Xanthone의 in vitro 및 in vivo 모델 내 알레르기 접촉성 피부염 조절 효능 연구

Aye, Aye 전북대학교 일반대학원 2020 국내박사

Xanthone is a phenolic compound found in a few higher plant families such as gentian root. Xanthone has been known as having a variety of biological properties, such as anti-oxidant, anti-bacterial, anti-inflammatory and anti-cancer activities. However, the molecular and cellular mechanisms underlying the activity of xanthone in allergic contact dermatitis (ACD) remain to be explored. Therefore, the aim of this study was to investigate the regulatory effect of xanthone on allergic contact dermatitis in human keratinocytes (HaCaT), human mast cells (HMC-1) in vitro and in an experimental murine model in vivo. In the present study, treatment with xanthone reduced the production of pro-inflammatory cytokines and chemokine including interleukin (IL)-1β, IL-6, IL-8, and expression of chemokines thymus and activation-regulated chemokine (TARC) and macrophage-derived chemokine (MDC) in tumor necrosis factor (TNF)-α and interferon (IFN)-γ-stimulated HaCaT cells. Xanthone treatment also suppressed the production of pro-inflammatory cytokines, chemokine such as TNF-α, IL-6, IL-8, histamine and expressions of thymic stromal lymphopoietin (TSLP) in phorbol myristate acetate and calcium ionophore A23187 (PMACI)-stimulated HMC-1 cells. Furthermore, xanthone significantly suppressed the phosphorylation of mitogen-activated protein kinases (MAPKs), nuclear factor-kappa B (NF-κB) signaling pathway and activation of caspase-1 in stimulated keratinocytes and mast cells. Additionally, xanthone administration alleviated epidermal hyperplasia in the murine model of 2,4-dinitrofluorobenzene (DNFB)-induced dermatitis by reducing the serum levels of immunoglobulin E (IgE), histamine, and pro-inflammatory cytokines and suppressing MAPKs phosphorylation. Xanthone administration also inhibited mortality due to compound 48/80-induced anaphylactic shock and suppressed the passive cutaneous anaphylaxis (PCA) reaction mediated by IgE. Collectively, these findings suggest that xanthone has a potential for use in the treatment of allergic inflammatory diseases. 잔톤(xanthone)은 용담초의 뿌리 등에서 발견되는 페놀성 화합물로 독특한 화학구조를 가지고 있다. 이것은 다양한 생리활성도 가지고 있어, 항산화, 항균, 항염증, 항암 효능 등이 보고되어 있다. 하지만, 잔톤의 알러지성 접촉성 피부염에 대한 효능 및 분자생물학적 기전은 거의 밝혀지지 않았다. 그래서, 본 연구에서는 인간유래 각질세포인 HaCaT, 인간유래 비만세포인 HMC-1와 동물모델을 이용하여 잔톤의 조절작용을 검토하였다. 잔톤은 tumor necrosis factor (TNF)-α, interferon (IFN)-γ로 자극된 HaCaT세포에서 interleukin (IL)-1β, IL-6, IL-8과 같은 전염증성 사이토카인의 생산을 감소시켰고, chemokines thymus and activation-regulated chemokine (TARC)과 macrophage-derived chemokine (MDC)의 발현을 억제하였다. 또한, 잔톤은 phorbol myristate acetate, calcium ionophore A23187 (PMACI)로 자극된 HMC-1세포에서 histamine과 TNF-α, IL-6, IL-8과 같은 전염증성 사이토카인의 분비를 억제하였고, thymic stromal lymphopoietin (TSLP)의 발현도 감소시켰다. 잔톤은 두 세포에서 모두 mitogen-activated protein kinase (MAPKs)의 인산화, nuclear factor-kappa B (NF-κB) 신호전달경로과 caspase-1의 활성화를 억제하였다. 2,4-Dinitrofluorobenzene (DNFB)으로 피부염을 유도한 동물모델에서 잔톤의 경구 투여는 혈청 immunoglobulin E (IgE), histamine, 전염증성 사이토카인의 감소를 통해 표피과형성을 억제하였다. 또한, 같은 모델에서 MAPKs의 인산화를 억제하였다. 더욱이, compound 48/80으로 유도된 anaphylactic shock 사망률과 IgE로 매개된 passive cutaneous anaphylaxis (PCA) 반응이 잔톤의 투여에 의해 감소되었다. 이러한 결과는 잔톤이 알러지성 염증 질환에 생리활성물질로 활용될 수 있다는 것을 보여주는 것이다.

(The) effects of ginsenoside Rg3 via inhibiting NF-κB activation in IL-1β-induced A549 cells and human asthmatic lung tissue

어인준 경희대학교 대학원 2016 국내석사

목적: 홍삼의 여러 주요 활성 물질 중에서 ginsenoside Rg3가 염증 유도된 기도 상피 세포와 천식환자의 기도 상피조직에서 nuclear factor kappa B (NF-κB) 기전의 활성을 억제함으로써 항염증 효과를 가지는 지를 확인하기 위해 진행되었다. 방법: 기도 상피 세포에 염증 유도를 하기 위해 IL-1β (10 ng/ml)를 4 시간 처리하였다. 염증을 유도한 기도 상피세포와 천식환자의 기도 상피조직에서 Rg3에 의한 NF-κB의 활성억제는 western blotting analysis를 통하여 확인하였고, 마찬가지 방법으로 COX-2의 발현도 확인하였다. 그 후, 천식환자의 기도 상피조직에서 Rg3가 NF-κB에 의해 조절되는 cytokines / chemokines들의 분비량에 끼치는 영향을 확인하기 위해multiplex assay를 사용하였다. 결과: Rg3는 IL-1β로 염증을 유도한 기도 상피세포에서 증가한 NF-κB의 활성을 유의하게 감소시켰으며, 마찬가지로 천식환자의 기도상피조직에서도 NF-κB의 활성을 크게 감소시켰다. 그에 따라 COX-2의 발현양도 감소시켜 염증을 완화시킨다는 것을 확인할 수 있었다. NF-κB에 의해 조절되는 cytokines / chemokines 중 IL-4, TNF-α, eotaxin의 분비량을 유의하게 감소시켰으며, 비록 통계적 유의성이 나타나지는 않았지만, IL-6, IL-9, IL-13의 분비량 또한 무처리군에 비해 감소하는 경향을 확인할 수 있었다. 결론: Rg3가 NF-κB 기전에 직•간접적인 영향을 미쳐 염증에 관련되어 있는 인자들을 줄여줌으로써 천식치료제로서의 역할을 가진다는 것을 본 연구를 통해서 예측할 수 있다.

인간 열충격 단백질-60에 대한 인간 단클론 항체 Fab의 기능 연구

장은정 아주대학교 2007 국내석사

목적 : 열충격 단백질(Heat Shock Protein; HSP)은 원핵 세포과 진핵 세포에서 발현된다. 열충격 단백질은 단백질이 합성될 때 올바른 접힘을 돕는 chaperone의 역할을 하며 분자량에 따라 나뉠 수 있다. 그 중에서 열충격 단백질-60은 열과 같은 충격에 의하여 미토콘드리아 내에서 발현 양이 증가되고, 세포 표면에서도 발현될 수 있다. 열충격 단백질-60은 다양한 미생물질에 의한 선천적 면역 체계 활성체 및 염증 반응 자극제로서 작용한다고 알려졌다. 인간 재조합 열충격 단백질-60은 면역 세포에서 염증 반응을 유도한다. 즉, 부착분자 (adhesion molecule)의 발현과 종양 괴사 인자-alpha (TNF-a)와 인터루킨-6 (IL-6)와 같은 염증 매개체의 유도와 nitric oxide (NO)등의 방출을 증가시키며, Th-1 촉진 싸이토카인 인터루킨-12 (IL-12)와 인터루킨-15 (IL-15)의 유전자 발현을 유도한다. 이러한 염증 반응의 촉진을 통하여 열충격 단백질-60은 조직손상과 염증성 질환을 유도한다. 본 연구실에서는 선행 연구로 파아지 디스플레이 (phage display) 기법을 이용하여 인간 재조합 항-열충격 단백질-60에 대한 단클론 항체 Fab (HSP60-45)를 제작하였다. 본 연구에서는 HSP60-45 항체가 HSP60에 의하여 자극을 받은 대식세포에 의하여 방출되는 종양 괴사 인자-a, 인터루킨-6, NO의 방출 양상에 미치는 영향 분석을 통하여, 이 항체의 염증 반응 조절에서의 잠재적 기능을 연구하고자 하였다. 재료 및 방법 : 항-열충격단백질-60 Fab 클론, HSP60-45를 박테리아에서 발현시킨 후, Ni-NTA agarose 친화성 크로마토그래피를 이용하여 용해성 Fab를 순수 정제하였다. 정제된 HSP60-45가 열충격 단백질-60의 대식세포로의 결합 (binding)과 섭취 (uptake)에 어떠한 영향을 미치는지 유세포 형광분석기 (FACS)와 형광현미경으로 관찰하였다. 인간 열충격 단백질-60가 대식세포를 자극하여 염증 유도 물질 (proinflammatory mediator; TNF-a, IL-6, NO)들의 유도와 이러한 물질 유도에 HSP60-45가 어떠한 영향을 미치는지를 각각 ELISA를 이용하여 측정하여 분석하였다. 결과 : 열충격 단백질-60이 농도 의존적으로 대식세포에 결합 (binding)하고 세포 안으로 섭취 (uptake) 되었고, HSP60-45는 열충격 단백질-60이 대식세포에 결합하고 섭취되는 것을 농도 의존적으로 억제하였다. HSP60-45에 의한 열충격 단백질의 대식세포로의 섭취 억제를 형광현미경으로 분석한 결과, 이 항체에 의한 섭취억제는 열충격 단백질-60에 특이적인 반응임이 확인되었다. 또한 HSP60-45는 열충격 단백질-60 자극에 의해 대식세포로부터 유도되는 종양 괴사 인자-a, 인터루킨-6, 그리고 NO의 생산 정도를 농도 의존적으로 억제하였다. 결론 : 여러 연구에서 알려져 있는 바와 같이 열충격 단백질-60이 대식세포에 결합하고 섭취되며 염증 유도 매개 물질을 유도하는 것이 확인 되었고, HSP60-45가 이러한 열충격 단백질-60의 대식세포에서의 염증 반응 유도 활성을 농도 의존적으로 억제하는 효과가 있는 것을 in vitro 세포 실험에서 확인하였다. 따라서, 인간 단클론 HSP60-45 Fab가 염증성 질환에 임상적으로 응용될 수 있을지를 추후 in vivo 동물 실험을 통하여 밝혀야 될 것이라고 제안한다.

류마티스관절염 활막세포에서 peroxisome proliferator-activated receptor-γ agonist 처치에 따른 염증매개인자 감소 및 활막세포 증식의 억제효과

권용진 연세대학교 대학원 2010 국내석사

류마티스관절염은 가장 흔한 염증성 관절염으로 약 1%의 유병율을 가진다. 류마티스관절염의 정확한 원인이나 발병기전은 아직 완전히 밝혀지지는 않았으나 자가면역현상이 주요 기전으로 알려져 있으며 대칭성, 다발성 말초 관절염이 특징인 만성 전신성 염증질환이다. 가장 먼저 염증이 시작되는 부위는 관절을 둘러싸고 있는 활막으로서, 활막세포가 비정상적으로 과다 증식하여 연골과 뼈의 손상을 유발하여 관절 파괴와 그에 따른 기능 손실을 초래한다. 류마티스관절염 환자의 활막에는 다양한 면역세포들이 침윤되어 있으며 특히 대식세포가 많은 부분을 차지하고 있다. 어떠한 원인 항원에 의해 염증이 시작되면 nuclear factor-kappaB (NF-?B), mitogen-activated protein kinases, IκB kinase (IKK) 및 activator protein (AP)-1과 같은 신호전달체계가 관여하여 대식세포와 단핵구로부터 tumor necrosis factor (TNF)-α, interluekin (IL)-1β 등 다양한 염증성 싸이토카인과 chemokine (C-C motif) ligand (CCL)-2, CCL-7 등의 케모카인, 그리고 matrix metalloproteinase (MMP)-9, cyclooxygenase (COX)-2 등이 분비되어 염증을 악화시키게 된다6-12. 그 결과 활막의 증식이 가속화되어 pannus를 형성하여 연골을 파괴하고 여러 염증매개 인자들이 receptor activator of NF-κB lilgand (RANKL)의 활성화를 유발하여 파골세포를 활성화시켜 골파괴를 일으켜 관절손상이 진행되는 것으로 알려져 있다. 이러한 염증을 억제하고 관절의 변형을 최소화하기 위해 류마티스관절염의 치료 약제 개발에 대한 연구도 꾸준히 지속되어 왔다. 최근에는 류마티스관절염에서 활막 증식과 관절 파괴에 중심적인 역할을 할 것으로 생각되는 여러 염증성 싸이토카인들에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며, NF-κB의 산물인 TNF-α 및 IL-1β의 작용을 차단하는 약제가 개발되어 류마티스관절염의 임상증상의 호전뿐 아니라 방사선 소견의 진행까지 늦출 수 있음이 보고되었다15-17. 하지만 치료효과가 뛰어남에도 불구하고 일부 환자들은 여전히 치료에 반응을 보이지 않아 새로운 치료법 개발의 필요성이 강조되고 있다. Peroxisome proliferator-activated receptor-γ (PPAR-γ)는 유전자 전사에 관여하는 핵수용체(nuclear receptor family)의 하나로, 지질대사 및 항상성 유지에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 최근 들어 PPAR-γ가 염증반응에도 관여함이 밝혀졌는데, PPAR-γ agonist를 관절염 실험 쥐 모델에 투여하자 대식세포에서 염증매개 물질의 생성이 감소하는 것이 관찰되었다. 또한 PPAR-γ가 TNF-α 및 IL-1β를 비롯한 다양한 염증성 싸이토카인에 대한 억제 작용뿐만 아니라 COX-2와 MMP-9을 비롯한 다양한 염증매개 물질들의 발현을 감소시키고 이러한 항염증작용은 주로 NF-κB의 억제 작용에 의한 것으로 받아들여지고 있다. 이상의 연구 결과들을 미루어 볼 때, 대식세포의 활성화 및 NF-κB에 의해 발현이 증가된 여러 염증매개 인자들이 그 병인에 있어서 중요한 류마티스관절염에 있어서도 PPAR-γ agonist가 항염증효과를 나타낼 가능성이 있을 것으로 추정된다. 류마티스관절염의 병인에 있어서 관절 활막이 특이적 면역반응이 일어나는 주요 부위임은 분명히 밝혀져 있는 바, 류마티스관절염의 관절 활막에서 발생되는 병태생리를 연구하고 활막염의 발생을 억제 혹은 감소시키는 인자를 발견하는 것은 류마티스관절염의 발생기전을 이해하며 새로운 치료를 도모할 수 있는 매우 중요한 임상적 의미를 갖는다고 생각된다. 본 연구에서는 류마티스관절염 환자의 관절활막에 대하여 synthetic PPAR-γ agonist인 rosiglitazone을 투여하고 투여 용량과 비례하여 활막에서 발생하는 염증반응이 감소되는지, 그리고 활막세포의 증식이 억제되는지의 여부를 확인하고자 하였다.

Studies on the effects of human prothrombin kringle-2 and kringle-2-derived peptides in murine microglia

김지연 Graduate School, Yonsei University 2009 국내박사