토양 metagenomics와 토양효소활성을 통한 윤작지 토양의 미생물 다양성 분석 및 모니터링

김요환 嶺南大學校 2012 국내석사

Soil microorganisms are very important, particularly the diversity of composing species and additionally produced useful microbial enzymes, antibiotics are used in real life such as industry and agriculture. Especially with emerging of eco-friendly agriculture, the importance of soil microbes are stressed because we can expect increase the productivity of crops, also the effect of maintenance and improvement of soil ecosystem. Furthermore, applying crop rotation, one of the cropping system is on the rise as one of the eco-friendly agricultural method. Thus, in this research, we investigated the main microbial community existing in the soil ecosystem after observing soil microbes in the farm applied consortium microbial agent using crop rotation and soil microbe, also confirmed the effect on crops through the analysis of the productivity of crops. Metagenomics used to observe soil microbial community is for observing microbes using DNA activities and information of base sequence, in this research, we analyzed the diversity of first or second year rotational lands which cultivated different crops. After analyzing species richness through Rarefaction curve, we confirmed species richness is more abundant in soil treated by consortium microbial agent than the one treated with agricultural chemical’s, also comparing one year soil planted pepper production with second year soil planted kidney beans, as second year soil has more species richness. This result shows processing consortium microbial agent and crop rotation affect increase’s the diversity of soil microbe’s. In order to the confirm community composition of soil microbial community, we analyzed microbial community in phylum level, class level and species level. As a result, the composition of soil microbe of one year and second year soil microbe were the same, since it contains acidobacteria, proteobacteria, gemmatimonadetes, chloroflexi, planctomycetes, bacteroidets, nitrospirae, actinobacteria and the composition ratio was also not so different. For more detailed observation, we analyzed the composition of soil microbe in class level and found a difference between first year microbe and second year microbe. In class level, Gemmanimonadetes, Soilbacteres, Deltaproteobacteria, Actinobacteria, Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Holophagae, Anaerolineae, Betaproteobacteria, Sphingobacteria, FJ478837 were composed in similar ratio in all treatments in first year microbe, but Planctomycetacia, Phycisphaerae, Nitrospira were added in second year. Also, Bacteroidia, Clostridia, Bacilli which we could not find in other treatments at all were found in agricultural chemical treated treatments. We assume that is change of soil microbial community due to agricultural chemicals. We found that this change was disappeared by cultivation of kidney beans and back to the status as the compositon of the other treatments. Furthurmore, we tried to find out the unique function of dominant species through analysis in species level, and check the effect of it on crops and soil microbe. However, we could not discover the unique function of dominant species because neither there are 10 species of dominant species over 1% nor even though there are dominant species, most of them were unculturable microbes. Comparing pepper planted one year with kidney bean planted second year in culturable bacteria, dominant species showed the difference. There is little or no difference between phylum and class of one, and second year soil, so the change of soil microbial community by external stimulus is very slight, especially in soil treated by consortium microbial agent maintains soil microbial ecosystem and increase useful species, species richness overall. In the analysis of soil enzyme activities conducted to support the above result’s which are by the metagenomics analysis, the soil treated by consortium microbial agent showed higher enzyme activities than other treatments with the figures dehydrogenase 3.5584 ㎍ TPF g-1h-1, urease 15.8689 ㎍ NH4-N g-1h-1, phosphatase 0.5692 ㎍ PNP g-1h-1, β-glucosidase 2.4785 ㎍ PNP g-1h-1, cellulase 86.1597 ㎍ glucose g-1h-1. And with the comparative analysis to observe the difference between first year and second year of soil enzyme activities, we found out the increase of 149% in dehydrogenase, 12% in urease, 158% in phosphatase, 41% in β-glucosidase and 10% in cellulase. This result is coincide with the metagenomics analysis which showed the effect on increasing diversity of microbes in rotational lands treated by consortium microbial agent. We measured growth promotion and yield of pepper and kidney beans to confirm that consortium microbial agent is also effective on crops with soil microbial community. In case of planting pepper, in growth promotion, we confirmed the growth promotion of consortium microbial agent because it showed growth promotion maximum of 6.1% in main stem, and 8.1% in stem diameter. In yield measured, consortium microbial agent showed 14% increase of on a standard of control, 7.3% more than treated with agricultural chemicals. So we also confirmed its effect of increasing yield. In case of planting kidney beans, consortium microbial agent showed the highest growth promotion with the result of about 33cm of main stem, over 25 pods per tree, over 5 seeds per pod, over 6 branches, also through measurement of one hundred seed weight, it increased 20% to 23% more than control and agrochemicals. Therefore, we believe that increase in diversity of soil microbes by consortium microbial agent and crop rotation, and the effect of improving yield will act as a wake-up call for microbial pesticides industry which focuses only on visible effect and will stress the importance of soil ecosystem as well. 토양미생물은 구성하는 종의 다양성이나 부가적으로 생산되는 유용효소, 항생물질 등이 산업, 농업 등 실생활에 사용된다는 점에서 매우 중요하다. 특히 친환경농업이 부각되면서 농업에서 토양미생물의 중요성이 강조되는데, 이는 작물의 생산성 향상과 더불어 토양생태계의 유지 및 개선효과도 기대할 수 있기 때문이다. 또한 토양생태계의 중요성이 부각됨에 따라 작부체계의 하나인 윤작의 적용이 친환경농업의 방법 중 하나로 대두되었다. 따라서, 본 연구에서는 윤작과 토양미생물을 이용한 복합미생물제제를 적용한 경작지의 토양미생물상을 관찰하여 토양생태계에 존재하는 주요 미생물 군집을 규명하고, 작물의 생산성 분석을 통해 작물에 미치는 효과를 확인하였다. 토양미생물상을 관찰하기 위해 사용된 metagenomics는 DNA의 활성과 염기서열 정보를 이용해 미생물상을 관찰하는 것으로, 본 연구에서는 각기 다른 작물을 재배한 1,2년차의 윤작지 토양의 다양성을 분석하였다. Rarefaction curve를 통해 species richness를 분석하여 복합미생물제제를 처리한 토양이 화학농약을 처리한 토양보다 species richness가 풍부함을 확인하였다. 또한 고추를 정식한 1년차의 토양과 강낭콩을 정식한 2년차의 토양을 비교했을 때 2년차에서 species richness가 더 높음을 확인하였다. 이는 복합미생물제제 처리와 윤작이 토양미생물의 다양성 증가에 기여한다는 것을 보여주는 결과이다. 토양미생물상의 군집구성을 확인하기 위하여 phylum level과 class level, species level에서 미생물 군집을 분석하였다. Phylum level에서는 1년차와 2년차의 토양미생물 구성이 acidobacteria, proteobacteria, gemmatimonadetes, chloroflexi, planctomycetes, bacteroidets, nitrospirae, actinobacteria로 동일하였고 구성비율도 큰 차이가 없었다. 좀 더 자세한 관찰을 위해 class level에서 토양미생물 구성을 분석하였고 1년차와 2년차의 차이를 발견하였다. Class level에서 1년차에는 Gemmanimonadetes, Soilbacteres, Deltaproteobacteria, Actinobacteria, Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Anaerolineae, Betaproteobacteria, Sphingobacteria, Holophagae, FJ478837가 모든 처리구에서 유사한 비율로 구성되어 있었으나, 2년차에는 기존의 구성에서 Planctomycetacia, Phycisphaerae, Nitrospira가 추가되었다. 또한, 화학농약 처리구에서 다른 처리구에서는 확인할 수 없었던 Bacteroidia, Clostridia, Bacilli가 확인되었는데 이는 화학농약에 따른 변이에 의한 토양미생물 군집의 변화로 보인다. 이러한 변화는 강낭콩 재배를 통한 윤작효과에 의해 사라지고 타처리구와 같은 구성의 class로 회복되었음을 확인할 수 있었다. 또한 species level에서의 분석을 통해 우점종의 특이적 기능을 확인하여 작물과 토양미생물에 미치는 영향을 확인하고자 하였으나, 1% 이상의 우점종이 10여종 밖에 안되고 그나마 우점하고 있는 종들의 경우 대부분이 난배양성 미생물이어서 특이적 기능을 확인할 수 없었다. Culturable bacteria에서 고추를 정식한 1년차와 강낭콩을 정식한 2년차의 species를 비교했을 때, 우점 species가 차이를 보임을 확인할 수 있었다. 1,2년차 토양의 phylum과 class가 차이가 없거나 적은걸로 봤을 때, 외부의 자극에 의한 토양미생물상의 변화는 그리 크지 않으며 특히 복합미생물제제를 처리한 토양에서는 토양미생물 생태계를 유지시키며 유익한 종들의 증가와 전체적인 species richness를 증가시킴을 확인할 수 있었다. 위와 같은 metagenomics 분석에 의한 결과를 뒷받침하기 위해 수행한 토양효소활성 분석에서 복합미생물제제를 처리한 토양이 dehydrogenase 3.5584 ㎍ TPF g-1h-1, urease 15.8689 ㎍ NH4-N g-1h-1, phosphatase 0.5692 ㎍ PNP g-1h-1, β-glucosidase 2.4785 ㎍ PNP g-1h-1, cellulase 86.1597 ㎍ glucose g-1h-1의 수치를 나타내 타처리구보다 높은 효소활성을 보였다. 또한, 1년차와 2년차의 토양효소활성의 차이를 확인하기위해 비교분석한 결과 dehydrogenase가 149%, urease 12%, phosphatase 158%, β-glucosidase 41%, cellulase 10%의 활성증가를 보였다. 이같은 결과는 복합미생물제제를 처리한 윤작지 토양의 미생물 다양성 증대효과를 확인한 metagenomics 분석과 일치하는 것으로 토양미생물상의 species richness 증가로 인한 토양효소활성의 증대로 보인다. 복합미생물제제가 토양미생물상과 더불어 작물에도 효과가 있음을 확인하기 위해 고추와 강낭콩의 생장촉진도 및 수확량을 측정하였다. 고추정식 시 생장촉진도측정에서 복합미생물제제가 타처리구에 비해 주경장에서 최대 6.1%, 경경에서 최대 8.1%의 생장촉진능을 보여 복합미생물제제의 생장촉진능을 확인하였고, 수확량 측정에서는 복합미생물제제가 무처리구를 기준으로 했을 때 14%, 화학농약 처리구보다도 7.3%의 증대효과를 나타내어 수확량 증대효과도 확인하였다. 강낭콩 정식 시 복합미생물제제 처리구에서 주경장 약 33 cm, 그루당 25개 이상의 꼬투리, 꼬투리당 5개 이상의 종자수, 분지수 6개 이상으로 가장 높은 생장촉진능을 보였고, 백립중 측정에서 무처리구보다 20%, 화학농약 처리구보다 23% 증대됨을 확인하였다. 따라서 본 연구를 통해 증명된 복합미생물제제와 윤작에 의한 토양미생물 다양성 증대 및 작물의 수확량 증대효과는 가시적인 효과만을 초점으로 남발되던 기존의 미생물제제 산업에 경각심을 일깨우고 토양생태계의 중요성을 부각시키리라 생각한다. 또한, 토양미생물과 식물의 상호작용을 생태학적으로 이해하고 기존의 화학제제에 의해 피폐해진 토양을 복원시키는 일에도 도움이 되리라 생각한다.

Aerococcus urinaeequi HS36으로부터 생산되는 펩타이드성 항균물질

성호선 영남대학교 대학원 2020 국내박사

본 연구의 목적은 어류 양식업에서 대량 폐사를 유발하는 세균성 질병을 제어하기 위해 항생제가 아닌 단백질성 항균물질을 분리하고, 특성화하였다. 어류병원균인 Vibrio anguillarum을 저해하는 활성 균주를 어류 내장으로부터 분리하였으며, 분리한 활성균주의 생리학적, 생화학적 특성 및 16S rRNA 염기서열을 분석한 결과 Aerococcus urinaeequi IFO12173와 99%의 상동성을 나타내었으며, 분리한 균주를 Aerococcus urinaeequi HS36로 최종 동정하였다. 활성 균주가 접종 후 5시간 이후부터 항균물질을 생산하며, 단백질 분해효소인 proteinase K에 의해 실활되는 것으로 보아 단백질성 항균물질이다. 항균물질은 Sephadex G-100, Sephadex G-25, RP-HPLC를 통해 정제하였으며, 최종 정제된 항균물질의 분자량을 tricine SDS-PAGE를 통하여 약 1000Da으로 확인하였으며, 항균물질의 크기가 비교적 작고, 3차구조가 결여되어 있는 복잡하지 않은 구조 때문에 온도, pH, 금속이온 및 효소저해제에 대해 영향을 많이 받지 않는 것으로 예상된다. β-amylase에 의해서도 분해되는 것으로 보아 당이 혼합된 구조로 예상된다. 뿐만 아니라 Edman degradation에 의해 N-말단 아미노산 서열 분석을 시도하였으나, 최초의 4개의 아미노산(NH2-Phe-Pro-Pro -Gln, FPPQ)만 판독되었으며 5번째 서열부터는 당으로 인하여 Endman 반응을 방해하여 확인할 수 없었다. 따라서 염기서열 확인 및 숙주세포인 Escherichia coli에서의 발현을 위하여 유전자 클로닝을 확인한 결과, 형질전환체에 도입된 유전자의 전체 길이는 약 105bp정도이며, 아미노산서열 FPPQISLPNATVSLN로 확인할 수 있었다. 또한 이 서열의 이론적인 분자량은 1597Da(pI 5.52)이며, cytoplasmic dynein 2 heavy chain 1 isoform X1(Sparus aurata)과 60%의 상동성이 있는 것으로 조사되었다. Escherichia coli에서의 항균 물질 발현은 배양액으로부터 항균물질의 활성을 확인할 수 없었으며, 세포 내에서 활성을 확인할 수 있었다. 이는 세포 외로 분비되기 위한 신호 펩타이드를 가지고 있지 않아 분비되지 않는 것으로 예상된다. 수산양식산업에서 미생물이나 항균물질을 보다 효율적 사용하기 위해서 외부로 유출되지 않고 소실되는 양을 감소시켜 농도를 높게 유지하는 방안으로 규조토를 이용한 기능성 담체를 사용하였다. 혼합배양에서는 담체의 효율성을 확인한 결과에 따르면 균주로 혼합배양 한 것보다 규조토를 담체를 이용한 혼합배양에서 어병균을 잘 제어하는 것을 확인하였다. 또한 시간에 따라 담체를 이용한 혼합배양 한 경우, 4시간 이후에 활성균주가 포함된 담체만 어류 병원균의 성장이 미비한 것으로 보아 활성 균주가 고정된 규조토는 성장하는 어병균을 보다 효율적으로 제어하는 것으로 보인다. 따라서 규조토는 어병균을 제어하기 위해 효과적인 담체로서 미생물과의 부착성이 우수하며 2차 환경오염을 줄일 수 있다는 측면에서 매우 유용할 것으로 사료된다. A bacterial strain inhibiting the growth of Vibrio anguillarum, the causative agent of vibriosis, was isolated from fish intestines. The isolated strain HS36 was identified as Aerococcus urinaeequi based on the characteristics of the genus according to Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology and by 16S rRNA sequencing. The growth rate and antibacterial activity of strain HS36 in shaking culture were higher than those in static culture, while the optimal pH and temperature for antibacterial activity were 7.0 and 30°C, respectively. The active antibacterial substance was purified from a culture broth of Aerococcus urinaeequi HS36 by Sephadex G-75 gel chromatography, Sephadex G-25 gel chromatography, and reverse-phase high-performance liquid chromatography. Its molecular weight, as estimated by Tricine SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, was approximately 1,000 Da. The antibacterial substance produced by Aerococcus urinaeequi HS36 was stable after incubation for 1 h at 100°C. Although its antibacterial activity was optimal at pH 6-8, activity was retained at a pH range from 2 to 11. The purified antibacterial substance was inactivated by proteinase K, papain, and β-amylase treatment. In addition, an attempt to analyze the amino sequence of the N-terminal was made with the Edman degradation method. Although only the first four amino acids (NH2-FPPQ) were read and the sequence from the fifth was not identified by any sugar moiety, the proteic nature of the compound was confirmed. The purified antibacterial substance, classified as a class II bacteriocin, inhibited the growth of Klebsiella pneumoniae, Salmonella enterica, and Vibrio alginolyticus. Therefore, as a result of gene cloning for expression at host cell Escherichia coli, it was found that the entire length of gene introduced to the recombinant was about 105bp and so could be confirmed with amino acid sequence FPPQISLPNATVSLN. The theoretical molecular weight of the short peptide sequence was estimated to be 1,597 Da(pI 5.52). The short peptide sequences had 60% homologous to those of the cytoplasmic dinein 2 heavy chain 1 isotype X1 (Sparus aurata). The gene encoding the antibacterial activity peptide was introduced into Escherichia coli cells to confirm the antibacterial activity. The activity of the antibacterial substance from the culture supernatant was not found, however the activity in the cell lysate was shown. This is probably resulted from the non-secretion because it had not signal peptide for extracellular secretion. The functional carrier using diatomite was used as a way for reducing the lost amount and retaining the concentration at high levels without external leakage for use microorganism or antibacterial substance more efficiently in the aquaculture industry. In co-culture, it was found according to the results of checking the efficiency of carrier that fish pathogen could be controlled better in co-culture of diatomite using carrier than the co-culture of strain. Additionally, in case of co-culture using carrier over time, the growth of fish pathogen is inhibition only in the carrier containing activity strains after 4 hours. Thus, it seems that the diatomite in which activity strains are immobilized controls the growing fish pathogen more effectively. Therefore, diatomite is considered to be very useful in that as an effective bio-carrier for controlling the fish pathogen, its microbial adherence is excellent and thus can reduce the secondary environmental pollution.

여름철 해운대 해안의 환경미생물 생태분포 모니터링

엄태윤 영남대학교 대학원 2020 국내석사

The purpose of this study was to investigate the distribution of environmental microorganisms and human-pathogenic microorganisms in summer at Haeundae Beach, Korea, to which the highest numbers of visitors come during June to September. In the clean dry sand (A) adjacent to the coastal road, Actinobacteria showed a 32% distribution in June and July, and the predominant species were Nocardioides glacieisoli and Arthrobacter subterraneus. Bacteroidetes showed a 64% distribution in August and the dominant species was Gramella oceani. Proteobacteria showed 29% distribution in September, and the dominant species was Sphingomonas sediminicola. The surface seawater (B), which is close to the sandy beach, had a distribution of 85 ± 5% from June to September, and predominant species were Pseudoalteromonas marina and Alteromonas mediterranea. In the wet sand (C), similarly to that of seawater, proteobacteria showed a high distribution of 53 ± 2% and the predominant species were Colwellia beringensis, Woeseia oceani and Thioprofundum lithotrophicum. Bacteroidetes also showed a relatively high distribution of 23 ± 4%, and the predominant species were Gillisia myxillae and Bacteroides plebeius. In the dry sand at picnic area (D), Bacteroidetes showed 53% to 58% distribution in June and August, respectively and the predominant species were Gramella aquimixticola and Gramella planctonica. Firmicutes showed a distribution of 36% in July, and the dominant species was Halobacillus profundi. Proteobacteria showed a 68% distribution in September, and the dominant species was Woeseia oceani. Due to the activities of the summer visitors, the distribution of human-related microorganisms increased in the dry sand near the beach, and the oceanic microorganisms related to seawater were also found in the dry sand. In the wet sand both soil-derived and seawater-derived microbes were mixed, due to the wave of seawater, resulting in the increased distribution of total microorganisms. More than 30 species of human pathogenic microorganisms were found, but most showed less than 1%.

Metagenomics를 이용한 미행물제제와 화학제제를 처리한 고추 경작지 토양의 미생물 다양성 비교

안창환 嶺南大學校 2012 국내석사

꿀벌의 미국 부저병과 노제마병에 항균 활성을 갖은 probiotics 미생물에 관한 연구

장윤정 嶺南大學校 2012 국내석사

American Foulbrood (AFB) of honeybees (Apis mellifera), caused by the Gram-positive bacterium Paenibacillus larvae is one of the most serious diseases affecting the larval and pupal stages of honeybees. Nosemosis, a disease caused by a microsporidian infection, is one of the most frequently observed parasitic pathologies affecting adult honeybees. Presently, Nosema ceranae and Nosema apis seems to be the main microsporidian infection in honeybees. The aim of this study was to evaluate lactic acid (LAB) strains isolated from Kimchi and to study its inhibitory effects against Paenibacillus larvae subsp. larvae KCTC 3744 and Nosema trichoplusiae ATCC 30702. In all, 3,500 strains were screened and three highly active bacteria were selected and were identified as Lactobacillus plantarum YML001, L. plantarum YML004 and Leuconostoc citreum KM20. The optical density of P. larvae KCTC 3744 at OD600nm showed drastic decrease in cell growth as compared to control. Three groups of honey bees (N=25) were given Nosema Spores at a concentration of 10,000 spores per ㎖ with addition of 1% of supernatant of three strains. The bees were incubated at 37℃ for seven days after infection, and the amount of spores in the mid gut was counted. To know the industrial effect of supernatant, three strains were subjected to further analyses; acid resistance, thermal resistance, enzyme stability and site investigation of activity substance in cellular structure. The optimal condition of carbon source and nitrogen source in media is glucose and tryptone. Temperature, agitation, pH and culture time for the three strains were proliferates at 30℃, 18 to 20hr in vitro assay. We found that the three strains inhibited the growth of P. larvae KCTC 3744 and N. trichoplusiae ATCC 30702 and provided new perspective for probiotics of honeybees. 꿀벌은 인간에게 식재료를 제공하는 것과 동시에 환경의 균형을 조절하는 역할을 하는 구성원이다. 식물의 수정을 조장함으로써 생태계의 순환에 일조하는 이 조력자가 최근 공해와 기계적인 요인에 의하여 개체 수가 줄어들고 있다. 단적인 예로 캘리포니아와 같은 오렌지 산지에서 꿀벌의 개체 수 감소로 인하여 생산량이 1/3이 줄었다. 이렇듯 꿀벌의 감소는 식용으로 쓰이는 식물의 생산량을 감소시키고 초식동물, 더 나아가 인간의 식량난으로 이어질 것이다. 그러므로 꿀벌의 개체 수를 증가시키고 유지하는 것이 중요하다. 본 연구에서는 꿀벌의 질병 중 대표적이고 피해 규모가 큰 미국부저병(American Foulbrood)와 노제마병을 목표로 하였고 그 병원균에 항균력을 가지는 유산균을 한국 전통 식품인 김치에서 분리하고자 하였다. 김치를 분리원으로 선택한 이유는 한국인이 즐겨 섭취하는 식품이며 그에 포함된 유산균 항균력이 많은 자료를 통하여 입증되어 있으며 취식이 가능한 균으로 확립되어 있기 때문이다. 총 200개의 다양한 종류의 김치에서 3,500종의 유산균을 분리해냈고 그 중 가장 항균력이 좋은 균 L. plantarum YML001,, L. plantarum YML004, Leu. citreum KM20 3종을 선발하였다. 이 세 균주는 각각 배양 시작 후 21시간, 21 ~ 24시간, 21시간에 가장 좋은 항균활성을 나타내었다. 또한 pH와 50℃ 이상의 고온에서도 항균활성을 잃지 않았고 Protease K, Lipase, Trypsin, Pepsin, α-amylase 5종의 효소에 의해서 항균활성을 잃지 않았기 때문에 산업적으로 안정하다 할 수 있다. 대량 배양을 위한 배지 조성은 탄소원으로는 glucose, 질소원은 tryptone을 선정하였고 미량원소 중 Tween 80과 Sodium acetate, MgSO4, MnSO4, Dipotassium Phosphate를 각각 2배로 넣은 것이 생균수 및 항균력이 우수하였다. 실제 현장 적용에 있어서는 선발된 3종의 유산균 배양액을 사양액과 혼합해 먹인 봉군이 가장 꿀벌의 기호도가 높았고 꿀벌의 생육도 더 좋아지는 것을 hive의 무게로 알 수 있었다. 성충을 무작위로 10마리 채취하여 유전자적 정성분석을 실시한 결과 노제마와 black queen cell virus가 없어지거나 줄어드는 것을 확인하였고 미국 부저병의 경우 완전하게 제거되지는 않았지만 그 유전자의 양이 현저히 줄어드는 것을 확인 하였다. 노제마와 미국 부저병은 치료항생제가 있지만 잔류성 문제가 대두되고 있어 항생제 대체 물질이 필요한 경우이지만 black queen cell virus의 경우에는 예방책 및 치료제가 없어 위의 결과는 양봉산업의 발전에 기여할 것으로 생각된다. 이와 같은 결과로 미루어 보아, 본 연구에서 개발된 Probiotics는 질병에 노출되어 있는 꿀벌의 성충 및 유충의 질병 예방 · 치료제로서 사용되어 질 수 있음을 증명하고 생산이 용이하고 경제적인 대량 배양용 배지로 배양되어 국내뿐만 아니라 국외에 보급된다면 실질적으로 양봉 산업에 많은 도움이 될 것이다.

포도 전정가지 추출물의 생리활성 검증과 이를 함유한 자외선차단제의 안정성 확립

박동우 嶺南大學校 2016 국내석사

포도는 전 세계적으로 가장 많이 재배되는 과수 중의 하나로 포도 및 포도 가공제품에 대한 성분분석, 항산화, 항암 등 다양한 생물학적 효능 연구가 이루어지고 있으나 겨울철 전정되어 버려지는 전정가지에 대한 연구는 미미한 실정이다. 본 연구에서는 포도 전정가지 추출물(GPSE)의 생리활성 및 자외선차단제에 첨가시의 안정성을 검증하였다. 먼저 DPPH radical 소거능, ABTS cation radical 소거능 등의 항산화 실험을 통해서 대조군으로 사용된 BHA와 L-ascorbic acid에 비교하여 GPSE은 높은 항산화 활성을 나타내었다. 미백 효과 측정을 위한 tyrosinase 저해활성 실험에서도 25 ug/ml 농도에서 GPSE는 15.35%, Arbutin은 1.48%로 GPSE의 미백효과가 높게 나타났으며, 주름개선 효과 측정을 위한 elastase 저해활성 측정 결과 대조군인 Ursolic acid와 비교하여 2.3∼3.7배 낮은 저해활성을 나타내었다. collagenase 저해활성 측정 결과 대조군인 EGCG와 유사한 저해활성을 나타내었다. 항균효과 측정 결과 Staphylococcus aureus, Staphylococcus epdermidis, Enterococcus faecalis, Streptococcus pyogenes 균은 항균활성은 있지만, resist한 결과를 나타내었다. p<0.000으로 통계학적 유의성이 있는 것으로 나타났으나 Escherichia coli, Propionibact erium acnes는 항균활성이 없는 것으로 나타났다. GPSE를 함유한 자외선차단제의 안정성 실험 결과 온도조건별(0, 25, 45℃, cycle chamber) 안정성과 냉 해동 순환에 따른 안정성 모두 안정함을 확인 하였고 30일 동안 측정한 pH 및 점도 변화에서도 큰 변화 없이 안정하였다. 이와 같은 결과로 미루어 보아 GPSE는 항산화제, 미백, 주름개선, 항균효과의 기능을 가지며, 자외선차단제에 적용 시 제형 안정성에 문제를 일으키지 않으므로 복합유형 기능성화장품 소재로서 이용이 가능할 것으로 사료된다. Studies have been done on the biological efficacy such as ingredient analysis, antioxidant, anticancer substances of the grapes, which is grown all around the world, and their processed products but the studies of the Grape pruning stems extract(GPSE) is very imperceptible. In this study, The GPSE showed high antioxidant activity compared to a control group of BHA and L-ascorbic acid by following DPPH radical scavenging activity, ABTS cation radical scavenging activity and so on. In addition, an experiment on tyrosinase inhibition activity for measuring skin-whitening, GPSE shows high whitening effect in that GPSE stands at 15.35% and anbutin 1.48% at 25 ug/ml. As the result of elastase measurement for anti-wrinkle effect it reveals 2.3~3.7 times as low inhibitory activity as Ursolic acid, and it is also similar inhibitory activity to EGCG, a control group at the collagenase measurement. In addition, GPSE showed antibacterial activity against Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis and Streptococcus pyogenes but shows a resistant results. The results are statistically significant as p<0.000. However, GPSE showed no activity against Escherichia coli, Propionibacterium acnes. The results of stability test showed that the sunscreen containing GPSE were very stable at both temperature conditions(0, 25, 45℃, cycle chamber) and freeze-thaw cycling conditions. And pH and viscosity of each sunscreen did not change greatly for 30 days. Therefore, GPSE can be used as an antioxidant, whitening, anti-wrinkle, and as antibacterial agent. It can be also used as a Multiple types of functional cosmetics because it doesn't effect the on stability when it was applied to sunscreen.

어류병원균 Streptococcus parauberis를 저해하는 Bacillus filamentosus 6112의 항균활성물질 정제 및 특성

지채윤 영남대학교 대학원 2020 국내석사

어류 병원균인Streptococcus parauberis를 저해하는 균주를 분리하기 위해 대구 및 경산, 포항 인근에서 어류 내장과 해수 등을 채취하여 균주를 선발 및 동정하였다. 선발된 균주는 16S rRNA gene sequence와 생화학적, 형태학적 특징을 비교하여 Bacillus filamentosus 최종 동정하고 Bacillus filamentosus 6112로 명명하였다. 6112 균주는 정치배양(0rpm)보다 진탕배양(120rpm)에서 높은 성장과 항균활성을 나타내었다. 균의 성장에 있어서 최적 배양 온도와 pH는 35℃와 pH 8.0로. 최적 활성 조건은 30℃, pH 7.0으로 확인되었다. 6112 균주의 성장을 위한 기본 배지로 TSY/NSS배지를 사용하였으며 균의 성장과 항균활성을 위해 탄소원으로 Sucrose, 질소원으로 Yeast extract를 첨가하였다. 또한 NSS의 조성에 대한 6112균주의 성장과 항균활성에 대한 영향을 조사 한 결과 MgCl2, CaCl2, SrCl2, boric acid가 항균활성에 큰 영향을 미치는 것을 확인하였고 이에 따라 6112균주의 최적 배지를 TSYBS/FSS 배지로 최종 결정하였다. 6112 균주의 성장곡선을 확인한 결과 접종 후 4시간 이후부터 항균물질이 생산되었고, 17시간에서 최대 항균활성을 나타냈다. 6112 균주가 생산하는 항균물질은 10∼70℃의 온도범위에서 100% 항균활성을 유지하였고, pH 2∼10에서 100% 항균활성을 유지하여 광범위한 온도와 pH범위에서 안정함을 확인하였다. 또한 다양한 금속이온과 SDS를 제외한 효소저해에서도 100%의 항균활성을 유지하였다. 또한 6112균주의 항균물질은 proteinase K와 pepsin등의 단백질 분해효소에 의해 활성이 소실되어 단백질성 물질로 사료되며, S. parauberis에만 아주 특이적인 항균활성을 나타냄을 확인하였다. 6112 균주가 생산하는 항균물질 정제를 위해 6112균주의 배양 상등액을 60% 포화농도의 ammonium sulfate로 분별침전 시킨 후 Sephadex G-100 gel chromatography와 DEAE-sepharose ion exchange chromatography를 진행하였다. 항균물질의 분자량은 glycine-SDS-PAGE를 통해 약 10kDa으로 확인되었다. Streptococcus parauberis is one of the bacteria that causes streptococcosis in fish. The strain that inhibit the growth of Streptococcus parauberis was isolated from intestines of fish. The isolated strain 6112 was identified as Bacillus filamentosus by biochemical test and 16S rRNA sequence analysis and designated as Bacillus filamentosus 6112. For the growth and antibacterial activity of the strain 6112, shaking culture was more effective than in static culture. The optimal pH and temperature for producing antibacterial substance were pH 7.0 and 30℃, respectively. TSY/NSS medium was used for growth and producing antibacterial substance of the strain 6112 and sucrose and beef extract were more effective than other carbon and nitrogen sources. The antibacterial substance of strain 6112 was maintained stable antibacterial activity at various temperature as 10∼70℃. Also antibacterial activity was stable at pH 2.0∼10.0. Metal ions such as FeSO4, CaCl2, AgNO3, MnSO4, MgSO4,, BaCl2, CoCl2, CuSO4, and ZnSO4 was not affect the antibacterial activity of strain 6112. Furthermore, the antibacterial substance was showed 100% residual activity on enzyme inhibitors except SDS. It was found that the antibacterial substance from strain 6112 was to be proteinaceous since the antibacterial activity of the substance was lost by treatment with proteinase K, pepsin, trypsin, α-chymotrypsin, papain. Antibacterial substance of strain 6112 was showed antibacterial activity against only Streptococcus parauberis. The antibacterial substance of strain 6112 was purified by Sephadex G-100 gel chromatography and DEAE-sepharose ion exchange chromatography after precipitated 60% saturation ammonium sulfate. The molecular weight of purified antibacterial substance was estimated to be about 10kDa by glycine-SDS-PAGE.

식중독 균 Bacillus cereus의 생육을 저해하는 균주 Pseudomonas aeruginosa K8로부터 생산되는 항 세균 물질의 정제 및 특성

김현희 영남대학교 대학원 2020 국내석사

식중독균인 Bacillus cereus는 포자를 형성하며 이 포자는 식품가공과정에서도 살아남아 사람에게서 구토와 설사를 유발한다. 현재 많은 항생제와 식품 보존제가 사용되고 있으나, 그들은 제한적이며 안정성에 문제를 유발하며 특히 항생제의 경우 내성의 문제로 인해 대체제에 대한 관심이 증가되고 있다. 그러므로 본 실험에서는 잔류성이 없는 단백질성 또는 펩타이드성 항균물질을 생산하는 미생물을 분리 동정하고자 한다. 활성 균주는 토양에서 분리하였으며, 분리한 활성균주를 Bergey’s manual of Systematic Bacteriolog, 16S rRNA 염기서열을 분석한 결과 Pseudomonas aeruginosa DSM 50071과 99% 염기 서열의 유사성을 나타내었으며, 분리한 균주룰 Pseudomonas aeruginosa K8로 최종 동정하였다. K8균주의 성장도는 정치 배양에서의 성장보다 진탕 배양에서 더 높은 것을 알 수 있었으며, 10% LB 배지(Tryptone 0.1%, Yeast extract 0.05%, NaCl 0.05%)를 기본배지로 하여 K8 균주의 탄소원⦁질소원에 대한 영향을 확인한 결과 탄소원으로 Fructose, 질소원으로 Tryptone에서 B. cereus에 대한 가장 높은 항균활성을 나타내었다. K8균주는 배양온도 30℃에서 가장 높게 성장하였으며 pH 7.0에서 가장 높은 성장과 항균활성을 보였다. 활성 균주는 접종 후 7시간부터 항균활성물질을 생산하는 것으로 보아 1차 대사산물임을 확인할 수 있었고, 배양 20시간에서 최대 항균활성을 나타내었다. K8균주가 생산하는 항균물질의 정제를 위해 동결건조한 후 Ammonium sulfate를 이용하여 분별 침전한 후 Sephadex G-100, DEAE-sepharose를 통해 정제하였으며, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis를 이용하여 분자량을 확인해본 결과 약 60kDa 정도로 추정되었다. 또한, K8 균주가 생성하는 물질은 상대적으로 낮은 온도에서 안정한 것을 확인할 수 있었으며, 특히 pH, 금속이온 및 효소저해제에 대한 영향에서 거의 모든 범위에서 높은 안정성을 보였다. 장류 유용균인 Bacillus subtilis의 성장에는 영향을 주지 않는 것으로 확인되었고 이 결과는 Bacillus subtilis와 K8이 생산하는 항세균물질을 같이 사용하여도 문제가 되지 않을 것으로 예상된다. 또한, 단백질 분해효소인 α-chymotrypsin에 대한 영향을 알아보기 위해 α-chymotrypsin을 첨가하고 37℃에서 5시간 처리한 결과 잔존 항균활성이 70% 실활되는 것으로 보아 단백질성 항균물질인 것으로 사료된다. 따라서 K8 균주가 생성하는 물질은 기존의 치료제인 항생제를 대신하여 이용할 수 있을 것으로 기대된다. Bacillus cereus, a foodborne bacterium, is a spore-forming bacterium that survives food processing and causes diarrhea and vomiting in humans. Currently, many antibiotics and food preservatives are used, but they are persistent and have problems with stability. Therefore, it wanted to isolate and identify the microorganisms that produced peptide antibacterial substances. A bacterium producing antibacterial substance was isolated from soil. The isolated strains were 99% homologous to Pseudomonas aeruginosa DSM 50071 when analyzed by Bergey's manual of Systematic Bacteriolog, 16S rRNA sequence, and finally identified as Pseudomonas aeruginosa K8. Growth and antibacterial activity of K8 strain was confirmed that shaking condition was better than static culture. The optimum medium for carbon and nitrogen source of K8 strain is Fructose, Yeast extract at growth rate and Fructose, Tryptone at the antibacterial activity, respectively. The optimal pH and temperature for growth of K8 strain were pH 7.0 and 30℃, respectively. The maximum antibacterial activity was confirmed in pH 7.0. As a result of the growth curve, antibacterial substance was produced after 8h incubation. After freeze-drying for purification of the antibacterial substances produced by the K8 strain was fractionated precipitated using Ammonium sulfate. Purification was performed using Sephadex G-100, DEAE-sepharose. To determine the molecular weight of purified antimicrobial substance, SDS-page was performed and was estimated to be about 60kDa by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Antibacterial substance from Pseudomonas sp. K8 did not affect B. subtilis, a beneficial bacterium. To confirm residual antibacterial activity against α-chymotrypsin, antibacterial substance was incubated with α-chymotrypsin on 37℃, 5h. As a result, the antibacterial activity of antibacterial substance from K8 strain was 70% inactivated by α-chymotrypsin. If these antibacterial substances are purified and commercialized, antibacterial substances produced by K8 strain they are expected to be used as natural food preservatives.

Functional analysis of a histone deacetylase MoRPD3 in the rice blast fungus, Magnaporthe oryzae

이재준 영남대학교 대학원 2019 국내석사

Magnaporthe oryzae is well known causal agent of rice blast disease, which is one of the most destructive diseases that reduce 10 ~ 30% of rice production every year throughout the world. Since rice is an important food crop of the world, the disease is major treat to global food security. Recently, it was shown that histone modifications among epigenetic mechanisms are involved in the pathogenesis of M. oryzae. Here, we set out to investigate how histone deacetylation is implicated in regulating important aspects of fungal development and pathogenesis. In eukaryotes, modification of chromatin structure is a critical factor that determines transcription of underlying genes. This structure can be influenced by post-translational modification of histones such as histone acetylation and deacetylation. Acetylation level at lysine residue of histone, in general, correlates with gene expression. Histone deacetylases (HDACs) are the enzymes that can remove acetyl group from lysine residue of histone. There are two kinds of HDACs family: Sirtuin family (NAD+-dependent HDAC) and the classical HDAC family (Zn2+ dependent HDAC). Classical HDAC family divides further into class I and class II. MoRPD3 is an orthologue of yeast RPD3 that encodes a class I HDAC in a plant pathogenic fungus, M. oryzae. In yeast, it is well known that regulation of RPD3 is associated with various processes including meiosis, cell-type specificity, biosynthesis, chromatin stability, and stress responds. However, roles of RPD3 during fungal pathogenesis has not been understood in detail yet. In this study, to elucidate the roles of MoRPD3 in fungal development and pathogenesis, MoRPD3 knock-down mutants were generated due to our repeated failure to make deletion mutant of the gene. MoRPD3-silenced mutants showed that significant reduction in asexual reproduction, and appressorium formation, compared with wild type strain. We also conducted several pathogenicity associated assays and these showed that MoRPD3 knock-down mutants have an attenuated pathogenicity. These data suggest that MoRPD3 histone deacetylase is required for fungal development and pathogenicity in M. oryzae. This study would enhance to comprehensively understand the role of the MoRPD3 in the rice blast fungus, M. oryzae. Magnaporthe oryzae는 벼에 발생하는 가장 치명적인 병인 벼 도열병의 원인 균으로, 전 세계적으로 이 병에 의해 매년 10~30%의 쌀 생산량의 피해가 발생한다. 벼가 세계적으로 매우 중요한 식량 자원이기 때문에, 이 병은 매우 중요하게 다루어지고 있다. 최근에 후성유전학적 기작 중 히스톤의 변형이 M. oryzae의 병원성과 관련하다는 연구가 발표되고있다. 이 연구에서 히스톤 탈 아세틸화가 곰팡이의 발달과 병원성에 어떻게 영향을 미치는지를 확인하려고 한다. 진핵생물에서 chromatin 구조의 변형은 하위 유전자들의 전사를 결정짓는 아주 중요한 요소이다. 이러한 구조의 변화는 히스톤의 아세틸화와 탈 아세틸화와 같은 전사 후 변형에 의해 결정된다. 일반적으로 히스톤에 있는 lysine 잔기의 아세틸화 수준이 높으면 관련된 유전자의 발현이 증가하는 것으로 알려져있다. 히스톤 디아세틸레이즈들은 히스톤의 lysine 잔기로부터 아세틸기를 제거하는 효소이다. 이들은 두가지 family로 구분되는데 NAD+를 조효소로 이용하는 Sirtuin family와 Zn2+를 조효소로 이용하는 Classical HDACs family가 있다. Classical HDACs family는 다시 염기서열 유사성에 따라 class I과 class II 나뉜다. MoRPD3는 S. cerevisiae RPD3의 orthologue로 class I HDAC를 암호화하는 유전자이다. 효모에서 RPD3는 다양한 기능을 하는 것으로 알려져 있는데, 그 기능에는 meiosis, cell-type specificity, potassium transport, phosphate metabolism, 다양한 biosynthesis, chromatin 안정성, 그리고 스트레스에 대한 반응 등이 있다. 그러나, 사상형 곰팡이들에서 RPD3의 역할에 대한 이해는 아직까지 부족하다. 이 연구에서는 곰팡이의 발달과 병원성에 대한 MoRPD3의 역할을 설명하기 위해, MoRPD3의 knock-down 돌연변이를 만들었다. MoRPD3 knock-down 돌연변이들은 야생형 균주보다 무성 포자 형성 능력과 appressorium 형성 능력에 관해 상당히 부진함을 보였다. 또한 병원성과 관련된 실험은 MoRPD3 knock-down 돌연변이들에서 약화된 병원성을 보여주었다. 이 연구의 결과들은 MoRPD3가 M. oryzae의 발달과 병원성에 필요한 유전자임을 암시한다. 이 연구는 벼 도열병 균인 M. oryzae에서 MoRPD3의 역할을 완전히 이해하는 것을 도울 것이다.

형광분석법을 이용한 S. cerevisiae 의 GPCR 리셉터와 α-factor 사이의 affinity 분석

안희준 嶺南大學校 2016 국내석사

The α-factor pheromone receptor of S. cerevisiae, Ste2p, belongs to the large family of GPCRs associated with signaling system present in diverse living organism from higher animals to microbes. α-factor binding onto a type yeast pheromone receptor (Ste2p) causes the signal transfer into the cell causes physiological and morphological change. Native α-factor, tridecapeptide (WHWLQLKPGQPMY), is secreted by Saccharomyces cerevisiae MATa haploid cells and recognized by a receptor that is coded by gene (STE2), which is expressed in S. cerevisiae MATa haploid cells. To assess α-factor affinity onto the receptor, we designed fluorophore contained detector peptides (Edan--factor and AMC--factor) and measured affinity of non-chromogenic analogs onto the receptor by competitive analysis using fluorophoric detector. Fluorometric assay was found to be more sensitive than colorimetric assay. We conducted three kinds of tests using 2 kinds of Yeast strains. First, we conducted affinity test using S. cerevisiae Y7925 strain. Among 20 analogs tested, some showed 2.4-fold better affinities than native a-factor. The affinity was following order; [Dap6,D-Ala9]-factor (240) > [Orn6,D-Ala9]-factor (238) > [Homo-Arg6,D-Ala9]α-factor (160) > [Glu6,D-Ala9]α-factor (120) > [Arg6,D-Ala9]α-factor (109) > [Orn6,L-Ala9]α-factor (107) > [Glu5,Arg6,L-Ala9]α-factor (102) > [Dab6,D-Ala9]α-factor (101) > native α-factor (100) > [Orn6,D-Ser9]α-factor (98) > [Glu5,Orn6,D-Ala9]-factor (97) > [Orn5,Arg6,D-Ala9]α-factor (75) > [Orn6,Aib9]α-factor (73) > [Orn6,D-Glu9]α-factor (70) = [Asp5,Arg6, D-Ala9]-factor (70) > [Lys6,D-Ala9]α-factor (51) > [Orn6,D-Phe9]α-factor (50) > [Lys*6,D-Ala9]α-factor (41) > [Arg5,6,D-Ala9]α-factor (30) > [Orn6,D-Lue9]α-factor (14) > [Orn6,D-Cys9]α-factor (3). Second, we conducted affinity test using S. cerevisiae LM102 strain, it is different from the S. cerevisiae Y7925 strain-using test that we revealed Receptor gene artificially by means of the vector. Among 20 analogs tested, some showed 2.2-fold better affinities than native a-factor. The affinity was following order; [Dap6,D-Ala9]a-factor (220) > [Orn6,D-Ala9]a-factor (210) > [Homo-Arg6,D-Ala9]α-factor (158) > [Glu6,D-Ala9]α-factor (103) = [Glu5,Arg6,L-Ala9]α-factor (103) > [Arg6, D-Ala9]α-factor (101) > native α-factor (100) > [Orn6,L-Ala9]α-factor (98) > [Glu5,Orn6,D-Ala9]-factor (95) > [Dab6,D-Ala9]α-factor (87) > [Orn6,D-Ser9]α-factor (80) > [Asp5,Arg6,D-Ala9]-factor] (70) > [Orn6,Aib9]α-factor (65) > [Orn6,D-Glu9]α-factor (60) = [Orn5,Arg6,D-Ala9]α-factor (60) [Lys6,D-Ala9]α-factor (48) > [Lys*6,D-Ala9]α-factor (41) > [Orn6,D-Phe9]α-factor (35) > [Arg5,6,D-Ala9]α-factor (30) > [Orn6,D-Lue9]α-factor (15) > [Orn6, D-Cys9]α-factor (1). In the third test, we conducted the test using FDG disposition regarding the -galactosidase revelation degree of analogs by means of the genetic characteristics that the LM102 strain synthesized b-galactosidase as a result of the signal delivery. The analog that the revelation of galactosidase was the highest was [Dap6,D-Ala9]-factor, which was 1.67 times higher than native. The expression rate was following order; [Dap6,D-Ala9]factor (167) > [Orn6,D-Ala9]-factor (143) > [Homo-Arg6,D-Ala9]α-factor (121) > [Glu6,D-Ala9]α-factor (107) > native α-factor (100) > [Arg6,D-Ala9]α-factor (94) > [Orn6,D-Phe9]α-factor (94) > [Glu5,Arg6,D-Ala9]α-factor (92) > [Dab6,D-Ala9]α-factor (88) > [Glu5,Orn6,D-Ala9]-factor (82) > [Orn6,L-Ala9]α-factor (80) > [Orn6,D-Ser9]α-factor (70) = [Asp5,Arg6,D-Ala9]-factor] (70) > [Orn5,Arg6,D-Ala9]α-factor (62) = [Lys6,D-Ala9]α-factor (62) > [Orn6,Aib9]α-factor (60) > [Orn6,D-Glu9]α-factor (58) > [Orn6,D-Lue9]α-factor (55) > [Lys*6,D-Ala9]α-factor (50) > [Arg5,6,D-Ala9]α-factor (41) > [Orn6,D-Cys9]α-factor (31). What we could know from the 3 kinds of tests is if the affinity between the receptor and a-factor was high, the signal was delivered strongly and if the affinity was low, the signal was delivered weakly. We could know it was clear the affinity affected the signal delivery from this result.