상피성 암세포주에 대한 녹차 Catechin의 효과

박정현(Jeong Hyun Park),김대중(Dae Joong Kim),한장희(Jang Hee Hahn),김홍태(Hong Tae Kim),정용욱(Yong Wook Jung),성훈기(Hoon Ki Sung),김주영(Joo Young Kim),송인환(In Hwan Song),성언기(Eon Gi Sung),이융창(Yung Chang Lee) 대한해부학회 2001 Anatomy & Cell Biology Vol.34 No.5

Catechin은 녹차에서 추출되는 폴리페놀의 주요성분으로 고혈압 및 동맥경화의 예방효과, 당뇨억제효과, 항산화작용, 항암작용 등에 직접 관여하는 물질이다. 본 연구에서는 태평양에서 제공받은 녹차 catechin을 이용하여 상피성 암세포주인 A549 (폐암)와 EATC (복수암)세포에 투여한 후 처리농도와 시간에 따른 변화를 비교, 관찰함으로써 녹차의 효과와 작용기전을 밝혀내는데 목적이 있었다. 본실험은 A549 세포와 EATC 세포를 배양한 후 녹차 catechin을 1, 10, 100, 500 μg/ml의 농도로 48시간 동안 처리하였고, 광학현미경, 공초점현미경, 전자현미경 등을 이용하여 세포의 구조적 변화를 확인하였으며 MTT분석, 전기영동, 유세포분석기 등을 사용하여 세포 손상정도를 파악하였다. A549 세포에서는 catechin 1 μg/ml와 10 μg/ml 농도에서는 대조군에 비하여 큰 변화를 관찰할 수 없었다. 100 μg/ml catechin을 처리하였을 때 세포내의 검은 과립들의 수가 증가하였고 층판소체의 손상이 나타났다. 세포주기의 장애가 나타나 DNA 합성전기에 있는 세포들의 수가 급격히 증가하였다. 500 μg/ml 농도에서는 층판소체와 사립체의 파괴가 심하게 나타났으며 세포생존율이 감소하였고 세포주기의 장애도 관찰되었다. EATC 세포에서는 catechin의 농도가 A549 세포의 경우보다 낮은 농도에서도 세포증식 억제 및 세포손상 효과가 나타났다. 10 μg/ml 농도에서도 세포의 위축과 생존율의 감소가 일어났으며 전기영동상에 괴사되는 세포들이 파악되었다. 100μg/ml catechin을 처리하였을 때 자연사의 형태학적 관찰, 전기영동, 유세포분석 등에서 자연사 과정에 있는 세포들이 많이 나타났다. 결과적으로 녹차 catechin을 배양한 상피성 암세포에 투여함으로서 세포의 생존율과 증식이 억제되었고 그 과정에서 괴사, 자연사, 세포주기의 장애 등이 관여하는 것으로 생각된다. 그러나 일련의 세포손상과정을 유도하는 데 있어 세포의 종류, 처리 시간, 농도에 따라 다소 차이가 있음을 확인하였다. Catechin is main component of polyphenol extracts from green tea, it is associated with prevention of hypertension and atherosclerosis, anti-diabetic effect, antioxidant, antitumor. The purpose of this research is to investigate the effect and its mechanism of green tea catechin on epithelial cancer cell lines in various concentrations and durations. For this study, epithelial cancer cell lines, A549 (lung cancer), EATC (Ehrlich-Lettre ascites tumor cell) were used. Inverted, light, confocal and electron microscopes were applied to find morphological changes. MTT assay, flowcytometric analysis, gel electrophoresis were used to compare severity of cellular damages to control after exposure to 1, 10, 100 and 500 μg/ml catechin for 48 hours. In the A549 cells, after 1 μg/ml and 10 μg/ml catechin treatments, there was no notable changes. However, exposure to 100 μg/ml catechin induced increase of cytoplasmic granules, destruction of lamellar body, inhibition of cell cycle, especially G0/G1. In the early phase of 500 μg/ml catechin administration, decrease of cell population, severe destruction of lamellar bodies and mitochondria, derangement of cell cycle were shown. In the EATC, such as those effects occurred after exposure to lower concentration of catechin than in that of A549 cells. After exposure of 10 μg/ml catechin, rounded-up cells and necrotic cells were found. Whereas, most of cells were under apoptotic changes-cytoplasmic condensation, nuclear fragmentation, cellular shrinkage, ladder pattern in the electrophoresis, when administrated 100 μg/ml catechin. These results suggested that exposure of catechin induced severe cellular damage and growth inhibition in dose- and time-dependent manner. And we confirmed that these effects of catechin were involved with apoptosis, necrosis and cell cycle arrest and were quite different according to cancer type. Therefore, much more research would be demanded before clinical application of catechin to human cancer therapy and this study would be the basic source for further study of green tea.

배양중 간 세포의 Glucose - 6 - Phosphatase 와 Alcohol Dehydrogenase 의 활동에 대한 에탄올의 영향

강민구(Min Goo Kang),성언기(Eon Ki Sung),이융창(Yung Chang Lee) 대한내과학회 1987 대한내과학회지 Vol.33 No.1

N/A To elucidate the effect of alcohol on the activities of alcohol dehyrogenase and ribosomal endoplasmic reticulum which is the site of alcohol dehydrogenase production in hepatocytes in culture, the hepatocytes of new-born rats were cultured in liquid medium and subjected to alcohol exposure. Alcohol dehydrogenase and glucose-6-phosphatase, the marker enzyme of endoplasmic reticulum were stained cytochemically and the results were analyzed. The results were as follows. 1) The reaction intensities of Alcohol DH and G-6-Pase were stronger in experimental groups than those of control groups. 2) The reaction of Alcohol DH in hepatocytes after alcohol exposure was most intense between 4 to 16 hours. 3) The reaction intensity of G-6-Pase in hepatocytes after alcohol exposure was strongest in 1 to 2 hours. 4) The reaction intensities of Alcohol DH and G-6-Pase of the hepatocytes in 0.5% group were stronger than those of 0.1% group. 5) The amount of alcohol given to the hepatocytes seemed to coincide with the intensities of Alcohol DH and G-6-Pase activity.

Distribution Patterns of Involucrin in the Stratum Corneum of the Normal and Psoriatic Artificial Skins

송인환(In-Hwan Song),성훈기(Hoon-Ki Sung),김주영(Joo-Yung Kim),성언기(Eon-Ki Sung),이융창(Yungchang Lee),박정현(Jeong-Hyun Park),문용석(Yong-Suk Moon),김홍태(Hong-Tae Kim),장성익(Sung-Ik Chang) 대한해부학회 2004 Anatomy & Cell Biology Vol.37 No.2

Cornified envelope는 최종분화과정에 있는 각질세포의 형질막 밑에 형성되는 비용해성의 구조로서 involucrin, loricrin, cornifin 등 여러 단백질의 상호연결로 안정화된다. 건선은 염증과 각질세포의 과다증식을 특징으로 하는 만성 피부질환이며 각질층의 involucrin에 대한 면역염색에서 정상 표피와는 차이가 있다. 즉 건선에서는 cornified envelope에 제한되나 정상피부에서는 세포질 전반에 표지된다. 본 실험에서는 건선과 정상 각질세포의 분화양상을 비교하기 위해서 건선병변부와 정상피부의 각질세포를 분리 배양하여 정상 및 건선인공피부를 제작하고 이들의 각질층에서 involucrin에 대한 면역금표지법을 시행하였다. 인공건선피부에서는 얇고 엉성한 각질층이 형성되었으며 표지반응이 아래층에서는 세포질 전반에 걸쳐, 상부층에서는 cornified envelope에 국한된 양상을 보여 생체에서와 유사하였다. 정상인공피부에서는 잘 형성된 중층의 두꺼운 각질층이 관찰되었지만 아래쪽의 대부분 영역에서 이상각화증의 흔적이 보였고 세포질 전반에 분포하는 표지반응을 보였다. 표면쪽의 일부 세포에서 cornified envelope에 집중되는 표지반응을 보였지만 정상인공피부의 두꺼운 각질층을 고려할 때 cornified envelope에 집중되는 경향의 정도는 인공건선피부와 비슷하였다. 결과적으로 장기형 인공배양 모델에서 정상 및 건선 각질세포의 최후 분화에서 involucrin 분포 양상은 차이가 없었다. 결론적으로 정상인공피부에서는 비록 잘 발달된 각질층이 형성되었지만 이들은 cornified envelope의 최종분화과정 까지 는 도달하지 못하는 것으로 보이며 건선피부 각질층에서 보이는 involucrin의 분포양상의 차이는 이들 세포의 특성에 기인한다기 보다는 빠른 세포성장에 기인하는 것으로 판단된다. Cornified envelope is highly insoluble structure formed beneath the plasma membrane during terminal differentiation of keratinocytes and is stabilized by cross linking of various proteins, including involucrin, loricrin, and cornifin. Psoriasis is a chronic skin disease characterizing inflammatory reaction and hyperproliferation of keratinocyte. There are some differences in involucrin immunolabelling in stratum corneum between normal and psoriasis epidermis. Labelling was convergent to cornified envelope in psoriasis skin but throughout cytoplasm in normal skin. To compare terminal differentiation patterns of normal and psoriasis keratinocytes, we reconstructed normal and psoriatic artificial skin by using primary cultured keratinocytes from normal and psoriasis skin and then performed immunogold labelling for involucrin in stratum corneum. Psoriatic artificial skin had thin and poorly organized corneal layer. Immunogold labelling for involucrin revealed same pattern of that in vivo by showing throughout cytoplasm in lower layer but convergent cornified envelope in upper layer. Compared with psoriatic artificial skin, normal artificial skin had well organized and thick stratum corneum. Involucrin labelling was throughout cytoplasm in most of corneal layer but convergent to cornified envelope in some uppermost cells. Even though some cells show convergent pattern in normal artificial skin, absolute number of this pattern was no lesser than in artificial psoriatic skin because of normal artificial skin had thick stratum corneum. This result showed there was no difference in involucrin distribution in terminal differentiation of normal and psoriasis keratinocytes in organotypic culture model. It is concluded that although well organized multiple corneal layers are formed in normal artificial skin, they can not reach to full maturation of cornified envelope, and difference of involucrin localization in cornified envelope of psoriasis epidermis is related with not peculiarities of the cells but rapid growing in vivo.

심장세포이식 시험관 모델에서 심장전사인자 Nkx2.5의 역할

신은경(Eun Kyung Shin),박정현(Jeong Hyun Park),김대중(Dae Joong Kim),한장희(Jang Hee Hahn),박경한(Kyeong Han Park),성훈기(Hoon Ki Sung),김주영(Joo Young Kim),송인환(In Hwan Song),성언기(Eon Gi Sung),이융창(Yung Chang Lee) 대한해부학회 2004 Anatomy & Cell Biology Vol.37 No.1

최근 허혈성 심장질환 발생률이 크게 증가하고 있으며 줄기세포나 미분화 세포를 이용하여 허혈성 심장근육에 직접 주입하는 세포이식(Cell transplantation; cellular cardiomyoplasty)이 획기적인 치료방법으로 제시되고 있다. 그러나 세포이식의 대상이 되는 줄기세포의 분화기전이나 심장근육세포로의 분화유도 기전 또한 명확히 밝혀져 있지 않으며, 세포이식시 많은 수의 주입된 세포가 손실된다는 제한점이 있다. 따라서 본 연구에서는 세포 이식 효율을 증진시키고자 줄기세포주 P19에 심장발생을 조절하는 전사인자 MEF2c와 Nkx2.5 각각을 과발현 시킨 후, 심장근육세포로의 분화와 심장근육과의 동시 수축여부를 알아보기 위해 이와 밀접한 관련이 있는 세포사이결합 형성 유무, 그리고 저산소 처리에 대한 저항성을 관찰하였다. 면역염색시 P19-Nkx2.5 세포는 교통반점 단백질 connexin43이 대조군에 비해 발현양이 현저히 감소하였고, 전자현미경상 에서 근원섬유가 관찰되었다. 위 결과를 바탕으로 심장근육세포로의 분화여부를 확인하기 위해 cardiac troponin T (cTnT)의 분포를 관찰한 결과 일부 P19-Nkx2.5 세포에서 점 형태의 반응이 나타났다. 또한 저산소 처리시 P19-Nkx2.5 세포는 다른 실함군에 비해 세포 손상이 적었다. 아울러 심장근육세포와 혼합배양 결과 P19-MEF2c 세포와 P19-Nkx2.5 세포는 심장근육세포와의 경계면에서 교통반점과 부착판의 표지자에 대한 반응이 관찰되었다. 또한 cTnT 항체로 면역염색시 P19-Nkx2.5 세포에서 반응이 증가하였으며, 다른 혼합배양군에 비해 심장근육세포의 높은 수축수와 규칙적인 박동이 관찰되었다. 결과적으로 전사인자 Nkx2.5의 과발현에 의하여 줄기세포주 P19은 심장근육세포로 분화가 유도되었고, 심장근육세포와 혼합배양시 세포사이결합이 형성되었으며. 세포의 수축력도 유의하게 증가하였다. 또한 Nkx2.5의 과발현 군에서 저산소 처리시 강한 저항성을 나타내었다. 따라서 심장발생을 조절하는 전사인자인 Nkx2.5를 이용하여 다양한 이식세포를 구축하고 심장세포이식에 응용함으로서 심장질환에 대한 치료 효율성을 증가시킬 수 있으리라 기대한다. Despite therapeutic advance, the prevalence of ischemic heart disease continues to increase. Recently, cell transplantation of stem cell has been proposed as a strategy for cardiac repair following myocardial damage. However, low differentiation efficiency into cardiomyocyte and poor cell viability associated with transplantation have limited the reparative capacity of these cell. In this study, we engineered P19 embryonal carcinoma cells using plasmid vector to overexpress the transcription factor MEF2c, Nkx2.5 involved in cardiomyogenesis. We investigated 1) formation of intercellular junction of P19 in mono-culture and co-culture with cardiomyocyte for functional and structural synchronous contraction after transplantation, 2) differentiation into cardiomyocyte, 3) resistance to hypoxic condition. An P19 embryonal carcinoma cell line expressing GFP, MEF2c, Nkx2.5 was generated by gene transfection and clonal selection. Nkx2.5 overexpression induced connexin43 expression level decrease. Electron microscopy revealed myofibril organization and immunostaining with cTnT showed positive staining in P19-Nkx2.5, consistent with early stage cardiomyocyte. Connexin43 and N-cadherin was expressed between P19-MEF2c and cardiomyocyte, P19-Nkx2.5 and cardiomyocyte in co-culture. And beating rate of cardiomyocyte co-cultured with P19-Nkx2.5 increased much more than other group, even if P19-Nkx2.5 did not have synchronous contraction with cardiomyocyte. Additionally, P19-Nkx2.5 had a resistance against hypoxia. These result suggest that overexpression of Nkx2.5 induced differentiation of P19 into cardiomyocyte and would be electro-mechanical coupling with cardiomyocyte after transplantation. Futhermore, Nkx2.5 overexpression had protection potential to hypoxic injury. Therefore, P19 cell overexpressed Nkx2.5 would be promising cell source for further study of new therapy of myocardial disease and building up in vitro model.

심근세포 및 내피세포의 분화에 미치는 Dimethyl Sulfoxide의 영향

이동협,박이태,한승세,이융창 영남대학교 의과대학 1988 Yeungnam University Journal of Medicine Vol.5 No.2

효소와 기계적인 힘을 이용하여 얻어진 심장세포를 심근세포와 내피세포를 분리하여 48시간 배양한후 양군으로 나눠서 관찰하였다. 실험군은 배양중에 10% DMSO에 1시간 처리하였고 DMSO를 처리하지 않고 계속 배양한 것을 대조군으로 하였다. DMSO효과를 관찰하기 위하여 도립현미경하에서 세포의 형태, 수축능력, 증식 능력등을 관찰하였고, 심근세포에서는 succinate dehydrogenase 반응으로 사립체의 증감을 대조군과 비교하였고, 심장내피세포에서는 thiamine pyrophosphatase의 반응으로 Golgi의 양을 대조군으로 비교하였다. 실험결과를 요약하면 다음과 같다. 1. DMSO에 의하여 심근세포는 분화된 형태로 모양이 길어졌고 사립체의 증가에 의해 succinate dehydrogenase의 반응이 대조군보다 강하게 나타났다. 2. DMSO에 의해 심근세포는 근세섬유의 파괴와 혼란이 초래되었고 이로 인하여 수축능력이 감소되었다. 3. 심장내피세포는 DMSO에 의해 세포증식이 감소되고 고유기능이 강조되어 Gologi의 표지효소인 thiamine pyrophosphatase의 반응이 대조군보다 강하였다. 4. 심장내피세포는 DMSO의 세포접착력 소실과 운동성 소실작용에 의해 배양중 많은 세포의 손실이 초래되었다. To elucidate the effects of dimenthyl sulfoxide on myocardial and endothelial cells in culture, the cells were exposed to 10% dimenthyl sulfoxide in culture medium for 1 hour at 48 hours after cell isolation. The general morphology and the cytochemical reaction of marker enzymes for mitochondria and Golgi complexes were investigated. The results were summarized as follows : 1. DMSO induced elongation and narrowing of the cells and increase of mitochondrial reaction in myocardial cells. 2. DMSO induced destruction and disruption of myofibrils in myocardial cells resulting in increase of contractile activities. 3. In the endothelial cells, DMSO suppressed proliferative activities but thiamine pyrophosphatase reactions were enhanced indicating increase of Golgi complex activity. 4. DMSO seemed to hamper with the adhesiveness and motility of the endothelial cells causing the decrease of the number of cells in vitro.

Mouse배 십이지장상피의 세포환에 미치는 전자기장의 영향에 관한 연구

이융창 慶北大學校 醫科大學 1974 慶北醫大雜誌 Vol.15 No.1

배양을 위한 심근세포 분리에 미치는 Trypsin, Collagenase와 Dimethyl Sulfoxide의 영향

박창우,이융창 영남대학교 의과대학 1987 Yeungnam University Journal of Medicine Vol.4 No.1

백서 심장조직을 trypsin과 collagenase 두가지의 효소를 사용하여 분리하면서 각 효소의 분리효과와 두가지 효소의 복합적 세포분리 효과를 조사하였으며 이와 동시에 dimethyl sulfoxide가 세포분리과정 및 단기간 배양중에 세포에 미치는 효과를 조사한 결과를 다음과 같이 요약할수 있다. 1. 백서 심장조직에서 세포를 분리할때 4℃ trypsin 18시간 전처리후 37℃ collagenase 처치한군에서 세포생존율 세포수확량 및 심근세포 생존율이 가장 높았다. 즉 단일 효소 처리보다는 효소 복합연속 처리가 더 효율적이었다 2. 37℃ trypsin 만으로 세포분리를 하였을때 세포생존율과 수확량이 가장 낮았다. 3. 백서 심장세포의 분리과정과 초기 배양과정에서 세포 회복이나 보호에 대한 DMSO의 효과는 인정되지 않았으며 오히려 세포파괴 효과가 높음을 알수 있었다. New born rat heart cells were dissociated using trypsin and /or collegenase to elucidate the dissociation efficiency of these two enzymes. And the effect of dimethyl sulfoxide during and immediately after cell dissociation was also investigated to clarify the so-called protective activity of dimethyl sulfoxide on cell performance. The results can be summarized as follows. 1. Cold trypsin 18 hours pretreatment followed by warm collagenase treatment resulted best cell viability and cell yield. 2. Single warm trypsin treatment gave the poorest result. 3. Dimethyl sulfoxide did not seem to play any protective role during or immediately after rat heart cell dissociation. It had very damaging effect on rat heart cells.

세포융합에 의한 백서심근세포와 HEP-2세포간의 종간 잡종세포 형성

이융창 慶北大學校 醫科大學 1980 慶北醫大誌 Vol.21 No.1

Ventricular myocardial cells from 3day old rat hearts were fused with human epidermoid cancer cells(HEP-2 cells) by PEG technique. Fusion technique using PEG and IEHM was introduced. Frequencies of hybrid cells increased until 4 days after PEG freatment. Fusogens, fusion processes including membrane fusion were discussed.

척추동물 심근세포의 분리와 배양

이융창 慶北大學校 醫科大學 1980 慶北醫大誌 Vol.21 No.1

To develop a simple method in isolation and cultivation of cardiac myocytes, 3-day old rat hearts were used. 0.1% trypsin and 0.1 collagenase were used combiningly to achieve a high yield of viable cells. Myocardial cells were separated from endotheloid cells via differential attachment technique. Cells were cultured in Falcon flasks, Rose chambers and Leighton tubes. Changes of cell population in culture were observed and effects of enzymes were discussed.

배양중 심근세포의 분화

이융창 慶北大學校 醫科大學 1980 慶北醫大誌 Vol.21 No.1

The pattern of differentiation of rat myocardial cells was analyzed by way of elucidating frequencies of binucleated myocytes and attitude of DNA synthesis using new born rats ranging from age of 0 day to 7 days postnatal and autoradiography. Labeled mononucleated myocyte frequencies decreased with age while frequences of binucleated myocytes, labeled and unlabeled, increased. Frequencies of endothelial cells showed steady state regardless of the age of rats. Decrease of labeled mononucleated myocytes balanced increase of binucleate myocytes. Autoradiographic processes and mechanisms of differentiation were discussed.