소나무 내생 세균으로부터 소나무재선충 살선충 효과 탐색

안지은 경남대학교 대학원 2021 국내석사

소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)에 의해 발병하는 소나무재선충병은 우리나라 소나무림의 손실에 막대한 영향을 주고 있는 산림병이다. 따라서 본 연구에서는 건강한 소나무 내에 기생하며 살아가는 소나무 내생 세균으로부터 소나무재선충에 살선충 활성을 가지는 균주를 탐색하고자 screening을 실시하였다. 그 결과 소나무 내생 세균 170종으로부터 살선충 효과를 나타내는 8종의 균주를 우선 선발하였다. 우선 선발된 세균의 동정을 위해 16S rRNA gene sequencing 분석을 실시한 결과, 두 균주가 Lysinibacillus xylanilyticus와 100%의 similarity를 나타냈기 때문에 최종적으로 해당 균주를 선발하였다. LB agar plate 상에서 Lysinibacillus xylanilyticus 균주의 형태학적 특성을 관찰하여 표면이 매끈하고 옅은 노란색을 띠는 colony를 확인하였고, 문헌조사를 통해 그람양성의 호기성균, 운동성, 내생포자 형성, 막대모양의 균임을 확인하였다. 또한, 소나무재선충 성충과 L2/L3 유충에 대한 살선충 활성을 확인하기 위해 nematicidal activity assay를 실시하였고, 소나무재선충 알의 부화 억제 효과를 확인하기 위해 egg hatch assay를 실시하였다. 해당 균주를 소나무재선충의 성충과 L2/L3 유충에 처리하였을 때, 희석하지 않은 original 농도에서 100%의 살선충 효과를 보였으며 알의 부화율에 미치는 효과를 확인하기 위해 실시한 egg hatch assay에서도 마찬가지로 original 농도의 균주 처리 시 알의 부화를 100% 억제한 모습을 확인하였다. 이러한 결과를 바탕으로 소나무 내에 해당 균주가 일정량 이상 존재한다면 소나무재선충에 대해 저항성을 가질 수 있을 것이라 판단된다. 결론적으로 본 논문은 소나무 내생균으로부터 살선충 효과를 가지는 균주를 선발하였고, 선발된 Lysinibacillus xylanilyticus의 소나무재선충 성충과 유충, 알에 대한 살선충 효과를 보고하며 소나무재선충병 방제를 위한 생물학적 제제로서의 가능성과 가치를 제시하는 바이다. Pine wilt disease, caused by Bursaphelenchus xylophilus, is a forest disease that greatly affects the loss of pine forests in Korea. Therefore, in this study, screening was carried out to select strains from endophytic bacteria in healthy pine trees that have nematicidal activity against Bursaphelenchus xylophilus. As a result of the identification, 8 strains that showed nematicidal effect were pre-selected from 170 species of endophytic bacteria in pine trees. The reason why Lysinibacillus xylanilyticus was finally selected, is because the result from 16S rRNA gene sequencing analysis to identify the 8 strains showed 100% similarity to Lysinibacillus xylanilyticus from two of the strains. By observing the morphological characteristics of Lysinibacillus xylanilyticus strain on LB agar plate, a smooth surface and pale yellow colony was observed. Supplementally through literature investigation research, it was confirmed that the selected strain is a gram-positive, aerobic, motile, endospores-forming and rod-shaped bacteria as well. In addition, nematicidal activity assay and egg hatching assay was performed to investigate the nematicidal activity and effect of egg hatching inhibition against adult, L2/L3 larvae and eggs of Bursaphelenchus xylophilus. As a result, it showed 100% nematicidal and egg hatching inhibition effect at the original concentration against adult, L2/L3 larvae and eggs of Bursaphelenchus xylophilus. Through these results, it is regarded that if this strain exists in a certain amount or more in pine trees, it will be able to have resistance to pine tree nematodes. In conclusion, this study reports the nematicidal effect of Lysinibacillus xylanilyticus against Bursaphelenchus xylophilus, and suggests its potential and value as a biological agent for controlling pine wilt disease.

꾸지뽕잎으로부터 항산화 및 미백활성 물질의 분리 및 기전 규명

강용경 경남대학교 대학원 2012 국내석사

부작용이 없는 피부미백제를 탐색하기 위하여 440가지의 한약재를 이용하여 screening을 실시한 결과 꾸지뽕잎을 선별하였고 항산화 및 미백활성을 확인하였다. 꾸지뽕잎 추출물로부터 미백활성 물질을 분리하고자 꾸지뽕잎 methanol 추출물에 water를 가하고 hexane을 이용하여 hexane 층과 water 층으로 분리하고, 다시 water 층을 ethyl acetate를 이용하여 분배 추출하였다. 이것을 silica gel column chromatography와 ODS column을 실시하고 최종적으로 HPLC를 실시하여 단일 물질로 분리하여 이를 KJ-1이라 명명하였다. KJ-1의 화학 구조를 결정하기 위해 ESI-Mass, IR spectrum 그리고 NMR spectrum 분석을 실시하였다. 그 결과, KJ-1은 isoflavone glycoside계열의 화합물로써 지금까지 보고되지 않은 신물질임을 확인할 수 있었고 이를 Flaniostatin이라 명명하였다. Flaniostatin의 항산화 활성, 세포독성을 확인하고 tyrosinase 저해 활성을 측정함으로서 Flaniostatin이 새로운 피부미백제가 될 가능성을 제시하였다. Tyrosinase is known to be the first, two and rate-limiting enzyme in the synthesis of melanin pigments responsible for colouring skin. Tyrosinase inhibition is one major strategy used to treat hyperpigmentation. In human skin melanocytes, the cellular tyrosinase inhibition was examined by the conversion of L-tyrosine and oxidation of L-DOPA to DOPAquinone. We evaluated the tyrosinase inhibitory effects with in vitro systems to find skin-whitening agents without cytotoxic concerns. We have found that the methanol extract of dried skin of Cudrania tricuspidata shows potent tyrosinase inhibitory activity in B16 melanoma cells. The active compound in this Cudrania tricuspidata extract was isolated and identified as Flaniostatin by ESI-Mass spectrum, 1H-NMR and 13C-NMR analysis. During our on-going attempts to develop a new skin-whitening agent, we identified a novel candidate compound Flaniostatin. The non-toxicity and tyrosinase inhibitory effects of Flaniostatin are investigated in B16 melanoma cells. In addition, the antioxidant activity of Flaniostatin was evaluated in the oxygen radical absorbance capacity assay, total radical trapping antioxidant potential and DPPH radical scavenging assay. Flaniostatin was shown to be a promising ingredient that could be useful for treating hyperpigmentation and for protecting against oxidative stress.

간세포 보호효과를 가지는 물질의 탐색 및 기전 연구

권진원 경남대학교 대학원 2014 국내석사

간은 우리 몸을 구성하고 있는 많은 장기 중 생체 내 대사가 가장 활발하게 일어나는 장기로써 인간에 있어서 중요한 장기 중 하나이다. 그러나 바이러스, 약물의 오남용에 의한 독성 및 과도한 음주, 흡연 등의 다양한 원인에 의한 산화적 스트레스로 인해 간질환은 빈번하게 일어나고 있다. 간질환은 우리나라뿐만 아니라 여러 선진국의 간질환 예방 및 치료제에 대한 많은 연구에도 불구하고 현재까지 임상적으로 독성 없이 만족할만한 효과를 나타내는 간질환 치료제는 없으며, 현재 사용되고 있는 간질환 치료제 또한 장기간 복용 시 간질환에 대해 효과적이지 못하고 부작용의 위험성이 있다. 따라서 장기간 복용 시에도 부작용과 간에 부담을 주지 않으면서 치료효과가 지속될 수 있고, 평상시에도 섭취 가능한 간 손상을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 치료제 개발 연구가 요구되고 있다. 본 연구에서는 국내·외에서 자생하고 있는 517가지의 한약재를 대상으로 HepG2 간암 세포주를 이용하여 tert-butyl hydroperoxide로부터 유도된 산화적 스트레스로부터 간세포 보호효과를 가지는 생리활성물질을 탐색하기 위해 screening을 실시한 결과, 간세포 보호효과를 나타내는 고량강을 선별 할 수 있었다. 고량강 methanol 추출물로부터 간세포 보호효과를 가지는 활성물질을 분리하고자 서로 극성을 달리하여 n-hexane, diethyl ether, ethyl acetate, water로 순차적으로 분획하였다. 그 중 활성이 있던 diethyl ether층을 정제하기 위하여 silica gel column chromatography와 LH-20 column, ODS column 등의 column work와 HPLC를 통해 단일물질을 분리하였으며 이를 KR-500이라 명명하였다. KR-500의 화학 구조를 결정하기 위해 ESI-Mass, NMR spectrum 분석을 실시하였다. 이를 바탕으로 문헌 조사를 실시한 결과, KR-500은 기존의 flavonoid계 화합물인 galangin과 같은 구조임을 알 수 있었다. Galangin에 대한 간세포 보호효과 및 세포생물학적 기전 연구를 통하여 galangin이 산화적 스트레스로 인한 간손상에 대한 간기능 보호제로써의 가능성을 제시하였다. Reactive oxygen species (ROS) act as subcellular messengers in such complex cellular processes as mitogenic signal transduction, gene expression, and regulation of cell proliferation. High levels of ROS production may, however, lead to oxidative stress, loss of cell function, and ultimately apoptosis or necrosis. Oxidative stress is widely recognized as an important mediator of apoptosis in liver cells and plays a role in the pathogenesis of several diseases. A number of pro-oxidants like tert-butyl hydroperoxide (t-BHP) have been implicated in the oxidative stress and cell injury that result from intracellular production of ROS. Therefore t-BHP is widely applied to investigate the mechanism of cell injury initiated by oxidative stress. It can be metabolized to free radical intermediates by cytochrome P-450 in hepatocytes, which in turn can initiate lipid peroxidation, affect the cell integrity, and mediate DNA damage. This present study examined the protective effects of galangin against t-BHP-induced hepatotoxicity. In this study, Galangin, a biologically active compound, was isolated from the Alpinia officinarum Hance. Galangin showed hepatoprotective activity in HepG2 cells against oxidative stress induced by t-BHP. Several biological experiments were conducted to investigate the hepatoprotective activity of Galangin. As the result, morphological changes occurred when HepG2 cells were treated with t-BHP, but morphological changes were recovered by treated with galangin. When the cell survival rate was measured, it re-increased when galangin was treated with t-BHP, while it reduced when t-BHP was independently treated. Equally, cytotoxicity was reduced by galangin, while it increased when t-BHP was independently treated. Apoptosis, which was observed through t-BHP treatment, was suppressed by galangin. ROS generation induced by t-BHP was significantly reduced when cells were treated with galangin. In conclusion, our results demonstrated that galangin is efficacious in protecting hepatocytes against oxidative stress and suggested the possibility of galangin as a new hepatoprotective agent.

아토피 피부염을 억제하는 물질의 탐색 및 기전 연구

최정현 경남대학교 대학원 2018 국내석사

최근 산업화된 사회로 인해 생활환경의 변화, 환경오염과 대기오염 등에 의해 발생되는 생물학적, 화학적 유해물질들에 대한 노출은 아토피 피부염, 천식, 알레르기 비염 등 알레르기 질환을 꾸준히 증가시키고 있다. 그 중 아토피 피부염은 아토피가 동반된 염증성 피부질환으로 심한 가려움증, 홍반, 피부건조증, 부종 그리고 습진을 특징으로 하는 비전염성의 만성 재발성 피부질환이다. 그러나 약품의 과량 또는 장기간 사용에 따른 부작용이 문제점으로 지적되고 있어 부작용을 최소화 하면서 아토피 피부염을 억제하는데 효과적인 새로운 아토피 피부염 치료제의 개발이 필요한 실정이다. Histamine은 일반적으로 비만세포 내에 과립형태로 존재하고 비만세포의 과립으로부터 가장 먼저 방출되는 화학적 물질로써 혈관확장, 알레르기 반응, 기관지 평활근에 대한 수축작용 등을 유발시키는데 가장 중요한 분자이며 체내에 histidine decarboxylase 반응을 통해 생합성된다. 이와 같이 알레르기 반응에 있어 histamine은 핵심적인 역할을 하고 있으며 아토피 피부염의 알레르기 반응정도를 측정하는데 많이 이용된다. 또한 염증반응에서 inducible nitric oxide synthase (iNOS) 발현에 의한 nitric oxide (NO)의 염증 촉진 매개물은 염증반응이 유도되어 아토피 피부염을 더욱 악화시키는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 부작용이 적으면서 보다 안정적인 천연물자원으로부터 아토피 피부염 억제효과를 가지는 물질을 탐색하기 위하여 PMA와 A23187로 유도된 비만세포에서 628종의 천연물자원을 이용하여 screening을 실시한 결과, 아토피 피부염 억제효과에 활성이 있는 백반, 녹반, 밀타승, 월석을 선별할 수 있었다. 따라서 백반, 녹반, 밀타승, 월석 methanol 추출물에서 아토피 피부염 억제효과를 가지는 물질을 확인하기 위해 다양한 생물학적 실험을 실시하였다. HMC-1 세포에 다양한 농도의 백반, 녹반, 밀타승, 월석과 탈과립을 유도하는 PMA와 A23187을 처리하였을 때, 형태학적 변화 및 β-hexosaminidase assay를 통해 탈과립 억제효과를 확인하였으며 다양한 농도의 백반, 녹반, 밀타승, 월석과 염증을 유도하는 LPS를 처리하였을 때, NO production assay를 통하여 염증 억제 효과를 확인하였다. 따라서 본 연구에서는 PMA와 A23187로부터 탈과립이 유도된 비만세포와 LPS로부터 염증이 유도된 대식세포에서 백반, 녹반, 밀타승, 월석의 아토피 피부염 억제 효과를 확인할 수 있었으며 백반, 녹반, 밀타승, 월석이 탈과립 및 염증 억제에 대한 천연물자원 신약소재로서의 가능성을 제시하고자 하였다. Histamine is present in granules form in mast cells, is the first chemical substance released from granules of mast cells. It is the most important molecule that causes vasodilation, allergic response, and contraction of the bronchial smooth muscle. Thus, histamine is a key role in the allergic response and used as a measure allergic response of atopic dermatitis. In addition, it is known that in the inflammatory response, atopic dermatitis aggravated by induction of inflammatory response is inflammatory mediat of nitric oxide (NO) by inducible nitric oxide synthase (iNOS) expression. In this study, we conducted a screening of 628 species from less side effects and stable natural resources, and identified that Alunitum, Melanterite, Plumbum, Borax exhibit a inhibition effects of degranulation against PMA plus A23187-induced degranulation in mast cells. Therefore, several biological experiments were conducted to investigate the inhibition effects of atopic dermatitis of methanolic extracts of Alunitum, Melanterite, Plumbum, Borax. The cells were exposed to PMA plus A23187-induced degranulation were treated with various concentrations of Alunitum, Melanterite, Plumbum, Borax. This treatment resulted in the induction of dose-dependent inhibition effects of degranulation, which was evidenced by the results of morphological change, β-hexosaminidase assay. also dose-dependent inhibition effects of inflammation, which was evidenced by the results of NO production assay. In conclusion, studies show inhibition effects of atopic dermatitis from Alunitum, Melanterite, Plumbum, Borax against PMA plus A23187-induced degranulation in HMC-1 cells and LPS-induced inflammation in RAW 264.7 cells. These results suggest that Alunitum, Melanterite, Plumbum, Borax is a useful natural resources and it is may be the possibility as a new drug material.

인간 유래 대장암 세포주에 대한 안식향 추출물의 항암활성 효과

노종혁 경남대학교 대학원 2023 국내석사

Cells are the elements that make up the human body and grow through cell division. When cells are damaged by various factors, apoptosis occurs in which cells die on their own, but when genes change, they multiply excessively, which is called Cancer. With the development of modern society, cancer treatments have also developed, but the number of cancer deaths and cancer developers is steadily increasing. Among them, the incidence of colon cancer in Korea is the highest in the world, due to westernized eating habits, heredity, obesity, drinking, and smoking. Colon cancer treatment consists of chemotherapy to prevent recurrence and metastasis after surgery. Most of the anticancer drugs used in chemotherapy are synthetic anticancer drugs and have side effects such as vomiting, diarrhea, and hair loss, so it is necessary to develop anticancer drugs that can eliminate or minimize them. In order to develop these anticancer drugs, natural products known to have fewer side effects and physiological activity were selected through various studies. Natural products are based on animals and plants that exist in nature, and many natural-based drugs have been developed so far, and the natural-drug market is expected to increase significantly. In this study, the first screening was conducted to find herbal medicines that show anticancer activity in human-derived colon cancer cell lines from herbal medicines, a type of natural product. As a result of screening 650 kinds of herbal medicine methanol extracts, 14 types of samples showed anticancer activity in the human-derived colon cancer cell line HT-29. Through a literature search, secondary screening was performed by selecting three types of sample resin, sabbatical scent, and blood cells without studies related to colorectal cancer. All three samples showed anticancer activity against HT-29, but the anticancer activity of the benzoinum was the best, so the benzoinum was finally selected. Benzoinum is a drug that has been dried after a resin has been leaked by wounding the stem of a Styrax benzoin dryander. It is produced in Asia, Thailand, and Vietnam and has the effect of talking, wound treatment, and heart pain relief. Anti-tumor activity for nerve cell protection, human liver cancer, lung cancer, breast cancer, and prostate cancer has been reported, but since there is no anti-tumor study on colon cancer, studies were conducted to confirm the anti-cancer activity of benzoinum for colon cancer. Colon cancer cell lines HT-29 were used to confirm the anticancer activity of the sabbatical, and morphological analysis, LDH release assay, colony formation assay, and Hoechst 33342 staining were performed. As a result of the experiment, the strong anticancer activity of the sabbatical was confirmed for the colon cancer cell line HT-29. Anti-cancer activity was additionally confirmed using SW620, a colon cancer cell line. Morphological analysis, MTT reduction assay, and LDH release assay showed the same activity as the anticancer activity identified in HT-29. In order to search for substances with anticancer activity in the benzoinum, the benzoinum was extracted with methanol and fractionated into ethyl acetate. The fraction was concentrated and separated and purified using the stepwise gradient and linear gradient methods using the silica gel column. After that, ASH-1 was separated under 60% acetonitrile conditions through HPLC. FAB-mass, QTOF-mass, and ESI-TOFMS were conducted to determine the chemical structure of ASH-1, and literature was searched based on the molecular composition and molecular weight measured through this. As a result, four substances were found and ASH-1 was likely to have a similar structure. Morphological analysis and MTT reduction assay were performed using the colon cancer cell line HT-29 to confirm anticancer activity against colon cancer. As a result of the experiment, ASH-1 confirmed strong anticancer activity against HT-29. Therefore, in this study, it was confirmed that Sabbath has anticancer activity against colon cancer cell lines, and based on this, it suggests the possibility of developing anticancer drugs for the treatment of colon cancer. 세포(Cell)는 인간의 몸을 구성하는 요소로 세포분열을 통해 성장한다. 다양한 요인으로 세포가 손상을 받으면 세포가 스스로 사멸하는 apoptosis가 일어나지만, 유전자가 변하게 되면 과다하게 증식하게 되는데 이것을 암(Cancer)이라 한다. 현대 사회의 발전으로 암 치료법도 발전하였지만 암사망자수와 암발생자수는 꾸준하게 증가하고 있다. 그 중 우리나라 대장암 발생율은 전 세계에서 최고 수준인데, 이는 서구화된 식습관, 유전, 비만, 음주, 흡연 등이 원인이다. 대장암 치료는 수술과 수술 이후의 재발 및 전이를 방지하기 위한 항암화학요법으로 이루어진다. 항암화학요법에 사용하는 항암제는 대부분 합성 항암제이며 구토, 설사, 탈모 등의 부작용이 있기 때문에 이를 없애거나 최소화할 수 있는 항암제 개발이 필요한 실정이다. 이러한 항암제 개발을 위하여 여러 연구를 통해 부작용이 적고 생리활성을 가졌다고 알려진 천연물을 선택하였다. 천연물은 자연에 존재하는 동물, 식물을 기원으로 하는 것으로 현재까지 천연물 기반 의약품이 많이 개발되었으며, 천연물의약품 시장도 크게 증가할 것으로 예상된다. 본 연구에서는 천연물의 일종인 한약재로부터 인간 유래 대장암 세포주에 항암활성을 보이는 한약재를 찾고자 1차 screening을 실시하였다. 한약재 methanol 추출물 650종을 screening한 결과, 14종의 sample이 인간 유래 대장암 세포주 HT-29에 항암활성을 보였다. 문헌검색을 통해 대장암 관련 연구가 없는 3종의 sample 송진, 안식향, 혈갈을 선별하여 2차 screening을 실시하였다. 3종의 sample 모두 HT-29에 대하여 항암활성을 보였지만, 안식향의 항암활성이 가장 뛰어났기에 최종적으로 안식향을 선정하였다. 안식향(Benzoinum)은 안식향나무(Styrax benzoin Dryander)의 줄기에 상처를 내어 수지를 유출시킨 후 건조시킨 약재이다. 아시아, 태국, 베트남에서 생산되며 거담 작용, 상처치료 심장 통증 완화 등의 효능이 있다. 신경세포 보호, 인간 간암, 폐암, 유방암, 전립선암 등에 대한 항종양 활성은 보고되었지만 대장암에 대한 항종양 연구는 없기 때문에 대장암에 대한 안식향의 항암활성을 확인하기 위하여 연구를 진행하였다. 안식향의 항암활성을 확인하기 위하여 인간 유래 대장암 세포주 HT-29를 사용하였으며 Morphological analysis, LDH release assay, Colony formation assay, Hoechst 33342 staining을 실시하였다. 실험 결과, 대장암 세포주 HT-29에 대하여 안식향의 강한 항암활성을 확인하였다. 다른 유형의 인간 유래 대장암 세포주인 SW620을 이용하여 추가적으로 항암활성을 확인하였다. Morphological analysis, MTT reduction assay, LDH release assay를 실시한 결과, HT-29에서 확인한 항암활성과 동일한 활성을 나타내었다. 안식향에서 항암활성을 가지는 물질을 탐색하고자 안식향을 methanol로 추출하고 ethyl acetate로 분획하였다. 분획물을 농축하여 silica gel column을 이용하여 stepwise gradient, linear gradient 방식을 통해 분리 및 정제를 실시하였다. 그 후에 HPLC를 통하여 60% acetonitrile 조건에서 ASH-1을 분리하였다. ASH-1의 화학구조를 결정하기 위하여 FAB-mass, QTOF-mass, ESI-TOFMS를 실시하였고, 이를 통해 측정한 분자조성과 분자량을 토대로 문헌검색을 실시하였다. 그 결과 4개의 물질을 찾아내었고 ASH-1이 이들과 유사한 구조를 가질 가능성이 있다고 예상한다. 대장암에 대한 항암활성을 확인하기 위하여 인간 유래 대장암 세포주 HT-29를 이용하여 Morphological analysis, MTT reduction assay를 실시하였다. 실험 결과, ASH-1이 HT-29에 대한 강한 항암활성을 확인하였다. 따라서 본 연구에서는 안식향이 대장암 세포주에 대한 항암활성이 있는 것을 확인하였고 이를 토대로, 안식향이 대장암 치료를 위한 항암제 개발의 가능성을 제시하는 바이다.

매실(Prunus mume) 추출물의 생리활성 연구

박지해 경남대학교 대학원 2022 국내석사

매실은 장미과에 속하는 매화나무의 열매로서 예로부터 여러 가지 생리활성이 인식되어 민간요법에 사용되어 왔다. 우리나라 중 경상남도 하동의 특산물로 생산되고 있다. 본 연구에서는 동결 건조된 매실 가루를 이용하여 MeOH, EtOH, acetone을 이용하여 용매 추출물을, 증류수를 이용하여 아임계수 추출물을 제조 하여 DPPH, 총 페놀함량을 비교하였다. 매실의 항산화능을 비교했을 때 아임계수 추출에서 DPPH 라디칼 소거능이 높게 나타내었고, 총 페놀 함량의 경우 용매 추출물 중 메탄올 추출물이 가장 높은 총 페놀 함량 나타내었지만, 아임계수 250℃ 추출물이 메탄올 추출물보다 6.9 배 높은 총 페놀 함량을 나타내었다. 총 페놀 함량에서 아임계수 추출물에서 제일 높은 활성이 나와 아임계수 온도별 추출물을 사용하여 생리학적활성 탐색에 대한 연구를 실시하였다. HT-29의 항암활성, PC-12의 세포보호효과를 알아보기 위해 MTT assay를, 알코올 대사 관련 효소 활성을 알아보기 위해 ADH, ALDH의 활성을, 피부미백활성을 알아보기 위해 tyrosinase의 저해활성과 melanocyte 이용한 실험을 실시하였다. 이 중 미백 실험에서 높은 활성이 나와 미백 연구를 진행 하고자 한다. 기능성 화장품에는 피부에 melanin 색소가 침착되는 것을 방지하거나 엷게 하는 피부미백제, 주름개선제, 일소 및 일소방지제로 정의하고 있다. 그 중 피부미백제는 과학적 활성검증 기술의 미비함과 미백 기능성을 나타내는 자원의 한계성으로 인해 천연물 유래 소재개발이 요구되며, 특히 하얀 피부를 갈망하는 동아시아 등의 시장에서 큰 관심사로 대두된다는 점에 착안하여, 항산화성이 있는 피부미백에 대해 연구를 하고자 한다. 아임계수 250℃ 추출물을 농도별로 제조하여 tyrosinase 활성 저해 실험, melanocyte를 이용한 실험을 통해 제일 높은 농도에서 높은 활성이 나왔고, western blot을 실시하여 멜라닌 기전 규명을 한 결과 Tyrosinase와 TRP-1 단백질의 발현이 농도 의존적으로 감소함을 알 수 있었다. 매실 자체만의 미백활성 물질로서의 기능을 시사하였고, 매실 아임계수 추출물로부터 항산화성이 포함된 미백활성 물질 탐색의 필요성을 제시함. To investigate the antioxidant activity of maesil (Prunus Mume), methanol, ethanol, acetone, and subcritical water extract (SWE) were prepared. To accomplish this, maesil powder (0.1 g) was placed in a stainless vessel containing 10 mL of distilled water, after which subcritical water extraction was carried out at 150, 200, and 250 °C for 30 min. The content of the SWE total phenolic compounds and DPPH radical scavenging activity test was higher than that of the solvent (methanol, ethanol, acetone) extracts. As a result of testing to confirm the potential of plum SWE as a whitening agent, it was found that plum SWE had non-cytotoxic and depigmenting activity in IBMX-induced B16-F10 melanoma cells. Also, Mechanism of depigmenting effect of maesil SWE evaluated by western blot analysis. The results, what maesil SWE inhibit IBMX-induced melanogenesis in B16-F10 cells is caused by reducing expression of tyrosinase protein. Therefore, this study indicates that SWE might be a useful method for increasing the physiological activity of maesil as a useful inhibitor of melanogenesis and it might be effective in hyperpigmentation disorders and whitening cosmetics.

항암제 내성을 억제하는 물질 탐색 및 기전 연구

이연지 경남대학교 대학원 2019 국내석사

Chemotherapy is a treatment that works on cancer cells that spread throughout the body. As the number of treatments increases, cancer patients have resistance to anticancer drugs. Cancer cells grow continuously due to abnormal physiological environment, so the cores of cancer cells far from blood vessels is surrounded by microenvironmental stress conditions such as hypoglycemia, hypoxia, and nutrient starvations. The microenvironmental stress conditions causes two kinds of cell biological changes. The first is the accumulation of proteasome in the nucleus. When the proteasome accumulates, the topoisomerase-Ⅱα is degraded, and anticancer drugs targeting topoisomerase-Ⅱα lose their target and resistance to anticancer drugs. The second is up-regulation of GRP78 protein in the endoplasmic reticulum. Up-regulated GRP78 does not activate caspase-7 by binding to procaspase-7. Therefore, the caspase pathway is blocked, leading to the anticancer drug resistance. Based on this mechanism, studies about anticancer drugs resistance under microenvironmental stress conditions in cancer cells were conducted, we established a new screening system for anticancer drugs that inhibit the viability of cancer cells that have acquired resistance under microenvironmental stress conditions. We isolated the active compound JS-18-25 from Bomby mori Linne through silica gel column chromatography, LH-20 column chromatography and high performance liquid chromatography (HPLC). Finally, We confirmed that JS-18-25 was identified as that of dehydrovomifoliol by ESI-Mass spectrum, 1H-NMR and 13C-NMR analysis. Although dehydrovomifoliol has various biological activities, the inhibition of anticancer drug resistance has not been reported. Dehydrovomifoliol is not cytotoxic under normal conditions and inhibits degradation of topoisomerase-Ⅱα in microenvironmental stress conditions. We suggested the possibility of dehydrovomifoliol as a new inhibitor for anticancer resistance induced by microenvironmental stress in cancer cells. 암은 인간 평균 수명의 연장으로 인한 노령인구의 증가, 서구화된 식생활, 운동부족 및 스트레스 등으로 인해 사망률이 매년 지속적으로 증가하는 질병이다. 이러한 암을 치료하는 방법으로는 외과적 수술, 방사선 치료 및 화학요법 등이 있으며 암의 재발 및 전이 방지를 위해 화학요법이 기본적으로 병용 치료된다. 항암제를 사용하여 치료하는 항암화학요법은 항암제가 혈류를 따라 온몸에 퍼져있는 암세포에 작용하는 치료법이며 치료 횟수가 증가할수록 암환자가 항암제에 대한 내성을 획득하게 되는 문제점이 있다. 항암제의 내성 기전으로는 암세포가 가지는 비정상적인 생리환경으로 인해 계속적으로 덩어리지며 성장함으로써 혈관으로부터 멀리 떨어지게 되어 glucose, oxygen, nutrition 등의 공급이 원활하지 않은 미세환경 스트레스 상태에 놓이게 되며, 이러한 스트레스 상태의 암세포에서는 두 가지의 세포생물학적 변화가 나타난다. 첫째, 핵내 proteasome 양의 증가와 축적으로 topoisomerase-Ⅱα를 분해한다. 둘째, 소포체내에서 분자샤페론 GRP78의 과발현을 유도하여 caspase pathway가 blocking된다. 본 연구에서는 암세포내 미세환경 스트레스로부터 유도되는 항암제 내성을 억제하는 효과를 가지는 새로운 내성억제제 탐색을 위해 국내·외에서 자생하는 636종의 한약재 추출물을 이용하여 screening을 실시한 결과, 잠사(Bombyx mori Linne) 추출물이 항암제 내성억제활성을 가지는 것을 확인하였다. 잠사 추출물은 정상상태의 암세포에서는 세포독성을 보이지 않았으며 미세환경 스트레스 상태에서 강력한 내성억제활성을 나타내었다. 잠사는 누에 Bombyx mori의 분변으로 알려져 있으며 알려진 효능으로는 염증완화, 노화억제, 중풍억제, 혈압과 콜레스테롤 저하 등의 생리활성이 있으나, 항암제 내성억제활성에 관한 연구는 아직 전무한 상태이다. 따라서 본 연구팀은 잠사 methanol 추출물로부터 항암제 내성억제활성을 가지는 생리활성물질을 분리하고자 극성도를 달리하여 n-hexane, diethyl ether, ethyl acetate, water로 순차적으로 분획하였다. 그 중 활성이 있는 diethyl ether 층을 silica gel column, LH-20 column chromatography와 HPLC를 실시하여 단일물질을 분리하였다. 이 활성물질을 JS-18-25라 명명하였고, JS-18-25의 화학 구조를 결정하기 위해 ESI-Mass, NMR spectrum 분석을 실시하였다. 이를 바탕으로 문헌조사를 실시한 결과, JS-18-25는 기존의 sesquiterpenoid계 화합물인 dehydrovomifoliol과 동일한 구조임을 확인하였다. 다음으로 dehydrovomifoliol의 세포생물학적 기전 연구를 실시하여 암세포내 미세환경 스트레스에 의해 유도된 항암제 내성을 억제하는 새로운 항암제 내성억제제로써의 가능성을 제시하였다.

류마티스 관절염을 억제하는 물질의 탐색 및 기전 연구

강민경 경남대학교 대학원 2018 국내석사

Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that causes chronic inflammatory in the joints and causes fatal disorders in the joints. There are various inflammatory factors in the joint of patients with rheumatoid arthritis. The pro-inflammatory cytokines TNF-α, IL-6 and Nitric Oxide (NO) are the major causes and play an important role in the immune system. However, if it is overproduced, it will cause an inflammatory reaction. Thus, it is important to regulate TNF-α, IL-6 and NO. In this study, we examined the effect of inhibiting inflammatory by using 628 kinds of natural products in the RAW 264.7 cells induced by LPS. As a result of screening, Cassia angustifolia Vahl was selected. Cassia angustifolia Vahl is widely used as laxatives. It is toxic to humans and can be used as a small amount of drug, and can not be used as a raw material for food. Therefore, several biological experiments were conducted to confirm the inhibitory effect of Cassia angustifolia Vahl methanol extract (CAM) on rheumatoid factor. The inflammatory response of RAW 264.7 cells was induced by LPS and the inhibitory effect of inflammatory factors was confirmed by MTT reduction assay, NO production assay, Morphological assay, ELISA assay. As a result, inhibition of rheumatoid arthritis related factors of Cassia angustifolia Vahl in LPS induced RAW 264.7 cells was confirmed. Thus, Cassia angustifolia Vahl was given to the possibility to a natural drug material. 류마티스 관절염은 자가면역질환 중 하나이며 관절에 만성적인 염증이 생겨 치명적인 장애를 일으키는 질환이다. 류마티스 관절염 환자의 관절 안에는 여러 가지 염증인자들이 생성되어 있다. 주로 pro-inflammatory cytokines인 TNF-α, IL-6와 NO가 주원인인데, 이들은 일반적으로 면역작용에서 중요한 역할을 하지만 과잉으로 생산되면 염증반응을 일으키게 된다. 따라서 류마티스 관절염은 염증으로부터 이어지며 과잉 생산되는 염증 인자들을 조절하는 것이 중요하다. 본 연구에서는 국내·외에서 자생하는 628종의 천연물자원을 대상으로 염증반응이 유도된 RAW 264.7 세포에 염증억제 효과를 가지는 물질을 탐색하기 위하여 screening을 실시하였고, 그 결과 센나엽을 선별할 수 있었다. 센나엽은 통변효과가 뛰어나 주로 완하제로 사용하고 있으며 사람에게 독성이 있어 소량의 약물로는 사용할 수 있으나 식품의 원료로는 사용하지 못하는 생약으로 분류되어 있다. 따라서 센나엽 methanol 추출물(CAM)의 류마티스 관련 인자 억제 효과를 확인하기 위해 여러 생물학적 실험을 실시하였다. RAW 264.7 세포의 염증반응은 LPS로부터 유도하였고, MTT reduction assay, NO production assay, Morphological assay, ELISA assay를 통하여 염증 인자 억제 효과를 확인하였다. 따라서 본 연구는 LPS로부터 염증반응이 유도된 RAW 264.7 세포에서 센나엽의 류마티스 관절염 관련 인자의 억제 효과를 확인하여 류마티스 관절염 치료제 개발의 가능성을 제시하고자 하는 바이다.

토양 유래 방선균 Embleya hyalina의 췌장암 세포주 PANC-1에 대한 세포독성효과

여라경 경남대학교 대학원 2022 국내석사

현대 의학의 발전으로 암 치료법이 개선되었음에도 불구하고 여전히 우리나라 전체 사망률의 1위를 차지하고 있는 것은 암이다. 그 중에서도 췌장암은 다른 암들에 비해 특히 예후가 좋지 않아 매우 치명적인 악성종양 중 하나이다. 췌장암은 특별한 초기 증상이 없고 여러 장기에 둘러싸여 있기 때문에 암의 발견이 매우 어렵다. 따라서 환자가 이상증상을 느껴 병원에 방문했을 때에는 이미 암이 상당히 진행된 상태이거나 수술을 할 수 없는 경우가 대부분이며 조기에 발견되어 수술을 하더라도 재발률이 매우 높고 다른 장기로의 전이가 쉽고 빠르기 때문에 대부분의 환자는 암이 진행된 상태로 발견하게 된다. 암의 성장을 저해하기 위해서는 항암제를 사용하여 암을 치료하는 항암화학요법이 필수적으로 진행되어야 하지만 암환자들은 항암제로 인한 부작용을 겪고 있다. 따라서 췌장암세포에는 선택적으로 세포사멸효과와 성장억제효과를 보이면서 정상세포의 성장에는 영향을 미치지 않는 치료제의 개발이 시급한 상황이다. 이와 같은 조건을 충족하기 위해서는 화학적 부작용이 덜한 천연물 유래 항암치료제의 탐색이 필요하다. 따라서 본 연구에서는 천연물자원인 방선균으로부터 췌장암 세포주에 항암활성을 보이는 물질을 탐색하였다. 결과적으로 한국생명공학연구원으로부터 분양받은 토양 유래 방선균 배양액 2,000종의 acetone 추출물을 이용하여 screening을 실시한 결과, 토양유래 방선균주 AN121147이 매우 낮은 농도에서도 뛰어난 항암활성 효과를 가지는 것을 확인하였다. AN121147은 Embleya hyalina라는 방선균주로 알려져 있으며 이에 대한 활성피크를 찾고자 EtOAc 용매추출하여 silica gel column, LH-20 column chromatography와 HPLC를 실시하여 단일물질을 분리하였다. 이 활성물질을 AC-21-32로 명명하였고, AC-21-32의 화학구조를 결정하기 위해 FAB-Mass, HR FAB-Mass, NMR spectrum 분석을 실시하였다. 이를 바탕으로 문헌조사를 실시한 결과, AC-21-32는 기존의 L-156,602와 동일한 구조임을 확인하였고, 다음으로 L-156,602의 항암활성 연구를 실시하였다. 최종적으로 L-156,602가 인간 췌장암 세포주인 PANC-1에서 낮은 농도에서도 강한 항암활성을 보이는 것을 확인하였으며, 토양 유래 희소 방선균주인 Embleya hyalina가 인간 췌장암 세포주인 PANC-1에서 뛰어난 항암활성효과를 보이는 것을 여러 실험을 통해 확인하였으며, 이는 췌장암 치료제로서 새로운 천연물 신약소재의 가능성을 제시하고자 한다. Pancreatic cancer is one of the most fatal malignant tumors due to its poor prognosis compared to other cancers. Pancreatic cancer has no special initial symptoms and is surrounded by various organs, so it is very difficult to detect cancer, and when a patient visits a hospital due to abnormal symptoms, surgery is not possible because the cancer has already progressed considerably. In order to hinder the growth of cancer, chemotherapy to treat cancer using anticancer drugs must be carried out, but cancer patients are suffering from side effects from anticancer drugs. Therefore, it is urgent to develop a treatment that shows cell death and growth inhibitory effects on pancreatic cancer cells and does not affect the growth of normal cells. In order to meet these conditions, it is necessary to search for natural-derived anticancer drugs with less chemical side effects. Therefore, in this study, substances exhibiting anti-cancer activity in pancreatic cancer cell lines were explored from the natural resource, Actinomyces. As a result, it was confirmed that the soil-derived Actinomyces AN121147 has an excellent anticancer activity effect even at very low concentrations. AN121147 is known as a radiation strain called Embleya hyalina, and a single substance was separated by performing silica gel column, LH-20 column chromatography, and HPLC using EtOAc solvent extracts to find an active peak. This active substance was named AC-21-32, and FAB-Mass, HR FAB-Mass, and NMR spectrum analysis were performed to determine the chemical structure of AC-21-32. As a result of conducting a literature survey based on this, it was confirmed that AC-21-32 has the same structure as the existing L-156,602, and the study was conducted because there were no reports of anticancer activity studies of L-156,602. Finally, it was confirmed that L-156,602 showed strong anticancer activity even at low concentrations in PANC-1, a human pancreatic cancer cell line, and Embleya hyalina, a soil-derived Actinomyces, showed excellent anticancer activity in PANC-1, a human pancreatic cancer cell line, to suggest the possibility of a new natural drug material as a treatment for pancreatic cancer.

경찰조직문화와 직무만족의 관계에서 직무스트레스의 매개효과 연구

박종문 경일대학교 행정대학원 2022 국내박사

최근 우리나라에서 발생하는 범죄는 흉포화와 더불어 저연령화, 높은 재범률 등으로 우리사회의 안전이 위협받고, 두려움으로 인해 시민의 삶의 질이 저하되는 부정적 결과를 초래하게 되었다. 이러한 상황에서 공공질서와 공공안녕을 위한 경찰의 역할이 증대되었으며, 경찰인력과 예산 등 자원의 충분한 확보와 효율적 운영의 필요성이 강조되고 있다. 이와 더불어 국민의 생명과 재산을 보호하는 경찰조직의 목표달성에 중요한 것은 조직문화와 조직원의 직무만족이라 할 것이다. 선행연구에 따르면 경찰조직의 경우 경찰관이 본인의 직무에 불만족할 경우 업무를 수행함에 있어 양적질적인 면에서 부정적인 결과를 가져온다고 한다. 이는 자연스럽게 국민의 안전에 직접적인 영향을 미치게 될 것이며, 시민에게 부정적 태도를 취함으로써 경찰과 지역사회의 관계에서 부정적 결과를 초래하게 되는 것이다. 직무만족과 관련이 있는 또 다른 중요한 변수는 직무스트레스이다. 직무에 대해 스트레스를 경험하게 되면 개인의 삶에도 부정적 영향을 가져오게 된다. Hoath 등(1998)은 경찰관이 직무에 대한 불만족이 지속될 경우 직무스트레스를 경험하게 되며, 한계에 도달하게 될 경우 소진(burn out), 이직 등을 심화시키는 주요 원인이 된다고 하였다. 이상과 같이 조직문화와 직무만족, 직무스트레스와 직무만족 등 각 변수들 간의 인과관계를 분석하는 많은 선행연구들이 있으나, 두 변수간의 관계에만 한정하여 분석하거나 다른 변수를 매개변수 또는 종속변수 그리고 독립변수에 추가하는 연구가 다수를 이루고 있었다. 또한 선행연구를 바탕으로 보았을 때 조직문화와 직무만족 그리고 직무스트레스는 인과관계가 성립되고 있음을 알 수 있으며, 이에 본 연구에서는 조직문화와 직무만족, 직무스트레스 등의 관계를 중심으로 살펴보고자 한다. 본 연구의 목적을 달성하기 위하여 조사대상자는 대구경북권 경찰서, 파출소 등에서 근무하고 있는 조직원 중 집락표본추출방법을 사용하여 선정하였다. 이들을 대상으로 구조화된 설문지를 바탕으로 설문조사를 실시하였으며, 자기기입식(Self- administered) 방법을 사용하였다. 설문지는 총 500부를 배포하였으며, 최종적으로 응답한 422명(회수율 84.4%)을 분석대상자로 확정하여 분석에 활용하였다. 경찰조직문화와 직무만족의 관계에서 직무스트레스의 매개효과를 검증하기 위하여 SPSS와 AMOS 통계프로그램을 활용하여 분석하였으며, 기술통계분석, 빈도분석, 상관관계 분석, 신뢰도분석, 확인적 요인분석, 경로검증, 붓스트래핑(Bootstrapping)을 활용한 효과성검증을 실시하였다. 주요 연구결과는 다음과 같다. 첫째, 주요변수에 대한 기술통계분석을 실시한 결과이다. 경찰조직문화의 하위요소별 평균을 살펴보면, 위계문화는 3.89점(표준편차 0.74), 합리문화는 3.96점(표준편차 0.85), 집단문화는 3.01점(표준편차 0.68), 혁신문화는 2.51점(표준편차 0.87)으로 각각 나타났다. 직무만족의 하위요인에 대한 기술통계 값은 내재적 요인의 평균은 3.46점(표준편차 0.72), 외재적 요인의 평균은 2.74점(표준편차 0.84)으로 나타났다. 직무스트레스의 하위요인에 대한 기술통계 값은 직무요구 스트레스 평균은 3.34점(표준편차 0.74), 관계갈등 스트레스의 평균은 2.37점(표준편차 0.74), 보상관련 스트레스의 평균은 3.29점(표준편차 0.94), 업무관련 스트레스의 평균은 3.07점(표준편차 0.77)으로 나타났다. 둘째, 주요변수 상관관계를 분석한 결과, 10개 변수의 관계는 p<.01 수준에서 통계적으로 유의미한 것으로 나타났다. 셋째, 인구사회학적 변수(성별, 연령)를 바탕으로 경찰조직문화(집단문화, 합리문화, 위계문화, 혁신문화), 직무만족, 직무스트레스에 대한 집단 간 차이분석을 실시한 결과는 다음과 같다. 성별에 따른 차이분석을 실시한 결과 경찰조직문화 중 위계문화에서만 통계적으로 유의미한 차이가 나타났다. 이는 여자 경찰이 남자 경찰보다 위계문화에 높은 수용적 인식을 갖고 있으며, 여자 경찰이 남자 경찰에 비해 상대적으로 업무처리에 있어 절차와 규칙의 준수를 중시하는 것으로 해석할 수 있으며, 실무적인 경험과도 부합되는 것이라 할 수 있다. 한편, 연령에 따른 차이분석을 실시한 결과 혁신문화, 직무만족 그리고 직무스트레스에서 통계적으로 유의미한 차이가 발견되었다. 넷째, 경찰조직문화와 직무만족의 관계에서 직무스트레스의 매개효과를 분석한 결과 직무스트레스가 매개효과로 작용하고 있음을 확인하였다. 다섯째, 각 변수의 하위요인을 측정변수로 설정하여 변수들 간의 관계를 분석하였다. 경찰조직문화와 직무만족의 관계에서 직무스트레스의 매개효과를 검정한 결과 집단문화와 외재적 요인, 내재적 요인의 관계에서 직무스트레스는 매개효과가 있는 것으로 나타났다. 또한, 혁신문화와 외재적 요인의 관계에서 직무스트레스가 매개효과를 가지는 것으로 나타났다. 다른 경찰조직문화의 하위요소에서는 통계적으로 유의미한 결과가 도출되지 않았다. 본 연구에서 제시하는 함의는 다음과 같다. 첫째, 경찰조직문화를 측정할 때 자치경찰제에 대한 인식, 내용 등을 포함할 필요가 있다. 둘째, 경찰조직 내 문화를 긍정적 문화로 만들기 위해 다각적 노력이 필요하다. 셋째, 경찰조직구성원의 직무만족을 향상시키기 위해서 적절한 보상체계가 마련되어야 할 것이다.