Baicalin protects hepatic ischemia/reperfusion injury in alcoholic fatty liver

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Fatty livers are susceptible to greater ischemia/reperfusion (I/R) injury and a higher incidence of primary graft nonfunction after transplantation. The burst of reactive oxygen species generated after reperfusion may contribute to the initiation of post-ischemic injury and to the subsequent inflammatory infiltration. Baicalin is the major active component extracted from Scutellaria baicalensis, one of the most widely used herbal preparations for the treatment of inflammatory disorders. The aim of this study was to investigate the cytoprotective properties of baicalin against injury to the liver caused by I/R in alcoholic fatty liver. Rats were fed an alcohol liquid diet or a control isocaloric diet for 5 weeks, and then subjected to 60 min of hepatic ischemia and 5 h of reperfusion. Baicalin (200mg/kg) was administered intraperitoneally 24 and 1 h before ischemia. The serum alanine aminotransferase (ALT) activity and lipid peroxidation significantly increased, whereas the hepatic glutathione content decreased in ethanol diet-fed animals compared with control diet-fed animals. These changes were attenuated by baicalin. The serum levels and mRNA expressions of tumor necrosis factor-a (TNF-a) and interleukin-6 (IL-6) increased significantly in ethanol diet-fed animals. Furthermore, cyclooxygenase-2 (COX-2), inducible nitric oxide synthase (iNOS), and heme oxygenase-1 (HO-1) protein and mRNA expression increased significantly in ethanol diet-fed animals. Baicalin attenuated the increase in seum levels and mRNA expressions of TNF-a and IL-6, and protein and mRNA expressions of COX-2, iNOS and IL-6. In contrast, the increase in the level of HO-1 protein and mRNA expression, an anti-inflammatory mediator, was augmented by baicalin. Furthermore, baicalin inhibited the activation of nuclear transcription factors, nuclear factor-𝜅B (NF-𝜅B) and activator protein (AP-1), that regulates inflammation and cell death.In conclusion, our findings suggest that baicalin protects alcoholic fatty liver exposed to ischemia/reperfusion injury, and this protection is likely due to the inhibition of pro-inflammatory mediators and the induction of HO-1 expression.

국문 초록 (Abstract)

간장이식은 면역억제제를 이용한 치료 및 외과적 수술기법 등의 발달로 현재 간 질환 말기 환자들에게서 가장 표준화된 치료 방법으로 사용되고 있다. 그러나, 간장은 다른 장기에 비해 장기 기증자의 부족이 가장 심각한 문제로 남아있으므로, 최근에는 기증 가능한 장기의 범위를 넓히기 위한 연구가 계속되고 있다. 이에 대한 원인 및 기전은 아직 불투명한 상태로 남아있지만 허혈 및 재관류에 의한 간장 손상이 주요한 원인이며, 특히 허혈 시간의 증가는 곧바로 손상의 증가로 이어지는 것으로 알려져 있다. 특히, 지방간은 이러한 허혈 및 재관류 손상에 매우 민감하고, 이로 인한 이식 후 거부반응의 가능성이 매우 높다고 알려져있다. 재관류 이후에 생상되는 활성산소종은 이러한 허혈 및 재관류 손상과 이어지는 염증반응의 주요 원인으로 알려져있다. 이러한 허혈 및 재관류 손상은 만성적인 알코올 섭취에 의해 유발되는 지방간에 있어서 더욱 더 심하게 일어난다. 간 내 비정상적인 지방축적을 그 특징으로 하는 지방간에서 허혈 및 재관류 손상이 정상간보다 심하게 일어나는 주 요인으로는 지질과산화의 증가, 간장대식세포나 호중구의 활성, 간장 내 미세 혈류의 변화 그리고 TNF-α 같은 염증 매개 물질의 분비 증가 등이 거론되고 있지만 아직도 많은 부분이 해결되지 않은 채 불투명한 상태로 남아 있다.
이미 오래 전부터 이를 극복하기 위한 다양한 시도들이 있었으며, 항산화 및 항염증 작용을 가진 물질들이 세포손상을 줄이기 위한 약물로 시도되고 있다. 황금은 동양에서 전통적으로 항염증제, 관절염 치료제 및 평활근 이완제로서 사용되어 왔으며 중국, 일본, 한국에서 간보호 작용을 가지는 약초로서 널리 이용되어왔다. Baicalin은 황금의 뿌리에서 추출되는 활성성분으로 활성산소종을 제거하며 항염증 작용을 가진다고 알려져 있다. 최근 보고에 따르면 baicalin은 심장 근육세포의 허혈 및 재관류 손상 시 산화물을 제거하고, 노화된 흰쥐의 신장 조직에서 NF-kB 활성을 억제함으로써 허혈 및 재관류 손상으로부터 보호 작용을 나타낸다고 한다.
본 연구는 알코올성 지방간에서의 허혈 및 재관류시 나타나는 손상에 대해 알아보고, 그에 대한 baicalin의 보호작용에 대해 알아보았다. 60 분 간의 허혈과 5 시간의 재관류를 유도 하였으며 허혈 처치 24 시간 전과 1시간 전에 baicalin (200 mg/kg)을 각각 복강으로 투여 하였다. Lieber-DeCarli 방법에 의해 유발시킨 알코올성 지방간의 간장내 triglyceride의 함량은 정상간에 비해 유의적으로 증가하였다. 간장 기능의 손상 지표인 ALT활성은 허혈을 일으키지 않은 동물 비해 허혈 및 재관류시 그 활성이 현저히 증가하였으며, 특히 알코올성 지방간의 경우에는 정상간에 비해 현저히 증가하였다. 이러한 증가는 baicalin 처치시 현저히 억제되었으며, 이러한 간보호 효과는 조직학적 검사에서도 확인할 수 있었다.
지질과산화의 지표인 MDA는 허혈 및 재관류 5시간 후 증가되었으나, 세포 내 항산화 물질인 glutathione 은 감소되었다. 이러한 산화적 손상은 정상간에 비하여 알코올성 지방간에서 현저하였다. 하지만 baicalin 투여시에는 이러한 변화가 현저히 억제되었다. 또한, 허혈 및 재관류로 인해 유도된 내인성 항산화 물질인 HO-1 단백질 및 유전자 발현의 경우, 정상간에 비해 알코올성 지방간에서 현저히 적었으나, baicalin 전처치로 인하여 HO-1의 발현량이 정상간과 비슷한 수준으로 강화되었다. 이로써 지방간에서 더욱 심각하게 진행된 허혈 및 재관류로 유도된 세포 손상이 baicalin의 투여로 현저히 억제되는 것을 관찰할 수 있었으며, 이는 baicalin의 항산화 활성과 관련이 있음을 확인하였다.
또한, 대표적인 염증매개 인자인 TNF-α, IL-6, COX-2 와 iNOS의 단백질 및 유전자 발현량을 측정한 결과 TNF-α, IL-6, COX-2 및 iNOS가 허혈 및 재관류 5시간 후 현저히 증가 되었으며, 이는 알코올성 지방간군에서 더욱 현저하였다. 하지만 baicalin의 전처치로 인하여 염증매개인자들의 발현이 유의적으로 억제 되었다.
세포 자멸사의 지표인 TUNEL 양성반응, caspase-3 활성 및 세포기질 내 cytochrome c 유입량은 허혈 및 재관류 5 시간 후 현저히 증가되었고, 이 또한 알코올성 지방간에서 더욱 현저하였다. Baicalin 전처치에 의해서 이러한 세포 자멸사의 유의적인 감소가 확인되었다.
또한 이러한 염증 및 세포사멸을 조절하는 전사인자인 핵 내 NF-κB 활성 및 cJun의 인산화는 허혈 및 재관류시 현저히 증가하였으며, 이 또한 알코올성 지방간에서 현저하였다. 이러한 변화는 baicalin 전처처군에서 현저히 억제되는 것을 관찰하였다.
이상의 결과를 종합하여 볼 때 baicalin은 알코올 섭취로 인해 발생된 알코올성 지방간의 허혈 및 재관류 후의 세포괴사 및 세포자멸사를 완화 시켰으며 이는 NF-κB 및 AP-1 활성을 억제함으로 염증매개인자의 발현을 억제하였고, 특히 HO-1 효소의 발현량을 유의적으로 증가시킴으로 간보호 작용을 나타내었다. 따라서 본 연구는 baicalin을 투여하는 것이 지방간의 이식 등에서 나타나는 허혈 및 재관류에 의한 간장 손상 및 기능 이상에 대한 새로운 예방제로서 탁월한 후보물질이 될 수 있을 것으로 사료된다.

목차 (Table of Contents)

• I. INTRODUCTION 1
• 1. Hepatic ischemia/reperfusion 1
• 2. Alcoholic fatty liver 2
• 3. Alcoholic fatty liver and I/R injury 3
• 4. Two types of cell death in hepatic I/R: Necrosis and Apoptosis 3
• 5. Oxidative stress and cellular signaling 4
• 5.1. NF-κB 6
• 5.2. AP-1 7
• 5.3. Nrf2 8
• 6. Baicalin 9
• 7. Aims of the study 11
• II. MATERIALS AND METHODS 12
• 1. Materials 12
• 2. Instruments 14
• 3. Animals 15
• 3.1. Liquid diet technique for induction of alcoholic fatty liver 15
• 3.2. Preparation of liquid diet 16
• 3.3. Pair-feeding 16
• 4. Hepatic I/R procedure 17
• 5. Experimental groups 18
• 6. Analytical procedures 18
• 6.1. Liver to body weight ratio 19
• 6.2. Serum and tissue triglyceride levels 19
• 6.3. Serum alanine aminotransferase activity 19
• 6.4. Histological analysis 20
• 6.5. Hepatic lipid peroxidation 20
• 6.6. Hepatic glutathione contents 20
• 6.7. Serum TNF-α and IL-6 levels 21
• 6.8. Preparation of nuclear and cytosolic extraction 21
• 6.9. Western blotting analysis 22
• 6.10. Total RNA extraction 23
• 6.11. Reverse transcription polymerase chain reaction 23
• 6.12. Detection of apoptotic cells 24
• 6.13. Caspase-3 activity 25
• 7. Statistics 26
• III. RESULTS 27
• 1. Induction of alcoholic fatty liver 27
• 1.1. Liver weight to body weight ratio 27
• 1.2. Hepatic triglyceride content 27
• 1.3. Serum triglyceride level 27
• 2. Liver necrosis 28
• 2.1. Serum alanine aminotransferase activity 28
• 2.2. Histological analysis 28
• 3. Oxidative damages 29
• 3.1. Hepatic lipid peroxidation 29
• 3.2. Hepatic glutathione contents 29
• 3.3. HO-1 protein level and mRNA expression 30
• 4. Inflammation 30
• 4.1. Serum TNF-α level and mRNA expression 30
• 4.2. Serum IL-6 level and mRNA expression 31
• 4.3. iNOS protein and mRNA expression 31
• 4.4. COX-2 protein and mRNA expression 32
• 5. Apoptosis 33
• 5.1. Caspase-3 activity 33
• 5.2. Cytosolic cytochrome c release 33
• 5.3. Apoptotic cell detection 34
• 6. Transcription factors 34
• 6.1. IκB-α degradation and NF-κB/p65 translocation 34
• 6.2. Nuclear phosphorylated c-Jun expression 35
• 6.3. Nuclear Nrf2 expression 35
• IV. DISCUSSION 61
• V. REFERENCES 68
• VI. 국문요약 78