전분발효 효모에서의 외래 $\alpha$-Amylase 유전자의 세포분열시 안정성 증진

김정희,김근,최영길,Kim, Jung-Hee,Kim, Keun,Choi, Yong-Keel 한국미생물학회 1994 미생물학회지 Vol.32 No.4

To develop a yeast strain which stably secretes both $\alpha$-amylase and glucoamylase and therefore is able to convert starch directly to ethanol, a mouse salivary $\alpha$-amylase cDNA gene with a yeast alcohol dehydrogenase I promoter has been introduced into the cell of a Saccharomyces diactaticus hybrid strain secreting only glucoamylase. To secrete both enzymes more stably without loss of the $\alpha$-amylase gene during a cell-multiplication, an integrating plasmid vector containing $\alpha$-amylase gene was constructed and introduced into the yeast cell. The results showed that the linearized form of the integrating vector was superior in the transformation efficiency and the rate of the expression of the $\alpha$-amylase gene than the circular type of the vector. The yeast transformant having a linearized plasmid vector exhibited higher mitotic stability than the yeast transformant habouring episomat plasmid vector. The transformant containing the linearized vector producing both $\alpha$-amylase and glucoamylase exhibited 2-3 times more amylolytic activity than the original untransformed strain secreting only glucoamylase. ${\alpha}$-Amylase와 glucoamylase를 동시에 안정하게 분비하여 전분을 일단계로 직접 에탄올로 발효시킬수 있는 효모 균주를 개발하기 위하여 glucoamylase를 분비하는 Saccharomyces diastaticus hybrid 균주에 쥐의 침샘 유래의 ${\alpha}$-amylase cDNA 유전자를 plasmid vector를 이용하여 도입하였다. 이 균주로부터 효소생산에 필요한 유전자를 잃어버림이 없이 안정하게 분비할 수 있도록 하기 위하여 $\alpha$-amylase 유전자를 효모의 염색체에 삽입시키기 위한 integrating plasmid vector인 YIpMS$\Delta$R(LEU2)를 제작하였다. 이 vector의 효모형질전환에 있어 원형(circular)상태와 제한 효소 XbaI으로 처리된 직선화된(linearized) 상태의 두가지 형태를 비교한 결과 형질전환 효율에서나 형질전환체내의 $\alpha$-amylase 유전자 보유정도가 모두 직선화된 형태의 경우가 원형상태의 경우보다 높았다. Linearized vecotr를 가진 효모 형질전환체에서의 유전자 발현 안정도는 세포분열을 거듭할수록 episomal vecotr에 의한 효모 형질전환체에서의 발현 안정도보다 우수하게 나타났다. 또한 이 linearized vector를 가진 형질전환체는 $\alpha$-amylase와 glucoamylase를 동시에 분비하여 glucoamylase만 분비하는 원균주보다 2배 이상의 전분분해력을 보였다.

반수체 Saccharomyces diastaticus의 에탄올내성 증진

송상호,김근,이민웅 한국산업미생물학회 1994 한국미생물·생명공학회지 Vol.22 No.6

Glucoamylase를 분비하여 전분 분해력이 있는 S. diastaticus 균주의 에탄올 내성을 증가시킬 목적으로 돌연변이와 rare-mating에 대한 연구를 수행하였다. 돌연변이 유발원은 EMS와 UV를 사용하였으며, 단독 처리보다는 병행한 결과가 더 좋아 에탄올 내성을 11.5%(v/v)에서 14.0%(v/v)로 증가시켰다. Rare-mating 방법에 의해 얻을 hybrid의 selection marker로 이용하기 위하여 S. diastaticus 균주의 영양요구성돌연변이주와 Saccharomyces에 속하는 배수체 산업효모균주들의 호흡결여 petite 돌연변이주를 얻었다. 이들 두 균주의 rare-mating 결과 생성된 hybrid 들은 모균주들보다 에탄올내성과 전분으로부터 에탄올생성능에서 증진되었음을 보여주었다. Several mutation procedures have been compared to obtain an ethanol-tolerant Saccharomyces diastaticus strain secreting glucoamylase. These procedures include spontaneous mutation, EMS treatment, UV irradiation, and combination of EMS treatment and UV irradiation. All these methods were followed by adaptation of the yeast cells to gradually higher ethanol concentration. Among these procedures, the combined method of EMS treatment and UV irradiation gave the promising result, i.e. the ethanol tolerance of the yeast increased from 11.5%(v/v) to 14.O%(v/v). Respiratory deficient petite mutants of industrial and ethanol-tolerant yeast strains have been isolated and hybridized with haploid S. diastaticus strains. The resulting hybrids showed increased ethanol tolerance and starch-fermentability.

Construction of a Transformed Yeast Strain Secreting Both $\alpha$-Amylase and Glucoamylase for Direct Starch-Fermentation

Kim, Keun The Korean Society for Microbiology and Biotechnol 1994 Journal of microbiology and biotechnology Vol.4 No.1

A yeast strain secreting glucoamylase was transformed with an expression vector (pMS12) containing the promoter of yeast alcohol dehydrogenase I gene ADC1, mouse salivary $\alpha$-amylase cDNA, and a segment of yeast $21\mu m$ plasmid. The transformed strain could produce ethanol from starch (4%, w/v) through a direct one-step process with the conversion efficiency of 93.2%, during 5 days of fermentation, while the original, untransformed strain exhibited a conversion efficiency of 38.1% under the same condition. When the regulatory site of the ADC1 promoter region was removed, the production of ethanol increased to 29~37% in the presence of exogenous 3%(v/v) ethanol in the fermentation medium.

전분분해 효모융합체를 이용한 전통 발효주의 제조와 품질특성

주민노(Min No Ju),홍성욱(Sung Wook Hong),김관태(Kwan Tae Kim),염성관(Sung Kwan Yum),김계원(Gye Won Kim),정건섭(Kun Sub Chung) 한국식품과학회 2009 한국식품과학회지 Vol.41 No.5

전분 분해활성과 알코올 발효능을 모두 보유한 효모융합체 FA776과 알코올 발효능이 우수한 Saccharomyces cerevisiae KOY-1을 각각 이용하여 누룩의 첨가량에 따른 발효주를 제조하여 이화학적 성분분석과 관능검사를 수행하였다. 발효주의 알코올 함량은 K-100와 F-50이 각각 135.0 mg/mL과 119.4 mg/mL으로 확인되었으며, 효모융합체 FA776이 전분을 기질로 하는 배지에서 알코올을 생산한다는 사실은 관찰하였지만, 전분 분해효소의 역가는 실제 약주 담금과정 중의 누룩에서 유래된 전분 분해효소의 역가보다 낮음을 확인하였다. pH는 발효종료시 모든 처리구에서 pH와 산도는 pH 4.3-4.5과 0.47-0.60%로 각각 유지되었다. 효모융합체 FA776을 이용하여 제조한 발효주에서 유기산 함량이 높은 반면, 아미노산 함량은 더 적게 나타났다. 모든 처리구에서 lactic acid와 citric acid의 함량이 높게 관찰되었으며, 특히 S. cerevisiae KOY-1을 사용한 발효주에서는 fumaric acid와 succinic acid가 검출되지 않았고 효모융합체 FA 776을 사용한 발효주에서만 각각 2 g/mL와 60-141 g/mL의 함량이 확인되었다. 발효주의 향기성분은 S. cerevisiae KOY-1을 사용한 발효주보다 효모융합체 FA 776을 사용하였을 때 향기성분의 함량이 더 높은 것으로 나타났으며, 관능검사에서는 효모융합체 FA 776을 이용하여 제조한 발효주가 종합기호도가 4.00점으로 가장 우수한 것으로 확인되었다. 이로써 효모융합체 FA 776을 이용할 때, 기호성이 우수한 발효주로서의 제조 가능성이 있다고 사료된다. The objectives of this study were to evaluate the physico-chemical and sensory characteristics of a Korean traditional alcoholic beverage (yakju) prepared using different nuruk (Korean-style koji) concentrations and yeasts such as the fusant FA776 and Saccharomyces cerevisiae KOY-1, respectively. The fusant FA776, which has alcohol-fermenting and starch-utilizing properties, was formed by Saccharomyces cerevisiae KOY-1 and Saccharomyces diastaticus KCTC1804. The fermentation trial was conducted in a 5 L lab-scale jar at 25℃. The maximum alcohol production of the K-100 and F-50 reached levels of 135.0 mg/mL and 119.4 mg/mL, respectively. The pH values were in a range of 4.3-4.5. Total acidity was in a range of 0.47-0.60%. Organic acids and amino acids were analyzed in order to evaluate variations in its composition and content via HPLC analysis. Organic acids including lactic acid, citric acid, malic acid, and pyruvic acid, and 16 kinds of amino acids, including aspartic acid, were detected in all treatments. K-100 showed the highest amino acid contents, whereas F-50 exhibited the lowest amino acid contents. Volatile flavor components such as phenylethyl alcohol, isoamyl alcohol, 2-methylthiophane, isobutyl alcohol, and ethyl succinate were detected as a major component in all treatments, as determined via gas chromatography. The results of our sensory evaluation demonstrated that Yakju fermented by the FA776 fusant yielded more favorable results than S. cerevisiae KOY-1.

Construction of a Transformed Yeast Strain Secreting Both α-Amylase and Glucoamylase for Direct Starch-Fermentation

Kim, Keun,Lee, Jung-Wha 한국미생물 · 생명공학회 1994 Journal of microbiology and biotechnology Vol.4 No.1

A yeast strain secreting glucoamylase was transformed with an expression vector (pMS12) containing the promoter of yeast alcohol dehydrogenase I gene ADC1, mouse salivary α-amylase cDNA, and a segment of yeast 2μm plasmid. The transformed strain-could produce ethanol from starch (4%, w/v) through a direct one-step process with the conversion efficiency of 93.2%, during 5 days of fermentation, while the original, untransformed strain exhibited a conversion efficiency of 38.1% under the same condition. When the regulatory site of the ADC1 promoter region was removed, the production of ethanol increased to 29∼37% in the presence of exogenous 3%(v/v) ethanol in the fermentation medium.

원형질 융합에 의한 전분으로부터 에탄올 발효효모균주의 개량

이혜정,이지나,천경숙,박소영,마은애,민경희 한국미생물학회 1992 미생물학회지 Vol.30 No.6

에탄올 내성 및 고 알콜 생성 균주인 S. cerevisiae BU-1 와 glucoamylase 생성 우수 균주인 S. diastaticus A15 를 시험 균주로 하여 genetic manipulation 에 의하여 haploid 인 S. cerevisiae BUI.alpha.26($alc^r thr^-$) 와 S. diastaticus A15a6($STA^+ hom$) 균주를 분리하였다. 이등 효모 균주의 원형질체 형성을 위하여 0.8 M sorbitol 의 존재하에서 zymolyase $200\mu$g/ml 와 $400\mu$g/ml 을 2 시간 동안 처리시 두 균주 모두 95% 이상 원형질체를 얻었다. PEG 6000 을 90 분간 반응시킬 경우 융합 빈도는 $ 3.25 {\times} 10^{-3}$ 이었다. 원형질체 융합으로 생성된 융합주의 유전적 분석, 에탄올 내성, glucoamylase 생성을 측정한 결과, 이들 융합주의 유전자형은 STA $alc^r$ thr hom. '/STA' $alc^r$ thr hom로 예상되었으며, glucoamylase 활성도는 A15a6 의 경우 2.7 units 이었으나, 융합주 F7, F10 은 각각 4.2 와 8.4 units 로 나타났다. 에탄올 내성 시험을 하여 선별한 결과, 가장 우수한 균주인 융합주 7개 중 F7 과 F10 을 선별하였다. 5% 의 녹말이 포함된 발효배양액에서 $30^{\circ}C$ 5일간 배양시 생성된 에탄올 생성은 융합주 F7 과 F10 은 각각 2.0% 와 1.85 이였다. Ethanol-tolerant strain, S. eerevisiae BUI a26 ($alc^r thr^-$) and gJucoamylase-producing strain, S diastatieus AI5a6 (STA+ hom-) were prepared by means of genetic manipulation, Protoplast fusion was carried out to introduce STA gene from AI5a6 strain to BUla26 strain, Protoplast formation was shown at 0,8 M sorbitol and 200 Jig/ml to 400 Jig/ml zymolyase treatment for 2 hours incubation, Fusion frequency was $ 3.25 {\times} 10^{-3}$ to the regenerated protoplast number using PEG 6000 for 90 min incubation. The excellent fusants with genotype of STA- $alc^r thr^-$ hom+/STA+ ($alc^s thr^+$ hom- (2n), F7 and FIO, were selected by ethanol-tolerant, ethanol fermentation, and glucoamylase production tests, Glucoamylase production of AI5a6 showed 2,7 units, but 4.2 or 8.4 units for F7 or FIO fusant at $30^{\circ}C$, Ethanol fermentation from 32% glucose by BUla26 was 14,0%(v/v) in fermentaion medium for 5 days incubation, but 14.5% or 15,0% for F7 or FIO strain, respectively. Ethanol fermentation from 5% starch was 2,0% by F7, or 1.8% by FIO strain in fermentation medium for 5 days fermentation.

맥아당 전처리에 의한 제빵용 효모의 발효활성 개선

이기평,강원진 한국산업식품공학회 2002 산업 식품공학 Vol.6 No.1