CRISPR/Cas9 유전자 편집 기술과 돼지에서 응용

조광근,박서영 경상대학교 농업생명과학연구원 2021 농업생명과학연구 Vol.55 No.4

새롭게 부상하는 CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas (CRISPR-associated protein) 9 유전자 편집 기술은 장기 이식(organ transplantation)과 같은 생의학 연구(biomedical research)와 동물 산업에 대한 전통적인 접근 방식을 빠르게 변화시키고 있다. 돼지 생식 및 호흡기 증후군 바이러스(porcine reproductive and respiratory syndrome virus; PRRSV)와 전염성 위장염 바이러스 (transmissible gastroenteritis coronavirus; TGEV)는 돼지 산업에 막대한 경제적 손실을 초래하는 치명적인 바이러스이다. 바이러스의 숙주 수용체 단백질 CD163과 pAPN에 대한 이중 유전자 녹아웃(double knock-out; DKO) 돼지는 PRRSV와 TEGV에 내성을 나타내었으며, 정상(wild-type; WT) 돼지와 비교할 때 성장과 생식 특성의 차이가 없었다. 이러한 결과는 경제 동물 돼지에 CRISPR-Cas9 매개 유전자 편집 기술을 적용하여 바이러스 저항성 유전자 변형에 의한 품종 개량이 달성될 수 있다는 것을 보여주며, 질병 저항성 돼지 생산을 위한 육종 시작점을 제공한다. 종간 배반포 보완(interspecies blastocyst complementation)은 이종 만능 줄기세포 유도체(xenogenic pluripotent stem cell derivatives)의 장기 특이적 생산(organ-specific enrichment)을 가능하게 한다. CRISPR-Cas9 매개 접합자 유전자 편집(CRISPR-Cas9-mediated zygote gene editing)을 이용하여 췌장 생성(pancreatogenesis), 신장 생성(nephrogenesis), 간 생성(hepatogenesis) 및 혈관 생성(vasculogenesis)이 불가능 생쥐 숙주를 만들었으며, 이러한 숙주와 배반포 보완 플랫폼을 결합하여 키메라를 만들었다. 또한 돼지와 소 같은 유제류(ungulate)의 섬유아세포(fibroblasts)를 이용하여 CRISPR-Cas9 매개 유전자 편집과 체세포 핵 치환(somatic cell nuclear transfer) 과정을 거쳐 복제 배아(genome-edited cloned embryos) 를 생산하였다. 복제 배아의 1차 배양 섬유아세포(primary cultured fibroblasts)를 재복제하여 배반포 보완을 위한 숙주 배아로 이용하였다. CRISPR-Cas9 유전자 편집 기술과 종간 배반포 보완 플랫폼 전략의 조합은 유전자 변형 돼지를 생산하는 데 유용하다. 본 논문에서는 CRISPR/Cas9 유전자 편집 기술과 배반포 보완 플랫폼, 질병 저항성(disease resistance) 돼지, 이종장기이식(xenotransplantation) 목적의 키메라 생산을 소개하고자 한다. The emerging CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas (CRISPR-associated protein) 9 gene editing technology is rapidly changing the traditional approach to biomedical research and animal industry such as organ transplantation. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and infectious gastroenteritis virus (TGEV) are lethal viruses that cause major economic losses to pig production. The double gene knockout (DKO) pigs against these viral receptor proteins CD163 and pAPN showed resistance to PRRSV and TEGV, and there were no differences in meat production and reproductive performance traits compared to wild-type (WT) pigs. These results show that breeding by viral resistance genetic modification can be achieved by applying CRISPR-Cas9 mediated gene editing technology to economic animal pigs, providing a breeding starting point for the production of disease-resistant pigs. Interspecies blastocyst complementation enables organ-specific enrichment of xenogenic pluripotent stem cell derivatives. CRISPR-Cas9-mediated zygote gene editing was used to create a mouse host incapable of pancreatogenesis, nephrogenesis, hepatogenesis and vasculogenesis. Chimera was created by combining this host with a blastocyst complementation platform. In addition, using fibroblasts from ungulates such as pigs and cows, genome-edited cloned embryos were produced. Primary cultured fibroblasts were used for generating cloned embryos as the host embryos for blastocyst complementation. The combination of CRISPR/Cas9 gene editing technology and an interspecies blastocyst complementation platform strategy is particularly useful for generating genetically modified pigs. Therefore, this review paper introduces CRISPR/Cas9 gene editing technology, interspecies blastocyst complementation platform, disease resistance pigs, and human-pig chimera production for xenotransplantation purposes.

CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 돼지 수정란에서의 cd163 발현 효율 분석

박미령(Mi-Ryung Park),이민국(Min Gook Lee),이보람(Bo Ram Lee),옥선아(Sun A Ock),변승준(Sung June Byun) 한국산학기술학회 2023 한국산학기술학회논문지 Vol.24 No.4

유전자 편집 돼지는 농업과 의료 분야에서 제공될 수 있어 폭넓게 각광 받고 있다. 최근 CRISPR/Cas9 시스템이 적용됨에 따라 genome editing이 효율적으로 향상되었다. 돼지 수정란 내 CRISPR/Cas9을 세포질내 미세주입으로 site specific mutations을 가능할 수 있게 하였다. 본 연구에서는 돼지 수정란 내 cd163 gRNA와 CRISPR/Cas9 components를 이용하여 도입한 후 그 효율성을 비교 분석하였다. CRISPR/Cas9 protein과 cd163 gRNA를 수정란 내 주입하여 발달율을 비교 분석한 결과 대조구 (90.6%)와 미세주입 그룹 (78.9% and 85.2%)에서 유의적 차이는 인정되지 않았다. 또한, 배반포 발달율을 비교 분석 한 결과 CRISPR/Cas9 protein과 cd163 gRNA 주입 그룹 (19.9% and 19.6%)로 대조구와 (21.5%) 유사하게 나타났다. 각각의 배반포를 이용하여 cd163 유전자의 targeted modification을 분석하였다. 그 결과 cd163(10+134) gRNA를 주입한 그룹의 경우(22.7%) cd163(10) 주입한 그룹보다(12.9%) 유의적으로 높은 효율을 나타내었다. 유전자 변형은 4bp deletion 일어난 것부터 72bp insertions 패턴까지 다양한 패턴으로 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 바탕으로 CRISPR/Cas9 system을 돼지 수정란 내 미세주입 함으로써 유전자 편집 돼지 생산에 응용할 수 있을 것으로 사료된다. Gene editing (GE) in pig production can have a wide impact by increasing the availability of gene-edited pigs for agriculture and biomedicine. Recent applications of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/ CRISPR-associated protein 9 (Cas9) system hold promise for improving the efficacy of gene editing. The cytoplasmic microinjection of the CRISPR/Cas9 system enables the induction of site-specific mutations in porcine zygotes. In this study, we examined the efficiency of the CRISPR/Cas9 protein and cluster of differentiation 163 (cd163) guide RNA (gRNA) components for introduction into zygotes by cytoplasmic microinjection. The cleavage rates of the CRISPR/Cas9 protein and cd163 gRNA injected groups (78.9% and 85.2%) were statistically similar to that of the control group (90.6%). Moreover, the blastocyst formation rates of the CRISPR/Cas9 protein and cd163 gRNA injected groups (19.9% and 19.6%) were also statistically similar to that of the control group (21.5%). When individual blastocysts were genotyped, we observed targeted modification of the genes in the subsequent blastocysts. In the samples of 10 ng/ul, each of the CRISPR/Cas9 protein and the cd163 (10+134) gRNA injected group (22.7%) was significantly higher (p<0.05) than that in the 10 ng/ul samples each of CRISPR/Cas9 protein and cd163(10) gRNA injected group (12.9%). Various types of indel mutations, including 4 bp deletion to 72 bp insertions, were detected in the mutant blastocysts. These results suggest that the CRISPR/Cas9 technology can be applied to produce gene-edited pigs by direct zygote injection.

식물 유전체 편집을 위한 CRISPR/Cas9의 적용

이만보(Man Bo Lee),서용원(Yong Weon Seo) 고려대학교 생명자원연구소 2017 생명자원연구 Vol.25 No.-

초 록 최근 유전자 편집 기술을 Streptococcus pyogenes에서 유래한 CRISPR/Cas9 system이 주도하고 있다. 바이러스 침입에 대항하는 면역체계인 CRISPR/Cas9 system을 활용하여 목표 유전자에 돌연변이를 유발하거나 목표 유전자를 원하는 염기서열로 편집할 수 있다. CRISPR/Cas9 기술은 목표 유전자의 변화로 인한 생물학적 표현형 변화 연구에 적용되며 기능 유전학 연구에 핵심적인 역할을 할 수 있다. 나아가 인간 질병 modeling, 유전질환 치료, 신약 개발, 식물 바이오 매스 증대, 종자 생산량 증산 등 다양한 영역에서 활용 가능하다. CRISPR/Cas9 system의 CrRNA과 tracrRNA은 결합하여 sgRNA로서 역할을 하고 목표 유전자 특이성 및 Cas9 단백질의 인식에 관여한다. PAM 은 Cas9 단백질의 DNA 결합에 관여하는 필수적인 염기서열이며, 실험 설계 단계에서 sgRNA와 함께 고려되어야 한다. Cas9 단백질은 DNA에 double-strand break를 발생시켜 DNA 보수 기작을 유도한다. 목표 유전자는 DNA 보수 기작을 거치는 동안 돌연변이가 발생하거나 유전자가 편집된다. 식물은 인간의 주식, 치료제, 바이오 연료원 등을 제공하며 삶의 유지와 질적 향상에 밀접한 역할을 한다. 유전체에 임의 돌연변 이를 유발하는 기존의 화학적 물리적 돌연변이 유발 방법과 달리 CRISPR/Cas9 system은 식물 유전체 특정 위치에 돌연변이를 유발시킬 수있다. CRISPR/Cas9 system은 실제적으로 이미 개발된 Agrobacterium-mediated transformation과 particle bombardment 기술 등 식물 형질전환 기법을 통해 식물체에 적용 가능하다. 유전체 크기가 크고 반복 서열의 비중이 높은 일부 작물에서는 목표 유전자 특이성 확보가 어렵고 원하지 않는 유전자가 돌연변이 되는 off-target 발생 가능성이 높으나, 애기장대, 담배, 벼 등 모델 식물과 일부 작물에서 실제 적용 사례가 보고 되어 있다. CRISPR/Cas9 system은 실험이 단순하고 효율적이며 한 번에 여러 유전자에 적용 가능하고 비용이 저렴한 큰 장점을 가지고 있으며 식물을 포함한 동물, 심지어 인간에게도 적용 가능하다. CRISPR/Cas9 system을 활용한 유전체 편집 기술은 인간의 삶의 질 향상에 핵심적인 역할을 담당할 것으로 예측된다.

현장에서 가축질병을 진단하기 위한 CRISPR/Cas 시스템의 활용

이원희(Wonhee Lee),이윤석(Yoonseok Lee) 한국생명과학회 2020 생명과학회지 Vol.30 No.3

최근, 국내에서 발생하는 대가축의 질병은 바이러스 혹은 세균 등과 같은 병원체가 사료 섭취, 가축 간의 신체접촉, 호흡 등 다양한 경로를 통해 전파되어 발병되는 전염성 질병이다. 전염성 질병은 가축의 건강을 위협하고 생산성을 감소시키기 때문에 현장에서 조기 진단하여 개체 격리와 같은 통제 관리가 필수적이다. 기존 사용되고 있는 진단 키트들은 현장에서 사용하기에 용이하지 않으며 극소량의 감도에서 진단이 제한적인 단점을 가지고 있다. 그러므로, 현장에서 극소량의 감도와 진단의 편이성을 고려하여 DNA와 RNA 수준에서 진단할 수 있는 CRISPR/Cas 시스템은 최적의 시스템이라 할 수 있다. 본 연구논문에서는 대가축의 전염성 질병들을 현장에서 조기 진단함에 있어 CRISPR/Cas 시스템의 활용전략에 대해 소개하고자 한다. 최근 발견된 CRISPR/Cas 효소들은 2개의 클래스와 6가지 하위유형으로 분류되었다. 이 중에서 클래스 2에 포함되는 Cas 효소들은 대표적으로 제 2형에 Cas9, 제 5형에 Cas12a와 Cas12b, 제 6형에 Cas13a와 Cas13b가 있다. 현재까지 개발된 CRISPR/Cas 시스템들은 간단한 시각 신호를 통해 표적에 대한 정량 및 다중 감지가 가능하고 특히, 극소량 수준의 초고감도에서도 표적만을 진단할 수 있으며 단시간 이내에 진단 결과를 얻을 수 있다. 하지만 초고감도 DNA 혹은 RNA를 진단하기 위해 최적의 신호 증폭 방법과 결합되어야 하고 표적 DNA 혹은 RNA를 진단에 적합하도록 DNA를 RNA로, RNA를 DNA로 전변해야 하는 단점이 있다. 따라서, 현장에서 대가축의 전염성 질병을 조기에 진단할 수 있는 CRISPR/Cas 바이오센서를 개발하는데 있어 가축의 전염 매개체로부터 추출되는 병원체 유형(DNA 혹은 RNA)을 고려하여 최적의 Cas 효소를 선정하여야 하고 이에 따른 적절한 신호 증폭 방법이 결합되어야 한다. 따라서, CRISPR/Cas 시스템은 유전자 편집 방법을 사용하는 빠르고 효율적인 진단 도구이며 이 시스템은 소의 전염병을 조기에 진단하고 감염 확산방지에 도움될 수 있을 것으로 판단 되어진다. Recently, cattle epidemic diseases are caused by a pathogen such as a virus or bacterium. Such diseases can spread through various pathways, such as feed intake, respiration, and contact between livestock. Diagnosis based on the ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) and PCR (Polymerase chain reaction) methods has limitations because these traditional diagnostic methods are time consuming assays that require multiple steps and dedicated equipment. In this review, we propose the use of the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) Cas system based on DNA and RNA levels for early point-of-care diagnosis in cattle. In the CRISPR/Cas system, Cas effectors are classified into two classes and six subtypes. The Cas effectors included in class 2 are typically Cas9 in type II, Cas12 in type V (Cas12a and Cas12b) and Cas13 in type VI (Cas13a and Cas13b). The CRISPR/Cas system uses reporter molecules that are attached to the ssDNA strands. When the Cas enzyme cuts the ssDNA, these reporters either fluoresce or change color, indicating the presence of a specific disease marker. There are several steps in the development of a CRISPR/Cas system. The first is to select the Cas enzyme depending on DNA or RNA from pathogens (viruses or bacteria). Based on that, the next step is to integrate the optimal amplification, transducing method, and signal reporter. The CRISPR/Cas system is a powerful diagnostic tool using a gene-editing method, which is faster, better, and cheaper than traditional methods. This system could be used for early diagnosis of epidemic cattle diseases and help to control their spread.

유전자 편집기술인 CRISPR-Cas9의 특허 가능성

박인회 경북대학교 법학연구원 2018 법학논고 Vol.0 No.62

The CRISPR-Cas9 genetic editing technology, which is considered to be innovative, has been developed in the process of researching the technology of editing the DNA of living organisms at will and applying these techniques to biotechnology research to achieve research results. The economic value of this technology is significant, so it is crucial that this technology be patentable. In order to be protected by a patent, a technology developed once must be an invention. The judgment of whether or not the invention is applicable is different between Korea and the United States. Korea is judged according to the definition of invention, whereas in the case of the United States, it is judged that it is subject matters of patent law. In the case of CRISPR-Cas9 gene editing technology, there will be no problem to be recognized as an invention in Korea and the United States. Next, if the CRISPR-Cas9 gene editing technology falls under the medical act itself for human beings, the possibility of industrial use is denied. However, although it may be used as a medical act for human beings, if the claims are limited to medical activities for non-human animals, the possibility of industrial use will be recognized. It is not difficult to judge that the CRISPR-Cas9 gene editing technology has novelty and inventiveness in comparison with the existing gene editing technology in the judgment of novelty and inventive step which is another patent requirement. However, in the course of the development of the CRISPR-Cas9 gene editing technology, a patent dispute is underway over the question of whether the later technology is more advanced than the previous technology, and the result should be closely monitored. Much controversial in patentability is when the CRISPR-Cas9 gene editing technology is used to modify human genes. In this case, it is not desirable to tell uniformly whether or not it violates the public morals, and it is necessary to set the standards globally considering the power of human genes when they are manipulated at will. 생명체의 DNA를 자신의 뜻대로 편집하는 기술을 연구하고, 생명공학 연구에 이러한 기술을 적용하여 연구성과를 이루어내는 과정에서, 혁신적이라 평가받는 CRISPR-Cas9 유전자 편집기술이 개발되었다. 이 기술의 경제적 가치가 상당하기 때문에 이 기술이 특허권으로 보호받을 수 있는지 여부는 상당히 중요하다. 특허로 보호되기 위해서는 일단 크리스퍼-Cas9 기술이 발명에 해당하여야 한다. 발명에 해당하는지 여부에 대한 판단은 우리나라와 미국이 다르다. 우리나라는 발명의 정의규정에 따라 판단함에 비해 미국의 경우에는 특허법상 보호 적격성을 기준으로 판단하는데 비하여, 우리나라는 발명의 정의규정에 따른 발명의 성립요건을 만족하는지에 따라서 판단한다. 판결이나 학설에 따를 때, 크리스퍼-Cas9 기술의 경우, 우리나라와 미국에서 발명으로 인정되기에 문제가 없을 것으로 판단된다. 산업상 이용가능성 판단에서 크리스퍼-Cas9 기술이 인간에 대한 의료행위로 사용된다면 조약, 학설, 판례 등에 의하여 산업상 이용가능성이 부정될 것이다. 그러나 크리스퍼-Cas9 기술이 식물의 품종 개량에 사용되거나 또는 인간이 아닌 동물 등에 대한 치료행위로 제한하여 청구범위를 작성한다면 이에 대한 산업상 이용가능성이 인정될 것이다. 또 다른 특허 요건인 신규성, 진보성 판단에 있어서는 기존 유전자 편집기술과 비교할 때 크리스퍼-Cas9 기술이 신규성, 진보성을 갖는다고 판단하기는 어렵지 않다. 다만 크리스퍼-Cas9 기술의 발달과정에서 서로 다른 연구팀들 사이에 이전 기술에 비해 이후 기술이 진보적이냐는 질문을 둘러싸고 현재 특허분쟁이 진행 중이고 이의 결과를 예의 주시할 필요가 있다. 특허가능성 여부에서 논의의 필요성이 많은 부분이 크리스퍼-Cas9 기술이 불특허사유에 해당하는지 여부에 대한 것이다. 문제가 발생한 염기서열은 해당 개체에만 영향을 미치는 것이 아니라, 후대에 유전될 수 있다는 점에서 그 위험이 존재하기 때문에 크리스퍼-Cas9 기술이 ‘공중의 위생을 해칠 우려’가 있는지는 신중하게 판단하여야 한다. 또한 크리스퍼-Cas9 기술이 인간의 유전자 치료에 이용될 때에는 생명윤리법의 적용을 받게 되고, 그 결과 공서양속 위반여부가 문제될 수 있다. 특허권 부여의 기준으로서 공서양속에 반하는지 여부만을 논의할 것이 아니라, 더 나아가 크리스퍼-Cas9 기술이 식물이나 동물의 유전자를 조작하는 것 이외에도 인간 유전자를 조작하는 경우에 그 파급력을 고려하여 세계적으로 산업계나 학계, 그 외의 다양한 영역에 있는 모두가 함께 그 기준들을 마련해가는 것이 필요하다.

Molecular insights into DNA interference by CRISPR-associated nuclease-helicase Cas3

Gong, Bei,Shin, Minsang,Sun, Jiali,Jung, Che-Hun,Bolt, Edward L.,van der Oost, John,Kim, Jeong-Sun National Academy of Sciences 2014 PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF Vol.111 No.46

<P><B>Significance</B></P><P>Bacteria can repel invader DNA and RNA molecules by using an adaptive immunity mechanism called clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs)-Cas. CRISPR loci in a host genome are a repository of DNA fragments obtained from previous encounters with an invader, which can be transcribed and activated into short RNA molecules (crRNA) with sequences complementary to invader DNA or RNA. In some CRISPR-Cas systems, crRNA is assembled into a targeting complex called “Cascade” that seeks invader DNA to form an R-loop that triggers recruitment of a nuclease-helicase, Cas3, to destroy invader DNA. In this study, we show atomic resolution structures of a full-length Cas3, revealing how Cas3 coordinates binding, ATP-dependent translocation, and nuclease digestion of invader DNA.</P><P>Mobile genetic elements in bacteria are neutralized by a system based on clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs) and CRISPR-associated (Cas) proteins. Type I CRISPR-Cas systems use a “Cascade” ribonucleoprotein complex to guide RNA specifically to complementary sequence in invader double-stranded DNA (dsDNA), a process called “interference.” After target recognition by Cascade, formation of an R-loop triggers recruitment of a Cas3 nuclease-helicase, completing the interference process by destroying the invader dsDNA. To elucidate the molecular mechanism of CRISPR interference, we analyzed crystal structures of Cas3 from the bacterium <I>Thermobaculum terrenum</I>, with and without a bound ATP analog. The structures reveal a histidine-aspartate (HD)-type nuclease domain fused to superfamily-2 (SF2) helicase domains and a distinct C-terminal domain. Binding of ATP analog at the interface of the SF2 helicase RecA-like domains rearranges a motif V with implications for the enzyme mechanism. The HD-nucleolytic site contains two metal ions that are positioned at the end of a proposed nucleic acid-binding tunnel running through the SF2 helicase structure. This structural alignment suggests a mechanism for 3′ to 5′ nucleolytic processing of the displaced strand of invader DNA that is coordinated with ATP-dependent 3′ to 5′ translocation of Cas3 along DNA. In agreement with biochemical studies, the presented Cas3 structures reveal important mechanistic details on the neutralization of genetic invaders by type I CRISPR-Cas systems.</P>

Advances in CRISPR-Cas systems for RNA targeting, tracking and editing

Wang, Fei,Wang, Lianrong,Zou, Xuan,Duan, Suling,Li, Zhiqiang,Deng, Zixin,Luo, Jie,Lee, Sang Yup,Chen, Shi Elsevier 2019 BIOTECHNOLOGY ADVANCES Vol.37 No.5

<P><B>Abstract</B></P> <P>Clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated protein (Cas) systems, especially type II (Cas9) systems, have been widely used in gene/genome targeting. Modifications of Cas9 enable these systems to become platforms for precise DNA manipulations. However, the utilization of CRISPR-Cas systems in RNA targeting remains preliminary. The discovery of type VI CRISPR-Cas systems (Cas13) shed light on RNA-guided RNA targeting. Cas13d, the smallest Cas13 protein, with a length of only ~930 amino acids, is a promising platform for RNA targeting compatible with viral delivery systems. Much effort has also been made to develop Cas9, Cas13a and Cas13b applications for RNA-guided RNA targeting. The discovery of new RNA-targeting CRISPR-Cas systems as well as the development of RNA-targeting platforms with Cas9 and Cas13 will promote RNA-targeting technology substantially. Here, we review new advances in RNA-targeting CRISPR-Cas systems as well as advances in applications of these systems in RNA targeting, tracking and editing. We also compare these Cas protein-based technologies with traditional technologies for RNA targeting, tracking and editing. Finally, we discuss remaining questions and prospects for the future.</P> <P><B>Highlights</B></P> <P> <UL> <LI> RNA targeting and editing are becoming increasingly important </LI> <LI> CRISPR-Cas systems are advancing for RNA targeting, tracking and editing </LI> <LI> The type VI CRISPR-Cas systems are useful for RNA-guided RNA targeting </LI> <LI> Use of Cas9 and Cas13 will advance RNA-targeting technologies </LI> </UL> </P>

생명윤리적 관점에서 본 유전자 편집 특허의 제문제

진영진,구인회 서강대학교 생명문화연구소 2018 생명연구 Vol.48 No.-

The gene editing technology using CRISPR-Cas9 opens up the possibility of overcoming disease through gene therapy and eliminating genetic inheritance. Patent applications for the innovative technology are increasing rapidly. Patents must be granted for inventions that meet the patentability requirements, but the potential ethical issues such as stability caused by unresolved scientific uncertainty, violation of the autonomy of future generations, and eugenic manipulation raise questions of granting patents to the invention. Allowing the exclusive right on the technology is also giving a social and economic control over the technology. Aiding the spread of ethical issues into society through the use of technology is against to the original purpose of the patent system that pursues the public interest. Accordingly, this paper begins first by examining whether the CRISPR-Cas9 made from the natural CRISPR and the natural Cas9 is patent-eligible subject matter or not. And more specifically, building on discussions about the relationship between the ‘dangerous knowledge’ CRISPR-Cas9 and the patent, the relationship between the precautionary principle and the patent, the irrationality of applying only one patent law even as the number of patent subject matter increases, and the ethical and legal issues that arise as research becomes more complex and interconnected with business and other issues, this paper conclude that the expertise required in ethical judgment regarding patenting gene editing technologies is important and particular. In examining inventions on human genetic editing using CRISPR-Cas9, the Korean patent system needs to be changed for the protection of human dignity and responsible ethical judgment. As part of this, I propose to set up an ethical review committee that will make ethical judgments about the technology or a multiple examiner system that includes ethics judges, rather than the current technology-based one-person screening method. CRISPR-Cas9을 사용한 유전자 편집 기술은 유전자 치료를 통한 질병 극복과유전병 대물림을 없앨 수 있는 가능성을 열어준다. 이 혁신적 기술에 대한 특허출원이 빠른 속도로 증가하고 있다. 특허요건을 충족하는 발명이라면 특허를 허여해야 하지만, 아직 해결되지 않은 과학적 불확실성으로 인한 안정성의 문제와미래 세대에 대한 자율성 침해, 우생학적 조작 가능성 등 잠재된 윤리적 문제는그 발명에 특허권을 부여해도 되는지 의문을 제기한다. 기술을 독점배타적으로소유할 수 있는 권리를 허락한다는 것은 그 기술에 대한 사회적 및 경제적 통제력을 주는 것이기도 하다. 또한 기술을 통해 윤리적인 문제가 사회 속으로 확산되는 것을 방조하는 것은 공익을 추구하는 특허제도의 본래 목적에도 어긋난다. 이에 본 논문은 먼저 자연 상태의 CRISPR와 Cas9으로부터 만들어진CRISPR-Cas9이 과연 특허법으로 보호해야 하는 대상인가 검토하는 것에서부터출발한다. 그리고 “위험한 지식” CRISPR-Cas9과 특허의 관계, 사전예방원칙과 특허의 관계, 특허 대상 확대에도 불구하고 단일 특허법을 적용하는 문제, 연구의탈순수성과 복잡화에 따른 윤리적·법적 문제에 관한 논의를 통해 유전자 편집 기술 관련 특허심사에서의 윤리적 판단에 요구되는 전문성이 특별하다는 결론에이르렀다. 한국 특허시스템이 CRISPR-Cas9을 사용한 인간유전자 편집에 관한 발명을 심사하는 데 있어서 인간 존엄성의 수호와 책임 있는 윤리적 판단을 하기위해서는 현행 기술 위주의 1인 심사 방식을 지양하고, 해당 기술에 대한 윤리적 판단을 함께 해줄 윤리심사위원회를 설치하거나 윤리담당 심사관이 포함된다인심사체제를 도입할 것을 필자는 제안한다.

벼에서 CRISPR/Cas9 활용 고빈도 유전자 편집 방법

정유진,배상수,이긍주,서필준,조용구,강권규,Jung, Yu Jin,Bae, Sangsu,Lee, Geung-Joo,Seo, Pil Joon,Cho, Yong-Gu,Kang, Kwon Kyoo 한국식물생명공학회 2017 식물생명공학회지 Vol.44 No.1

CRISPR/Cas9 기술은 생명공학을 활용한 신품종 작물육성에 있어 패러다임 변혁을 가져다 줄 핵심 기반기술이다. 본 연구에서는 CRISPR/Cas9를 이용하여 유전자편집기술을 기존에 알려진 방법보다 쉽고 정확하게 실험 할 수 있도록 sgRNA 디자인, 벡터구축, 형질전환체 육성 및 분석 등을 자세히 기술하였다. sgRNA는 http://www.rgenome.net/ 사이트에서 NGG 영역을 중심으로 하여 target-up: 5'-ggcaGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'과 target-down: 5'-aaacNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNC-3'의 올리고를 디자인하였다. 식물형질전환용 벡터는 pPZP-Cas9-RGEN을 기본으로 하였으며, sgRNA의 프로모터는 OsU3를 이용하여 pPZP::35S::Cas9::PinII-OsU3::sgRNA::Bar-Gen 순으로 구축하였다. 형질전환체의 육성은 단기형질전환 Agrobacterium 법을 사용하였으며 재분화 식물체를 얻는데48일 정도 소요되었다. 형질전환체 유무는 genomic PCR 분석으로 single copy 선발은 TaqMan PCR로 분석하였다. 정밀유전자편집 식물체는 T1 세대에서 T-DNA 삽입되지 않은 식물체를 Bar-strip에 의해 선발하였다. 선발된 식물체의 sgRNA 영역의 염기배열 조사에 의해 유전자 편집 식물체를 육성하였다. 따라서 본 연구에서 CRISPR/Cas9 system에 의한 정밀유전자편집 기술을 이용하여 보다 빠르고 쉽고 경제적으로 유전자가 편집된 개체를 확보할 수 있었다. 본 실험에서 확립된 system은 상업용 식물 계통육성에 이용 가능하여 육종적 가치가 매우 클 것으로 사료된다. The CRISPR/Cas9 is a core technology that can result in a paradigm for breeding new varieties. This study describes in detail the sgRNA design, vector construction, and the development of a transgenic plant and its molecular analysis, and demonstrates how gene editing technology through the CRISPR/Cas9 system can be applied easily and accurately. CRISPR/Cas9 facilitates targeted gene editing through RNA-guided DNA cleavage, followed by cellular DNA repair mechanisms that introduce sequence changes at the site of cleavage. It also allows the generation of heritable-targeted gene mutations and corrections. Here, we present detailed procedures involved in the CRISPR/Cas9 system to acquire faster, easier and more cost-efficient gene edited transgenic rice. The protocol described here establishes the strategies and steps for the selection of targets, design of sgRNA, vector construction, and analysis of the transgenic lines. The same principles can be used to customize the versatile CRISPR/Cas9 system, for application to other plant species.

Characterization of distinct mutation patterns by CRISPR-Cas9 and CRISPR-Cpf1 genome editing systems

Taegeun Bae,Woo Chang Hwang,Dohyeon Lee,송길태,Junseok W Hur,허준호 대한독성 유전단백체 학회 2019 Molecular & cellular toxicology Vol.15 No.4

Backgrounds: The differences of DNA mutation patterns of genome editing by CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)-Cas9 and CRISPR-Cpf1 is not completely understood. Methods: CRISPR-Cas9 or CRISPR-Cpf1 is applied for genome editing at the exact same four genomic locations in human embryonic kidney 293T (HEK293T) cells. The mutation patterns of the target genomic loci were analyzed by targeted deep sequencing. Results: The mutation patterns of CRISPR-Cas9 and CRISPR-Cpf1 showed prominent differences. CRISPR- Cpf1 mediated genome engineering almost always resulted in deletion, while CRISPR-Cas9 showed remarkably high rate of insertion mutation of 1 base pair. The deletion patterns of CRISPR-Cas9 and CRISPR- Cpf1 were also different. The deletion patterns of CRISPR-Cas9 were composed of diverse and evenly distributed deletion patterns, while the mutation patterns of CRISPR-Cpf1 were composed of fewer major patterns. Conclusion: Genome editing by CRISPR-Cas9 and CRISPR-Cpf1 shows different characteristics.