The intrinsic role of CD8α- dendritic cell subset in the initiation of effective humoral immunity

Changsik Shin Graduate School of UNIST 2016 국내박사

Dendritic cells (DCs), the most potent antigen presenting cells, have been identified in 1973 by Ralph M. Steinman. DCs. DCs role as an immune initiator as well as regulator, have been intensively studied for their crucial function in regulating cellular and humoral immune responses. Efficiency of human vaccines is mostly dependent on the generation of proper humoral immunity, and recently T follicular helper (Tfh) cells have been identified as a true B cell helper, which significantly advanced our understanding of T cell-dependent B cell humoral immune responses. However, there are still little studies regarding the initial commitment of Tfh cells primed by DCs, particularly by the two major myeloid CD8α+ and CD8α- DC subsets. In this study, we present the undescribed intrinsic features and roles of the two DC subsets in the induction of Tfh cells and subsequent Tfh cell dependent humoral immune responses. We here demonstrate that the CD8α- DC subset critically roles in inducing antigen-specific Tfh cells by up-regulated expressions of Icosl and Ox40l via the non-canonical NF-κB signaling pathway. CD8α- DCs are able to induce functional Tfh cells regardless of an adjuvant type. Tfh cells initially primed by CD8α- DCs function as a true B cell helper that results in dramatically enhanced humoral immune responses against various human pathogenic antigens such as Yersinia pestis LcrV, HIV Gag, and Hepatitis B surface antigen. In addition, we showed that the localization of CD8α- DCs in the marginal zone (MZ) bridging channels is closely related to the induction of CXCR5+CCR7low Tfh cells. We also demonstrated that the major source of IL-6 for inducing Tfh cells is provided from the antigen specifically activated CD4+ T cells primed by CD8α- DCs, and those secreted by the DC subset seem have a minor role. Moreover, CD8α- DCs were superior in inducing functional Tfh cells over other antigen presenting cells majorly B cells. In contrast, CD8α+ DCs localized in the T cell enriched region are superior in inducing CXCR5lowCCR7high CD4+ T cells responsible for the generation of IFN-γ secreting Th1 cells. Taken together, this study reveals the undescribed intrinsic features and mechanistic role of the CD8α- DC subset in priming antigen-specific Tfh cell differentiation and thereby provides the potential of investigating CD8α- DCs to effectively evoke antigen-specific humoral immune responses through the improved therapeutic vaccines.

Dendritic cell과 Macrophage에 대한 Cefodizime의 면역학적 활성 기능

김한준 中央大學校 大學院 2002 국내석사

세포디짐은 원래 항생제로 개발되었으나, 감염은 항상성의 매개체에 현저한 변화를 초래하여 면역기능을 강력하게 변화시키므로 유효한 항생제는 간접적이긴 하지만 강력한 면역조절제가 될 수 있다. 그리하여 본 연구에서는 세포디짐을 사용하여 dendritic cell과 macrophage에 대한 면역학적 활성기능을 알아보았다. Dendritic cell과 macrophage를 취하여 각각에 cefodizime 10㎍/㎖, cefodizime 50㎍/㎖, cefodizime 100㎍/㎖, IFN-γ10U/㎖+LPS 1㎍/㎖을 넣은 뒤 4, 8. 12. 24시간을 배양하여 이들 세포가 발현하는 cytokine인 IL-1, IL-6,IL-12 mRNAs를 RT-PCR 기술을 통하여 알아보았다. 그 결과 Dendritic cell이나 macrophage의 경우 baseline에서도 모든 cytokine이 소량씩 분비가 되며 dendritic cell이나 macrophage의 모든 경우 IL-1β, IL-6, IL-12 mRNA expression에 증가 효과를 나타내는 것으로 생각되어진다. 따라서 IL-1β, IL-6의 분비가 증가로 인하여, mouse에게 cefodizime을 투여하면 proinflammatory cytokine이 증가하여, macrophage, NK cell, CTL, B cell등의 활성이 증가될 것이라는 것을 유추할 수 있다. 또한 IL-12의 증가는 T cell growth and differentiation factor 증가를 제시한다. 이런 결과로부터 cefodizime은 기존의 항생제의 개념이 아닌 새로운 면역증강물질로서의 가능성을 제시한다. 이와 같은 시도는 cefodizime의 항생제로의 개념이 아닌 면역 부활제로서의 기능을 알아본 것이고, 이것으로 dendritic cell의 특성 규명이나 macrophage의 활성 mechanism을 연구하는 토대가 될 수 있다는데 그 의의가 있다. Cefodizime has originally been developed for treating infections as an antibiotics. However, according to some of recent studies, cefodizime, a third generation cephalosporin, may potentially have the capability of stimulating chemotactic activity of neutrophils and monocytes as well as the strong immuno-modulator. In turn, infection can result in a drastic change of mediators, which lead to initiate an immune response in an indirect way. With this backgrounds, I have studied to see if cefodizime can be a potential substance to induce an immunological function in dendritic cells and peritoneal macrophages. In experimental process, dendritic cell and peritoneal macrophages were taken and mixed with 10㎍/㎖, 50㎍/㎖, 100㎍/㎖cefodizime and 1㎍/㎖ IFN-γ10U/㎖+LPS. These mixtures were then incubated for 4, 8. 12. 24 hours to see if cytokines would be released in an analytical amount by assessing RT-PCR for IL-1β, IL-6, IL-12 mRNAs. As a result, I have found that both dendritic cells and peritoneal macrophages released cytokines, such as IL-1β, IL-6, IL-12 even though the amounts were not that significantly much. This result may represent that both cells when treated with cefodizime can show an increase of cytokine. Accordingly, we can expect that cefodizime may induce the activation increase for macrophage, NK cell, CTL, B cell due to the increase of pro-inflammatory cytokine noted above. Besides, the increase of IL-12 may be a meaningful result for T-cell growth and for the increase of differentiation factor. From these results, we will be able to say that cefodizime may be a potential immuno-modulator rather than an antibiotics itself. Importantly, the meaningness of this study is to be a basic knowledge for elucidating the properties of dendritic cells and for researching the mechanism of macrophage's activation in a presence of cefodizime in future study.

돼지 호홉기 생식기 증후군과 부루셀라 아보투스에 대한 수지상세포 백신의 효과와 평가

NGUYEN DINH QUAT 전남대학교 대학원 2009 국내박사

Inhibition of Differentiation and Function of Monocyte-derived Dendritic Cells, and Analysis of Responses to Inflammatory Stimuli of Leukemia Cell Line-derived dendritic cells : 단핵구 유래 수지상세포의 분화 및 기능 억제와 혈액암 세포주 유래 수지상세포의 염증 자

김광동 Graduate School Chungnam National University 2004 국내박사

수지상세포는 초기면역반응, 획득면역 그리고 면역계의 조절에 있어서 중요한 역할을 하는 전문적인 항원제시세포이다. 본 연구에서 수지상세포의 분화와 기능에 억제제로서 apolipoprotein A-Ⅰ과 dexamethasone을 연구하였다. 또한 급성혈액암 세포주 (MUTZ-3)로부터 유래된 수지상세포의 다양한 염증반응에 대한 반응성을 조사하였고, 특히 LPS자극에 대한 반응을 조사하였다. Apollpoprotein A-Ⅰ은 고밀도 지방단백질(HDL)의 주요 구성 단백질이다. 그리고 apolipoprotein A-I과 HDL은 동맥경화증에서 항염증활성을 갖는다. 수지상세포가 동맥경화와 관련이 있다는 보고는 있어왔으나, 수지상세포의 분화 및 기능에 대한 apolipoprotein A-Ⅰ의 조절기작은 보고되지 않았다. 이 연구는 기능적 분석을 통하여 apolipoprotein A-Ⅰ이 수지상세포 분화 및 성숙의 억제제라는 것을 보여준다. Apolipoprotein A-Ⅰ이 존재하는 상태에서 단핵구로부터 분화된 수지상세포는 감소된 세포표면분자 (CD1a, CD80, CD86, HLA-DR)의 발현을 가지게되고 allogenic T 세포의 활성과 식세포작용은 억제되었다. 또한, 수지상세포의 분화와 기능에 대한 억제제로 알려진 PGE_(2)와 IL-10이 apoA-Ⅰ존재하에서 분화된 세포에서 생성되었으며, CD40과 IFN-γ의 자극에 대해 IL-12를 생산하지 못하였다. Apolipoprotein A-Ⅰ은 이미 분화된 미성숙 수지상세포에도 억제능력을 가지고 있다. Apolipoprotein A-Ⅰ을 전처리하면 T세포 자극에 관여하는 표면항원의 발현과 MLR활성이 감소되었다. Apolipoprotein A-Ⅰ으로 전처리된 수지상세포에 의해 활성화된 T세포는 IFN-γ의 생산능력이 감소하였다. 또한, apolipoprotein A-Ⅰ는 IL-12와 IFN-γ의 생산면에서 수지상세포와 NK세포의 상호작용을 억제한다. 따라서, apoloprotein A-Ⅰ는 선천성 면역반응과 염증을 조절하는 중요한 작용을 하는 것으로 사료된다. 수지상세포에 대한 apolipoprotein A-Ⅰ의 새로운 억제기능은 염증질병에 새로운 치료적 접근을 유도할 것으로 사료된다. Glucocorticoid hormones (GC)는 강력한 항염증 및 면역억제제이다. 그러나, 항염증적 영향들에 대해서는 아직 많은 부분 알려지지 않았다. GC처리는 수지상세포의 성숙과 IL-12생성을 억제하는 것으로 알려져있다. 본 연구에서는 합성 glucocorticoid인 dexamethasone (Dex)에 의한 수지상세포의 세포사멸을 연구하였다. 수지상세포에 Dex를 처리하면 양적 및 시간에 따라 세포사멸이 유도되었고 annexin V의 결합과 mitochondrial potential을 조사함으로써 세포사별을 측정되었다. 단핵구는 그 세포사멸에 저항성이 있었다. Dex에 의한 수지상세포의 세포사멸은 caspase억제제 Z-VAD-fmk에 의해 억제되지 않았다. 흥미롭게도 agonistic CD40 antibody는 완벽하게 그 세포사멸을 억제하였다. 그러나, 다른 염증자극은 억제하지 못하였으므로, CD40 신호전달은 glucocorticoid에 의한 수지상세포의 세포사멸을 선택적으로 조절한다고 할 수 있다. 우리의 결과는 다양한 면역 관련 질병들에서 수지상 세포가 중요한 역할을 하는 면역반응의 조절에 있어서 glucocorticoid와 CD40 신호전달의 중요한 역할을 설명할 수 있었다. 여러 혈액암 유래 세포주가 수지상 세포로의 분화능을 가진다는 보고가 있다. 혈액암 세포주인 MUTZ-3는 GM-CSF, IL-4와 TNF-α에의해 수지상세포와 같은 표현형을 갖는다. 본 연구에서 MUTZ-3 유래의 수지상세포 (MuDC)는 많은 양의 HLA class Ⅱ, CD80과 CD86의 발현을 보였다. 그리고 강력한 항원표지세포의 기능을 할 수 있었다. 그러나, CD40자극에 부분적으로 반응을 하였고, LPS자극에 의해서는 성숙과정을 거치지 못했다. 우리는 MuDC의 CCR1, CCR7 그리고 TLR의 발현을 조사하였고, 성숙화 자극후, IL-10과 IL-12의 생산을 측정하였다. 비록, MuDC의 TLR4 mRNA는 발현하였으나 LPS자극 후에 CCR7과 cytokine의 생산양은 증가하지 않았다. 반대로, CD40자극에 대해서는 CD83, CD86, CCR7이 증가하였다. LPS에 의한 자극에 대해 MoDC는 DC-NK cell coclutre에서 NK 세포를 강력하게 활성화시키는 반면 MuDC는 NK세포를 자극하지 못하였다. 본 연구결과에 의하면 MuDC는 TLR4를 발현하기는 하지만 LPS에 의해서 성숙화되지 못했다. MuDC에 있어서 TLR에 의한 세포신호전달기작은 더 연구되어야 할 것이다. 따라서, 혈액암 치료를 목적으로 하는 혈액암 유래의 DC를 사용하고자 할때 다른 전구체로부터 유래된 DC와의 차이점을 고려하고 효과적인 함암 세포 치료제로서 개선되어야 할 것이다 Dendritic cells (DC) are professional antigen presenting cells, which play important roles in primary immune responses, acquired immunity, and regulation of immune system. Recent studies suggest that DC also play critical roles in induction of peripherals immunological tolerance, regulate the types of T cell immune responses and function as effector cells in innate immunity against microbes. In this study, we report apolipoprotein A-Ⅰ and dexamethasone as inhibitors of DC differentiation and/or function. In addition, we investigate that acute myeloid leukemia cell line (MUTZ-3)-derived dendritic cells response differentially to various inflammatory stimuli and especially cannot response to LPS stimulus. Apolipoprotein A-Ⅰ(ApoA-Ⅰ) is the principle protein of high density lipoprotein (HDL), and ApoA-Ⅰ and HDL have anti-inflammatory activity in atherosclerosis. Although it has been reported that DC are associated with atherosclerosis, it remains to be reported whether ApoA-Ⅰ inhibits the differentiation of DC from monocytes and the inhibition of DC function. The present study demonstrates that ApoA-Ⅰ is the inhibitor of DC differentiation and maturation. DC differentiated from monocytes in the presence of ApoA-Ⅰ showed a decreased expression of surface molecules like CD1a, CD8O, CD86, and HLA-DR. They also showed decreased endocytotic activity as well as the we allogenic T-cell activation. During the DC differentiation in the presence of ApoA-Ⅰ, PGE_(2) and IL-10, which were known as inhibitors of DC differentiation or/and modulator of DC function, were produced by the cells, whereas in stimulation with CD4O and IFN-γ, IL-12 production was significantly decreased in the treated cells. T cells stimulated by apolipoproteinA-Ⅰ-pretreated DC produced significantly low level of IFN-γ, and ApoA-I inhibited cross-talk between DC and NK cells in terms of production of IL-12 and IFN-γ. Therefore ApoA-Ⅰ appears to play an important role in modulating both innate immune response and inflammation, and the novel inhibitory function of ApoA-Ⅰ on DC differentiation and function might lead to new therapeutic approaches in inflammatory diseases. Glucocorticoids (GC) are potent anti-inflammatory and immune-suppressive agents that act on a variety of immune cells, including T cells, monocytes/macrophages, osteoclasts and dendritic cells (DC). It is already well known that GC treatment inhibits DC maturation and IL-12 production by DC. In this study, I investigated the apoptosis induction of DC by a synthetic glucocorticoid, dexamethasone (Dex). The stimulation with Dex resulted in DC apoptosis in a dose-and time-dependent manner as it was measured by determining annexin V-positive cells and mitochondrial potential. The Dex-induced apoptosis of DC was independent of caspase-activation as it was not inhibited by the broad caspase inhibitor, Z-VAD-fmk. Interestingly, agonistic CD40 antibody completely inhibited Dex-induced cell death, whereas other inflammatory stimuli did not show the same effect, suggesting that CD40 signaling may selectively modulate glucocorticoid-mediated DC apoptosis. Taken together, our findings revealed an important role of GC and CD40 signaling in the regulation of immune responses in which DC play a key role in the inflammatory process of various immunomediated diseases. Several myeloid leukemia-derived cells have been reported to possess the ability to differentiate into dendritic cells (DC). MUTZ-3, a myeloid leukemia cell line, responds to GM-CSF, IL-4 and TNF-α and acquires a phenotype similar to immature monocyte-derived DC (MoDC). In the present study, MUTZ-3-derived DC (MuDC) showed high level of expression of HLA class Ⅱ molecules, CD80 and CD86, and were able to function as potent antigen presenting cells as previously reported. However, MuDC maturation was partially induced by CD40-mediated stimulation, but not by LPS stimulation. I analyzed CCR1, CCR7 and TLR expressions in MuDC, and measured IL-10 and IL-12 production after maturation stimuli. Although MuDC expressed the mRNA for TLR4, a major component of the LPS receptor system, they did not show enhanced level of CCR7 or cytokine production after LPS stimulation. In contrast, they responded in part to CD40 stimulation, which resulted in increased levels of CD83, CD86 and CCR7. Moreover, while LPS-stimulated MoDC could play potentially stimulate NK cells in a DC-NK cell co-culture, LPS-stimulated MuDC failed to stimulate primary NK cells. Taken together, our data suggest that, although MuDC express TLR4, LPS does not stimulate MuDC to acquire mature phenotypes. The mechanisms underlying the defect in the TLR-mediated cell signaling pathway in MuDC are under current investigation.

참당귀로부터 분리한 angelan에 의한 dendritic cell의 항암효과 증가 : Augmentation of antitumor effect of dendritic cell by angelan isolated from Angelica gigas Nakai

김지연 충남대학교 대학원 2007 국내박사

Dendritic cell (DC)은 강력한 antigen presenting cell (APC)로서 microbial pathogen과 tumor에 대하여 T cell 반응의 개시자이며 immune sentinel의 중요한 요소로서 작용한다. Immature DC는 antigen을 capture하여 maturation되며 mature DC는 lymphoid organs으로 이동해 major histocompatibility complex (MHC) molecules과 co- stimulatory molecules의 signaling을 통해 T cell을 활성화 시킨다. 그러나 종양의 성장하는 동안 dendritic cell의 기능은 일반적으로 약해지는데 이것이 cancer에 대한 DC-based immunotherapies의 문제점이다. 또한, DC-based immunotherapies의 또 다른 문제점으로 DC의 완벽한 maturation, cell survival의 유지, lymph nodes로의 이동을 들 수 있다. 따라서 참당귀로부터 분리한 acidic polysaccharide인 angelan을 이용해 DC therapy의 문제점을 해결하고 최종적으로 cancer에 대한 antitumor effects를 확인하였다. 1. Angelan induced dendritic cell maturation through toll-like receptor4 Dendritic cell을 angelan을 24~48시간 처리한 결과 MHC Ⅱ, CD80, CD86이 증가하는 phenotypic maturation을 보였으며 angelan을 처리한 DC는 antigen을 capture하는 능력이 떨어짐을 확인했다. 또한 DC의 maturation 주요 marker인 IL-12 production이 크게 증가하였으며 IFN-α, IFN-β, TNF-α, IL-1β production도 증가하는 functional maturation을 보였다. Angelan 처리한 DC는 immature DC에 비해allogenic T cell proliferation, IFN-γ, ILR-2, IL-4, IL-10 증가하는 allogenicr T cell stimulation activity의 증가를 확인하였다. C3H/HeN (tlr+/+)와 C3H/HeJ (tlr-/-) mice를 사용해 angelan이 TLR4를 통해 DC를 maturation을 유도하는지 실험한 결과 LPS를 인지할 수 있는 C3H/HeN (tlr+/+) mice는 angelan에 의해 정상적으로 maturation하는것을 확인했으나 LPS를 인지할 수 없는 C3H/HeJ (tlr-/-) mice는 maturation을 하지 않아 angelan은 TLR4를 통해 DC를 maturation 시키는 것을 확인하였다. 2. Differential role of MAPK and NF-κB signalings in maturation and survival of angelan-activated DCs Angelan을 처리한 DC는 western blotting과 EMSA를 통해 MAPK와 NF-κB를 활성화 시키는 것을 보았다. MAPK와 NF-κB의 inhibitor를 처리해 DC의 maturation과 survival을 관찰한 결과 NF-κB는 DC의 maturation에 관여하며 p38과 ERK는 DC의 survival에 관여하는 것을 확인하였다. 3. Angelan increased dendritic cell migration by up-regulating chemokine receptor expression Angelan을 처리한 DC는 chemokine MIP-3β와 SDF-1α에 의해 migration이 증가되며 RT-PCR을 통해 이 chemokines의 receptor인 CCR7, CXCR4도 증가되는 것을 확인하였다. 또한 DC의 migration에 대한 MAPK와 NF-κB의 관계를 inhibitor를 통해 실험한 결과 NF-κB와 p38가 angelan-treated DC의 migration에 관여하는 것을 알 수 있었다. 4. Angelan increased the function of antitumor effects C57BL/6 mice를 이용해 B16F10 melanoma cell에 대한 antitumor effects를 본 결과 tumor lysate-pulsed DC가 iDC보다 그 효과가 높았다. 그리고 angelan의 in vitro, in vivo 처리는 적은 cell 수의 lysate-pulsed DC에도 불구하고 anglean을 처리하지 않은 실험구에 비해 tumor growth를 거의 완벽하게 감소시켰다.

The Activators of Dendritic Cells

MAZA PERRY AYN MAYSON 아주대학교 2022 국내박사

The Activators of Dendritic Cells Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells and effective activators of naive T lymphocytes. They serve as a link between innate and adaptive immunity. The ontogeny and functions of DC subsets are diverse and proven to potentially take up and potentially process tumor-associated antigens (TAA). In this context, scientists have devised techniques like genetically modified or TAA-pulsed DC vaccines and immunostimulatory adjuvants or agents to block immunosuppressive DC function that can promote the activation of DC and T cell priming. Thus, efforts to combine adjuvants with antigens for in vivo applications are rising. The phenomena of spleen dendritic cells (sDCs) activating spontaneously when isolated and put in cell culture have proven intriguing. Freshly isolated sDCs are immature, having low MHC and co-stimulatory molecules. However, significant activation occurred in culture as early as 3 hours. The most important observation is that most of the up-regulation of maturation factors happens due to cell-cell interactions. This cell clustering enables soluble ICAM-1 to be shed, which increases the up-regulation of maturation surface molecules such as CD86, CD80, CD40, MHCI, and MHCII. Furthermore, fibronectin and fibronectin cell-binding domain peptides, but not laminin and its cell-binding domain peptides, suppress sDCs cell aggregation and activation without affecting cell survival. The findings indicate a potential technique for using primary spleen dendritic cells in cancer immunotherapy research. The extracellular matrix (ECM) plays a dynamic role in shaping a cell's survival, differentiation, and migration. The ECM and DCs cooperate in finely tuned, dynamic exchanges that subsequently affect the homeostasis between steady-state DC tissue residence or DC-stimulated inflammation. It is important to elucidate how DCs maintain homeostasis. It was then investigated whether the ECM proteins, such as fibronectin (FN) and laminin (LMN) proteins, affect the maturation of bone marrow-derived DCs (BMDCs). Fibronectin inhibited the expression of surface maturation marker CD86 in a dose-dependent manner compared to untreated cells or laminin-treated BMDCs. Moreover, the production of pro-inflammatory cytokines such as TNF-α and IL-12p40 in LPS-induced BMDCs was dose-dependently inhibited by fibronectin compared to LPS alone. Additionally, fibronectin abrogated the phosphorylation of AKT and IKKα/β but not p38 and ERK1/2 Kinases in LPS-stimulated DCs. Upon using integrin inhibitors like BIO5192 (α4β1 inhibitor) and PF-562771 (FAK inhibitor), FN's inhibitory activity was disrupted because it is most likely that FN inhibition began with binding to the α4β1 integrin receptor and then phosphorylated FAK, resulting in AKT kinase dephosphorylation. The decreased expression of FN in the LPS-injected mouse spleen also proved that FN solely regulated dendritic cell activation and migration. These results suggest that Fibronectin and laminin ECM proteins have a different impact on the phenotypic or functional properties of matured DCs. In the search for DC adjuvants for cancer immunotherapy, Inotodiol from Inonotus obliquus, a natural compound with a wide range of biological activities, was investigated. It was explored whether it promotes the maturation of bone marrow-derived DCs (BMDCs) and inotodiol-treated BMDCs induce T cell activation. Inotodiol increased the expression of surface maturation markers, including MHC-I, MHC-II, CD86, and CD40, on BMDCs without affecting the production of various pro-inflammatory cytokines. T cells primed with inotodiol-treated BMDCs proliferated and produced IL-2 without producing other cytokines. Injection of inotodiol into mice induced maturation of splenic DCs and IL-2 production. The administration of inotodiol and inotodiol-treated BMDCs induced the proliferation of adoptively transferred CD8+ T cells in vivo. The phosphatidylinositol-3-kinase inhibitor wortmannin abolished the upregulation of Akt phosphorylation and CD86 and MHC-II expression caused by inotodiol. However, inotodiol failed to induce phosphorylation of the IκB kinase and degradation of IκB-α, and increased expression of CD86 induced by inotodiol was not blocked by an IκB kinase inhibitor. These results suggest that inotodiol induces an atypical maturation in DCs through phosphatidylinositol-3-kinase activation but not through NF-κB, and inotodiol-treated DCs enhance T cell proliferation and IL-2 secretion. Overall, these findings raised critical theoretical issues that have a bearing on the dendritic cells' maturation, functionality in the presence of fibronectin, and a promising strategy to utilize primary sDCs as a platform for cancer immunotherapy. 수지상 세포의 활성화제 수지상 세포는 전문적인 항원 제시 세포이며, naive T 림프구의 효과적인 활성화제이다. 그들은 선천적 면역과 적응적 면역 사이의 연결고리 역할을 한다. DC 하위 집합의 개체 발생과 기능은 다양하며 종양 관련 항원(TAA)을 잠재적으로 수용하고 처리하는 것으로 입증되었다. 이러한 맥락에서 과학자들은 DC 및 T 세포 priming의 활성화를 촉진할 수 있는 면역 억제 DC 기능을 차단하기 위해 유전자 변형 또는 TAA pulsed DC 백신 및 면역 자극 보조제 같은 기술을 고안했다. 따라서, 생체 적용을 위해 보조제와 항원을 결합하려는 관심이 증가되고 있다. 비장 수지상 세포(sDC)가 분리되어 세포 배양에 투입될 때 자발적으로 활성화되는 현상은 주목받고 있다. 새롭게 분리된 sDC는 미성숙하고, 낮은 MHC와 공동 자극 분자를 가지고 있다. 그러나 비장 수지상세포의 자발적 활성화는 배양 3시간 안에 일어난다. 가장 중요한 부분은 대부분의 성숙 인자의 상향 조절이 세포-세포 상호작용에 의해 일어난다는 것이다. 이는 수용성 ICAM-1을 흘려 보내어CD86, CD80, CD40, MHCI, MHCI와 같은 성숙 표면 분자의 상향 조절을 증가시킨다. 또한 피브로넥틴, 특히 피드로넥틴의 세포 결합 도메인은 세포 생존에 영향을 주지 않고 세포 응집과 활성화를 억제한다. 하지만 라미닌은 그 역할을 하지 못한다. 이 연구결과는 암 면역요법 연구에 1차 비장 수지상 세포를 사용할 수 있음을 기대한다. 세포 외 기질(ECM)는 세포의 생존, 분화, 이동을 형성하는 데 중요한 역할을 한다. ECM과 DC는 미세 조정된 동적 교환에서 협력하며, 이는 이후 정상 상태의 조직 상주DC 또는 염증 자극된DC 사이의 항상성에 영향을 미친다. DC가 어떻게 항상성을 유지하는지 설명하는 것이 중요하다. 따라서 피브로넥틴(FN) 및 라미닌(LMN) 단백질과 같은 ECM 단백질이 골수 유래 DC(BMDC)의 성숙에 영향을 미치는지 여부를 조사했다. 대조군, 라미닌 처리 BMDC 와 비교하여 피브로넥틴이 처리된 BMDC는 용량 의존적인 방법으로 표면 성숙 마커 CD86의 발현을 억제되었다. 또한 LPS 유도 BMDC에서 TNF-α 및 IL-12p40과 같은 염증성 사이토카인의 생성은 LPS 단독과 비교하여 피브로넥틴에 의해 용량 의존적으로 억제되었다. 피브로넥틴은 LPS 자극 DC에서 AKT와 IKKα/β의 인산화를 억제했지만, p38과 ERK 1/2 키나아제는 유의미한 반응을 보이지 않았다. BIO5192(α4β1 저해제) 및 PF-562771(FAK 저해제)과 같은 인테그린 억제제를 사용하였을 때, FN의 억제 활성은 α4β1 인테그린 수용체에 결합하는 것으로 시작하여 phosphorylated AKT 키나아제 탈인산화가 일어났다. LPS 주사 마우스 비장에서 FN의 발현의 감소는 FN이 수지상 세포의 활성화와 이동을 단독으로 조절한다는 것을 증명했다. 이러한 결과는 피브로넥틴과 라미닌 ECM 단백질이 성숙 DC의 표현형 또는 기능 특성에 다른 영향을 미친다는 것을 시사한다. 암 면역요법을 위한 DC 보조제를 찾기 위하여 천연 화합물 Inonotus obliquus로부터 다양한 생물학적 활성을 가진 Inotodiol을 선발하였고, Inotodiol처리에 따른 골수유래 수지상세포(BMDC)의 성숙을 촉진여부와 BMDC의 T세포 활성화 유도 능력을 확인하였다. Inotodiol은 다양한 염증성 사이토카인의 생성에 영향을 미치지 않고 BMDC에서 MHC-I, MHC-II, CD86, CD40을 포함한 표면 성숙 마커들의 발현을 증가시켰다. Inotodiol 처리 BMDC로 활성화된 T 세포는 다른 사이토카인을 생성하지 않고 증식하여 IL-2를 생성한다. 생쥐에 Inotodiol을 주입하면 비장 DC의 성숙과 IL-2 생산이 유도된다. Inotodiol과 Inotodiol 처리된 BMDC의 투여는 생체 내에서 양쪽으로 전이된 CD8+ T 세포의 증식을 유도하였다. The phosphatidylinositol-3-kinase저해제 wortmannin은 Inotodiol에 의한 Akt 인산화 및 CD86 및 MHC-II 발현의 상향 조절을 억제했다. 그러나 Inotodiol 은 IκB 키나아제의 인산화 및 IβB-β의 분해에 영향이 없었고, Inotodiol에 의해 유도된 CD86의 발현 증가는 IβB 키나아제 억제제에 의해 차단되지 않았다. Inotodiol 이 The phosphatidylinositol-3-kinas활성화를 통해 DCs에서 비정형 성숙을 유도하지만 NF-κB를 통해서는 유도되지 않으며, Inotodiol이 처리된 DCs는 T세포 증식과 IL-2 분비를 향상시킨다는 것을 시사한다. 이를 바탕으로 수지상 세포의 성숙, 피브로넥틴 존재에서의 기능, primary sDC를 암 면역 치료의 플랫폼으로 활용하는 유망한 전략과 관련된 중요한 이론적 문제를 제기한다. 키워드: 골수 유래 수지상 세포, 이노토디올, 피브로넥틴, s-ICAM-1, 비장 수지상 세포

Identification of dendritic cell subsets in psoriasis vulgaris : immunohistochemical study

박상건 Graduate School, Yonsei University 2005 국내석사

건선은 전세계적으로 발생하며 인구의 약 1-3%에서 발생하는 매우 흔한 피부질환으로 외상, 감염, 차고 건조한 기후 등의 악화 요인들은 알려져 있으나 그 원인에 대해서는 명확히 밝혀져 있지는 않다. 건선의 병인으로 전에는 표피세포의 과증식이 일차적인 원인으로 생각되었으나, 이후 T 세포 매개의 자가면역 질환으로 알려지고 있으며, 최근에는 수지상 세포 또한 중요한 역할을 하는 것으로 알려지고 있다.수지상 세포에는 랑게르한스 세포, inflammatory dendritic epidermal cell, dermal dendritic cell, plasmacytoid dendritic cell 등이 알려져 있으며, 최근에는 건선 이외의 여러 염증성 피부질환에서 이러한 수지상 세포의 아형들이 다른 기전으로 관여하는 것으로 알려지고 있다.본 연구에서는 랑게르한스 세포, inflammatory dendritic epidermal cell, plasmacytoid dendritic cell 등의 수지상 세포를 건선 환자의 병변 및 비병변 조직과 정상인의 조직에서 염색하여 비교해 보고자 하였다. 다섯명의 건선환자와 2명의 정상인을 대상으로 면역화학적 염색을 시행하여 다음과 같은 결과를 관찰할 수 있었다. 건선환자의 병변 및 비병변 조직과 정상인의 조직에서 랑게르한스 세포를 발견할 수 있었고, 병변 부위에서는 CD83을 표현하였다. Inflammatory dendritic epidermal cell과 plasmacytoid dendritic cell은 각각 병변 조직의 표피와 진피에서 발견되었으며, 비병변 부위와 정상조직에서는 발견되지 않았다. 이들은 병변 부위에서 증가되었지만, 랑게르한스 세포와는 달리 CD83을 표현하지는 않았다.본 연구를 통해, 저자들은 건선 병변 조직에서의 CD83 양성 수지상 세포는 대부분 랑게르한스 세포임을 알 수 있었다. Inflammatory dendritic epidermal cell과 plasmacytoid dendritic cell이 CD83을 표현하지는 않았지만, 이들은 비병변 부위에서는 발견되지 않고 병변 부위에서만 발견되는 점으로 보아, CD83을 발현하면서 성숙되지는 않았지만, 건선의 발병기전에 관여할 것으로 사료된다. In the past, the view of the pathogenesis of psoriasis was focused on the primary dysfunction of keratinocytes. In recent years, however, it has been viewed as a T cell-mediated autoimmune disease. Moreover, newly defined dendritic cell subsets such as inflammatory dendritic epidermal cells and plasmacytoid dendritic cells have been identified in various inflammatory skin diseases, including psoriasis.In this study, we attempted to stain and compare the dendritic cell subsets including Langerhans cells, inflammatory dendritic epidermal cells, and plasmacytoid dendritic cells in the involved and uninvolved skin of five psoriasis patients and in normal skin of two healthy volunteers. Immunohistochemical analysis confirmed that Langerhans cells were present in the involved and uninvolved skin of psoriasis patients and in the skin of healthy volunteers. However, Langerhans cells expressed CD83 only in the involved skin. Inflammatory dendritic epidermal cells and plasmacytoid dendritic cells were also found in the epidermis and dermis of the involved skin, respectively, but not in the uninvolved skin and in normal skin. Unlike Langerhans cells, they did not express CD83.In conclusion, we have found that most of the CD83+ dendritic cells in psoriatic lesions are Langerhans cells. Although inflammatory dendritic epidermal cells and plasmacytoid dendritic cells did not express CD83, they may play a role in the pathogenesis of psoriasis.

수지상세포의 방사선 저항성에 대한 연구

김은실 전남대학교 대학원 2003 국내박사

면역계에 수지상세포는 가장 강력한 항원제시 세포로서 T 림프구에 항원을 제시하여 면역반응을 유발한다. 최근에는 말초혈액의 조혈줄기세포나 단핵구에 수지상세포를 분화시킨 뒤 면역력을 강화한 후, 암 환자에게 다시 주입하는 항암 백신(dendritic cells-based cancer vaccine) 요법이 난치성 암 환자 치료법으로 각광받고 있다. 치료 시 투여되는 수지상세포가 각종 장기에 어떻게 분포하고 작용하는 지를 추적하는 것은 핵의학 분야에 관심의 대상이 되고 있으며, 그에 따른 세포 궤적의 추적(cellular trafficking) 연구를 위한 방사능표지(radio-labelling) 시 재료가 되는 세포에 대한 기본적인 방사선 민감성 연구가 필요하나, 과거부터 혈액세포에 대한 방사선 민감성 연구재료로 림프구가 많이 이용된 반면, 수지상세포에 대한 방사선 민감성 연구는 지금까지 시도된 바가 없다. 저자는 림프구와 비교되는 수지상세포의 방사선 민감성을 보기 위하여 조혈모세포에 수지상세포를 분화시킨 뒤 방사선을 조사하고 세포고사를 관찰하였다. 말초혈액에 분리한 T 림프구에 0 Gy, 5 Gy, 25 Gy의 방사선을 조사하고 4시 간 후에 유세포 분석기를 이용하여 선량별 세포고사 빈도를 관찰하였다. 조혈모세포에서는 미성숙 및 성숙 수지상세포를 단계적으로 분리 배양하여 각각 0 Gy, 10 Gy, 30 Gy, 100 Gy의 방사선을 조사하고 4 시간, 24 시간 그리고 48 시간 후에 유세포분석에 의한 선량별 세포고사 빈도를 관찰하였다. 또한 세 가지 세포군을 원심분리하고 염색한 후 광학현미경 하에서 세포에 대한 세포핵의 면적비율을 형태학적으로 관찰하였다. 림프구에서는 방사선조사 전량별로 세트고사 빈도가 유의하게 증가하였으나, 수지상세포에서는 방사선 조사선량이나 관찰시간에 따른 세포고사의 빈도차이가 없었다. 저항성을 나타낸 두 가지 수지상세포 중에서는 미성숙 형의 세포고사 분획이 성숙 형보다 증가하여 성축 형 수지상세포가 방사선에 더욱 저항성을 나타내었다. 광학 현미경으로 관찰한 세포에 대한 세포핵의 면적비율은 림프구에서 유의하게 높았다. 결론적으로, 수지상세포는 림프구에 비하여 방사전에 저항성을 나타내었고, 이것은 세포핵의 크기와 관련이 있을 것으로 생각되며, 항후 수지상세포를 이용한 세포 궤적의 추적연구나 종양치료 관련 연구에서 방사성동위원소 표지 수지상세포를 하나의 중요한 도구로 활용할 수 있을 것으로 생각된다. Dendritic cells, as accessory cells of immune system, capture and process antigens, express lymphocyte co-stimulatory molecules, migrate to lymphoid organs for initiating immune responses. The use of dendritic cell vaccines for cancer immunotherapy has emerged as an exciting new focus of investigation, In comparison with lymphocytes, dendritic cells have small size of nucleus with numerous cell membrane processes and there are few studies on radiation sensitivity of them. The purpose of this study is to find out radiation sensitivity of dendritic cells compared with lymphocytes. T lymphocytes captured from peripheral blood were irradiated by 0 Gy, 5 Gy, 25 Gy and apoptosis was measured by flowcytometry 4h after irradiation. Immature and mature dendritic cells processed from blood hematopoietic stem cell were irradiated by 0 Gy, 10 Gy, 30 Gy, 100 Gy respectively and apoptosis was measured by flowcytometry with time differences as 4h, 24h and 48h after irradiation. Morphometric analysis by percent nucleus ratios was measured in three cell groups, also. Lymphocytes showed radiation sensitivity by increasing apoptotic fraction according to radiation doses. However, both mature and immature dendritic cells showed consistent fraction of apoptosis in spite of increasing radiation dose. Percent nucleus ratio is significantly higher in lymphocytes than that of mature or immature dendritic cells. In conclusion, dendritic cells showed radio-resistance which might be related with small size of nucleus in comparison with lymphocytes and this result would be used as a basal data of radio-labelling for the cellular trafficking studies in nuclear medicine fields

Development of multi-functional anti-inflammatory therapeutics and innovative screening system for small molecule inhibitors

Do, Thi Thu Hien 세종대학교 대학원 2022 국내박사

Immunomodulatory effect of breast cancer cell-derived exosomes on macrophage and dendritic cells

Piao, Yinji 서울대학교 대학원 2020 국내박사

서론: 암세포 유래 엑소좀은 면역세포와의 정보교환을 통해 종양면역을 조절하여 암의 진행과 전이에 관여한다고 알려져 있지만 유방암에서 엑소좀의 자극을 받은 대식세포 또는 수지상세포의 면역기능 변화가 암 진행과 전이에 주는 영향에 관한 생체 연구는 부족하다. 따라서 본 연구에서는 세포추적 영상으로 유방암세포유래 엑소좀과 대식세포 또는 수지상세포와의 상호작용을 관찰하고 엑소좀에 의한 대식세포와 수지상세포의 종양면역 기능 변화를 분석하고자 한다. 또한 생체광학영상기법과 일체형 광음향 초음파 영상기법을 이용하여 엑소좀에 의한 유방암 진행과 전이 기전을 규명하고자 한다. 실험방법: 본 연구에서는 사람과 마우스 삼중음성유방암세포(MDA-MB-231과 4T1), 마우스 대식세포(Raw264.7) 그리고 마우스 수지상세포(DC2.4)를 사용하였다. 렌티바이러스 시스템을 이용해 엑소좀 특이 막단백질(CD63)과 적색형광단백질(RFP)를 재조합한 CD63/RFP를 발현하는 MDA-MB-231-CD63/RFP, 4T1-CD63/RFP, 루시퍼라제(firefly luciferase)와 녹색형광단백질(GFP)을 동시에 발현하는 MDA-MB-231-Luc/GFP, GFP를 발현하는 RAW264.7/GFP와 DC2.4/GFP를 수립하였다. MDA-MB-231-CD63/RFP 와 4T1-CD63/RFP에서 분비되는 적색형광단백질을 발현하는 엑소좀을 추출하여, 나노입자분석 기기(NanoSight)를 사용하여 크기를 측정하고, 웨스턴 블럿으로 엑소좀 특이 단백질의 발현을 확인하였다. 추출한 엑소좀의 세포간 이동을 공초점 현미경으로 추적 관찰하였으며, 세포증식 평가(MTT)와 트렌스웰 이동 분석법으로 엑소좀에 의한 세포들의 증식, 이동 및 침윤 능력을 분석하였고, 실시간 역전사중합효소연쇄반응법, 웨스턴 블럿과 유세포 분석으로 대식세포와 수지상세포의 면역기능을 분석하였다. 면역결핍마우스(BALB/c nude)의 유선지방조직에 MDA-MB-231-Luc/GFP를 이식하여 유방암모델을 만들었다. 생체발광영상으로 엑소좀에 의한 종양의 성장과 전이 과정을 추적 관찰하였고 일체형 광음향 초음파 영상으로 EGFR항체가 탑재된 골드나노로드(anti-EGFR-GNs)를 일차 종양에 주입하여 유방암 림프절 전이를 분석하였다. 또한 마우스 피하에 엑소좀으로 활성시킨 수지상세포를 골드나노로드(GNs)로 표지하여 주사하고 피하부터 액와림프절로의 이동을 일체형 광음향 초음파 영상기법으로 추적 관찰 하였다. 영상 분석 후 적출한 종양 및 림프절 조직에서 H&E염색과 면역염색을 수행하였다. 결과: 유방암세포, 대식세포 그리고 수지상세포내에서 유방암세포 유래 엑소좀의 포식을 확인하였고 그 중 대식세포와 수지상세포는 엑소좀에 의해 활성화 되는 것이 관찰되었다. 엑소좀에 의해 각 세포들의 성장, 이동 및 침윤 능력이 증가되었고, 대식세포에서는 M1, M2 분극화 발현 마커인 NOS2와 CD206, Arginase-1의 발현이 유도되었고, 수지상세포에서는 보조자극 분자인 CD40, CD80, CD86의 발현과 이동성 관련 케모카인 수용체인 CCR7의 발현뿐만 아니라 분화와 성숙을 자극하는 TNF-α의 발현이 증가되었다. 생체발광영상과 일체형 광음향 초음파 영상으로 유방암 모델에서 엑소좀에 의해 종양의 성장과 전이가 촉진되는 것을 확인하였고 마우스의 피하에 이식한 엑소좀으로 활성 된 수지상세포는 림프절로의 이동 능력이 증가되었다. 결론: 형광단백질을 발현하는 유방암세포 유래의 엑소좀이 유방암세포, 대식세포, 수지상세포로 이동하는 과정을 실시간으로 추적 관찰한 결과, 엑소좀은 대식세포의 분극화와 수지상세포의 분화를 유도하여 유방암의 성장과 전이를 조절할 것이라는 가능성을 제시하였다. 또한 생체광학영상기법과 일체형 광음향 초음파 영상기법은 엑소좀에 의한 국소 림프절 전이 여부와 수지상세포의 이동과 분포를 효율적으로 추적 관찰하고, 분석할 수 있는 생체 영상법으로 다양한 암종에 활용에 활용될 수 있을 것이다. Introduction: Cancer cell-derived exosomes known as the mediators of intercellular communications, are involved in tumor progress and metastasis by modulating tumor immunity. Nevertheless, the role of macrophages or dendritic cells stimulated by breast cancer cell-derived exosome in breast tumor progression and metastasis is not fully elucidated. In this study, we investigated the interaction of breast cancer cell-derived exosomes with macrophages or dendritic cells, and analyzed the tumor immunity of macrophage and dendritic cells which stimulated by exosomes. We also analyzed the molecular mechanisms of exosome mediated breast cancer growth and metastasis using bioluminescent imaging and ultrasound-guided photoacoustic imaging. Methods: The human and mouse triple negative breast cancer cell lines MDA-MB-231 and 4T1, mouse macrophage cell line Raw264.7 and mouse dendritic cell line DC2.4 were used. MDA-MB-231-CD63/RFP, 4T1-CD63/RFP cells were established using lentivirus expressing RFP-tagged CD63, which is a specific marker of exosomes. MDA-MB-231-Luc/GFP cells expressing both green fluorescence protein (GFP) and the firefly luciferase (Luc), RAW264.7/GFP cells and DC2.4/GFP cells expressing GFP were established using a lentiviral system. RFP-tagged exosomes secreted from MDA-MB-231-CD63/RFP or 4T1-CD63/RFP cells were isolated. The size of isolated exosomes was measured by NanoSight and specific exosomal marker proteins were assessed by Western blot. The intercellular transfer of RFP tagged exosomes between cells was monitored by confocal microscopy. The effects of exosomes on cell proliferation, migration and invasive abilities were evaluated by MTT and Trans-well migration assays. The expression of genes associated with the anti-or pro-tumor immunity in the exosome-stimulated macrophage and dendritic cells were evaluated using RT-PCR, Western blot and flow cytometry. The xenograft tumor models were produced by injection with MDA-MB-231-Luc/GFP cells into the mammary gland of female Balb/c nude mice. Tumor progression and metastasis affected by exosomes were noninvasively monitored by bioluminescence imaging and ultrasound-guided photoacoustic imaging after intratumoral injection of anti-EGFR-GNs. Histologic examination of tissue was performed by H&E staining and immunostaining. Result: RFP tagged exosomes taken up by breast cancer cells, macrophages and dendritic cells can be tracked by live-cell microscopy, macrophage and dendritic cells when took up exosomes were exhibited slightly elongated morphology. Exosomes significantly increased cell growth, migration and invasion abilities. Exosomes activated macrophages to M1 and M2 phenotypes, which exhibited high expression of M1 marker (NOS2) and M2 markers (CD206, Arginase-1). Exosomes led to dendritic cell activation by inducing upregulation of co-stimulatory molecules CD40, CD80, and CD86, the chemokine receptor CCR7, and TNF-α. Primary tumor growth and metastasis promoted by exosomes and exosome-stimulated dendritic cell migration into lymph node were observed by bioluminescent imaging and ultrasound-guided photoacoustic imaging. Conclusions: We monitored the interaction of RFP-tagged exosomes with macrophages and dendritic cells in real-time. Our data demonstrated breast cancer cell-derived exosomes mediate breast cancer progress by modulating the immune function of macrophage and dendritic cells. The bioluminescent imaging and ultrasound-guided photoacoustic imaging combined with GNs allowed for sensitive and longitudinal monitoring of tumor growth, metastasis and dendritic cell migration in vivo.