Growth modulatory role of zinc in prostate cancer

도금퐁 전남대학교 2019 국내박사

Belong to group IIB of heavy metals, zinc is considered to have least toxicity among them. Zinc functions as regulator of major cell signaling pathways in mammalian cell and is present in cells from all inner organs and lack of zinc leads to severe diseases in brain, pancreas, liver, kidneys and reproductive organs. Loss of zinc is also involved in tumor development and progression to malignant carcinomas. Zinc obviously exhibits the function to prevent the development of wide-range cancer cell types. Zinc is most abundantly present in prostate gland compared with other soft tissues and intracellular zinc is found to dramatically diminish during prostate cancer (PCa) development. Due to the obscure mechanistic role of zinc in this process, therapeutic application using zinc and its supplement is very limited in PCa field. Protective role of zinc was found in PCa research with very limited information on its mechanistic role. To verify precise role of zinc at physiological level in PCa proliferation and its intervening mechanism, this study was designed to use several PCa cell lines followed by various in vitro assays as well as in vivo study. Addition of zinc suppressed proliferation of androgen receptor (AR)-intact PCa cells LNCaP, C4-2 and TRAMP-C2 in a dose-responsive manner while minor effect on cell proliferation was found on AR-negative PCa cells PC3 and DU145. Further investigation showed that using LNCaP and TRAMP-C2 cells, addition of zinc also exhibited a downregulation of AR expression in both dose and time dependent fashion regardless of the presence of synthetic androgen, R1881. Furthermore, zinc-mediated AR suppression accordingly also inhibited androgen-mediated transactivation and androgen target prostate-specific antigen expression. Further analysis showed that zinc-induced AR downregulation resulted from facilitated protein degradation instead of controlling transcriptional activities. Studies using syngeneic mice bearing TRAMP-C2 subcutaneous tumors, peritoneal injection of zinc significantly reduced tumor size. Protein analyses of both xenograft tumors and normal prostate revealed that zinc reduced expression of AR and increased cancer cell death. Androgen and androgen receptor play a pivotal role for growth of normal prostate as well as the development and progression of prostate carcinogenesis. Hence, androgen withdrawal is effective therapy to treat patients with PCa but leaves recurrent tumors. This study demonstrated that zinc inhibits PCa growth via downregulation of AR. Considering the fact that AR functions as a major effector in PCa development and progression into castration resistant PCa, loss of zinc may be a critical step during PCa progression. 아연은 IIB군의 중금속 중 독성이 가장 적은 것으로 알려져 있다. 아연은 포유동물세포에서 주요 세포신호기전의 조절 인자로 작용하며, 모든 장기의 세포에 존재하고 아연이 부족할 시에는 뇌 및 이자, 간, 신장, 생식기에 심각한 질병을 초래한다. 아연은 다양한 종류의 암세포 생성을 예방하는 기능을 나타내며, 아연의 손실과 종양 생성 및 악성화으로의 진행은 밀접한 관계가 있다. 아연은 연부 조직 중 전립선에 가장 풍부하게 분포하고 있고, 전립선암 생성과정에서 세포내 아연은 급격하게 감소한다. 하지만 이러한 과정에서 아연의 역할이 명확하게 알려져 있지 않기 때문에 전립선암의 치료를 위한 아연과 아연 보조제의 사용은 극히 제한적이다. 아연의 손실에 의한 전립선암의 생성에 대한 정확한 기전은 알려져 있지 않다. 아연의 생리적 농도에서 전립선암 증식 및 이를 매개하는 기전을 파악하기 위하여, 본 연구는 다양한 전립선암 세포주를 이용하여 in vitro 및 in vivo 실험을 진행하였다. 아연의 처리는 용량 의존적으로 LNCaP 및 C4-2, TRAMP-C2의 안드로겐 수용체가 존재하는 전립선암 세포주의 증식을 억제한 반면, PC3 및 DU145의 안드로겐 수용체 음성 전립선암 세포주의 증식 억제에는 미미한 효과를 나타냈다. 또한, LNCaP과 TRAMP-C2에 아연의 처리는 합성 안드로겐의 처리와 상관없이 용량 및 시간 의존적으로 안드로겐 수용체의 발현을 감소시켰다. 더욱이, 아연에 의한 안드로겐 수용체 억제는 안드로겐을 매개로 하는 유전자 활성화 및 표적 단백인 prostate-specific antigen의 발현을 억제시켰다. 아연에 의한 안드로겐 수용체 발현 감소는 전사 억제에 의한 것이 아니라 단백질 분해 감소에 의한 것이었다. 또한, 피하에 TRAMP-C2 세포주 종양을 유도한 마우스에서 아연의 복강 주사는 종양 크기를 감소시켰고, 획득한 ex vivo 종양세포에서 안드로겐 수용체 발현 감소 및 종양세포사가 관찰되었다. 안드로겐과 안드로겐 수용체는 정상 전립선의 성장뿐 아니라 전립선암 생성과 진행에 중요한 역할을 한다. 그러므로, 안드로겐의 억제는 호르몬 저항성 전립선암을 제외한 전립선암 환자를 치료하는데 효과적이다. 본 연구는 아연이 안드로겐 수용체 발현 억제를 통하여 전립선암 성장을 억제한다는 것을 입증하였다. 안드로겐 수용체가 전립선암 발달 및 호르몬 저항성 전립선암으로의 진행에 주요인자로 작용하는 것을 고려해 볼 때, 전립선암 진행과정에서 아연의 손실은 중요한 역할을 할 것으로 사료되며, 본 연구결과는 아연이 안드로겐 수용체 발현 감소를 유도함으로서 전립선암 치료제로써의 가능성을 제시하였다.

Current status of prostate cancer treatment and anticancer effect of a novel ANO1 modulator on PC3 prostate cancer cells

이예찬 Graduate School, Yonsei University 2022 국내석사

Prostate cancer is the major leading causes of death in males, and the diagnosis is made by prostate biopsy in patients with abnormalities detected in their prostate-specific antigen (PSA) level or digital rectal exam (DRE). Prostate cancer patients are increasing rapidly due to an aging society, westernized dietary habits and abdominal obesity. According to American Cancer Society (ACS), a total of 193,930 new prostate cancer patients will occur in the United States alone this year, and it is estimated that nearly 33,330 patients will die. In the case of young men, the incidence of prostate cancer is not large, but it increases rapidly with age. The global prostate cancer treatment market size is expected to reach 9.94 billion by 2026 from 6.887 billion in 2017. The drugs currently in use cause side effect such as erectile dysfunction, decreased sexual desire and decrease in muscle strength because they suppress male hormones, and thus development of new treatments is required. In the present study, we identified a new drug target for prostate cancer, ANO1 (Anoctamin 1). ANO1 is also known as Ca2+activated chloride channel (CaCC), and recent studies suggest that one of the causes of prostate cancer is the overexpression of ANO1. Overexpression of ANO1 is regulated by multiple mechanisms and activates many signaling pathways. In addition, activation of signaling pathway promotes cell proliferation, migration, tumorigenesis, cancer progression. Thus, inhibition of ANO1 is potential therapeutic target for prostate cancer. We performed SAR from 3n to identify novel ANO1 degrader because inhibition of ANO1 channel activity leads to a rapid decrease in blood pressure through relaxation of vascular smooth muscle and a speedy decrease in gastrointestinal motility via inhibition of pacemaker activity in interstitial cells of Cajal (ICC). Result of evaluation of 50 compounds, we identified that 13 compounds degraded only protein without inhibiting ANO1 channel activity. Among them, AD012 most significantly reduced ANO1 protein level. In addition, AD012 inhibited cell viability and cell migration in a dose-dependent manner in PC3 cells and induced apoptosis through activation of caspase-3 and cleavage of PARP. Therefore, these results suggest that novel ANO1 degrader may be useful as a pharmacological tool for cancer research targeting ANO1 and potentially in the development of ANO1 degrader for the treatment of prostate cancer. WHO 와 국제 암연구소에 따르면 전 세계 암 발병률은 2012 년 1,410 만명에서 2035 년에는 무려 2,400 만명까지 증가할 것이고, 많은 사람들이 암으로 고통받을 것으로 예상하고 있다. 이는 2012 년과 비교하였을 때 약 70% 가량 증가한 수치다. 이처럼 암은 과거부터 현재까지 인간의 사망 원인 순위에서 1 위를 차지하고 있는 질병으로서 최근에는 여러 암 중에서 남성에게서만 발병하는 전립선암의 발병률이 급증하고 있는 상황이다. 전립선암은 서양의 경우 흔하게 발병하는 남성암으로 우리나라에서도 발생빈도가 점점 증가하고 있는 상황이고 특히 고령화 사회, 비만, 인종, 가족력 등으로 인하여 전립선암 환자가 급증하고 있다. 현재 다양한 치료제들이 임상에서 사용되고 있으며 전 세계 전립선암 치료제 시장 규모는 2017 년 68 억 달러에서 2026 년 99 억 달러에 도달할 것으로 예상하고 있다. 또한 당분간 전립선암 치료제 시장은 매년 9.1%의 성장률을 보일 것으로 전망하고 있다. 현재 사용되고 있는 치료제들은 주로 남성호르몬을 억제하는 약물로서 초반에는 치료 효과가 우수하지만 보통 치료받은 지 2 년 정도가 되면 내성이 생기게 되어 효과가 감소하는 것이 특징이다. 게다가 이러한 치료제들은 남성호르몬인 테스토스테론의 기능과 분비를 억제하기 때문에 발기부전, 성욕감퇴 등의 부작용들을 일으키며 최근에는 심혈관과 관련된 부작용들이 계속해서 보고되고 있는 상황이다. 따라서 새로운 치료제 개발이 필요한 상황이며 본 연구자는 새로운 기전의 전립선암 치료제 약물 표적으로 anoctamin 1 (ANO1)을 제안하였다. ANO1 는 calcium-activated chloride channel (CaCC) 이며 세포 내 칼슘에 의해 활성화되어 클로라이드의 이동을 유도한다. 이러한 ANO1 은 세포 내 다양한 기능에 관여하고 특히 과 발현되었을 때 암세포 성장에 중요한 역할을 한다고 보고되어 있다. 여러 연구에 따르면 ANO1 이 과 발현되었을 때 암세포의 확산, 이동, 침윤 등을 유도함으로서 결국 암을 진행시키고, 이러한 ANO1 을 억제하였을 때 암이 치료될 수 있다는 연구 결과들이 보고되고 있다. 기존의 개발된 ANO1 억제제의 경우 ANO1 채널 활성을 단기간동안 빠르게 억제하기 때문에 평활근 이완을 통한 저혈압이나 위장운동 억제와 같은 부작용들이 일어날 수 있다. 하지만 분해제의 경우 장기간에 걸쳐 천천히 ANO1 단백질을 분해하기 때문에 앞서 말한 부작용들을 최소화하면서 ANO1 을 분해하여 암을 억제할 수 있을 것이다. 그리하여 본 연구에서는 기존의 ANO1 억제제가 아닌 분해제를 발굴하고 그 특성을 규명하는 것을 목적으로 한다. 이러한 내용을 바탕으로 ANO1 억제제로 알려진 3n 의 구조-활성 관계분석 (structure activity relationship, SAR)을 통해 ANO1 채널 활성은 억제하지 않으면서 단백질만을 선택적으로 분해하는 물질을 선별하였고, 총 50 개의 약물 중 13 개의 약물을 선별하였다. 그 중 AD012 가 ANO1 채널 활성은 억제하지 않으면서 가장 강하게 ANO1 단백질의 분해를 유도하였고, 추가적으로 AD012 가 전립선암 세포를 억제할 수 있는지 확인하기 위하여 전립선암 모델 세포인 PC3 세포에서 약물 평가를 진행하였다. 먼저 YFP 형광 측정 실험과 단락전류 측정 실험 그리고 생쥐 회장 평활근 수축 실험을 통해 AD012 가 ANO1 채널 활성에 영향이 없는 것을 확인하였으며, AD012 가 ANO1 단백질을 용량 의존적, 시간 의존적으로 분해하는 것을 확인하였다. 또한 AD012 를 제거하였을 때 ANO1 의 발현이 다시 증가하는지 확인하는 실험을 통해 AD012 가 ANO1 에 대해 가역적인 약물이라는 것을 확인하였다. 또한 실시간 중합효소 연쇄반응을 통해 AD012 가 ANO1 의 mRNA 수준에 영향이 있는지 확인해 보았을 때 ANO1 발현에는 영향을 미치지 않는다는 것을 확인할 수 있었다. 추가적으로 ANO1 이 AD012 에 의해 어떤 기전으로 분해되는지 확인하는 실험을 통해 AD012 가 리소좀에 의해 ANO1 의 분해를 유도한다는 것을 확인하였으며, ANO1 만을 선택적으로 분해하는지 확인하기 위해 또 다른 세포막 이온채널인 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)과의 선택성을 확인해 보았고 그 결과 CFTR 의 채널 활성과 단백질 수준을 억제하지 않았다. 마지막으로 AD012 가 전립선암 세포에서 항암효과를 유도하는지 확인하기 위해 세포생존율, 세포이동, caspase-3 활성화, PARP 분열 실험을 진행하였고 그 결과 AD012 가 용량의존적으로 세포자살을 유도하여 전립선암 세포를 억제하였다. 따라서 본 연구에서 발굴한 AD012 는 특이적이고 강력한 최초의 ANO1 분해제이며 ANO1 과 관련된 연구를 하는데 있어서 약리학적인 도구로 사용될 수 있을 것이다. 이러한 AD012 의 특성을 더욱 규명한다면, 최초의 ANO1 을 표적 하는 전립선암 치료제가 될 것이다.

Prostate MR Imaging at 3T using a Phased-Arrayed Coil in Predicting Locally Recurrent Prostate Cancer after Radiation Therapy : Preliminary Experience = 방사선 치료 후 국소 재발 전립선암을 예측하는데 위상배열코일을 이용한 3 테스라 전립선 자기공명영상 : 예

Kim, Chan Kyo 강원대학교 대학원 2009 국내박사

목적: 전립선암의 방사선 치료 후 재발암의 보다 정확한 전립선내 지도화와 조기 진단은 환자에게 적절한 2차 치료 방법을 선택하는데 보다 유용한 정보를 제공할 수 있다. 하지만, 방사선 치료 후 전립선은 선위축과 섬유화로 인해 정상 전립선의 구역 해부학이 불분명해짐과 전립선의 전반적 T2 저신호강도의 방사선 치료와 연관된 변화로 인해 T2 강조영상을 이용한 재발암을 예측하는 데는 한계가 있다. 따라서 본 연구의 목적은 방사선 치료 후 국소 재발 전립선암을 예측하는데 3 테스라 자기공명영상에서 확산강조영상과 역동적 조영증강영상의 진단적 수행능력을 평가하고자 한다. 대상 및 방법: 전립선암의 방사선 치료 후 혈청 전립선 특이항원이 상승한 총 24명의 환자들은 모두 3 테스라 전립선 자기공명영상을 촬영하였으며 자기공명영상 검사 후 경직장초음파 유도하 전립선 조직 생검을 시행하였다. 전립선의 양측엽 말초구역의 6개 구획에서 자기공명영상 소견과 전립선 조직 생검 결과를 비교 분석하였다. 두명의 영상의학과 전문의의 합의하에 자기공명영상 소견을 분석하였으며 재발암의 가능성에 대해 5점 척도(five-point scale)를 이용해 3점 이상을 재발암으로 판정하였다. 통계적 방법은 McNemar 검사법, generalized estimation equations 그리고 ROC 분석법을 이용하였다. 결과: 총 144개의 전립선 말초구역 구획 중에서 10명 환자의 37개(26%) 구획에서 조직 생검에서 재발암이 발견되었다. 국소 재발을 예측하는데, 민감도와 특이도의 경우, 확산강조영상(49%와 93%), 역동적 조영증강영상(49%와 92%) 그리고 역동적 조영증강영상과 확산강조영상(59%와 91%)은 모두 T2 강조영상(27%와 80%) 보다 통계학적으로 우수하였다(P< 0.0081). 정확성의 경우도, 확산강조영상(82%), 역동적 조영증강영상(81%) 그리고 역동적 조영증강영상과 확산강조영상(83%) 모두 T2 강조영상(67%) 보다 통계학적으로 높았다(P< 0.001). ROC 분석에서 역동적 조영증강영상과 확산강조영상은 T2 강조영상, 역동적 조영증강영상 그리고 확산강조영상과 비교시 통계학적으로 높은 ROC 곡선 아래 면적을 보였다(Az = 0.863, P < 0.05). 결론: 전립선암의 방사선 치료 후 국소 재발암을 예측하는데 본 예비 연구의 결과에 의하면 확산강조영상 혹은 역동적 조영증강영상이 T2 강조영상보다 우수하였다. Purpose: An earlier diagnosis of locally recurrent prostate cancer and more accurate intraprostate mapping of the recurred prostate cancer after radiation therapy can provide a better selection of the appropriate second-line treatment. However, local tumor depiction with MR imaging in the irradiated gland is limited by radiotherapy-related changes including diffuse low T2 signal intensity in the gland and an indistinctness of the normal zonal anatomy, which is caused by glandular atrophy and fibrosis. Therefore, the aim of this study was to assess the diagnostic performance of diffusion-weighted imaging (DWI) and dynamic contrast-enhanced imaging (DCEI) at 3T in predicting locally recurrent prostate cancer after radiation therapy. Materials and Methods: Twenty-four patients with a rising prostate-specific antigen level after treatment with radiation therapy underwent prostate MR imaging at 3T, followed by transrectal ultrasound-guided biopsy. MR imaging findings and biopsy results were correlated in six prostate sectors of both peripheral zones. Two radiologists in consensus reviewed the MR images and rated the likelihood of recurrent cancer on a five-point scale images with a score of 3 or more were considered indicative of recurrence. The results were compared with McNemar test, generalized estimation equations and receiver operating characteristics analysis. Results: Of 144 sectors, 37 (26%) prostate sectors were positive for cancer in 10 patients. For predicting locally recurrent cancer, the sensitivity and specificity of DWI (49% and 93%), DCEI (49% and 92%), and combined DCEI and DWI (59% and 91%) were higher than the values for T2-weighted imaging (T2WI) (27% and 80%) (P < 0.0081). The accuracy of DWI (82%), DCEI (81%) and combined DCEI and DWI (83%) was greater than the accuracy for T2WI (67%) (P < 0.001). A significantly greater Az (area under the receiver operating characteristic curve) was determined for combined DCEI and DWI (Az = 0.863, P < 0.05) as compared with T2WI, DCEI and DWI. Conclusion: For predicting locally recurrent prostate cancer after radiation therapy, our preliminary results suggest that the use of either DWI or DCEI is superior to the use of T2WI.

Investigating Heterogeneity in the Prostate Epithelium

Crowley, Laura Columbia University ProQuest Dissertations & These 2022 해외박사(DDOD)

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Prostate cancer is consistently the most frequently diagnosed cancer in American males as well as the second leading cause of cancer-related mortality. This underscores the dire need to understand the healthy prostate and how it can transform into a diseased state. Therefore, I have sought to investigate the heterogeneity and ontogeny of the mouse and human prostate. To do this, I employed single-cell RNA-sequencing, electron microscopy, immunofluorescence, and immunohistochemical analyses to identify specific cell populations, as well as lineage tracing, organoid culture, and tissue recombination assays to assess the function and origin of these populations. I discovered a profound level of heterogeneity uniquely within the luminal epithelial compartment of the prostate, including several novel populations. These luminal populations differ in distribution between mouse prostate lobes and along the proximal-distal axis within each lobe. These populations demonstrated significant differences in progenitor behavior in both organoid culture and tissue recombination assays, as shown by their differential abilities to proliferate, generate patterned structures, and differentiate into distinct cell types. Comparisons of the mouse prostate cell populations to cells from several benign human prostate samples showed that there is also luminal heterogeneity in the human prostate, and that several mouse populations have substantial gene expression overlap with human prostate populations. The observed luminal heterogeneity as well as the functional differences were consistent across several different published studies of the mouse prostate, and cross-species transcriptional similarities between populations were maintained across additional human samples, indicating that these findings are robust. My findings suggest that the luminal compartment of the mouse prostate contains distinct populations of cells that may act as reserve progenitors, and that their distribution across the prostate lobes could be functional. Additionally, if these populations can be cells of origin for prostate cancer, then their differences in progenitor behavior could contribute to the heterogeneity observed in prostate cancer prognosis and treatment response, which could have substantial clinical implications for patients.

Synthesis and biological evaluation of PSMA-targeted compounds for diagnosis and treatment

김경민 고려대학교 대학원 2024 국내석사

Diagnostic Performance of Polygenic Risk Score Combined Model for Prostate Cancer in Korean Men Undergoing Prostate Biopsy

정유진 서울대학교 대학원 2024 국내석사

연구 배경: 전립선 특이 항원 (Prostate Specific Antigen; PSA)은 전립선암 진단을 위한 임상 바이오 마커로 사용된다. 그러나 PSA의 특이도가 낮기 때문에 PSA 수치가 진단 회색 영역 (3~10ng/mL)에 있는 경우 전립선 생검 필요 여부를 결정해야 한다. 조직 검사는 전립선암 진단의 표준으로 여겨지지만 과도한 출혈, 감염, 주변 조직이나 장기 손상과 같은 부작용과 관련된 침습적 시술이다. 이 연구에서는 다유전자 위험 점수 (Polygenic Risk Score; PRS)를 결합한 머신러닝 모델을 개발하여 특히 PSA 회색 영역에서 진단 정확도를 개선할 수 있을 것이다. 연구 방법: 총 1,171명의 샘플을 확보하여 사용하였으며, PSA 회색 영역 내 314명의 전립선암 생검 양성 환자와 857명의 전립선암 생검 음성 환자로 구성되어 있다. 연령, 첫 번째 전립선 생검 전 PSA, 자기공명영상(Magnetic Resonance Imaging; MRI) 및 경직장 초음파상 전립선 용적, PSA 밀도, 전립선암 병기 등의 임상 데이터를 수집하였다. PRS는 한국인 집단에서 확인된 6개의 전립선암 연관 유전자 변이의 가중치 합으로 계산하였다. 머신러닝 기법 중 하나인 로지스틱 회귀분석 기반으로 모델을 구축하였으며, 샘플 불균형을 보완하기 위해 학습 데이터에 통계적 언더 리샘플링 (under re-sampling)을 진행하였다. 언더 리샘플링은 10,000번의 비복원 반복추출 부트스트래핑 (bootstrapping)과 10번의 반복 10겹 교차 검증 (10-fold cross-validation)을 통해 최종 모델을 구축하였다. 연구 결과: 모든 변수 (연령, 첫 번째 전립선 생검 전 전립선특이항원 (PSA), MRI 및 경직장초음파상 전립선 용적, PSA 밀도)는 생검 양성 그룹과 생검 음성 그룹 간에 유의미한 차이를 보였다 (p<0.001). 연령, PSA 밀도, PRS를 결합한 모델은 PSA 단독 (AUC 0.561, 95% CI 0.519-0.603) 및 PSA 밀도 단독(AUC 0.689, 95% CI 0.650-0.729)에 비해 유의하게 개선된 결과 (AUC 0.741, 95% CI 0.705-0.778)를 보였다. PRS를 연령과 PSA 밀도와 같이 사용한 통합 모델 (AUC 0.741, 95% CI 0.705-0.778)에서 검정력이 유의미하게 상승하였으며 (p=0.005), 이는 연령과 PSA 밀도를 포함한 임상 위험 모델 (AUC 0.703, 95% CI 0.665-0.742)보다 성능이 우수하였다. 동일한 민감도 수준인 0.90에서 PRS 통합 모델은 PSA 단독 및 PSA 밀도 단독 모델에 비해 불필요한 생검을 각각 26.5%와 9% 줄였다. 연구 결론: PRS 통합 모델은 PSA 단독 모델, PSA 밀도 단독 모델, 연령 및 PSA 밀도를 포함한 임상 매개변수 모델보다 더 우월한 성능을 보였다. 의사 결정 도구로 PRS를 통합한 모델을 구현하면 불필요한 생검을 효과적으로 줄이면서 환자에 대한 잠재적 위험을 최소화할 수 있다. Introduction: Prostate-specific antigen (PSA) is used as a clinical biomarker for diagnosis of prostate cancer (PCa). However, due to the low specificity of PSA, it is necessary to determine whether to require prostate biopsy when the PSA level is in the diagnostic gray zone (3-10ng/mL). While biopsy is considered the gold standard for PCa diagnosis, it is an invasive procedure associated with side effects such as excessive bleeding, infection, and damage to nearby tissue or organs. In this study, we developed a machine learning model that combines the polygenic risk score (PRS) to improve diagnostic accuracy, particularly in the PSA gray zone. Method: A total of 1,171 samples were obtained and used, consisting of 314 PCa biopsy-positive (Bx-pos) patients and 857 PCa biopsy-negative (Bx- neg) patients within the PSA gray zone. Clinical data, including age, PSA before the initial prostate biopsy, prostate volume on Magnetic Resonance Imaging (MRI) and transrectal ultrasound, PSA density (PSAD), and PCa status, were collected. PRS was calculated as the weighted sum of 6 PCa association genetic mutations identified in Korean populations. The model was built based on logistic regression, one of the machine learning techniques, and statistical under re-sampling was performed on the training data to supplement for sample imbalance. The final model with under re-sampling was constructed using 10,000 times non-replacement bootstrapping and 10 repeated 10-fold cross-validation. Results: All variables (age, PSA before the initial prostate biopsy, prostate volume on MRI and transrectal ultrasound, PSAD) showed significant differences between the Bx-pos and Bx-neg groups (p<0.001). The combined model with age, PSAD and PRS significantly improved performance (AUC 0.741, 95% CI 0.705-0.778) compared to PSA alone (AUC 0.561, 95% CI 0.519-0.603) and PSAD alone (AUC 0.689, 95% CI 0.650-0.729). Statistical power was significantly increased (p=0.005) in the combined model using PRS with age and PSAD (AUC 0.741, 95% CI 0.705-0.778), which outperformed the clinical risk model including age and PSAD (AUC 0.703, 95% CI 0.665-0.742). At the same sensitivity level of 0.90, the PRS-integrated model reduced unnecessary biopsies by 26.5% and 9% compared to the PSA- only and PSAD-only models, respectively. Conclusion: The PRS combined model showed superior performance the PSA- only, PSAD-only models, and the clinical parameter model including age and PSAD. Implementing a model incorporating PRS as a decision-making tool can effectively reduce unnecessary biopsies while minimizing potential risks to patients.

Off-target Binding of Glu-Ureido-Lys-Targeted Radioligands to PSMA-like Alternative Proteins : A Potential Therapeutic Target in PSMA-negative and Neuroendocrine Prostate Carcinoma

모하마드레자 서울대학교 대학원 2021 국내박사

막횡단 단백질인 전립선특이막항원 (prostate-specific membrane antigen, PSMA)은 전립선암의 영상 및 치료를 위한 유망한 표적이다. PSMA는 대부분의 전립선암에서 과발현되며 PSMA 표적 양전자방출단층촬영 (positron emission tomography, PET) 프로브를 사용하여 임상적으로 영상화 할 수 있다. 현재 글루타메이트-우레이도-리신(Glutamate-Ureido-Lysine, GUL) 유도체 방사성 리간드는 PSMA 표적 PET 영상을 위한 선도적인 프로브이다. 신경내분비 전립선암 (neuroendocrine prostate cancer, NEPC)과 같이 높은 사망률, 치료 내성을 보이는 특정 전립선암 부분집단에서는 PSMA 발현이 낮은 편이다. 하지만 GUL 기반 PSMA 표적 프로브는 NEPC 전이성 종양 병변을 잘 검출하는 경우가 보고되고 있다. 이러한 PSMA 발현이 낮은 종양에서 GUL 기반 프로브는 PSMA가 아닌 비표적 단백질에 결합할 것으로 예상된다. 본 연구에서는, NEPC를 포함한 진행성 전립선암에서 PSMA 유사 아미노펩티다제 NAALADaseL 및 대사성 글루타메이트 수용체 (mGluR)의 높은 발현을 확인하였다. 또한, mGluRs의 발현 수준이 PSMA 발현과 역상관 관계가 있으며 불량한 임상 예후와 관련이 있음을 확인하였다. 컴퓨터 계산적 방법을 통해 GUL 기반 프로브의 NAALADaseL 및 mGluRs에 결합 능력을 예측하였고 in-vitro 형광 프로브를 활용하여 GUL 기반 프로브의 PSMA, NAALADaseL 및 특정 mGluRs에 대한 우수한 친화성을 검증하였다. 종합하여 볼 때 mGLuR 및 NAALADaseL은 GUL 기반 프로브의 표적이 될 수 있으며 특히, PSMA 발현이 낮은 NEPC와 같은 치료저항성 암에 대한 새로운 진단 및 치료 표적이 될 수 있다. Prostate-specific membrane antigen (PSMA), a transmembrane protein, is a promising target for imaging and therapy of prostate cancer. PSMA is highly overexpressed in most prostate cancers and is clinically visualized using PSMA-positron emission tomography (PET) probes. Development of small molecules for targeting PSMA is important for PSMA-PET and Glutamate-Ureido-Lysine (GUL)-derivative radioligands are currently leading probes for PSMA-PET. PSMA is effectively absent from certain high-mortality, treatment-resistant subsets of prostate cancers, such as neuroendocrine prostate cancer (NEPC); however, GUL-based probes still sometimes identify NEPC metastatic tumours. These probes may bind unknown proteins associated with PSMA-suppressed cancers. In this Ph.D. dissertation, the upregulation of PSMA-like aminopeptidase NAALADaseL and the metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in advanced prostate cancers including NEPC was identified. This work shows that the expression levels of mGluRs inversely correlate with PSMA expression and are associated with poor survival outcome. Computationally predicting that GUL-based probes bind well to these targets, a fluorescent probe used to investigate these proteins in vitro, where it shows excellent affinity for PSMA, NAALADaseL and specific mGluRs.

Expression and functional studies of PSA-based vaccines for prostate cancer using a plant expression system

신천하 중앙대학교 대학원 2020 국내박사

Prostate cancer is the most frequently diagnosed malignant tumor in men worldwide. Until now, radiation therapy, chemotherapy, and hormone therapy have been used for the treatment of prostate cancer. However, as metastatic castration resistant prostate cancer (mCRPC), which is resistant to previous therapies, increases, immunotherapies are emerging as alternatives. One of the immunotherapies to target prostate cancer is a cancer vaccine. Prostate cancer usually progresses more slowly than other cancers and enables early diagnosis. These characteristics provide sufficient time for an immune response after vaccination, so that it can produce effective cancer vaccines for the target disease. Therefore, cancer vaccines can be an ideal approach as an immunotherapy for prostate cancer. For vaccine-based immunotherapy of cancer, it is important to select a proper tumor-associate antigen (TAA) that can trigger an immune response. A well-known TAA of prostate cancer is prostate-specific antigen (PSA), which is expressed and secreted by the epithelial cells of the prostate gland. In order to produce biopharmaceuticals like cancer vaccines, plant-based platforms are being used plant molecular biopharming, a shortened form of pharmaceuticals and farming, is an emerging biotechnology, which uses plants to produce biopharmaceuticals as a biofactory. It is attracting attention because of the advantages of cost-efficiency, safety, high scalability, and post-translational modification of its system. One of the approaches for a production of a prostate cancer vaccine candidate is by using a Fc-based fusion protein. Fc fusion proteins have been reported that can be easily purified like antibodies, increased immune response through interaction with Fc receptors on effector cells, and extended half-life. Furthermore, Fc fusion proteins can be modified by addition of immunoglobulin A and M tailpieces results in formation of polymeric structures and enhancement of immune responses. In this paper, various PSA-based prostate cancer vaccine candidates were expressed in tobacco plants with Fc-fusion protein forms and tailpieces of IgA and IgM added to them. PCR analyses showed each transgene insertion and western blot analyses showed each recombinant protein expression in tobacco plants and also, indicated differences in expression rate according to KDEL. The size of purified proteins was analyzed by SDS-PAGE under reduced, non-reduced, and native conditions. The binding affinity between PSA-Fc fusion proteins and Fc gamma receptor I (FcγRI, CD64) was confirmed by ELISA and SPR analysis. In addition, through glycan analysis of PSA-IgG FcP and PSA-IgG FcKP, differences were confirmed according to KDEL. I confirmed the discrepancy in antibodies production of PSA-Fc based proteins against PSA antigen through an animal experiment. These results showed the potential of PSA-based prostate cancer vaccine candidates and the effect of Fc-fusion proteins and their modified forms in plants. Taken together, diverse forms of PSA-based prostate cancer vaccine candidates were successfully expressed in tobacco plant expression systems. Structural, functional characterizations and immunological functions in mice were confirmed in in vitro and in vivo levels. These studies suggest plant-derived PSA based vaccine using biopharmaceutical production systems can be a potential alternative to prostate cancer immunotherapeutic candidates. 전립선암은 전세계적으로 남성에게 가장 많이 발생되는 악성 종양이다. 지금까지 전립선암 치료를 위해 방사선요법, 화학요법, 호르몬요법 등이 사용되어져 왔다. 하지만 이전의 치료법에 내성을 보이는 전이성 거세저항성 전립선암이 증가함에 따라 면역 치료요법이 대안책으로써 대두되고 있다. 전립선암을 표적으로하는 면역 치료요법 중 하나는 암 백신이다. 전립선암은 타 암들에 비해 진행 속도가 느려 조기 진단이 가능하다. 이러한 특성은 백신 접종 이후 면역반응이 일어나기까지 충분한 시간을 제공할 수 있으며, 이는 목적 질병에 대한 효과적인 암 백신 개발을 가능하게 한다. 그러므로 암 백신은 전립선암을 위한 이상적인 접근법이 될 수 있다. 암 백신을 개발하는데 있어서 중요한 것은 효과적으로 면역 반응을 촉진할 수 있는 종양 관련 항원(TAA)의 선택이다. 전립선암에서 잘 알려진 TAA의 예로는 전립선의 상피세포에서 발현, 분비되는 PSA라는 단백질이다. 암백신과 같은 바이오의약품을 생산하기 위해서 식물 기반 플랫폼이 사용되어지고 있는데, 이는 제약과 농업의 줄임말인 분자농업(molecular pharming)으로써 바이오의약품을 생산하기 위하여 식물을 이용하는 생명공학 기술로 급부상하고 있다. 이는 비용적 측면에서 효율성, 안전성, 확장성, 번역 후 조절 시스템 등의 여러 장점을 가지고 있어 관심이 대두되고 있다. 전립선암 백신 후보물질 생산을 위한 하나의 접근법은 Fc 기반 융합 단백질이다. Fc 융합 단백질은 항체와 마찬가지로 정제가 용이하고, 효과기 세포들의 Fc 수용체와 상호작용을 통한 면역반응 증대 및 반감기 증대된다고 보고 되어 왔다. 더 나아가, Fc 융합 단백질에 면역글로불린 A와 M의 테일피스를 붙이게 되면 고분자 구조의 형성과 면역반응 증대가 기대될 수 있다. 본 논문에서는 Fc 융합 단백질 및 면역 글로불린 A와 M의 테일피스(tailpiece)가 결합된 형태의 다양한 PSA 기반 전립선암 백신 후보물질들이 담배 식물에서 발현되었다. PCR 분석은 각 유전자의 삽입을 보여주었고, 웨스턴블랏 결과는 담배 식물 내에서의 단백질 발현 및 KDEL에 따른 발현율의 차이를 보여주었다. 정제된 단백질의 크기 분석은 환원 및 비환원 조건에서의 SDS-PAGE 분석 및 native 조건에서 이루어졌다. PSA-Fc 융합 단백질과 Fc 감마 수용체 I (FcγI, CD64)간의 결합력을 보기 위하여 ELISA 및 SPR을 수행하였다. 또한 KDEL에 따른 차이를 보기 위하여 PSA-IgG FcP 와 PSA-IgG FcKP 의 당구조 분석을 수행하였다. 또한, 동물실험을 통해 PSA 항원에 대한 PSA-Fc 기반 단백질들의 항체 생산에 차이가 있음을 확인하였다. 이 결과들은 식물유래 PSA-기반 전립선암 백신 후보 물질들의 잠재성 및 Fc 융합 단백질과 그들의 변형된 형태의 효과를 보여주었다. 종합적으로, 다양한 형태의 PSA 기반 전립선암 백신 후보물질들이 담배 식물 발현 시스템에서 성공적으로 발현, 생산되었으며, 이 단백질들의 구조적, 기능적 특성 및 면역학적 기능이 in vitro와 in vivo 수준에서 확인되었다. 이러한 연구는 PSA가 전립선암에 대한 이상적인 목적 단백질임을 시사함과 동시에 식물 발현 시스템이 바이오의약품 생산의 대안책이 될 수 있음을 시사한다.

정상 및 거세 흰쥐 전립선에서 아쿠아포린의 발현 및 분포

정승일 전남대학교 대학원 2010 국내박사

목적: 아쿠아포린 (Aquaporin, AQP)은 생물학적 막을 통하여 수분을 전달하는 일종의 수분 전달 통로단백질 (water channel proteins)이다. 남성의 전립선과 정낭은 정액의 대부분을 분비하는 분비샘으로 작용하며 정액 분비 기전에 AQP 이 관여하리라 추정되고 있다. 본 연구의 목적은 수컷 흰쥐의 거세모델에서 전립선 배부의 AQPs 수분 채널의 발현 및 분포의 변화를 관찰하고자 하였다. 재료 및 방법: 수컷 Sprague-Dawley 흰쥐 (SD rat, 12 weeks)를 대상으로 대조군 (Control, n=5), 거세군 (n=25)으로 나누었고, 거세군은 거세 1, 3, 5, 7, 14일째군으로 나누었다 (각 군 n=5). 대조군과 거세군을 1,3,5,7,14일 째 마취하여 전제무게를 측정하였고 배부 전립선과 정낭을 적출하여 무게 측정후 면역조직화학 방법과 Western blot 을 이용하여 배부 전립선에서 AQP 발현과 분포의 변화를 관찰하였다. Western blot을 이용하여 Bax 와 Bcl-2 단백을 측정하여 배부전립선의 세포고사 정도를 살펴보았다. 결과: 정상 흰쥐 배부 전립선의 Western 분석에서 AQP1, AQP9의 단백이 발현되었으며, 면역조직화학염색 결과에서 AQP 1은 주로 배부전립선조직의 모세혈관과 세정맥에서 면역 반응을 나타내었고, AQP9은 배부전립선의 원주형상피세의 세포막에서 주로 관찰되었다. Western blot 상에서 거세군의 AQP1은 발현변화를 보이지 않았으나, AQP9는 거세 1, 3일째까지 발현이 유지되었고, 5, 7, 14일째 현저하게 감소하였다. 면역조직화학염색상에서 거세후 1, 3일에 AQP9의 발현부위가 원주형 상피세포의 세포질에서 주로 발현되었으며, 5, 7일에는 주로 입방형상피세포의 세포막에서 발현되었다. 대조군에 비해 거세 3일째부터 유의하게 전립선과 정낭의 무게가 감소하기 시작하였다 (p<0.05). 세포고사지표인 Bax/Bcl-2는 거세 1일째부터 증가를 보였고, 3일째는 최대를 보였으나 5일 이후부터는 대조군보다 더 감소하였다. 결론: 흰쥐의 배부 전립선에서 AQP1은 모세혈관 및 정맥의 내피세포에서 발현되며, AQP9는 상피세포의 세포막에 주로 분포함을 확인하였고, 거세모델에서 혈관에 존재하는 AQP1의 발현에는 변화가 없으며, 상피세포막에 주로 발현하는 AQP9은 거세 후 초기 세포고사시기에 세포막으로의 이동이 억제되는 것이라 생각하고, 이후 원주형상피세포의 고사 후, 형성된 입방형 상피세포막에서는 원주형 세포에서 보다 소량 발현되었다. AQP 9 발현감소와 동반한 세포고사 감소는 상피세포의 AQP이 단순히 분비기전에만 작용하는 단백이라기보다는 전립선 세포고사과정에도 관여하리라 생각된다. PURPOSE: Aquaporins (AQPs) are membrane proteins that facilitate water movement across biological membranes. The fluid movement is associated with the presence of AQPs in male reproductive system. It has been suggested that AQPs are involved in prostate secretion. The purpose of this study was to determine the localization and functional roles of AQPs in rat prostate by using a rat model of castration. MATERIALS AND METHODS: Male Sprague-Dawley rats (350-400 g; n=30) were divided into 6 groups with 5 rats in each group, as follows: one group of animals was used as non-surgical controls, and another five groups of animals were surgically-castrated. The operated groups were sacrificed at 1, 3, 5, 7, and 14 days after castration. Expression of AQPs in the ventral prostate (VP) of the control group and changes in the expression of AQPs in the castrated group were investigated by immunochemistry and Western blot analysis. Apoptosis of ventral prostate were investigated by Western blot analysis using Bax and Bcl-2 proteins. RESULTS: AQP 1 and AQP 9 were expressed in the ventral prostate (VP). In control rats, AQP 1 was expressed in the capillaries and venules of the prostate. AQP 9 was expressed in the epithelium of the prostate. From day 3 after castration, prostate and seminal vesicle weights were significantly decreased compared to controls. Expression of AQP 1 was not significantly changed after castration. But expression of AQP 9 was significantly decreased on days 5, 7, and 14 after castration. Apoptosis of the epithelium was developed from day 1 and reached a maximum on day 3 after castration by expression of Bax / Bcl-2 proteins, when the expression of AQP 9 was highly preserved and blocked translocation to the apical cell membrane and AQP9 was disappeared in later period with progressivechanges of tall columnar epithelial cells into cuboidal cells. CONCLUSIONS: These results showed a distinct localization of AQP 1 and 9 in the rat prostate and castration produces significant adverse effects on the expression of AQP 9. These patterns of expression of AQPs in prostate epithelium may play a role, not only in the prostate secretory process, but also in the castration-induced apoptotic and transition process.

Study on the Functional Role of Glutathione Peroxidase 3 as a Tumor Suppressor in Prostate Cancer

장서나 서울대학교 대학원 2017 국내박사

Prostate cancer is the most frequently diagnosed cancer in Western men, and more men have been diagnosed at younger ages in recent years. A high-fat Western-style diet is a known risk factor for prostate cancer. Dietary fat increases oxidative stress and levels of reactive oxygen species (ROS) that interfere with cellular processes. Among the antioxidant enzymes, glutathione peroxidase 3 (GPx3) is an essential component of the cellular detoxification system. GPx3 is involved in protecting cells from oxidative damage, and down-regulated levels of expression have been found in prostate cancer samples. However, it remains unknown whether GPx3 expression can regulate the development of prostate cancers and the role and mechanism of GPx3 in prostate tumorigenesis has never been directly tested. In addition, little is known about the effect of GPx3 expression on tumor invasion in prostate cancer. In this study, to study the functional role of GPx3 as a tumor suppressor in prostate cancer, I evaluated the expression and function of GPx3 during prostate cancer tumorigenesis in transgenic adenocarcinoma of the mouse prostate (TRAMP) mouse model and PC-3 human prostate cancer cells (Figure I). Chapter I study evaluated the association between dietary animal fat and expression of antioxidant GPx3, in the early stages of transgenic adenocarcinoma of the mouse prostate (TRAMP) mice. Six-week-old male nontransgenic and TRAMP mice were placed on high animal-fat (45% Kcal fat) or control (10% Kcal fat) diets and sacrificed after 5 or 10 weeks. The histopathological score increased with age and high-fat diet consumption. TRAMP mice fed a high-animal fat diet showed decreased GPx3 expression both at the mRNA and protein levels. GPx3 decreased both at the mRNA and protein levels in mouse prostate. GPx3 mRNA expression decreased (~36.27% and ~23.91%, respectively) in the anterior and dorsolateral prostate of TRAMP mice fed a high-fat diet compared to TRAMP mice fed a control diet. Cholesterol treatment increased PC-3 human prostate cancer cell proliferation, decreased GPx3 mRNA and protein levels, and increased H2O2 levels in culture medium. Moreover, increasing GPx3 mRNA expression by troglitazone (TGZ) in PC-3 cells decreased cell proliferation and lowered H2O2 levels. Overall, these results suggest that dietary fat enhances prostate cancer progression, possibly by suppressing GPx3 expression and increasing proliferation of prostate intraepithelial neoplasia (PIN) epithelial cells. In Chapter II, I evaluated the tumorigenic role of the GPx3 in vivo by using GPx3 deficient TRAMP mice. TRAMP / GPx3 (–/–) KO mice were generated by cross-mating of TRAMP mutant mice and GPx3 mutant mice. Prostate cancer incidence and progression were determined in TRAMP, TRAMP / GPx3 (+/–) HET, and TRAMP / GPx3 (–/–) KO mice at 8, 16, and 20 weeks of age. GPx3 expression was decreased in TRAMP mice during progression of prostate cancer in a fashion that parallels observations in human prostate cancer. GPx3 was not detected in GPx3 KO mice both in mRNA and protein levels. Disruption of GPx3 expression in TRAMP mice increased the genitourinary tract weights and the histopathological scores in each lobe with increased proliferation rates. Moreover, deletion of one (+/–) or both (–/–) alleles of GPx3 gene resulted in increase in prostate cancer incidence with activated Wnt/β-catenin pathway. These results provide the first in vivo molecular genetic evidence that GPx3 does indeed function as a tumor suppressor during prostate carcinogenesis. Chapter III study aimed to determine the inhibitory effect and mechanism of TGZ on cell growth, migration, and invasion using prostate cancer cell line PC-3. TGZ is a synthetic peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ) ligand that exhibits potential antitumor effects on a broad range of cancers, including prostate cancer. Cell migration and invasion were assessed with wound healing assay and transwell assay, respectively. The expression levels of mRNA and protein were determined by quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction and western blotting. TGZ dose-dependently inhibited cell migration and invasion of PC-3 cells. In addition, TGZ increased the mRNA and protein levels of E-cadherin and GPx3 in PC-3 human prostate cancer cells. In addition, GW9662, a PPARγ antagonist, attenuated the increased mRNA and protein levels of E-cadherin and GPx3, suggesting that PPARγ-dependent pathway was involved. Taken together, these results suggest that the anti-migration and anti-invasion effect of TGZ on PC-3 prostate cancer cells is, at least in part, mediated through upregulating E-cadherin and GPx3. I also conclude that PPARγ could be used as a potential therapeutic target for the prevention and treatment of prostate cancer cell invasion and metastasis. These findings further support the important role that GPx3 plays as a tumor suppressor provide an insight into disease pathogenesis, and indicate that it may serve as a substrate for translational investigations in prostate cancer. Additionally, identification of mechanisms that cooperate with loss of GPx3 to promote tumorigenesis may provide additional therapeutic targets.