생쥐조골세포에서 caspase 및 MAPK 신호전달경로를 통한 쿼시틴의 TNF-a 유도성 세포자멸사 촉진 효과

최용성 전북대학교 2006 국내박사

Tumor necrosis factor (TNF)-a plays a key role in osteoclastogenesis and osteoporosis by stimulating osteoblasts to secrete several inflammatory cytokines. The bioflavonoid quercetin is believed to reduce bone loss by inhibiting osteoclastogenesis and regulating many systemic and local factors including hormones and cytokines. However, the precise effects of quercetin on osteoblastic cells are unclear, which is particularly apparent in the presence of inflammatory cytokines. Therefore, this study examined the precise mechanism for how quercetin facilitates the TNF-a-mediated apoptosis in osteoblasts. TNF-a was found to induce apoptosis in preosteoblastic MC3T3-E1 cells through the caspase-dependent pathway, which was markedly accelerated by quercetin in a dose-dependent manner. Quercetin increased the activator protein (AP)-1 DNA-binding activity with a corresponding increase in the level of several Jun and Fos family proteins, which was closely related to mitogen-activated protein kinase (MAPK) activity. In particular, MAPK inhibitors, SP600125 and PD98059 but not SB203580 suppressed the down-regulation of Bcl-2 as well as decreased the mitochondrial ability induced by the TNF-a/quercetin treatment. However, these inhibitors did not affect the TNF-a-mediated caspase activation and apoptosis, which was strongly reduced by the caspase inhibitor, z-VAD-fmk. Collectively, these findings show that the quercetin-induced acceleration of TNF-a-mediated apoptosis in MC3T3-E1 cells is triggered by MAPK/Bcl-2-mediated mitochondrial stress, MAPK-mediated AP-1 activation and the caspase-dependent pathway. 종양괴사인자(TNF-a)는 조골세포(osteoblast)를 자극하여 다양한 염증성 사이 토카인(inflammatory cytokine)의 생성을 유도하며, 파골세포의 생성이나 골다공증 (osteoporosis)의 유발에도 중요한 역할을 하고 있다. 한편 플라보노이드(flavonoid)의 일종인 쿼시틴 (quercetin)은 파골세포 활성을 억제하거나 호르몬 및 사이토카인과 같은 시스템적 및 국소적 인자들의 조절을 통해 골 감소 억제효과를 갖는다고 믿어졌다. 그러나 쿼시틴이 조골세포의 활성에 미치는 영향에 대한 연구결과가 다양하지 않으며, 무엇보다도 염증성 사이토카인의 존재하에서 쿼시틴이 조골세포에 미치는 효과는 거의 알려지지 않았다. 따라서 본 연구에서는 종양괴사인자 유도성 조골세포 자멸사에 대한 쿼시틴의 효과를 세포 내 수준에서 알아보고자 하였다 . 실험결과 종양괴사인자는 caspase 의존성 경로를 통해 조골세포(MC3T3-E1) 자멸사를 유도하였으며, 쿼시틴은 이러한 세포자멸사를 억제하는 것이 아니라 농도의존적으로 촉진한다는 것을 알 수 있었다 . 이에 대한 기전을 알아보기 위해 전사인자 및 MAPK의 활성을 측정한 결과 쿼시틴은 AP-1의 DNA 결합 활성을 증가시키는 것으로 나타났으며 , 특히 Jun 및 Fos의 증가와 밀접한 관련이 있는 것으로 드러났다 . 또한 이러한 AP-1의 활성은 MAPK 경로를 통해 일어난다는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 보다 명확하게 확인하기 위해 MAPK 억제제를 이용하여 실험한 결과 JNK(SP600125) 및 ERK 억제제(PD98059)의 처리는 종양괴사인자/쿼시틴 유도성 Bcl-2 발현억제 뿐만아니라 미토콘드리아 활성억제에 대해서도 감소효과를 나타냈다. 그러나 종양괴사인자 자체에 의한 caspase 활성이나 세포자멸사 유도에 대해 MAPK 억제제는 유의적 감소효과를 나타내지 못한 반면 pan-caspase 억제제인 z-VAD-fmk에 의해서는 현저한 감소가 나타났다. 지금까지의 연구결과를 종합해볼 때 종양괴사인자 단독처리시에는 caspase 활성을 통해 조골세포의 자멸사가 유도된다는 것을 확인할 수 있었으며, 쿼시틴과 혼합처리시에는 기존의 세포자멸사 유도기전인 caspase 의존성 경로가 더욱 활성화될 뿐만아니라 MAPK/Bcl-2 매개성 미토콘드리아의 스트레스, MAPK 매개성 AP-1 활성이 유도되어 결국에는 종양괴사인자 유도성 세포자멸사가 더욱 촉진된다는 것을 알 수 있었다 . 그러나 쿼시틴은 자연계에 가장 널리 존재하는 식이성 플라보노이드로서 항산화 , 항염증 및 항암효과와 같은 다양한 약물학적 및 의학적 효과가 알려진 반면 , 생체 내 (in vivo)에서의 중간대사물질이나 그에 따른 정확한 역할은 아직까지 알려진 바 없다. 따라서 쿼시틴이 조골세포에 미치는 기전을 규명하기 위해서는 생체 시스템을 이용하여 연구할 필요가 있을 것으로 사료된다 .

A novel pathway responsible for LPS-induced translational regulation of TNF-a and IL-6 expression involves PKC and fascin : LPS에 의해 유도되는 TNF-a와 IL-6의 전사 후 번역 과정에 관여하는 fascin과 PKC의 새로운 작용 기작

김재관 경북대학교 대학원 2013 국내박사

Fascin은 단백질 인산화 효소 C (PKC)의 기질 중 하나로서 세포 내 골격의 배치와 구조 유지에 중요한 역할을 하고 있는 단백질이다. 특히 actin과 결합하여 그물구조를 형성함으로써 세포막의 구조를 유지하고 변형하는데 관여되어 있다. 이러한 fascin은 신경세포와 수지상 세포에서 발현된다고 알려져 있으며, 암세포에서도 발견되고 있지만, 대식세포에서의 발현은 아직까지 보고되지 않았다. 본 연구에서는 대식세포에서의 fascin의 발현을 발견하였으며, 그 기능을 분석하였다. 기능 분석을 위하여 fascin 특이적인 si/shRNA를 이용한 형질주입을 통해 fascin의 발현을 억제하였다. 그 결과, 세포의 이동 능력과 침윤 능력이 저해 되었으며, 또한 염증성 싸이토카인인 TNF-a와 IL-6의 발현이 저해되었다. 반면에, 또 다른 세포 내 골격 변화와 관련된 반응인 대식작용이나 세포접착능, 염증매개물질인 MMP-9이나 일산화질소/이산화질소의 발현 등은 영향을 받지 않았다. 특히, fascin의 발현저해에 의해 발견된 TNF-a와 IL-6의 발현 저해 현상에서는 mRNA의 발현은 줄어들지 않는 결과가 관찰되었다. 이 흥미로운 현상은, 리보솜과 mRNA의 결합을 통한 번역(translation)과정의 활성화를 확인하는 폴리솜 분석을 통해서 분석되었다. 그 결과, fascin의 발현이 저해된 세포의 TNF-a와 IL-6 의 mRNA는 전사과정에서는 정상적으로 만들어지지만, 번역과정에서 음성적 조절을 받는다는 것을 확인 할 수 있었다. 이러한 번역 조절에는 PKC가 관여를 하고 있으며, 특히 miRNA-155와 -125b가 관련된 조절기작이 있다는 것을 확인하였다. 특히 miR-125b의 경우 TNF-a의 mRNA와 직접적인 결합을 통해 번역을 조절한다는 사실도 확인하였다. 결론적으로, fascin은 대식세포에서 세포의 이동과 침윤작용에 중요한 역할을 하며, LPS에 의해 유도되는 TNF-a와 IL-6의 전사 후 번역과정에서 핵심적인 작용을 한다고 할 수 있다.

Epigenetic alteration of hSRBC/Cavin-3 in colorectal cancers and its implication in tumor cell resistance to TNF-a-induced apoptosis

이진희 Graduate School, Korea University 2012 국내박사

hSRBC is a putative tumor suppressor whose alteration has been observed in several human cancers. I investigated expression and function of hSRBC in colorectal cells and tissues to explore its candidacy as a suppressor in colorectal tumorigenesis. Expression and methylation status of hSRBC and its effect on tumor growth were evaluated. Transcriptional regulation by NF-kB signaling was defined using luciferase reporter and chromatin immunoprecipitation assays. hSRBC expression was hardly detectable in 29 of 80 (36%) primary tumors and 11 of 19 (58%) cell lines and its alteration correlated with tumor stage and grade. Promoter hypermethylation was commonly found in cancers. hSRBC expression induced the G1 cell cycle arrest and increased cellular sensitivity to various apoptotic stresses. hSRBC was induced by TNF-a and its level correlated with tumor cell sensitivity to TNF-a-induced apoptosis. hSRBC induction by TNF-a was disrupted by blocking NF-kB signaling while it was enhanced by p65/RelA transfection. The hSRBC promoter activity was increased in response to TNF-a and this response was abolished by disruption of a kB site in the promoter. hSRBC delayed the formation and growth of xenograft tumors and improved tumor response to TNF-a-induced apoptosis. Consequently, hSRBC is a proapoptotic tumor suppressor which is commonly altered in colorectal cancer by promoter hypermethylation, and its gene transcription is directly activated by NF-kB in response to TNF-a. This suggests that hSRBC inactivation may contribute to tumor progression by reducing cellular sensitivity to TNF-a and other stresses, particularly under chronic inflammatory microenvironment.

댄스스포츠가 비만중년여성의 건강관련체력과 CRP, Leptin, TNF-α, Adiponectin 농도 변화에 미치는 영향

문현화 조선대학교 2010 국내박사

This study was intended to examine the effects of a 12-week dance sport program on the changes of health-related physical fitness and CRP, leptin, TNF-α, and adiponectin concentration in 20 obese middle-aged women with >30% body fat. Finally the following results were obtained. 1)As for the body composition factors of health-related physical fitness, the dance sport group showed a statistically significant difference in weight and % body fat at p<.001, LBM at p<.05, and WHR at p<.01. As for health-related physical fitness factors, there was a statistically significant difference in muscle strength at p<.01 and muscle endurance, flexibility, and cardiorespiratory endurance at <.001. There was no significant difference in the control group as a result of pre- and post-test. It was found that the dance sport program was effective for improving health-related physical fitness in obese middle-aged women. Based on this result, dance sport can be an effective obesity management program as a low-intensity aerobic exercise program in obese middle-aged women. 2)As for the change of CRP in the dance sport group, there was a statistically significant difference at p<.05. However, the control group showed no significant difference as a result of pre- and post-test. This result suggests that weight loss by continuous exercise can decrease CRP concentration. 3)As for the change of leptin in the dance sport group, there was a statistically significant difference at p<.05. However, the control group showed no significant difference as a result of pre- and post-test. Leptin is known to increase food intake, decrease heat generation, and control appetite, weight, and energy consumption by working on hypothalamus. This result suggests that the dance sport program had a positive effect on the decrease in leptin. 4)As for the change of TNF-α in the dance sport group, there was a little decrease but no statistically significant difference. The control group showed no significant difference as a result of pre- and post-test. TNF-α, which is a kind of cytokine, is known to induce vascular inflammation. Although a statistically significant difference was not found, it was found that weight loss by the participation in the dance sport program led to the decrease in TNF-α concentration. 5)As for the change of adiponectin concentration in the dance sport group, there was a statistically significant difference at p<.05. However, the control group showed no significant difference in the results of pre- and post-test. Cardiovascular mortality is known to be related to chronic renal failure patients with high serum adiponectin level and obesity. As shown in this result, if obese people achieve effective weight loss by applying the dance sport program, adiponectin level highly connected with cardiovascular diseases can be decreased. In conclusion, the dance sport program was found to reduce the risk of metabolic syndrome through decreasing weight, % body fat, and WHR and be effective in decrease in CRP, leptin, and serum adiponectin concentration in obese middle-aged women. Furthermore, it was effective enough that all participants in the dance sport group were satisfied with their weight management. Thus, it suggests that participation in the dance sport program may have a positive effect on obesity management and improvement in quality of life in obese middle-aged women.

Proteomic Analysis of the Tumor Necrosis Factor-a-Induced Secretome of Human Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells

이미정 부산대학교 2009 국내박사

Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (hASCs) have been known to be useful for regeneration of inflamed or injured tissues by secreting various cytokines and chemokines through a paracrine manner. To identify proteins secreted from hASCs within inflamed environment, hASCs were exposed to tumor necrosis factor-α(TNF-α), a key inflammatory cytokine, and conditioned media derived from hASCs were analyzed by liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). We identified 255 individual proteins as secreted proteins (secretome) in the conditioned media from hASCs, and 144 proteins were secreted at higher levels upon TNF-α treatment. The TNF-α-induced secretome includes a variety of cytokines and chemokines, such as IL-6, IL-8, CXCL6, and MCP-1. RT-RCR and ELISA analyses supported the findings that TNF-α treatment induced expression of the cytokines and chemokines in hASCs. We found that TNF-α-conditioned media (TNF-α CM) stimulated migration of human monocytes, which plays a key role in inflammatory responses. The TNF-α CM-induced monocyte migration was markedly abrogated by pretreatment with neutralizing anti-IL-6, anti-IL-8 and anti-MCP-1 antibodies. These results suggest that IL-6, IL-8 and MCP-1 are involved in the TNF-α CM-induced migration of monocytes. In addition, TNF-α increased expression of various proteases, including cathepsin L and matrix metalloproteases, and protease inhibitors. Furthermore, TNF-α induced secretion of the long pentraxin 3, a key inflammatory mediator implicated in innate immunity, from hASCs, suggesting a pivotal role of hASCs in inflammatory responses. Taken together, the present study supports the paracrine hypothesis of hASCs within injured tissues and characterization of the secretome may lead to understanding of the molecular mechanism associated with hASCs-mediated regeneration of injured tissues. 인체 지방 조직으로부터 분리한 중간엽 줄기 세포 (hASCs)는 국소 분비 신호에 의해 다양한 사이토카인과 케모카인을 분비함으로써 염증 반응이 일어나거나 상처 입은 조직의 재생에 유용하다고 알려져 있다. 염증 반응이 일어나는 환경 내에서 hASC가 분비하는 단백질을 동정하기 위해, hASC에 대표적인 염증 사이토카인인 TNF-α를 처리하고, 그 배양액을 액체 크로마토그라피-질량 분석기(LC-MS/MS)를 통하여 분비된 단백질을 분석하였다. hASC 배양액에서는 255개의 단백질이 분비되는 것을 확인하였고, TNF-α를 처리한 배양액에서는 144개의 단백질들이 높은 수준으로 분비되는 것을 확인하였다. TNF-α에 의해 증가된 단백질은 IL-6, IL-8, CXCL6, MCP-1 등의 사이토카인과 케모카인이 있었고, 위의 발현을 RT-PCR과 ELISA 방법을 통해 다시 확인하였다. TNF-α배양액은 염증 반응에서 중요한 역할을 하는 단핵세포의 이동을 유도하였다. 이 TNF-α배양액에 의해 유도된 단핵세포의 이동은 TNF-α배양액 내에 존재하는 IL-6, IL-8, MCP-1을 중화시킴으로 세포이동이 완전히 억제 되는 것을 확인하였다. 또한, TNF-α를 처리한 hASC에서 발현이 증가하는 단백질에는 카텝신 L(cathepsin L)을 포함하는 다양한 protease, matrix metalloprotease, protease inhibitor등이 있는 것을 확인하였다. 또한, innate immunity에서 염증을 유도하는데 중요하게 작용하는 PTX3가 TNF-α에 의해 분비되는 것을 확인하였고, 이는 hASC가 염증반응에서 중요한 역할을 할 것임을 시사하고 있다. 상처 입은 조직내의 hASC에서 분비되는 다양한 단백질이 인접환경에 미치는 영향과 분비되는 단백질의 특성을 밝힘으로써, hASC에 의한 상처 치유 과정에 대한 분자학적인 이해를 높일 수 있을 것으로 사료된다.

TNF-a down-regulates S100B expression in primary human astrocytes

최경선 Graduate School, Yonsei University 2002 국내석사

뇌성상세포는 중추신경계에서 가장 많은 수를 차지하는 교세포로서 친염증성 사이토카인 및 신경성장인자를 생성하고 분비하여 중추 신경계 내에서 염증반응을 유발하고 면역 반응을 조절하는데 중요한 역할을 한다. S100B는 칼슘 결합 단백질로서 중추신경계에서 주로 뇌성상세포에서 생성되어 분비되며 다양한 세포 내, 외 기능을 수행하고 있다. 세포내에서 S100B는 단백질의 인산화, 세포골격 구성물질의 역동성, 세포주기 그리고 효소의 활성도를 조절하여 칼슘 이온의 항상성 유지에 중요한 역할을 한다. 활성화된 뇌성상세포에서 분비된 S100B는 저농도(nM)에서는 신경세포의 분화와 신경 교세포의 증식을 유도하지만 고농도(μM)에서는 신경계 세포의 세포죽음을 유발하여 신경계의 발달 및 유지에 중요한 역할을 한다. 이처럼 사이토카인과 같은 기능을 하는 S100B는 퇴행성 뇌질환 뿐만 아니라 뇌성상세포, 소교세포 및 신경세포를 활성화시켜 뇌 염증성 질환에도 관여한다. 따라서 S100B의 발현 조절은 뇌신경계 질환을 이해하는데 중요할 것으로 생각된다. 이에 본 연구에서는 일차배양한 사람 뇌성상세포에서 사이토카인 처리에 따른 S100B의 발현 변화를 관찰하였다. 그 결과 친염증성 사이토카인인 TNF-α에 의해 S100B mRNA가 시간별, 농도별 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다. 또한 S100B의 단백 발현도 TNF-α에 의해 감소하였다. 단백 합성 억제제인 cycloheximide와 NF-κB 억제제인 pyrrolidine dithiocarbamate의 전처리에 의해서는 TNF-α에 의한 S100B 발현 감소가 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 TNF-α에 의해 S100B의 발현이 조절되기 위해서는 NF-κB가 활성화되어야 할 뿐만 아니라 조절 억제 인자와 같은 새로운 단백질의 합성이 필요함을 제시한다. 이상의 결과로 일차배양한 사람 뇌성상세포에서 TNF-α가 S100B의 발현을 조절함으로써 여러 퇴행성뇌질환을 조절하는데 중요한 역할을 담당할 것으로 생각된다. S100B is a calcium-binding protein predominantly produced and secreted by astrocytes in the central nervous system (CNS). S100B is suggested to function as a cytokine with both neurotrophic and neurotoxic effects depending on its concentration. S100B would take part not only in the pathophysiology of neurodegenerative disorders but also in brain inflammatory diseases. Therefore, the evaluation of the expression and regulation of S100B is important for understanding its role in CNS diseases. In this study, the effect of TNF-α on the expression of S100B was studied. As results, S100B mRNA expression in primary human astrocytes was downregulated in a dose- and time-dependent manner by TNF-α. S100B protein expression in primary human astrocytes was also decreased by TNF-α. Pyrrolidine dithiocarbamate, an inhibitor of NF-κB, and cycloheximide inhibited TNF-α-induced decrease of S100B expression. These results suggest that activation of NF-κB and newly synthesized proteins are necessary to mediate TNF-α-induced down-regulation of S100B expression. As a conclusion, TNF-α could modulate the neurodegenerative disorders in the CNS through regulation of S100B expression.

The Role of Ninjurin1 on Acute Liver Failure in Mouse Model

김민우 서울대학교 대학원 2021 국내박사

Acute liver failure (ALF) is a severe clinical condition occurring in a previously healthy person. In the development of ALF, excessive hepatocyte death cannot be compensated by regeneration, leading to sudden loss of hepatic function, resulting in high mortality. Various factors such as drugs, viruses, toxins, and shock are associated with the development of ALF. Although prognosis is dependent on the cause of ALF, the only therapeutic option is liver transplantation. Thus, understanding the pathogenesis of ALF and developing therapeutic options are important. Nerve injury-induced protein 1 (Ninjurin1, Ninj1) is a membrane protein mediating cell adhesion. Ninj1 is closely involved in the pathogenesis of inflammatory diseases such as multiple sclerosis and colitis. Previous studies have reported the role of Ninj1 in macrophages and endothelial cells. Ninj1 is also expressed in various tissues, including high levels expressed by the liver. In addition, increased levels of Ninj1 have been reported in human hepatocellular carcinoma and septic mouse liver tissue. Nevertheless, the role of Ninj1 in the pathogenesis of liver diseases is poorly understood. Thus, this study explored the function of Ninj1 in liver inflammation by using the lipopolysaccharide (LPS)/D-galactosamine (D-gal)-induced ALF model. LPS/D-gal-induced acute hepatitis is a well-known murine ALF model. In this model, LPS induces tumor necrosis factor-α (TNF-α) production by stimulating macrophages via Toll-like receptor 4 (TLR4). TNF-α released from macrophages induces cell death in hepatocytes sensitized by D-gal. In the absence of D-gal, TNF-α alone cannot induce death of hepatocytes because of anti-apoptotic genes. Thus, D-gal is combined with LPS to induce hepatitis by sensitizing hepatocytes via ribonucleic acid (RNA) synthesis inhibition. In order to examine whether Ninj1 is associated with development of ALF, wild type (WT) and Ninj1 knock-out (KO) mice were subjected to LPS/D-gal-induced acute hepatitis model and the severity of liver inflammation was compared. In the histological evaluation, liver tissues of Ninj1 KO mice displayed relatively mild inflammation compared with those of WT mice when exposed to LPS/D-gal for 5 h. Serum levels of alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), and TNF-α were significantly lower and the activation of caspase 3 in liver tissues was significantly reduced in Ninj1 KO mice compared with WT mice, suggesting alleviation of LPS/D-gal-induced ALF by Ninj1 KO. Next, the mechanism shaping differences between LPS/D-gal-treated WT and Ninj1 KO mice was investigated. Myeloid-specific Ninj1 KO mice were used to verify whether Ninj1 in macrophages is important in the development of LPS/D-gal-induced hepatitis. Unexpectedly, when treated with LPS/D-gal, the myeloid-specific Ninj1 KO mice did not exhibit any remarkable difference in histological observation compared to WT mice, supported by no difference in serum ALT, AST, and TNF-α levels between myeloid-specific Ninj1 KO and WT mice. These results indicate that Ninj1 of macrophages is not crucial in the development of acute liver inflammation by LPS/D-gal. In vitro experiments with TNF-α addressed the possibility that Ninj1 in hepatocytes may have a function in the pathogenesis of LPS/D-gal-induced ALF. Interestingly, primary hepatocytes isolated from Ninj1 KO mice showed greater resistance against TNF-α-induced caspase activation than WT primary hepatocytes. Ninj1 knock-down (KD) in L929 and AML12 cells and Ninj1 KO in HepG2 cells caused attenuation of caspase activation induced by TNF-α treatment. However, Ninj1 KD or KO did not regulate the complex I signal of tumor necrosis factor receptor 1 (TNFR1). Also, the expression of TNFR1 and anti-apoptotic genes was not influenced by Ninj1 KD or KO. Finally, the phenomenon that Ninj1 KD or KO blunts TNF-α-induced caspase signaling was confirmed by in vivo experiment. To specify the role of Ninj1 in hepatocytes, hepatocyte-specific Ninj1 KO mice were generated, and the LPS/D-gal-induced ALF model was used. Hepatocyte-specific ablation of Ninj1 significantly reduced serum ALT, AST, and TNF-α levels and caspase 3 activation by LPS/D-gal treatment, indicating that Ninj1 of hepatocytes has a critical role in the pathogenesis of LPS/D-gal-induced ALF. In summary, deficiency of Ninj1 in hepatocytes ameliorates LPS/D-gal-induced ALF by attenuating TNF-α/TNFR1-induced caspase activation, whereas Ninj1 in macrophages does not have a pivotal function in development of ALF induced by LPS/D-gal. 급성 간부전은 기저 질환이 없던 환자에서 나타나는 치명적 임상 상태이다. 급성 간부전의 발생 과정에서는 과도한 간세포의 죽음이 재생에 의해 보상되지 못 하며, 이는 급성의 간 기능 소실로 귀결되고 높은 사망률을 나타낸다. 발생 원인으로는 약물, 바이러스, 독소, 쇼크 등이 보고되어 있다. 예후는 발병 원인에 따라 상이하지만, 간 이식만이 유일한 치료적 접근이다. 그러므로 급성 간부전의 발병 기전을 이해하고 치료 방법을 개발하는 것이 중요하다. Ninjurin1 (Ninj1)은 세포 부착을 매개하는 막 단백질로 알려져 있으며, 다발성 경화증, 대장염과 같은 염증성 질환의 발병 기전과 밀접한 연관이 있다. 선행 보고에서는 대개 큰포식세포와 혈관내피세포에서 Ninj1의 기능을 연구하였지만, 다양한 조직에서 Ninj1이 발현되고 간에서도 Ninj1의 발현이 높게 나타난다. 또한, 사람에서 간세포암종 발생 시와 패혈증이 유도된 마우스의 간 조직에서 Ninj1의 발현이 증가한다는 보고가 있었다. 그럼에도 간 질환의 발병에 있어서 Ninj1의 기능은 알려져 있지 않았다. 그러므로 본 연구에서는 지질다당류 (Lipopolysaccharide, LPS)/디-갈락토사민 (D-galactosamine, D-gal) 유도 급성 간부전 모델을 적용하여 간염에서 Ninj1의 기능을 탐색하고자 하였다. 지질다당류/디-갈락토사민 유도 급성 간염은 급성 간부전을 반영하는 설치류 모델로 널리 알려져 있다. 이 모델에서는 지질다당류가 Toll-like receptor 4 (TLR4)를 통해 큰포식세포 (Macrophage)를 활성화시켜 tumor necrosis factor-α(TNF-α) 생산을 유도한다. 이후 큰포식세포에 의해 생성된 TNF-α는 디-갈락토사민에 의해 감작된 간세포의 죽음을 일으킨다. 디-갈락토사민이 없을 경우, 항세포자멸 유전자의 존재로 인해 TNF-α 단독으로는 세포의 죽음을 유도할 수 없다. 그러므로 디-갈 락토사민을 지질다당류와 병용투여하여 RNA 합성 억제를 유도하고 간세포를 감작시킴으로써 간염을 유도한다. 급성 간부전 발생에 Ninj1이 연관되어 있는지를 확인하기 위하여 야생형 (Wild type) 마우스와 Ninj1 유전자 결손 (Knock-out) 마우스에 지질다당류와 디-갈락토사민을 병용투여하고 간염의 정도를 비교하였다. 지질다당류/디-갈락토사민 투여 5시간 후 부검하고 조직학적으로 관찰하였을 때, 야생형 마우스에 비해 Ninj1 유전자 결손 마우스의 간 조직에서 상대적으로 미약한 염증이 확인되었다. 또한, 급성 간부전 발생에 의해 증가한 알라닌 아미노전달효소 (ALT, alanine transaminase), 아스파르테이트 아미노전달효소 (AST, aspartate transaminase), TNF-α 수치가 Ninj1 유전자 결손 마우스에서 유의적으로 낮았으며, 간에서의 caspase 3 활성 또한 Ninj1 유전자 결손 마우스에서 더 낮은 수준으로 확인되었다. 이로부터 Ninj1의 결손이 지질다당류/디-갈락토사민에 의한 급성 간부전을 완화한다는 것을 확인할 수 있었다. 다음으로는 지질다당류/디-갈락토사민을 투여한 야생형 마우스와 Ninj1 유전자 결손 마우스 사이에서 차이가 발생하는 기전에 대해 연구하였다. 우선, 큰포식세포의 Ninj1이 지질다당류/디-갈락토사민에 의한 급성 간염의 발생에 중요한 역할을 하는지 검증하기 위하여 골수계 세포 특이적 Ninj1 유전자 결손 마우스를 활용하여 실험을 수행하였다. 예상과는 달리, 조직학적 관찰 시에 지질다당류/디-갈락토사민을 투여한 야생형 마우스와 골수계 세포 특이적 Ninj1 유전자 결손 마우스 사이에서 간염의 정도에 차이가 없었다. 또한, 알라닌 아미노전달효소, 아스파르테이트 아미노전달효소, TNF-α 수치에도 차이가 없었다. 이러한 결과는 큰포식세포의 Ninj1이 지질다당류와 디-갈락토사민에 의한 급성 간부전 발생을 매개하는 주요 인자가 아님을 의미한다. 그러므로 간세포의 Ninj1이 지질다당류/디-갈락토사민에 의한 급성 간부전의 발병 기전에서 역할을 가질 가능성을 고려하여 TNF-α를 이용한 시험관 내 실험을 수행하였다. 흥미롭게도, 야생형 마우스에서 분리한 일차 간세포에 비하여 Ninj1 유전자 결손 마우스에서 분리한 일차 간세포에서 TNF-α 처리에 의한 caspase 활성화가 상대적으로 미약하게 일어났다. 이러한 결과와 일관되게, L929 세포와 AML12 세포에서 Ninj1의 발현 감소 (Knock-down) 유도 시와 HepG2 세포에서 Ninj1 유전자 결손 시에 TNF-α 처리에 의한 caspase 활성화가 감소됨이 확인되었다. 하지만 Ninj1의 발현 감소나 결손에 의하여 tumor necrosis factor receptor 1 (TNFR1)의 complex I 신호전달이 영향받거나 TNFR1과 항세포자멸 유전자의 발현량이 변화하지는 않았다. 최종적으로는, 시험관 내 세포 수준에서 Ninj1의 발현 감소나 결손에 의하여 TNF-α에 의한 caspase 활성화가 감소되는 현상을 동물 실험으로 검증하였다. 간세포에서의 Ninj1의 역할을 특정하기 위하여 간세포 특이적으로 Ninj1 결손을 유도한 마우스를 확립하였으며, 지질다당류/디-갈락토사민을 투여하여 급성 간부전을 유도하였다. 그 결과, 간세포 특이적인 Ninj1의 결손이 알라닌 아미노전달효소, 아스파르테이트 아미노전달효소, TNF-α 수치의 증가와 간에서의 caspase 3 활성화를 유의적으로 감소시키는 것으로 확인되었다. 이러한 실험 결과는 간세포의 Ninj1이 지질다당류/디-갈락토사민에 의해 유도되는 급성 간부전의 발병 기전에서 중요한 역할을 한다는 것을 의미한다. 이상의 결과를 종합하여, 큰포식세포에서 Ninj1의 결손은 지질다당류/디-갈락토사민에 의한 급성 간부전 발생에 주요한 영향을 주지 않는 반면, 간세포에서의 Ninj1의 결손은 TNF-α/TNFR1 유도 caspase 활성화를 경감시킴으로써 지질다당류/디-갈락토사민에 의한 급성 간부전을 완화한다는 결론을 도출하였다.

TNF-α에 의해 증가하는 adhesion molecule 발현에 대한 마 성분 및 영여자 추출물의 억제 효과

최고운 성균관대학교 일반대학원 2011 국내석사

TNF-α는 대식세포와 같은 면역세포에서 발생하는 사이토카인으로 혈관내피세포의 ICAM-1 뿐만 아니라 평활근세포의 부착인자 중 하나인 VCAM-1의 발현을 유도하여 면역세포의 이동 및 침투를 용이하게 함으로써 그 부위의 염증 및 세포사멸 등을 일으켜 섬유반의 생성과 파열 등에 중요한 역할을 하여 동맥경화를 유발하는 한다고 보고되어 있다. 따라서 TNF-α에 의한 염증 유발 기작을 억제하는 물질을 처리함으로써 동맥경화의 유발을 조절할 수 있을 것으로 예상하여 최근 항균, 항혈전 및 항산화 활성 등 다양한 생리활성이 보고되고 있는 마의 겨드랑이눈이 변태된 곁눈의 하나인 영여자 추출물과 마의 성분 중의 하나인 diosgenin을 처리하였다. 본 연구에서는 TNF-α에 의한 ICAM-1과 VCAM-1의 발현을 억제하는 기작을 밝혀냈다. 먼저, diosgenin과 영여자 추출물의 전처리에 의해 ICAM-1과 VCAM-1 발현에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해 MOVAS 세포를 이용하여 RT-PCR, Western blot analysis, ELISA를 수행하였다. 그 결과 TNF-α처리에 의해 증가하는 VCAM-1의 발현이 영여자를 처리하게 되면 농도 의존적으로 mRNA와 protein level 및 세포표면으로의 발현이 감소함을 확인할 수 있었다. 그리고 다양한 스트레스에 의해 유도되어지는 세포의 신호전달 경로에서 중요한 역할을 하는 MAP kinase family 와 Akt의 활성을 확인한 결과 TNF-α에 의해 증가 된 phosphorylation이 diosgenin과 영여자 추출물 처리에 농도 의존적으로 감소하였다. 또한 MAP kinase와 Akt에 의해 활성화 되고, ICAM-1과 VCAM-1의 발현에 중요한 영향을 미치는 전사인자로 잘 알려진 NF-κB의 세포질에서 핵으로의 이동과 DNA 결합 활성이 diosgenin과 영여자 추출물의 농도가 증가함에 따라 감소하는 것을 western blot analysis와 luciferase assay를 통해 확인하였다. 여기에 덧붙여 NF-κB의 세포질에서 핵으로의 이동에 관여하는 IκBα도 확인 한 결과 diosgenin과 영여자 추출물을 전처리함으로써 TNF-α에 의해 분해되는 것을 억제할 수 있었다. 마지막으로 TNF-α에 의한 ROS의 생성에 diosgenin과 영여자 추출물이 어떠한 영향을 미치는지 측정한 결과 영여자의 농도가 증가함에 따라 ROS의 생성이 감소하는 것을 확인할 수가 있었다. 따라서, TNF-α에 의해서 유도되는 ICAM-1과 VCAM-1의 발현은 diosgenin과 영여자 추출물에 의한 ROS 생성의 억제로 인하여 MAP kinse, Akt, NF-κB 의 신호전달이 이루어지지 않아 그 발현이 감소되며, 이는 평활근세포의 염증반응으로 인한 동맥경화에 있어서 diosgenin과 영여자를 염증조절제로의 개발 가능성을 제시할 수 있다. Atherosclerosis is a chronic vascular occlusive disease characterized by intimal accumulation of macrophages, smooth muscle cells, lipid and extracellular matrix components. TNF-α, pro-inflammatory cytokine, plays a pivotal role in this disease by inducing expression of intra cellular adhesion molecule (ICAM)-1 and vascular cell adhesion molecule (VCAM)-1 in vascular smooth muscle cells (VSMCs). Diosgenin, a precursor of steroid hormones, has been shown to have a variety of biological activites including anti-inflammatory activity; however, its molecular mechani는 are poorly understood. And the bulbil of Discorea Batatas is axillary bud of yam and it is produced a lot every year. But the large of bulbils had been scrapped without specific use. Besides, the mechanism of action for the anti-inflammatory effects of Discorea Batatas extracts (Db-Ex) is still unclear. We examined our hypothesis whether inhibitory effects of diosgenin or Db-Ex on TNF-α-induced ICAM-1 and VCAM-1 expression and TNF-α-induced adhesion of THP-1 monocytic cells were due to NF-κB inhibition in cultured mouse VSMC cell line, MOVAS-1. Preincubation of VSMCs for 2h with diosgenin (0.1 - 10 μM) or Db-Ex (10 - 100 μg/ml) dose-dependently inhibited TNF-α-induced NF-κB translocation and activation through degradation of IκBα. Diosgenin or Db-Ex reduced TNF-α-induced ICAM-1 and VCAM-1 expression and TNF-α-induced adhesion of THP-1 monocytic cells in a dose-dependent manner. Furthermore, Diosgenin or Db-Ex reduced TNF-α-induced ROS generation and phosphrylation of JNK, p38 and ERK1/2 kinase. Diosgenin or Db-Ex inhibits the MAPK/Akt/NF-κB signaling pathway and ROS production so that it abrogates the adhesive capacity of VSMC and the TNF-α-mediated induction of ICAM-1 and VCAM-1. These results indicate that both diosgenin and Db-Ex may be using suppressor of inflammation for atherosclerosis and modulator of immune response.

CHO 세포에서 생산된 신규 재조합 TNFR-hyFc 융합단백질의 생화학적 및 약리학적 특성분석

이정환 인하대학교 일반대학원 2013 국내박사

Rheumatoid arthritis, psoriasis 같은 심각한 면역질환의 주 원인인 TNF-a(tumor necrosis factor-a) 의 차단제로서 infliximab, adalimumab, etanercept 등이 널리 사용되고 있다. 이러한 TNF blocker 들은 human IgG1 의 Fc region 을 사용하고있는데, IgG1 은 혈액내에서 긴 반감기의 장점이 있는 반면에 antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) 나 complement-mediated cytotoxicity (CDC) 등의 cytolytic 우려가 존재한다. 이에 본 연구는 ADCC, CDC 의 우려가 없으며 효능이 개선된 TNF blocker 개발 목적으로 IgG4 의 CH2, CH3 region 과 hinge 의 flexibility 가 우수한 IgD 의 hinge region 을 결합한 hybrid Fc (hyFc) 를 제조하였으며 여기에 TNF receptor 를 융합하여 신규 구조의 TNFR-hyFc 를 제조하였다. CHO cell 에서 발현된 TNFR-hyFc 는 정제 후 생화학적 특성을 분석하였으며 약리학적 효능을 유사 구조의 etanercept (Enbrel®) 과 비교 평가 하였다. 생화학적 특성분석 결과, 분자량은 SDS-PAGE 분석에서 150~160 kDa, MALDI-TOF 분석에서는 126.1 kDa 이었으며 etanercept 보다 2.9 kDa 크게 나타났다. N-말단분석 결과 etanercept 와 유사하게 N-말단 heterogeneity 가 존재하였으나 그 ratio 는 다소 상이하였다. 당분석 결과 당함량이 19.44%, 시알산 함량이 분자당 27.36 mol 로 etanercept 보다 다소 높은 값을 보였으며, main N-glycan form 은 etanercept 와 유사하게 bi-antennary form 이었다. 약리학적 특성분석 결과 L929 bioassay 에서 TNFR-hyFc 는 TNF-a 를 효과적으로 중화시켰으며 neutralizing efficacy 가 etanercept 에 비해 약 1.5배 뛰어남이 확인되었다. 또한, TNFR-hyFc 의 rat 및 monkey pharmacokinetic 시험에서 체내반감기 및 AUC가 IgG1을 사용한 etanercept 투여군과 유사하게 나타났다. Mouse CIA model 에서 vehicle control 투여군에 비하여 TNFR-hyFc가 유효적으로 관절염을 억제하였으며 etanercept 투여군에 비해서도 그 효과가 우수하였다. LPS-induced mortality model 에서 LPS로 유도된 septic shock에 대해 etanercept 와 동일한 effective antagonist 효과를 나타내었다. 이러한 결과를 통해 신규 제조된 재조합 TNFR-hyFc 융합단백질은 효과적인 TNF-a blocker 가 될 수 있는 가능성이 있음을 확인하였다.

복부수술 전 젖소초유의 경구투여가 내독소혈증과 TNF-a에 미치는 영향

徐 賢 一 성균관대학교 일반대학원 2005 국내석사

Objective : To evaluate the influence of preoperative oral application of bovine colostrums on endotoxemia and TNF-a in abdominal surgery Patient and Method : 46 patients who underwent the abdominal surgery were evenly enrolled in a prospective, randomized, double blind and placebo-controlled study. The patients were preoperatively managed by oral application of 20g of a bovine colostrumsor placebo(nonfat dried milk) per a day for 3 days. In both groups, endotoxin was sequentially determined pre-, intra- and postoperatively by a modified limulus amebocyte lysate test. TNF-a and CRP were also measured. The clinical course was followed and compared in both groups. Result : The colostrum group showed significantly lower level of endotoxin and TNF-a compared to the placebo group. CRP did not differ in both groups. Clinical event did not occur in both group until the discharge. Colostrum group tends to have a lower incidence of fever and leukocytosis without statistic significance. Conclusion : Prophylactic preoperative oral application of bovine colostrum lower the plasma level of perioperative endotoxin and TNF-a. Further studies were needed for the relation of clinical effect and preoperative oral application of bovine colostrum.