Ru/Ti, Pd/Ti, Ir/Ti 전극을 이용한 폐수의 전기화학적인 산화처리에 관한 연구

이진원 광운대학교 대학원 2000 국내석사

티타늄 금속표면에 Ruthenium, Palladium, Iridium 원소로 코팅된 전극을 사용하여 전류밀도, 전극간격, Chloride 농도, 그리고 유기물농도에 대한 전기분해 특성을 연구하였다. 염색 폐수, 염료제조공정 폐수, 제약공정 폐수, 그리고 PVA제조공정 폐수의 COD 제거율을 측정하였고, 중금속 및 염료의 색도 제거율을 구하였다. 사용된 세 가지 전극 중 Pd/Ti와 Ru/Ti전극은 Ir/Ti전극보다 COD 제거에 있어서 약 1.5배 더 우수하였다. COD 처리율에 가장 민감한 변수인 전류밀도는 수치가 증가할수록 COD 제거속도가 증가함을 보였고, 전극간격과 Chloride 농도는 COD제거에 있어서 전류밀도에 비해 큰 영향을 주지는 못하였다. 그리고 본 장치로는 유기물을 처리하는데 있어서 라디칼 반응인 전기화학적 직접산화가 일어나지 않았고 간접산화 방법에 의해 COD가 제거되었다. 또한 분산성염료인 Blue, Red, Yellow염료 3가지를 처리한 결과, Blue염료는 28분 후 712mg/L에서 14mg/L로, Red염료는 52분후 609mg/L에서 69mg/L로, 그리고 Yellow염료는 23분후 481mg/L에서 107mg/L로 감소하였다. 차아염소산염의 산화력을 이용한 살균실험결과, 40분만에 모든 미생물들이 제거되었다. 염색 폐수, 염료제조공정 폐수, 제약공정 폐수, 그리고 PVA제조공정 폐수를 120분 동안 전기분해한 결과, COD가 10mg/L, 45mg/L, 40mg/L, 70mg/L로, 방류수(약 40-90 mg/L COD) 기준에 근접하거나 만족하였음을 보였다. Titanium electrodes coated with ruthenium (Ru), palladium (Pd), and iridium (Ir) were tested at different conditions of current density, electrode gap, chloride concentration, and organic chemical concentration. The treatments of dyeing wastewater, dye-manufacturing process wastewater, pharmaceutical process wastewater, and PVA (polyvinyl alcohol) manufacturing process wastewater were examined by analyzing COD (chemical oxygen demand), color, and heavy metal concentration. Pd/Ti and Ru/Ti electrodes showed about one point five times better COD removal than Ir/Ti electrode. As the current density increased, the COD removal rate was increased all the time. But the effects of electrode gap and chloride ion concentration were less than current density. No electrochemical direct oxidation reaction was observed during the wastewater treatments and COD seemed to be solely removed by indirect oxidation reaction. For the result of electrical decomposition of blue, red, and yellow diffusive dyes, the concentration of blue dye was decreased from 712 mg/L to 14 mg/L after 28 minutes, red dye from 609 mg/L to 69 mg/L after 52 minutes, and yellow dye from 481mg/L to 107mg/L after 23 minutes. Sterilization using electrochemical oxidation with Ir/Ti, all microbes were removed after 40 minutes. Many laboratory tests using industrial wastewater showed excellent COD removal rates, too.

위안부문제에 관한 연구 : 일본정부의 인식 및 태도 변화에 대한 연구

윤소은 서울시립대학교 일반대학원 2012 국내석사

This study fixed its sight on the fact that Japanese government that had not recognized Japanese government 's involvement in the comfort women problem and forcibleness of mobilizing comfort women recognized governmental involvement in the women problem and forcibleness of mobilizing comfort women, and managing comfort women and the comfort place and was changed into the positive position in relation to compensation. Even though victims resulted from mobilization of comfort women standing on the center of the comfort women problem were a few people, the comfort women problem had been handled as the compensation problem after the war, the forced labor problem, the women's problem, and human rights issues rather than the relationship between individuals and the state. Accordingly, the comfort women problem had to be approached as a diplomatic issue that had to be solved at the level between nations, not as an issue between a minority group damaged by Japan and Japan. Main factors deciding Japanese diplomatic policy could be divided into elites, Japanese system as a bureaucracy, psychology of policy decision makers, interests, job procedure within an organization, and the environment of policy revisions. But, since politicians played a key role in deciding the politically sensitive diplomatic issue rather than any other factors, politicians sensitively reacted to public opinion more than bureaucrats to decide the diplomatic policy. Owing to characteristics in the decision-making process of Japanese diplomatic policies, agents expected to exert the biggest influence on the attitude of Japanese government in relation to the comfort women problem became national agents in Japan. When the comfort women problem had internationally received attention as it was related to the forced labor problem, the women's problem, and human rights issues, this issue had come up as a politically sensitive issue. Therefore, agents seemed to play a key role in deciding policies related to the comfort women problem. Especially, it seemed that the role of politicians sensitively reacting to public opinion might be important. congressmen, national agents in Japan, had continuously demanded apology and compensation of Japanese government to solve the comfort women problem in the congress. The local public organizations had also submitted a resolution calling for a prompt solution of the comfort women problem to Japanese government. These activities of national agents in Japan had reflected continuous demand of politicians who intended to handle the comfort women problem rapidly that had been issued internationally. After all, this came to bring about changes in awareness and attitudes of Japanese government as for the comfort women problem. 본 연구는 위안부 문제에 대해 일본 정부의 관여를 인정하지 않고 위안부 동원의 강제성에 대해서도 인정하지 않던 일본 정부가 위안부 문제에 대한 국가의 관여와 위안부 문제의 동원 및 위안부, 위안소 관리의 강제성을 인정하고 보상에 대해 긍정적인 입장으로 변화한 사실에 주목하였다. 위안부 문제의 중심에 서 있는 위안부 동원 피해자들은 일본 이외의 국가에 속해 있는 소수의 사람들이지만 위안부 문제는 개인과 국가와의 관계로 다뤄지기 보다는 전후 보상 문제, 강제 노동 문제, 여성 문제, 인권 문제로 다뤄져 왔고, 이로 인해 위안부 문제는 일본에 피해를 입은 소수 집단과 일본과의 문제가 아닌 국가와 국가 차원에서 해결해야 하는 외교 문제로 접근해야 할 것이다. 일본의 외교 정책을 결정하는 요인은 엘리트, 관료국가로서 일본의 시스템, 정책 결정 행위자의 심리, 이해관계, 조직 내 작업 절차, 정책 경정 환경으로 나누어 볼 수 있다. 다만 정치적으로 민감한 외교 사안의 경우에는 다른 어떤 요인보다도 정치인들이 주축이 되어 결정하게 되는데 정치인들은 관료보다는 여론에 민감하게 반응하여 외교 정책을 결정하게 된다. 이러한 일본의 외교 정책 결정 과정의 특징 때문에 위안부 문제에 대한 일본 정부의 태도에 영향을 가장 큰 영향을 미칠 것으로 예상되는 행위자는 일본 국내 국가 행위자이다. 위안부 문제는 강제 노동이나 여성 문제 및 인권 문제 등과 관련되어 국제적으로 주목받게 되었으며 이러한 사안은 정치적으로 민감한 이슈로 떠올랐다. 따라서 위안부 문제와 관련된 정책은 행위자들이 중요한 역할을 하는 것으로 생각할 수 있으며 특히 여론에 민감하게 반응하는 정치인의 역할이 중요할 것으로 보인다. 일본 국내 국가 행위자인 국회의원들은 국회 회의에서 정부에 위안부 문제를 해결할 수 있도록 사죄, 보상 등을 계속해서 요구했으며 지방 공공단체 또한 일본 정부에 위안부 문제의 조속한 해결을 촉구하는 결의안을 제출했다. 이러한 국내 국가 행위자의 활동은 국제적으로 이슈가 되고 있는 위안부 문제에 대해 빠르게 대처하고자 하는 정치인들의 계속된 요구를 반영했고, 이는 결국 위안부 문제에 대한 일본 정부의 인식과 태도의 변화를 가져오게 되었다.

Eco-friendly biosynthesis of 1,2-propanediol from methanol using metabolically engineered methylorubrum extorquens AM1 : 대사 조작된 메틸로루브룸 엑스토르켄스 AM1을 이용한 메탄올로부터 1,2-프로판다이올의 친환경 생합성

김현수 서강대학교 대학원 2022 국내박사

1,2-propanediol, also called propylene glycol, is a major commodity chemical with numerous industrial applications such as manufacturing, food, and pharmaceutical. Most of the 1,2-propanediol used in industry is manufactured through a petroleum-based chemical process using propylene oxide as a raw material. This petroleum-based 1,2-propanediol has the disadvantages of generating toxic by-products and dependence on fossil fuels. Therefore, the demand for bio-based, eco-friendly 1,2-propanediol is increasing. However, the current bio-based 1,2-PDO received a negative evaluation because of unsustainable feedstock, glycerol. These challenges inherent to current bio-based 1,2-PDO have brought this study to develop eco-friendly biosynthesis of 1,2-PDO from methanol which can be produced from sustainable raw materials including gaseous one-carbon feedstocks such as methane, carbon monoxide, and carbon dioxide. First, by preceding the 1,2-propanediol toxicity study on microorganisms, Methylorubrum extorquens AM1 strain, a representative methylotroph, was more resistant to 1,2-propanediol than Escherichia coli widely used for microbial 1,2-propanediol research. Thereafter, an efficient 1,2-propanediol biosynthetic pathway was introduced into Methylorubrum extorquens AM1, and by searching genes related to methylglyoxal and dihydroxyacetone phosphate which are precursors of 1,2-propanediol biosynthesis, major genes were overexpressed and genes expressing competitive pathway were deleted to improve 1,2-propanediol production. Furthermore, since the 1,2-propanediol biosynthetic pathway consumes cofactors, genes related to cofactors were manipulated and the effect on 1,2-propanediol biosynthesis was studied. This is the first study to produce bio-based 1,2-propanediol from methanol and is expected to help in research on eco-friendly diol production. 프로판다이올은 프로필렌글리콜이라고도 불리며 공업, 식품, 제약 등 다양한 산업 분야에서 널리 사용된다. 산업적으로 사용되는1,2-프로판다이올의 주요 제조 방법은 산화프로필렌을 원료로 하는 석유 기반의 화학 공정이다. 이러한 석유 기반의 1,2-프로판다이올은 유독한 부산물 발생과 화석 연료 의존이라는 단점을 지닌다. 따라서 바이오 기반의 친환경 1,2-프로판다이올 수요가 증가하고 있다. 하지만 생물공정을 이용한 친환경 1,2-프로판다이올 연구는 부족한 실정이다. 이러한 특성에 착안하여 본 연구는 재생가능한 자원, 예를 들어 메탄, 일산화탄소, 이산화탄소와 같은 탄소 수가 1개인 C1 가스에서 얻을 수 있는 메탄올을 원료로 미생물을 이용한 친환경 1,2-프로판다이올 생합성 방법을 개발하였다. 먼저 미생물에 대한 1,2-프로판다이올 독성 연구를 선행함으로써, 대표적인 메탄올자화균인 메틸로루브룸 엑스토르켄스 AM1 균주가 미생물을 이용한 1,2-프로판다이올 연구에 널리 쓰이는 대장균 보다 1,2-프로판다이올에 강한 내성을 보이는 것을 확인하였다. 다음으로 효율적인 1,2-프로판다이올 생산경로를 메틸로루브룸 엑스토르켄스 AM1에 도입하고 1,2-프로판다이올 생합성 전구체인 메틸글리옥살과 다이하이드록시아세톤 인산 관련 유전자 탐색을 통해 주요 유전자를 과발현하고 경쟁 경로의 유전자를 제거하여 1,2-프로판다이올 생산량을 향상시켰다. 또한 1,2-프로판다이올 생산 경로는 조효소를 소모하므로 조효소 관련 유전자를 조작하고 1,2-프로판다이올 생합성에 미치는 영향을 연구하였다. 마지막으로 개발한 균주의 최적의 배양조건을 탐색하였다. 본 연구는 미생물을 이용하여 메탄올로부터 1,2-프로판다이올을 생산한 최초의 시도이며, 나아가 친환경 다이올 생산 연구에 도움을 줄 것으로 기대된다.

발효공정에서 맨하이미아 균주의 숙신산 생산에 대한 공정 최적화

오인재 서강대학교 일반대학원 2009 국내석사

본 연구에서는 맨하이미아 LPK7 균주를 이용한 숙신산 생산 공정 연구를 수행하였고, 최적 숙신산 생산 공정 조건을 찾는 것을 목표로 하고 있다. 맨하이마 LPK7 균주의 최적 성장 조건 규명과 숙신산 생산성을 높이기 위해 연속발효 공정 연구 및 균주 농도의 극대화 연구를 수행하였고, 산업에의 응용에 대비한 스케일 업 연구를 수행하였다. 연속발효 공정 연구를 수행한 결과 희석 속도 0.2 h-1 에서 숙신산 수율 0.38 mol/mol, 생산성 1.77 g/l/h의 결과를 얻었고, 연속발효 공정 결과를 토대로 세포 내의 해당과정 (glycolysis)과 오탄당 회로 (pentose phosphate pathway)의 대사 흐름을 보기 위해서 대사 흐름 분석 (metabolic flux analysis)을 수행하였다. 숙신산 생산성을 높이기 위해 균주 농도의 극대화 연구를 수행한 결과 이전보다 약 10% 정도 균주의 농도가 증가한 결과를 얻었다. 또한, 산업에 적용하기 위해 스케일 업 연구를 수행하였다. 벤치 스케일에서 숙신산 발효 공정 연구를 수행한 결과 숙신산 농도는 15.4 g/l, 수율은 0.86 g/g 이라는 결과가 얻어졌다. 이 결과는 랩 스케일에서의 숙신산 발효 공정 결과와 비슷한 값이다. 이와 같은 결과로 보아 숙신산 생산 공정은 큰 스케일로 스케일 업 하는데 큰 문제가 없는 것으로 보이며, 산업에의 응용이 가능할 것으로 판단된다. To achieve a higher succinic acid productivity and evaluate the industrial applicability, this study used Mannheimia succiniciproducens LPK7 (knock-out: ldhA, pflB, pta-ackA), which was recently designed to enhance the productivity of succinic acid and reduce by-product secretion [29]. Process optimization was performed to enhance the production of succinic acid in lab scale. After optimization, anaerobic continuous fermentation of Mannheimia succiniciproducens LPK7 was carried out at different glucose feed concentrations and dilution rates. After repetitive fermentation experiments, a succinic acid yield and productivity of 0.38 mol/mol and 1.77 g/l/h, respectively, were achieved with glucose feed concentration of 18.0 g/l and 0.2 h-1 dilution rate. To improve productivity of succinic acid, experiments to reduce hydrogen ion effects have been performed. And protectants like as glutathione, biotin were protected cell against harmful environment factors [4, 23]. As results, cell concentrations were increased about 10%. To observe scale-up effects, bench scale fermentation was carried out at optimal conditions which were obtained from lab scale experiments. Final succinic acid concentration and yield were obtained as 15.4 g/l and 0.86 g/g. This result showed that a similar amount of succinic acid was obtained in lab scale fermentation and it would be possible to scale-up to larger size without problems.

Optimization for bio-milking of ectoine production in an engineered Methylomicrobium alcaliphilum 20Z from methane

Chai, Hanyu 서강대학교 대학원 2021 국내석사

Methane, used as a sole carbon source of methanotrophic microorganisms, is one of the major greenhouse gas (GHG). In order to reduce the greenhouse effect caused by methane gas emissions, the use of biotechnological conversion from methane to high-value chemicals has become a key research direction in recent years. In this study, Methylomicrobium alcaliphilum 20Z ΔPΔectDΔectR was used to improve production of ectoine, compatible solute produced by halophilic bacterium, through optimization for bio-milking of ectoine from methane. First, it was confirmed that the synthesis of intracellular ectoine was rapidly increased when M. alcaliphilum 20Z ΔPΔectDΔectR was cultivated in a medium containing 0.05 μM of tungsten and 6% NaCl. Second, we tried to find out the optimal conditions for the bio-milking of ectoine to further improve the yield of ectoine by engineerd M. alcaliphilum 20Z ΔPΔectDΔectR. The cultivation and intracellular ectoine accumulation conditions were optimized with respect growth phase and medium salinity to reach the highest synthesis. In addition, optimization for maximal ectoine excretion was performed by determination of ectoine secretion time (15 minutes) in appropriate salinity of medium under hypo osmotic condition (1% NaCl). As a result, bio-milking of ectoine was successfully repeated more than 10 times using M.alcaliphilum 20Z ΔPΔectDΔectR and ectoine yield increased up to 129.29 mg/ DCW g. 메탄은 주요한 온실가스(GHG) 중 하나로, 메탄자화균 생장의 유일한 탄소원이다. 최근 메탄가스 배출로 인한 지구온난화 문제를 줄이기 위해, 메탄에서 고부가가치 화학물질을 생명공학적인 방법으로 전환하는 연구가 다수 진행되고 있다. 본 연구에서는, 메탄을 단일 탄소원으로 사용하는 개량 균주 Methylomicrobium alcaliphium 20ZDP ΔectDΔectR를 이용하여 엑토인 생산의 최적 조건을 탐색하고, 엑토인의 효율적인 bio-milking 방법에 대하여 조사하였다. 첫 번째로, 배지에 텅스텐을 첨가하여 세포 성장과 엑토인 생산성을 높이고, 엑토인 대사에 적정 염도의 배지를 결정하였다. 그 후, 엑토인 생산량을 더욱 향상시키기 위해 bio-milking 최적 조건을 탐색하였다. 첫째로, M. alcaliphium 20ZDP ΔectDΔectR를 3% NaCl이 포함된 배지에서 배양하였고, 세포 내 엑토인을 축적하기 위해 고장액으로 (6% NaCl) 옮겼다. 두 번째 단계에서, 엑토인이 축적된 M. alcaliphium 20ZDP ΔectDΔectR은 저장액에 (1% NaCl) 노출 후, 세포 사멸 없이 세포 내 엑토인을 세포 외 방출하는 것을 확인하였다. 세포 내 엑토인 축적 조건, 세포 외 엑토인 방출 조건은 성장 단계와 배양 배지의 염도, 배지 노출 시간 등을 고려하여 최적화하였다. 그 결과, M. alcaliphilum 20Z ΔPΔectDΔectR을 사용하여 엑토인의 바이오 착유가 10 회 이상 성공적으로 반복되었고, 엑토인 수율이 최대 129.29 mg / DCW g까지 증가하였다. 이러한 방법은 엑토인의 bio-milking 시 세포의 재사용이 가능하므로, 기존의 bio-milking 방법에 비해 엑토인 생산성을 높일 수 있다.

Bioconversion of methane to methanol through selective inhibition of methanol dehydrogenase using methylomonas sp. DH-1

김유진 서강대학교 대학원 2018 국내석사

In this study methanol production using methanotroph cells as a biocatalyst without external reducing power regeneration was investigated. The previous study for bioconversion of methane to methanol focused on supplement of external reducing power such as sodium formate. However, sodium formate is much more expensive than product, methanol. Therefore, in this study, only selective inhibition of methanol dehydrogenase (MDH) in Methylomonas sp. DH-1 and NADH pool were controlled for methanol accumulation. The optimal pH and the optimal concentrations of MDH inhibitor were investigated. In order to find efficient inhibitors of MDH, various chemical inhibitors such as EDTA, Co2+, Mn2+, potassium cyanide (KCN) and cyclopropanol were tested. EDTA showed the best inhibition effect on activity of MDH. To produce methanol, whole cells of Methylomonas sp. DH-1 were used as a biocatalyst. Methanol was accumulated 4.4mM after 48h in the presence of EDTA under optimized batch condition without external reducing power. 본 연구는 외부 환원력 재생산 없이 메탄자화균 세포를 이용한 메탄올 생산에 대해 연구하였다. 그동안 메탄에서 메탄올로 생물전환을 하기 위한 이전연구는 모두 외부 환원력 공급원으로 개미산염을 사용하는 데 집중했다. 그러나 개미산염은 산물인 메탄올보다 훨씬 값이 비싸다는 단점이 있다. 따라서 본 연구는 메탄올 축적을 위해 오직 Methylomonas sp. DH-1의 메탄올탈수소효소 (MDH) 의 선택적 저해와 NADH pool의 조절만이 이루어졌다. 이를 위해 효소의 적정 pH와 MDH 저해제의 적정농도를 조사하였다. 효과적인 MDH 저해재를 찾기 위해 EDTA, Co2+, Mn2+, potassium cyanide (KCN) 그리고 cyclopropanol같은 여러 화학적 저해재를 실험하였다. EDTA는 가장 높은 MDH 저해효과를 나타내었다. 메탄올을 생산하기 위해 Methylomonas sp. DH-1이 생체촉매로 사용되었다. 외부 환원력 공급없이 EDTA를 첨가한 적정조건에서 48시간만에 메탄올이 4.41mM 축적됨을 확인하였다.

유전자 조작에 의한 에탄올 생산 Escherichia coli 균주 개발 및 내성 강화를 위한 개량

오은경 서강대학교 일반대학원 2009 국내석사

Due to dwindling of fossil fuel, microbial production of bio-fuel from organic byproducts has acquired significance in recent years. Ethanol has been trusted as an alternate fuel for the future. The ethanologenic pathway in Z. mobilis (Zymomonas mobilis), like that of saccharomyces cerevisiae, consist of two essentail activities, pyruvate decarboxylaseand alcohol dehydrogenase (ADH). 1,2 These two activities and the enzymes of glycolysis comprise 30 to 50% of the soluble protein in Z. mobilis. By inserting Z. mobilis genes encoding pyruvate decarboxylase and alcohol dehydrogenase II in E. coli.3,4 E. coli was able to ferment sugars into ethanol. This study Z. mobilis (containing pdc and adhB genes) were used as the construction sources of genes and plasmids.5,6,7 Expression vectors carrying pdc and adhB genes were constructed by using pET-32a vectors. Ethanol productivity in E. coli strain seemed to be affected by the extent of expresstion of pdc gene along with adhB genes. By successful gene mutation we could establish a new E. coli strain which can produce ethanol efficiently. The wild-type E. coli cannot produced ethanol. So, recombination for ethanolic E. coli was investigated in this study. Also to confirm the production of ethanol, fermentation experiment of recombinant E. coli BL21was performed in aerobic conditions. 8 Also ethanol productivity was increased two fold for nitrogen source, carbon source, temperature and pH optimization. 최근 몇 년간 석유 연료가 고갈이 심각해지면서 새로운 신재생 에너지인 미생물을 이용한 bio-fuel이 각광 받게 되었다. 따라서 본 연구는 미생물을 이용한 bio-ethanol의 생산에 중점을 두고자 한다. 현제 에탄올을 생산하는 균들 중에서 가장 대중화 되어있는 균주로서 대표적인 것에는 zymomonas mobilis와 saccharomyces cerevisiae가 있다. 9,10 이 중 Saccharomyces cerevisiae의 경우 박테리아 보다 안정하고 에탄올의 생산측면에서도 좋은 생산율을 보이지만 성장 시간이 길고 진핵 세포 이므로 유전자 조작 을 할 때 진행 과정상 박테리아에 비해 여러 단계를 거쳐야 하기 때문에 최종 균주로 선호 되지 않는다. zymomonas mobilis는 에탄올의 생산성 에서는 월등 하지만 saccharomyces cerevisiae처럼 성장 시간이 긴 단점이 있다. 이 단점을 극복하고자 zymomonas mobilis의 에탄올 생산 능력과 E. coli의 조작이 쉽고 균의 빠른 성장의 장점을 이용 하여 유전자 조작을 하고자 한다. 특히 zymomonas mobilis는 E, coli의 pathway상에서 Ethanol 생성에 필요한 Gene adhB (alcohol dehydrogenaseⅡ) 와 pdc (pyruvate decarboxylase)을 가지고 있으며 이를 높은 발현 레벨의 pET-32a vector에 삽입함으로서 E. coli의 glucose로부터 ethanol까지의 pathway를 연결시켰다. 그리고 호기와 혐기상태의 발효과정을 거쳐 HPLC 분석을 통해 에탄올 생산을 확인 하였다. 11 그리고 조작 균주의 에탄올 생산성을 증가시키고자 질소원 탄소원 최적화를 통하여 기존의 배지를 간소화함으로서 생산비용의 감소를 가져왔으며 에탄올에 대한 저항성을 확인한 결과 조작균주에서 에탄올에 대한 저항성의 증가를 확인 할 수 있었다. 또한 온도 최적화와 pH 최적화를 통하여 에탄올의 생산량을 2배 증진시켰다. 12,13

High-production of ectoine from methane in Methylomicrobium alcaliphilum 20Z by using high cell density cultivation

임상은 서강대학교 대학원 2023 국내석사

유산균을 이용한 유해 조류의 살조 효과

강수경 한양대학교 교육대학원 2011 국내석사

To evaluate whether LAB have the ability of algicidal bacteria, 15 strains of Lactic acid bacteria (LAB) including genus Lactobacillus and Latococcus were tested against 13 species of algae. Of them, Microcystis aeruginisa NIES 298, Anabaena flos-aquae CCAP 1403/13B, Anabaena affinis NIES 23, Stephanodiscus hantzschii UTCC 267 and Peridinium bipes HYJA0311-A2 were sensitive to many LAB. L. graminis showed algicidal activity against M. aeruginosa, S. hantzschii and P. bipes. L. brevis exhibited algicidal activity against M. aeruginosa and S. hantzschii. L. garvieae appeared active only against A. affinis. Both L. paracasei and L. plantarum exhibited algicidal activity on P. bipes. Especially, L. plantarum and L. paraplantarum possessed highest algicidal activity 105 and 104 cells/ml on cyanobacterium A. flos-aquae, respectively. Even at relatively low density of 102 cells/ml, moreover, two LAB showed high algicidal activity of 77% against A. flos-aquae. Biochemical assay of the culture filtrates revealed that the main algicidal substances from two LAB were likely to be heat-resistant extracellular substances with low molecular weight (< 3 kDa). These results indicate that many LAB are potential agents for the control of harmful algal blooms in eutrophic reservoir. 유해 조류의 대발생 (Harmful Algal Blooming, HAB)은 이들의 생육서식지에 따라 산업적으로 다양한 문제를 일으키고 있다. 우리나라와 같이 온대지방의 부영양화의 발생은 수생태계에서는 풍부한 영양분을 바탕으로 식물플랑크톤 같은 1차 생산자의 생장에 유리한 환경이 조성되면서 조류의 대발생이 폭발적으로 일어나고 있다. 호수, 하천, 저수지, 양어장 등지에서의 유해조류의 대발생은 산소공급 차단으로 수색생물의 폐사를 일으키고, 이취미(off-flavor)물질을 발생하고, 물의 착색 및 이상발포 형성 등 주로 일어나며, 마지막으로 상수처리과정 중의 여과지 폐쇄 및 응지 침전 저해 등으로 경제적 손실을 야기한다. 또한 하천 및 호수에서 발생하는 녹조 (algal blooming)는 주로 여름철의 남조류 (cyanobacteria), 봄과 겨울철의 규조류 (diatom)가 녹조현상의 주요 유해종이다. 따라서 유해 조류 원인 생물에 의한 현상을 제거 또는 완화시키기 위한 기술들이 개발로 본 실험에서는 생물학적 방법으로 살조세균을 선발 및 분리 연구를 하였다. 먼저, 우리나라에 우점하는 유해 조류 13종에 대한 제어 효과를 알아보기 위하여 Lactic acid Bacteria인 락토바실로스 (Lactobacillus)속과 락토코커스 (Lactococcus)속을 선택하여 살조능력을 평가하였다. 선택된 Lactic Acid Bacteria는 13종의 유해 조류 중에서 Microcystis aeruginisa NIES 298, Anabaena flos-aquae CCAP 1403/13B, Anabaena affinis NIES 23, Stephanodiscus hantzschii UTCC 267, Peridinium bipes HYJA0311-A2에 대해 살조활성을 나타냄을 확인하였다.M. aeruginisa의 경우 L. graminis, L. brevis 등이 107 cells/ml의 접종농도에서 숙주를 100% 제거 가능한 것을 확인할 수 있었으며, 저밀도에서도 우수한 살조효과가 있는 것으로 관찰되었다. A. affinis의 경우 L. garvieae가 107 cells/ml과 102 cells/ml의 접종 밀도에서 대조구 대비 44% 이상의 조류성장 저해효과를 가지는 것으로 나타났다. S. hantzschii에 대해서는 L. graminis, L. brevis 등이 저밀도에서 가장 우수한 살조활성을 나타내었다. 마지막으로 P. bipes에 대해서는 L. graminis, L. paracasei subsp. Tolerans, L, plantarum 등이 저밀도에서 가장 우수한 살조활성을 나타내었다. 결론적으로 본 실험에서 선택된 유산균 중 살조활성을 나타내는 세균들은 연못, 저수지, 호수, 호소, 하천 또는 강 등에 존재하는 다양한 종류의 유해조류 (녹조류, 남조류, 규조류, 유글레노이드류, 편모조류 및 황녹색조류)의 이상 증식을 억제할 수 있음을 확인하였고, 특히 녹조 제어에 우수한 효과를 나타낸다는 사실을 확인하였다. 독성이 있는 남조류인 A. flos-aquae에 대한 유산균의 살조능력을 농도별로 확인한 결과, L. plantarum와 L. paraplantarum가 A. flos-aquae에 강한 살조 능력을 보이며 각각의 초기 접종 밀도 ≥ 105 과 ≥104 cells/ml 에서 A. flos-aquae가 완전하게 제거되었고, 102 cells/ml로 접종된 경우에서도 살조효과가 우수하여 대조구 대비 77% 이상의 조류성장 저해효과가 있는 것을 확인 할 수 있다. L. plantarum와 L. paraplantarum가 A. flos-aquae를 제거하는 과정을 현미경으로 관찰한 결과, 유산균 접종 후 1시간이 지난 후에 A. flos-aquae 세포가 탈색되면서 팽창하고, 이 부위에는 유산균이 붙어 있는 것을 관찰 할 수 있었다. 시간이 지나면서 다수의 세포가 둥근형태로 변한 후 불규칙하게 합쳐지고 더 많이 팽창되었다. 결국 몇몇 세포는 터져서 세포액이 빠져나 오고 빠른 속도로 세포 파괴가 일어 나서 결국에는 완전히 제거 되는 것을 관찰하였다. 살조 현상을 나타내는 물질의 특성을 알아보기 위해 살조세균의 단일 배양여액 (mono-culture filtrate) 및 숙주와의 혼합 배양여액 (co-culture filtrate), 열처리한 혼합 배양여액, Proteinase-K를 처리한 혼합 배양여액 등을 이용하여 살조활성을 측정하였다. 단일 배양여액의 경우 조류제거효과가 거의 관찰되지 않았으나 혼합배양여액은 두 세균모두 농도구배에 따른 살조활성의 증가가 확연히 관찰되었다. 또한 L. plantarum의 혼합 배양여액을 열처리 (heat treatment)하고 농도 별로 접종한 경우에도 접종농도에 관계없이 살조활성이 70% 이상으로 관찰되었으나, L. paraplantarum의 경우에는 농도 구배별 살조활성의 증가하였다. 또한, proteinase-K와 열처리 과정을 순차적으로 처리한 혼합 배양여액을 접종한 경우에도 두 세균 모두에서 우수한 살조활성이 관찰되었다. 특히 L. paraplantarum의 경우 10-20%의 접종농도로 처리했을 때 열만 처리한 혼합배양여액을 접종한 경우보다도 살조활성이 높게 관찰되었다. 이러한 결과들로 볼 때 혼합 배양 시 L. plantarum 및 L. paraplantarum의 살조 활성이 증가하며, 살조활성을 나타내는 물질은 열에 강한 저분자 물질과 일부의 단백질 성분이 혼재되어 있음을 추측할 수 있다.

Deinococcus radiodurans OxyR 단백질의 과산화물 감지 기작 연구

최영진 한양대학교 대학원 2012 국내석사

OxyR은 세포 내 과산화물을 감지하는 전사조절인자로서 대장균을 모델 세균으로 가장 많은 연구가 이루어져 왔다. 대장균에 존재하는 OxyR (OxyREC)의 기존 연구 결과에 의하면 과산화수소를 감지하는 OxyR의 199번째 시스테인 잔기 (Cys199)는 먼저 sulfenic acid 형태 (R-SOH)의 intermediate 구조를 취하고, 이후에 208번째 시스테인 (Cys208)과 이황화 결합을 이루어 변화된 단백질 구조에 기인된 활성을 획득하게 된다. 활성화된 OxyR 단백질은 katG와 같은 조절 대상 유전자의 전사를 조절하게 된다. OxyR 단백질의 산화된 형태와 환원된 형태 모두조절 대상 유전자의 프로모터 부위에 결합은 하지만,활성을 획득한 산화된 형태의 OxyR이 RNA 중합효소와 상호작용에 의해 유전자 발현을 촉진한다고 알려져 있다. 본 연구에서 다루고자 하는 Deinococcus radiodurans내에는 기존에 알려진 OxyREC 단백질과 아미노산 서열상으로 비슷한 두 단백질이 존재한다고 생각 된다. D. radiodurans내에는 2개의 염색체가 존재하는데, 최근에 밝혀진 게놈 서열을 통해 염색체마다 각각 한 종의 oxyR 유전자 (dr0615과dra0336)가 존재하며, 이들을 OxyR1DR과 OxyR2DR라고 선행 연구에 의해 명명되었다. 아미노산 서열 분석을 통해, 이 두 OxyR 단백질들은 OxyREC에서 과산화수소를 감지하는 역할을 하는 Cys199 (Peroxidatic cysteine)에 상응하는 시스테인은 존재하지 않고, 이 시스테인이 산화가 되었을 때 이황화 결합을 이루는 Cys208 (Resolving cysteine) 위치에만 시스테인 잔기가 보존되어 있는 것으로 나타났다. 이를 통해 D. radiodurans OxyR 단백질들은 대장균에 존재하는OxyR이 과산화수소를 감지한 후에 분자 내 이황화 결합 (intramolecular disulfide bond)을 이룬다는 기존에 연구결과와는 같은 결과를 수반할 수 없는 특이적인 과산화물 감지 메카니즘을 이용할 것을 암시해 주고 있다. 실제 SDS-PAGE 분석 실험을 통해 wild type OxyR1DR의 경우 mutant OxyR1DR (C210S)과는 다르게 과산화수소에 의해 산화되어 dimer를 형성한 크기에 해당하는 band를 확인하였는데, 고농도의 과산화수소는 이러한 band 형성을 강화 시키는 것을 확인하였다. 최종적으로 MALDI-TOF 질량분석 기법을 통해 이 band의 Cys210이 포함된 펩타이드는 IA에 의해 alkylation되지 않음을 확인할 수 있었다. 이를 통해, 두 분자의 OxyR1DR 단백질이 해당 시스테인 잔기를 이용해 분자 간 이황화 결합 (intermolecular disulfide bond)을 이룬다는 결론을 얻을 수 있었다. 흥미롭게도 이러한 현상은 D. radiodurans 세포 내에서 발현시킨 OxyR1DR 단백질에서도 나타났는데, in vitro 실험 결과와 같이 과산화수소를 처리하지 않거나 1 mM 수준의 과산화수소를 처리한 세포 내 OxyR1DR에 대한 dimer 형성능력에 차이가 나타나지 않았다. 이러한 결과를 통해 OxyR1DR는 Cys210 잔기를 이용하여 고농도의 과산화수소를 감지하여 반응을 나타낸다고 생각된다. 본 연구는 기존에 보고된 OxyR1DR의 Cys210 잔기가 과산화수소를 감지하여 sulfenic acid (R-SOH)형태로 활성을 띈다는 내용이 아닌 OxyR1DR 분자끼리 이황화 결합을 통한 homodimer 형태를 이루어 기능을 한다는 것으로써, 기존에 알려진 OxyR 단백질의 작용 메커니즘과는 다른 과산화물 감지기작을 제시해 준다. OxyR, an intracellular peroxide sensing regulator, has been intensively studied using model organism, Escherichia coli. According to previous studies on E. coli OxyR (OxyREC), a thiol residue of Cys199 initially oxidized to a sulfenic acid intermediate (R-SOH) upon exposure to hydrogen-peroxide, which then forms a intramolecular disulfide bond with Cys208 resulting in active conformation. This activated OxyR upregulates target genes such as katG and grxA, which are involved in defense against oxidative stress. Although both the oxidized and reduced OxyR can bind promoter regions of target genes, the oxidized OxyR can only increase the expression of target genes through interaction with RNA polymerases. In this study, two putative OxyR proteins from Deinococcus radiodurans which exhibit similarity with OxyREC were investigated. D. radiodurans has two distinct chromosomes and each has one oxyR gene, dr0615 or dra0336 which encode different OxyR protein named as OxyR1DR or OxyR2DR respectively. Those proteins do not have a cysteine residue corresponding to peroxidatic cysteine of Cys199 in OxyREC, but have a conserved cysteine residue corresponding to resolving cysteine of Cys208 which can react with initially oxidized Cys199 by disulfide formation. These indicate that the peroxide sensing mechanism of the two D. radiodurans OxyR proteins may not be same with that of OxyREC which forms intramolecular disulfide bond upon hydrogen peroxide sensing. Indeed, SDS-PAGE analyses showed that wild type OxyR1DR could form a homodimer by intermolecular disulfide bond at both low and high concentration of hydrogen peroxide, but mutant OxyR1DR (C210S) could not. Furthermore, MALDI-TOF MS analysis revealed that the disappearance of tryptic peptide containing Cys210, indicating that Cys210 residue is involved in intermolecular disulfide bond formation. Dimer formation of OxyR1DR was also observed with in vivo experiment using D. radiodurans cells harboring FLAG-epitope tagged OxyR1DR. All these results suggest that D. radiodurans OxyR may use intermolecular disulfide bond formation unlike OxyREC which uses intramolecular disulfide bond formation for the sensing of peroxide