 반응이 일어난다. 그중에 혈관 신생은 새로운 혈관이 생성되는 것이며, 기존에 존재 하고 있는 혈관으로부터 새로운 혈관의 생성되는 과정을 포함한 생리학적 과정을 말한다. 혈관 신생에 관여하는 유도 인자에는 EGF(epidermal growth factor) , TGF-α (transforming growth factor α), TGF-β (transforming growth factor β) , TNF-α (tumor necrosis factor α), angiogenin, platelet -derived endothelial cell growth factor , bFGF(basic fibroblast growth factor) , VEGF (vascular endothelial growth factor) 등이 있다. 이러한 혈관 신생에 관여 하는 유도 인자가 증가함에 따라서 혈관 신생이 활성화 된다. 혈관신생의 차이를 앞선 연구에서 만든 형질 전환 생쥐인 AREL-1(Apotosis resistance E3 ubiquitin ligase)와 AREL-1의 도입 모델인 FVB를 통해서 확인하고자 하였다. AREL-1은 Anti-apoptotic한 유전자로 C-terminus에 E3 ubiquitin ligase 활성화가 되는 Hect 도메인을 가지고 있으며 anti-apoptotic한 유전자이다. 이번 연구에서 우리는 세포사멸에 저항성이 있는 AREL-1로 만든 형질전환 생쥐와 일반 생쥐에서 결찰 후 1일 2일 3일 7일 14일 후에 조직을 적출하여 시간에 따른 차이를 염색을 통해서 확인 하고자 하였다. 염색은 혈관 marker중에 CD31, SMA-alpha을 선택하여 발현 양과 시간적 변화를 통해서 두 유전자의 차이를 확인하고자 하였다. 또한 허혈을 유도 후에 혈관신생에 관련된 조절 전사자 중에 HIF-1α, NF-kB를 선택하여 염색을 통해 조절 전사자의 증가에 따른 회복에 관련된 물질이 유도되는 발현 양과 시간의 변화로 차이를 보고자 한다. 그리고 Hif-1α의 발현을 통해서 VEGF의 유도의 증가와 시간에 따른 차이 역시 확인 하였다.

Studies on the Gemcitabine Resistance of Pancreatic Cancer

김연정 단국대학교 대학원 2012 국내석사

Resistance to gemcitabine is a major obstacle in the treatment of advanced pancreatic cancer. Although efforts to overcome gemcitabine resistance have been underway, the outcomes have not been satisfactory. To enhance therapeutic efficacy, understanding of biochemical mechanisms of gemcitabine resistance is prerequisite. Gemcitabine resistant cells may alter the dependency on several key kinases to facilitate cell proliferation and survival. Thus, searching the bypass of biochemical pathways in gemcitabine resistant cells may be achieved by the comparison of sensitivities on protein kinase inhibitors (PKIs) between parental and gemcitabine resistant cells. Comparison of cell viability of parental and gemcitabine resistant cell on 84 PKIs revealed that 16 PKIs exhibited high scores (EC50 ratio >1.4) and 18 PKIs showed low scores (EC50 ratio <0.6). These results suggest that PI3K/AKT/mTOR, DNAPK, and AMPK pathway might be potential target for the enhancement of gemcitabine treatment. According to previous finding that blocking transforming growth factor-β (TGFß) signal enhances the efficacy of gemcitabine in pancreatic cancer cells, the combinational effects of TGFß receptor I (TßRI) inhibitors, SB431542 and SB525334 with gemcitabine were determined. Combination with TβRI inhibitors significantly augmented the cytotoxicity of gemcitabine in both parental and gemcitabine resistant pancreatic cancer cells. SB525334 significantly increased apoptotic cell death in gemcitabine-resistant cells. Treatment of SB525334 also reduced AKT signal pathway, which plays crucial role in gemcitabine resistance. Migration assay also revealed that blocking TβRI reduces cell migration. Therefore, chemotherapeutic approaches using SB525334 might also enhance the treatment benefit of the gemcitabine-containing regimens in the treatment of pancreatic cancer patients.

Anti-apoptotic role of cenexin1

김정순 단국대학교 대학원 2011 국내석사

Apoptosis는 불필요한 세포나 노화된 세포, 각종 상해를 받은 세포에서 enzyme의 순차적인 활성에 의한 자살프로그램에 의해 조절되는 세포사멸의 경로이다. Apoptosis에 의한 죽음은 세포 숫자와 조직의 크기를 유지하며 세포내의 항상성을 위협하는 자극으로부터 보호하도록 하는 세포의 정상적인 현상이다. p53은 일종의 전사인자로 세포분열의 제어나 apoptosis등을 포함한 세포의 다양한 반응을 유도한다. p53은 암세포에서 과발현 시켰을 경우 apoptosis를 유발한다. p53을 과발현 시키는 아데노바이러스로부터 살아남은 clone으로부터 Cenexin1 의 C-terminal fragment를 얻었다. 얻어진 C-terminal fragment와 cenexin1 의 full length는 p53에 의한 extrinsic death signal 과 intrinsic death signal을 통한 apopotosis에서 저항성을 갖는다. siRNA에 의한 Cenexin1의 knock down은 TNF-a에 의해서 유도되는 caspase-8와 PARP의 활성을 늦췄다. extrinsic pathway에서 ligands(FasL, TNFα, etc.)나 receptor recognizing antibodies에 의한 death receptors (Fas, TNF receptor etc.)의 binding은 adaptor molecules (FADD, TNF receptor 1-associated death domain protein (TRADD), etc.)의 보충을 유도한다. TNF에 의한 apoptosis는 TNF Receptor Associated Death Domain Protein (TRADD) protein, Fas-associated death domain protein (FADD)과 pro-caspase-8으로 구성된 DISC를 형성하여 apoptosis의 활성에 관여한다. Cenexin1은 FADD과 co-localization됨을 확인했고 TNF receptor complex와의 localization의 가능성을 제시했다. 이 논문에서 우리는 cenexin1의 anti-apoptotic으로서의 기능과 TNF receptor complex와의 localize의 가능성, caspase-8 cleavage의 억제를 연구했다. 게다가 cenexin1은 새로운 anti-apoptotic protein family 의 구성원일 수도 있음을 나타냈다. Apoptosis is a pathway of cell death that is controlled by tightly regulated suicide program in which cells eventually enter to death by sequential activations of enzymes. Death by apoptosis is a normal phenomenon that serves to get rid of cells that are no longer needed and to maintain a steady number of cell populations in tissue. Apoptosis eliminates cells that are injured beyond repair without inducing a host inflammatory response, thus protecting surrounding tissue from damage. From functional cloning of gene that provides viabilities under the adenovirus mediated overexpression of p53, C-terminal fragment of Cenexin1 could be obtained among the survived cell clones. Both the rescued C-terminal fragment and full length of Cenexin1 had given resistance against apoptosis under the extrinsic death signal activation and intrinsic death signal activation by p53. The siRNA mediated knock down accelerated TNF-α mediated cell death and over expression of this gene showed delayed activation of caspase-8 and cleavage of PARP. In the extrinsic pathway, binding of the death receptors (Fas, TNF receptor etc.) by the ligands (FasL, TNFα, etc.) or by the receptor recognizing antibodies leads to the recruitment of adaptor molecules (FADD(Fas-associated death domain protein), TRADD(TNF receptor 1-associated death domain protein) etc.) and an initiator caspase, caspase-8, to the receptor complex forming DISC(death inducing signalling complex). Under the condition of induction of apoptosis by TNF, the DISC is comprised of TRADD, FADD and pro-caspase-8. The Cenexin1 colocalized with FADD, suggesting that it might be one of the factors in TNF receptor complex. In this study we evaluated the antiapoptotic function of Cenexin1 and its possible action mechanism through localization of TNF receptor complex and inhibition of caspase-8 cleavage. In addition to its centrosomal function as centrosomal scaffold protein, Cenexin1 might be a novel member of antiapoptotic protein family.

인간 치주인대줄기세포의 백악모세포 분화 과정에서 Galectin-3 단백질의 기능에 관한 연구

최민정 단국대학교 대학원 2023 국내석사

인간의 치아 및 주변 조직에는 자기재생 능력 및 다분화능을 가지는 여러 성체줄기세포가 존재한다. 이 중 하나인 치주인대줄기세포는 치근의 표면에서 얻을 수 있는 줄기세포로 주변 환경이나 분화 자극을 달리함으로써 골아세포 (osteoblasts), 섬유아세포 (fibroblasts), 백악모세포 (cementoblasts) 등으로 분화할 수 있다. 이 중 백악모세포는 치주인대 부착에 필수적인 백악질을 형성하는 전구세포이다. 백악모세포에 대한 연구는 치아조직 재생 분야에서 활발히 진행되고 있다. 백악모세포 분화여부를 확인하기 위해서는 백악모세포 특이적 마커가 필요하지만 현재까지 백악모세포임을 확인하기 위한 특이 마커에 대한 연구 결과는 많지 않은 편이다. 본 연구에서는 치주인대줄기세포를 백악모세포로 분화 시킨 후 분화된 세포를 항원으로 이용하여 미끼 면역법 (decoy immunization)을 진행하였으며, 이를 통해 백악모세포 표면에만 특이적으로 발현하는 인자들을 인식하는 단일클론항체군을 얻었다. 이 중 하나인 CM3 항체는 인간 치주인대줄기세포에서 분화된 백악모세포와 마우스에서 확립된 백악모세포주에서 약 30 kDa의 단백질을 인식하였고, CM3 항체가 인식하는 항원은 치근의 백악질 부위에 축적됨을 확인하였다. 질량분석법 (mass spectrometry)을 통해 CM3 항체가 인식하는 항원이 Galectin-3 (LGALS3) 임을 발견했다. Galectin-3는 β-galactoside 구조를 인식하여 결합하는 동물 렉틴 계열의 단백질로 비렉틴 도메인인 N-말단과 탄수화물 인식 도메인 (CRD, Carbohydrate recognition domain)인 C-말단으로 구성되어 있다. Galectin-3는 비고전적인 분비 경로를 통해 세포 외 공간으로 분비된 후 N-말단끼리의 결합으로 올리고머를 이루고 CRD 영역이 ECM 단백질과 같은 리간드와 상호작용을 하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 galectin-3가 과발현 될 때 백악모세포 마커의 발현량이 증가하며, 발현이 억제 될 때 백악모세포 마커의 발현량이 감소하는 것을 확인하였다. 또한, galectin-3 특이적 저해제인 GB1107을 처리함으로써 백악모세포 분화 및 백악질의 미네랄화가 감소하는 것을 관찰하였다. Co- immunoprecipitation 실험을 통해 galectin-3가 백악모세포 분화와 관련 있는 laminin α2 또는 백악모세포 분화인자인 BMP7과 상호작용함을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 치주인대줄기세포가 BMP7에 의해 백악모세포로 분화될 때 galectin-3가 세포 표면에 축적될 뿐만 아니라 세포-ECM 간 상호작용에서 기능적으로 중요한 백악모세포 특이적 세포 표면 마커 중 하나로써 사용할 수 있을 것으로 기대한다. There are adult stem cells with self-renewal ability and multipotency in pulp and periodontal ligament tissues of human teeth. One of these postnatal stem cells, human periodontal ligament stem cells (hPDLSCs), are obtained from the surface of the tooth root and can differentiate into osteoblasts, ligamento fibroblasts, and cementoblasts according to the surrounding environment or differentiation factors. Cementoblasts are progenitor cells that form cementum, which are essential for adhesion of dentin and periodontal ligament. Research on cementoblasts is being actively conducted in the field of tooth tissue regeneration. In order to confirm the differentiation of cementoblasts, a cementoblasts-specific marker is required, but not much research has been done on the discovery of specific markers that needed to determine whether or not cementoblastic differnetiation is successful or not. For this purpose, we already set up the condition of BMP7-mediated cementoblastic differentiation from hPDLSCs, and then decoy immunization was performed using this cementoblast-like cells as immunogens. One of the novel monoclonal antibodies recognizing cementoblast-specific cell surface molecules, the CM3 antibody, recognized a protein of about 30 kDa in cementoblasts differentiated by BMP7 hPDLSCs and mouse cementoblast cell line. In immunohistochemistry, the antigen recognized by the CM3 antibody was highly accumulated in the cementum of the tooth root. Through mass spectrometry, it was found that the antigenic molecule Galectin-3 (LGALS3). Galectin-3 is an animal lectin family protein that recognizes β-galactoside, and is composed of a non-lectin N-terminal domain and a carbohydrate recognition domain (CRD) of C-terminus. Galectin-3 is secreted into the extracellular space through a non-classical secretion pathway, forms an oligomer by combining N-terminals, and interacts with ligands such as ECM proteins in the CRD region. When galectin-3/CM3 was overexpressed, the expression level of the representative cementoblastic markers increased. Reversely, when galectin-3 was depleted by siRNA, the expression level of cementoblastic markers decreased. In addition, cementoblastic differentiation and mineralization were reduced by treatment with GB1107, a galectin-3 specific inhibitor. Through co-immunoprecipitation experiments, galectin-3 interacted with laminin α2, has been known to be related to cementoblastic differentiation, and BMP7, which is the main cementoblast differentiation factor. These results suggested that when hPDLSCs are differentiated into cementoblasts by BMP7, galectin-3 accumulates on the cell surface of cementoblasts to build up the proper environment for cementoblastic differentiation through cell-ECM and cytokine accumulation.

유방암 세포에서 EGFR kinase 억제제와 PI3K/AKT 경로의 상호작용

홍우영 단국대학교 대학원 2013 국내석사

다중벽 탄소나노튜브 (MW-CNTs)에 의한 생쥐 대뇌피질 별아교세포의 가바 (GABA)의 분포 및 형태-기능학적 변화

민주옥 단국대학교 대학원 2015 국내석사

다중벽 탄소나노튜브 (Multi-walled carbon nanotubes; MW-CNTs)는 그라핀층이 말리면서 형성된 실린더 형태의 튜브로 신경계에서 광범위하게 사용될 수 있는 잠재적 활용성이 큰 물질이다. 특히 전기전도성이 높아 뉴런의 성장 및 전기적인 성질을 향상시키며 줄기세포를 신경계 세포로 분화하도록 조절가능하다. 최근 논문에서는 뉴런 뿐만 아니라 아교세포 역시 시냅스 전달 조절에 능동적으로 관여하며 아교세포들 중 가장 많은 비율을 차지하는 별아교세포 (astrocyte)는 tripartite synapse를 형성하며 신경활성을 조절할 수 있다고 밝혀졌다. 최근 아교세포를 다양한 나노구조물질 위에 배양하며 효과를 입증하는 연구들이 많이 이루어지고 있다. 그러나 다양한 길이의 MW-CNTs 위에 초대배양한 별아교세포 (astrocyte)의 특성에 관해서는 알려진 바가 없다. 따라서, 본 연구는 MW-CNTs 위에 배양한 astrocyte의 형태, 세포간 상호작용 및 세포 내 가바 (gamma-amino butyric acid; GABA)의 분포에 미치는 효과에 대해 연구하였다. MW-CNT 50 nm로 코팅된 커버슬립 위에 초대배양한 대뇌피질 astrocyte의 형태는 PDL (poly-D-lysine)로 코팅된 커버슬립 위에 배양한 astrocyte와 비교하였을 때, 둥근 형태를 가지며 세포의 프로세스 수 증가에 따른 세포간 상호작용이 증가하는 것을 확인하였다. 또한, MW-CNTs로 코팅된 커버슬립 위에 배양한 astrocyte 내 GABA는 세포의 프로세스 쪽으로 분포하는 것을 확인하였다. GABA의 세포체에서 프로세스 쪽으로의 이동은 PDL 위에 배양한 astrocyte에 비해 GABA 방출이 용이하고 많은 양을 방출할 수 있다. 본 연구는 MW-CNTs가 astrocyte의 형태 및 프로세스 수 증가에 따른 세포간 상호작용을 조절하며 세포내 GABA의 분포를 조절하는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 MW-CNTs는 뇌 세포에 다양한 영향을 미칠 수 있고, 나아가 뇌신경의학 및 연구 분야에서 유망한 물질임을 시사한다. Multi-walled carbon nanotubes (MW-CNTs) have been extensively explored for their possible beneficial use in the nervous system. CNTs have shown to modulate neuronal growth and electrical properties, but its effect that varying length of MW-CNTs on primary astrocyte roles have not been clearly demonstrated yet. We investigate here the effect of MW-CNTs on astrocytic morphology, cell-cell interaction and the distribution of intracellular GABA (gamma-amino butyric acid). Primary cultured cortical astrocytes on MW-CNT-coated glass coverslips grow rounder and make more cell-cell interactions, with many cell processes, compared to astrocytes on poly-D-lysine (PDL) coverslips. In addition, intracellular GABA spreads into the cell processes of astrocytes on MW-CNT coverslips. When this GABA spreads into cell processes from the cell body GABA can be released more easily and in larger quantities compared to astrocytes on PDL coverslips. Our result confirm that MW-CNTs modulate astrocytic morphology, the distribution of astrocytic GABA, cell-cell interactions and the extension of cell processes. CNTs look to be a promising material for use neuroprosthetics such as brain-machine interface technologies.

유사분열기 특이적 단백질 인산화 효소 polo-like kinase 1의 serine-137 인산화가 세포분열 과정에 미치는 영향 연구

김효주 단국대학교 대학원 2013 국내석사

Polo-like kinase 1 (Plk1) plays various roles in cell division cycle, especially during mitosis. Threonine-210 (Thr-210) of Plk1 is a major phosphorylation site and this residue is conserved in Polo-like kinase family members. Phosphorylation of Thr-210 on Plk1 is essential for its kinase activation. Additionally, phosphorylation of serine-137 (Ser-137), which is surrounded by homologous sequences with Thr-210 is induced during mitotic DNA damage repair response. To discriminate the cellular roles of each phosphorylation of Plk1 during mitosis, we investigate here the phenotypes of cells overexpressing ectopically Plk1 mutant constructs. Ser-137 or Thr-210 was substituted to aspartate, alanine or valine for phosphor-mimic or phosphor-defective, respectively. Cells overexpressed with Plk1-S137D and S137D/T210D is accumulated with 2N DNA contents. When cells overexpressed with Plk1-S137D were observed by confocal microscopy, two centrosomes were slightly separated by successful replication, indicating that overexpression of Plk1-S137D induce cell arrest in early S phase. Additionally when these cells were treated with nocodazole, cells are not accumulated at prometaphase, because of a dominant effect of overexpression of Plk1-S137D. When cells overexpressed Plk1-S137D were treated with mimosine, these cells were accumulated and underwent cell death without restart of cell cycle and cell division during release after late G1 arrest. In summary, phosphorylation of Ser-137 in Plk1 might be involved in a repair process of mitotic DNA damage through re-activation of Plk1 but not in normal mitotic progression in cell cycle. Polo-like kinase 1 (Plk1)은 세포분열주기, 특히 유사분열기 동안 일어나는 다양한 현상에 관여하며 중요한 역할을 수행한다. Plk1의 주요 인산화 자리는 threonine-210이며 이 자리는 다양한 생물종의 Plk1에 모두 보존되어 있다. Threonine-210의 인산화는 Plk1의 활성에 필수과정이다. 본 연구에서는 prometaphase 세포에 doxorubicin을 처리하여 DNA 손상을 유발한 뒤 DNA 손상 회복 과정에서 threonine-210과는 다른 부위인 serine-137의 인산화가 유발됨을 관찰하였다. Plk1-T210과 S137을 각각 aspartate, valine 그리고 aspartate, alanine으로 치환하여 Plk1의 인산화를 모방하거나 불가하도록 다양한 돌연변이 Plk1을 제조하여 세포에 과발현 한 후 세포의 표현형을 분석하였다. Serine-137을 aspartate로 치환한 인산화를 모방한 돌연변이 Plk1 (Plk1-S137D) 및 serine-137과 threonine-210을 동시에 aspartate로 치환한 돌연변이 Plk1 (Plk1-S137D/T210D)을 과발현하였을 경우 거의 대부분의 세포가 2N DNA content를 가진 상태에서 멈추었다. Plk1-S137D를 과발현시킨 세포를 공초점 현미경을 통하여 관찰한 결과 centrosome 복제가 완결되어 분리되어 있음을 발견하였다. 따라서 Plk1-S137D의 과발현이 세포를 초기 S기에 멈추게 했음을 예측하였다. 또한 Plk1-S137D가 과발현 된 세포는 nocodazole을 처리하였을 때에도 prometaphase에서 세포가 축적되지 않고, 과발현 효과가 우선적으로 나타났고, mimosine 처리에 의해 말기 G1기에 축적시킨 후에는 재배양 동안 세포분열이 일어나지 않고 세포사멸이 유발됨을 관찰하였다. 결론적으로, serine-137의 인산화는 정상적인 세포분열기 과정에서 일어나기 보다는 유사분열기에서 발생한 DNA 손상을 회복하는 과정에서 이미 불활성화된 Plk1을 다시 활성화하여 세포 분열을 진행할 수 있도록 하는 것으로 사료된다.