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Quinacrine 형광을 이용한 토마토 뿌리조직 마이크로솜의 수소이온이동 활성측정
신대섭,조광현,김영기 충북대학교 한국과학재단 지정 첨단원예기술개발 연구센터 2002 연구보고서 Vol.6 No.-
Quinacrine은 수소이온 농도변화에 민감한 형광 probe로서 양성자와 결합하지 않은 형광형이나, 양성자와 결합한 비형광형으로 존재한다. 따라서, quinacrine은 H+-ATPase에 의한 수소이온이동 활성측정에 이용된다. 본 연구에서는 토마토 뿌리조직에서 분리한 마이크로솜에서 quinacrine의 형광성을 이용한 H+-ATPase 활성측정의 최적 조건을 조사하였다. Quinacrine의 형광변화는 반응용액 중의 단백질 함량이 0.43㎍/㎕에서 25-26% 감소하여 10%의 quinacrine 형광을 감소시키는 데 약 100 nmol/min의 H+-ATPase 활성이 필요함을 알 수 있었다. Quinacrine의 최대 형광변화는 pH 7.0-7.2 범위와 2 mM Mg2+ 조건에서 일어났다. 이것은 기존에 보고한 H+-ATPase의 특성과 잘 일치하여, quinacrine의 형광변화가 H+-ATPase의 활성을 잘 반영하고 있음을 보인다. 원형질막 및 액포막 H+-ATPase들의 선택적 저해제인 vanadate와 NO3-는 각각의 효소에 의한 수소이온이동 활성을 저해하는데 성공적임을 확인하였다. 이상의 결과로 quinacrine이 토마토 뿌리조직에서 분리한 마이크로솜의 수소이온이동 활성측정에 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다. Quinacrine, a pH-sensitive fluorescence probe, which exists either as an unprotonated fluorescence form or protonated nonfluorescence form, can be used to measure the proton transport activity of H+-ATPase. Quinacrine was used to determine the optimal conditions for measuring the activity of microsomal H+-ATPases prepared from the roots of tomato plants. The amount of quinacrine fluorescence quenching obtained at 0.43 ㎍/㎕ of microsomal protein concentration was 25-26%, which shows that the enzyme activity of 100 nmol/min decreases 10% of quinacrine fluorescence. Maximal fluorescence quenching was obtained at pH 7.0-7.2 and 2 mM Mg2+. Because the activity of microsomal H+-ATPase is also maximal at these conditions, the quinacrine fluorescence well represents the activity of H+-ATPase. Vanadate and NO3-, specific inhibitors of plasma and vacuolar H+-ATPase, respectively, were successfully applied to inhibit the quinacrine fluorescence quenching mediated by the corresponding H+-ATPase. These results imply that quinacrine is a useful tool for measuring the proton transport activities of microsomes obtained from the root tissued of tomato plants.
음이온에 의한 토마토 뿌리조직 마이크로솜 H^+-ATPase 활성 저해
신대섭,조광현,김영기 충북대학교 첨단원예기술개발연구센터 2000 연구보고서 Vol.5 No.-
식물 뿌리세포의원형질막 및 액포막에 위치하는 H+-ATPase들은 세포의 여러 가지 생리활성에 중요한 역할을 수행한다. H+-ATPase의 생리활성 특성을 조사하기 위하여 토마토 뿌리조직으로부터 마이크로솜을 분리하고, H+-ATPase 활성에 미치는 음이온의 효과를 조사하였다. 다양한 종류의 음이온들이 H+-ATPase의 활성을 저해함을 확인하였으며, 이들 중 특히 효소의 저해정도가 다른 citrate와 인산을 선택하여 작용특성을 조사하였다. Citrate에 의한 ATPase 활성저해는 3mM 이상에서 나타났고, 20 mM citrate는 활성을 50-60% 저해하였다. 그러나, citrate,의 저해효과는 MG2+의 농도를 증가시킬수록 감소하여, citrate에 의해 저해된 ATPase 활성은 Mg2+에 의해 회복되는 것으로 나타났다. 즉, 7 mM Mg2+을 첨가하였을 때, citrate에 의한 활성저해는 관측되지 않았고 ATPase 활성은 대조활성과 비슷한 수준으로 회복하였다. 이러한 결과는 citrate가 Mg2+을 chelation함으로써 H+-ATPase의 활성을 저해하기 때문이다. 한편, 인산에 의한 ATPase 활성저해는 3mM 이상의 농도에서 나타났고, 30 mM 인산은 ATPase의 활성을 50% 저해하였다. 인산에 의해서 저해된 ATPase의 활성은 MG2+의 농도증가에 의해 회복되지 않아, 인산에 의한 저해효과는 Mg2+과 무관하였다. H+-ATPases located on plasma and vacuolar membranes play major roles in various cellular physiological processes. In order to investigate the physiological roles of H+-ATPases, microsomes were prepared from tomato roots and the effects of various anions were measured on the activities of H+-ATPases. H+-ATPase was inhibited by various anions. Citrate and phosphate were chosen to investigate detailed inhibitory mechanisms on ATPases since they showed different levels of inhibition. Inhibitory effect of citrate was observed at the concentrations above 3 mM. when 20 mM citrate was added, the H+-ATPase activity was decreased by 50-60%. However, the inhibitory effect of citrate was decreased by increasing the concentration of Mg2+. The citrate-induced inhibited activity was recovered by the addition of Mg2+. Addition of 7 mM Mg2+ completely removed the inhibitory effect of citrate and the activity recovered to the level of the control experiment. These results imply that citrate chelates Mg2+ and thus inhibits H+-ATPases. Meanwhile, the inhibitory effect of phosphate was observed at the concentration above 3 mM and the activity was decreased by 50% in the presence of 30 mM phosphate. Further addition of Mg2+ showed no recovery on the activity. These results imply that the inhibitory effect of phosphate is not dependent upon the concentration of Mg2+. Key words: anion, citrate, phosphate, H+-ATPase, tomato roots Abbreviation: PK, pyruvate kinase; LDH, lactate dehydrogenase; HEPES, N-(2-hydroxyethyl)-piperazine-N'-(2-ethanesulfonic acid); NADH, nicotinamide adenine dinucleotide
申大澈,權貞南,金瑩均,韓宗鉉,김재석,김재섭 동의대학교 한의학연구소 1997 동의한의연구 Vol.1 No.-
The purpose of this study was to investigate effect of water extract of Patriniae Herba on the poliferation of human cancer cell-lines. The effects of Patriniae Herba on the poliferation of A43l, HeLa, MOLT-4, K562 cells, Balb/c 3T3 cells, mouse thymocytes, splenocytes and human lymphocytes were estimated by MTT colorimetric assay, The results were as follows; 1. Patriniae Herbs did not effect A43l, HeLa, MOLT-4, K562 cells. 2. The cytotoxicity of mitomycin C on MOLT-4 cells was increased by the combination of Patriniae Herba. 3. Patriniae Herba inhibited the proliferation of Balb/c 3T3 cells. 4. Patriniae Herba stimulated the proliferation of thymocytes. 5. Patriniae Herba stimulated the proliferation of splenocytes. 6. Patriniae Herba stimulated the proliferation of human lymphocytes.
Hg^2+에 의한 토마토 뿌리조직 마이크로솜 H^+-ATPase의 가역적 저해
신대섭,조광현,김영기 충북대학교 첨단원예기술개발연구센터 1999 연구보고서 Vol.4 No.-
토마토 뿌리조직의 마이크로솜 ATPase 활성에 대한 중금속의 효과를 조사하기 위하여 뿌리조직으로부터 마이크로솜을 분리하였고, enzyme-coupled assay를 이용하여 마이크로솜 이온펌프(ATPase)의 활성을 측정하였다. 여러 가지 중금속 이온들 중 Hg2+은 마이크로솜 ATPase 활성을 농도 의존적으로 저해하였으며, Gd3+ 과 Fe3+, La3+, Zn2+ 그리고 Pb2+ 등은 마이크로솜 ATPase의 활성을 현저히 저해하면서 동시에 assay에 사용된 효소를 저해하였다. 그러나, CS+과 BA2+은 마이크로솜 ATPase 활성에 영향을 미치지 않았다. Hg2+은 원형질막과 액포막에 위치하는 H+-ATPase들의 활성을 10 μM 이상의 농도에서 급격히 저해하였고, 1 mM 이상의 농도에서 완전히 저해하였으며, 두 효소들에 대한 활성저해의 Ki 값은 각각 80 , μM, 58 μM로 나타났다. Hg2+에 의해 저해된 ATPase의 활성은 DTT의 농도를 증가시킴에 따라 회복되어, HG2+에 의한 ATPase 활성저해는 가역적임을 확인하였다. 이러한 결과들은 Hg2+이 원형질막과 액포막에 위치한 H+-ATPase들을 비선택적이고 가역적으로 저해함을 보여준다. In order to characterize the effects of heavy metal ions on the microsomal ATPase activities, microsomes were prepared from the roots of tomato plant and the activity of microsomal ATPase was measured by an enzyme-coupled assay. Hg2+ inhibited the activity of microsomal ATPase in a dose-dependent manner, while Gd3+, Fe3+, La3+, Zn2+, and Pb2+ inhibited not only the ATPase activity but also the activities of enzymes used in the assay. However, Cs+ and Ba2+ showed no significant effect. Hg2+ inhibited the activities of both plasma membrane and vacuolar membrane H+-ATPases. In the dose-response to Hg2+, the activities of both microsomal H+-ATPases were severely inhibited at the concentration of Hg2+ above 10μM and were completely inhibited at 1 mM Hg2+. Apparent Ki values of Hg2+ on the inhibitions of plasma membrane and vacuolar membrane H+-ATPases were 80 μM and 58 μM, respectively. The Hg2+-induced inhibitions were reversible since the addition of dithiothreitol completely reversed the inhibitory effects of Hg2+.These results suggest that the inhibitory effects of Hg2+ on both plasma membrane and vacuolar membrane H+-ATPases are nonselective and reversible.