파킨슨병 흰쥐 모델을 통한 레보도파 유발 이상운동증에서 세로토닌 신경계의 역할 = Role of Serotonergic System in Levodopa Induced Dyskinesia in Parkinson’s Disease Rats

국문 초록 (Abstract)

레보도파는 파킨슨병에서 가장 효과적이며, 널리 사용되는 치료 약제이나, 장기간 투여는 레보도파 유발 이상운동증을 유발할 수 있다. 레보도파 유발 이상운동증 발생 시기 및 나타나는 정도는 환자에 따라 차이가 크며, 일부에서는 전혀 발생하지 않기도 한다. 레보도파 유발 이상운동증의 발생에 도파민 외에도 다양한 신경전달물질들이 관여한다고 알려져 있으며, 특히 세로토닌 신경세포 말단에서 도파민을 분비할 수 있어 레보도파 유발 이상운동증에서 세로토닌 신경계의 역할에 대한 연구 결과들이 발표되고 있다. 때문에 본 연구에서는 파킨슨병 흰쥐 모델에서 레보도파를 장기간 투여하여, 레보도파 유발 이상운동증을 유도하고, 유도된 모델과 유도되지 않은 모델에서 세로토닌 신경계를 비교함으로써, 레보도파 유발 이상운동증에서 세로토닌 신경계의 역할에 대해 규명해보고자 하였다.

흰쥐에서 내측 전뇌속(medial forebrain bundle)에 6-hydroxydopamine을 주입하여 파킨슨병 모델을 제작하고, forepaw adjusting step 검사를 통해 증상 발현을 확인하였다. 파킨슨병 흰쥐 모델을 이용하면 환자에서 보이는 인구학적, 임상적 차이들의 영향을 최소화하고, 도파민 신경계의 near-complete 병변을 통해, 세로토닌 신경계의 역할에 보다 집중할 수 있다는 장점이 있다. 제작된 파킨슨병 흰쥐 모델에 레보도파를 3주간 매일 복강 투여하여(12mg/Kg) 레보도파 유발 이상운동증을 유도하였고, abnormal involuntary movements 점수를 측정하여 이상운동증을 평가하여, 이상운동증을 보이는 군과 보이지 않는 군으로 나누었다.

면역조직화학적 염색 통해 흑질(aubstantia nigra)에서 도파민 신경세포 수를, 등측 솔기핵(dorsal raphe nucleus)에서 세로토닌 신경세포 수를 측정하였고, 선조체(striatum)에서 세로토닌 신경세포의 활성 정도 평가를 위해 웨스턴블롯 분석을 통해 세로토닌 수송체의 농도를 측정하여 비교하였다. 또한 레보도파 유발 이상운동증 정도와 세로토닌 신경계 관련 수치들 사이의 상관관계를 분석하였다.

총 42마리의 흰쥐를 대상으로 모두에서 성공적으로 파킨슨병 모델로 제작되었으며, 이 가운데 23마리에서 레보도파 유발 이상운동증이 관찰되었고, 나머지 19마리에서는 이상운동증이 유도되지 않았다. 모든 개체의 병변측 흑질에서 양군에서 비슷한 수준의 도파민 신경세포의 near-complete 소실이 관찰되었다. 등측 솔기핵에서 세로토닌 신경세포의 수는 차이가 없었으나, 이상운동증을 보이는 군에서 선조체의 세로토닌 수송체 농도가 증가되어 있었다. 하지만 이상운동증 정도와 유의한 상관관계는 관찰되지 않았다.

본 결과를 바탕으로 파킨슨병 모델에서 레도도파 투여 후 세로토닌 신경세포 말단부의 과활성화가 레보도파 유발 이상운동증 발생과 관련되어 있음을 밝혀내었다. 세로토닌 신경세포에서 도파민을 분비할 수 있다는 점을 고려할 때, 선조체의 과활성화된 세로토닌 신경세포에서의 도파민 분비가 시냅스 도파민의 농도를 증가시켜 이상운동증을 일으킬 것으로 판단된다. 이러한 세로토닌 신경계 역할에 대한 이해를 바탕으로 이상운동증 발생을 예측할 수 있고, 이에 대한 새로운 약제가 개발되기를 기대한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Even though administration of dopamine precursor, levodopa, is the most effective treatment for Parkinson’s disease (PD) patients, chronic levodopa medication is related with disabling motor complication called levodopa induced dyskinesia (LID). Interestingly, there are large individual variabilities in the severity and time for LID development among PD patients, and small group of patients never develop LID. Therefore, understanding the pathophysiology of LID is important for prediction and personalized management of LID in PD patients, but the mechanism of LID is not elucidated yet.

Besides the dopaminergic degeneration and medication, many other neurotransmitter systems are regarded to be involved in development of LID. Especially, serotonergic neurons can directly affect dopaminergic levels in striatum, and result in dopaminergic dysregulation. However, in other study with pathologic data, there was no difference in serotonergic markers between PD patients with and without LID, and other neurotransmitter systems were also reported to be related with LID. In this study, we compared serotonergic markers between PD rat model with and without LID to figure out the serotonergic mechanism in development of LID.

We used PD rat model with unilateral 6-hydroxydopamine injection at medial forebrain bundle lesion in male Fischer 344 rats. After chronic levodopa treatment (12mg/Kg) for 3 weeks, all PD rats were divided into two groups based on the development of LID using abnormal involuntary movement (AIMs) score. First, we checked dopaminergic cell count in ipsilateral and contralateral substantia nigra, and serotonergic cell count in dorsal raphe nucleus by immunohistochemistry (IHC) staining. In addition, to figure out serotonergic nerve terminal in striatum, we evaluated serotonin transporter (SERT) level in ipsilateral and contralateral striatum using Western blotting. Between PD rat model with and without LID, we compared dopaminergic cell in substantia nigra, serotonergic cell dorsal raphe nucleus, and counts, and striatum SERT level. Additionally we investigated correlation between LID severity and serotonergic markers in LID group.

With forepaw adjusting step test, all 42 rats showed significant parkinsonism, and 23 rats (54.76%) showed LID after chronic levodopa medication. IHC staining data show definite wipe-out of dopaminergic cells in both LID and non-LID group. In terms of serotonergic system, LID group showed higher SERT level in ipsilateral striatum than non-LID group, while there was no difference in serotonergic cell count in dorsal raphe nucleus. In correlation analysis, whether severity of LID was classified as total AIMs score or cumulative stereotypy score, there was no correlation between LID severity and any serotonergic markers, such as striatal SERT levels and the number of serotonergic cell bodies in DRN.

In this study, we focused on the role of serotonin system in development of LID in PD. Even though there was no difference in serotonergic cells in DRN, LID group showed higher SERT level in striatum compared with non-LID group. Based on our results, even though dopaminergic depletion precedes development of LID, increased serotonergic terminals in striatum is directly related with LID development in PD.

목차 (Table of Contents)

• 논문요약 1
• 제1장 서 론 3
• 1. 연구의 배경 및 필요성 3
• 2. 연구의 목적 6
• 제2장 재료 및 방법 7
• 1. 연구 디자인 7
• 2. 실험동물의 선택 및 모델 제작 9
• 1) 실험 동물의 선택 및 사육 조건
• 2) 파킨슨병 흰쥐 모델 제작: 내측 전뇌속 병변
• 3) 파킨슨병 증상 평가: Forepaw adjusting step 검사
• 4) 파킨슨병 흰쥐 모델에서 레보도파 유발 이상운동증 유도
• 5) 레보도파 유발 이상운동증 평가: Abnormal involuntary movements 점수
• 3. 도파민 및 세로토닌 신경계 분석 16
• 1) 도파민 및 세로토닌 신경세포에 대한 조직학적 검증
• 2) 세로토닌 수송체에 대한 웨스턴블롯 분석
• 4. 통계 분석 18
• 제3장 결 과 19
• 1. 파킨슨병 흰쥐 모델에서 레보도파 유발 이상운동증 유도 결과 19
• 2. 도파민 신경계 분석 23
• 3. 세로토닌 신경계 분석 26
• 1) 세로토닌 신경세포 면역조직화학 염색 분석
• 2) 세로토닌 수송체 웨스턴블롯 분석
• 3) 상관관계 분석
• 제4장 고찰 32
• 1. 본 연구의 의의 32
• 2. 레보도파 유발 이상운동증의 기전 33
• 1) 도파민 신경계의 역할
• 2) 세로토닌 신경계의 역할
• 3. 파킨슨병 모델 제작 후 세로토닌 신경계의 변화 37
• 4. 본 연구의 한계 38
• 제5장 결 론 40
• 참 고 문 헌 41
• ABSTRACT 48