천연 NF-κB 저해제의 전사인자 NF-κB 활성 저해 기전 연구

김진환 충남대학교 대학원 2007 국내석사

Nuclear transcription factor NF-κB play a important role in the regulation of many genes encoding such as cytokines, cell adhesion molecules, tumorigenesis, apoptosis, autoimmune and inflammatory proteins. NF-κB consists of a family of proteins RelA (p65), RelB, c-Rel, NF-κB1 (p50 and p105), NF-κB2 (p52) and activated by various agents including TNF, LPS, IL-1, H2O2, and various cellular and environmental stresses . Under normal condition, NF-κB is present in the cytoplasm in an inactive state by incorporation with an inhibitor protein IκB. On activation, NF-κB is released and translocated to the nucleus, binding with specific sequences resulting in genes transcription. Thus NF-κB inhibitors could be effective in the treatment of inflammation and cancer disease. Mallotus apelta Muell. -Arg, (Euphorbiaceae) is widely distributed in the north of Vietnam and south of China, and has been used in traditional Vietnamese medicine to treat chronic hepatitis, white blood and enteritis. From this plant, a number of terpenoids, alkaloids, coumarinolignoids and benzopyrans together with biological activities such as antibiotic, anti-HIV, anti-oxidant and cytotoxicity have been reported. Recently we isolated a new benzopyran, Malloapelta B from M. apelta, which potently inhibited the LPS-induced NF-κB activation and NO production on RAW264.7 murine marcrophage cell line. however, there is no report on the molecular mechanism by which Malloapelta B regulates NF-κB activation. In this study, we investigated the mode of action of Malloapelta B in the NF-κB signaling pathway. Malloapelta B inhibited LPS-induced NF-κB activation through suppression of not only IκB degradation and IκB phosphorylation but also RelA phosphorylation. These activities is likely to be associated with the inhibition of IKK-α, and -β phosphorylation. Finally, we demonstrated Malloapelta B's effect on the expression of NF-κB target gene such as iNOS and COX-2. We also investigated how Celastrol, a quinone methide triterpenoid isolated as an inhibitor of NF-κB from Celastrus orbiculatus, induced apoptotic cell death. We found that celastrol not only induced caspase-8 activation, which resulted in Bid activation and PARP degradation, a hall mark of caspase-3 activation but also inhibited anti-apoptotic c-IAP1, cIAP2, and FLIP expression. Celastrol also inhibited expression of MMP-2 and -9, which would be correlated to the inhibitory activity of celastrol in cancer cell migration and invasion. Taken together, this study extends our understanding on the molecular mechanism underlying the anti-inflammatory and anti-cancer activities of Malloapelta B and Celastrol.

혈소판활성인자에 의한 NF-κB 활성에 있어서 CK2의 역할

조경득 전남대학교 대학원 2010 국내석사

혈소판 활성 인자 (platelet-activating factor; PAF)는 극성의 지질 매개자로 다양한 염증세포로부터 분비되고 nuclear factor-κB (NF-κB) 활성을 유도하여 염증성 cytokine이나 혈관형성 인자, anti-apoptotic 인자의 발현을 증가시킨다. CK2는 serine/threonine kinase로 inhibitor of κB (IκB)의 분해를 통해 NF-κB의 활성에 직접적으로 영향을 준다고 알려져 있다. 본 연구에서는 PAF에 의한 NF-κB의 활성에서 CK2의 역할을 알아보고자 하였다. PAF에 의해서 in vivo에서 CK2의 활성과 단백질 발현이 증가하였으며, CK2억제제에 의해 PAF에 의해 유도된 NF-κB의 활성과 NF-κB promotor activity, IκB의 분해가 억제 되었다. PAF에 의해 유도된 TNF-α와 VEGF의 mRNA은 CK2 억제제에 의해 억제되었으며, PAF에 의해 증가된 폐로의 흑색종 전이도 CK2 억제제에 의해서 억제되었다. PAF에 유도된 anti-apototic 인자인 Bcl-2, Bcl-xL의 발현은 CK2 억제제에 의해 억제되었으며, etoposide에 의해 유도된 caspase-3의 활성과 poly ADP ribose polymerase (PARP)의 절단은 PAF에 의해서 억제되었지만 CK2 억제제를 처리 시 억제되었던 caspase-3의 활성과 PARP의 절단이 증가하였다. 이러한 결과로 PAF에 의한 NF-κB의 활성에 CK2가 관여함을 알 수 있었다. Platelet-activating factor (PAF) is a potent biological lipid mediator released directly from cell membranes and induces inflammatory cytokines, angiogenic factors, and anti-apoptotic factors through NF-κB activation. CK2 is a ubiquitous serine/threonine protein kinase. CK2 has been shown to induce NF-κB activation via direct degradation of IκBα. I have investigated the role of CK2 on PAF-induced NF-κB activation. PAF increased CK2 activity in vivo. CK2 inhibitor prevented PAF-induced NF-κB activation and IκBα, β degradation in vivo and in vitro. CK2 inhibitors, DMAT and TBCA, inhibited PAF-induced not only mRNA expression of proinflammatory cytokines (TNFα and VEGF), antiapoptic factors (Bcl-2, Bcl-xL) but also experimental pulmonary tumor metastasis. CK2 inhibitors also blocked PAF-mediated decreases in the ectoposide-induced caspase-3 activity as well as PARP cleavage. Inhibitory activities of NF-κB inhibitor, NAC to the PAF-induced endpoints were comparable to those of CK2 inhibitors. These data suggests that CK2 is involved in PAF-induced NF-κB activation.

대장직장 점막의 전암성병변과 암종에서 Nuclear Factor-κB p65 (RelA)와 Nuclear Factor-κB1 p50, p38 Mitogen-Activated Protein Kinase 및 cyclin D1 단백 발현에 관한 면역조직화학적 분석

이상대 중앙대학교 대학원 2008 국내박사

배경 : Nuclear Factor-κB p65 (NF-κB p65)와 Nuclear Factor-κB1 p50 (NF-κB p50)은 세포증식과 세포자멸사, 시토카인 생성 및 종양화에 역할을 하는 것으로 알려져 있고, 최근 p38 Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK)/ NF-κB/ cyclin D1 신호전달 경로가 인간 종양의 발생에 중요한 부분을 담당한다는 연구 결과가 있다. 본 연구에서는 대장직장의 전암성 병변과 선안종에서 NF-κB p65, NF-κB p50, p38MAPKα, cyclin D1의 단백 발현을 알아보고자 한다, 방법 : 정상 점막 20예, 저등급의 선종 20예, 고증급의 선종 20예, 선암종 64예의 파라핀 포매 조직을 이용하여 NF-κB p65, NF-κB p50, p38MAPKα, cyclin D1 단백에 대한 면역조직화학 염색을 실시하였다. 결과 : NF-κB p65과 NF-κB p50 및 p38MAPKα 단백의 발현은 정상 점막에서 선암종으로 진행하면서 통계학적으로 유의하게 증가하였다. 선암종에서 NF-κB p65 단백은 저등급의 분화도, 림프절 전이가 있는 경우, 병기가 높은 경우에 발현 빈도가 높았으며, NF-κB p50 단백은 종양 병기가 높은 경우, 림프절 전이가 있는 경우, 병기가 높은 경우에 발현 빈도가 높았고, p38MAPKα 단백은 종양 병기가 높은 경우, 림프절 전이가 있는 경우, 병기가 높은 경우에 발현 빈도가 높았다. NF-κB p65, NF-κB p50, p38MAPKα, cyclin D1 단백은 서로 연관성 있게 발현을 하였고, 선암종에서 NF-κB p65, NF-κB p50, p38MAPKα, cyclin D1 단백이 모두 발현되는 예가 많았다. 결론 : NF-κB p65, NF-κB p50, p38MAPKα, cyclin D1 단백은 서로 연관성있게 발현을 하며 NF-κB/ p38MAPKα/ cyclin D1 신호전달 경로가 대장직장암의 발생과 진행에 역할을 하는 것으로 생각된다. Background : Nuclear Factor-κB p65 (NF-κB p65), Nuclear Factor-κB1 p50 (NF-κB p65) have been shown to play a role in cell proliferation, apoptosis, cytokine production, and oncogenesis. Recently, p38 Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK)/ NF-κB/ cyclin D1 signaling pathway has been shown to play an important part in the pathogenesis of human cancers. This study was designed to investigate the expression of NF-κB p65, NF-κB p65, p38MAPKα, and cyclin D1 proteins in premalignant lesions and colorectal adenocarcinoma. Methods: Paraffin sections of 20 normal mucosa, 20 low grade tubular adenoma, 20 high grade tubular adenoma and 64 adenocarcinoma tissues were analysed immunohistochemically for expression of NF-κB p65, NF-κB p65, p38MAPKα, and cyclin D1 proteins. Results: The expression of NF-κB p65, NF-κB p65, and p38MAPKα proteins were significantly higher in adenocarcinoma tissue in comparison with that in normal mucosa, low grade tubular adenoma, and high grade tubular adenoma tissues. Expression frequency of NF-κB p65 was higher in poorly differentiated histologic grade, presence of nodal metastasis and high stage. Expression frequency of p38MAPKα was higher in high tumor stage, presence of nodal metastasis and high stage. There were significant correlations between NF-κB p65, NF-κB p50, p38MAPKα, and cyclin D1 proteins. Moreover, synchronous expression of NF-κB p65, NF-κB p65, p38MAPKα, and cyclin D1 proteins were significantly higher in adenocarcinoma. Conclusion: The expression of NF-κB p65, NF-κB p50, and p38MAPKα proteins and the p38MAPK/ NF-κB/ cyclin D1 signaling pathway may be to play role in the pathogenesis of colorectal carcinoma.

Nuclear Factor κB and Hypoxia Inducible Factor-1 Inhibitors from Amorpha fruticosa and Morus species : Nuclear Factor κB and Hypoxia Inducible Factor-1 inhibitors from Amorpha fruticosa and Morus species

윈 디엔 닷 충남대학교 대학원 2008 국내박사

Helicobacter pylori induces apoptosis via NF-κB activation in human gastric AGS cells : Helicobacter pylori 감염 AGS 세포에서의 NF-κB 활성화와 세포고사

추상희 Graduate School, Yonsei University 2003 국내박사

Helicobacter pylori (H. pylori)는 비침습성, 그람 음성, 미호기성(microaerophilic) 세균으로, 위염, 소화성 궤양, 위 림프종, 위암의 중요한 원인균으로 여겨지고 있다. 그러나 H. pylori의 질병유발기전에서 위 상피 세포와 상호작용을 통한 위 상피 세포고사와 그에 따른 분자생물학적인 기전에 대해서는 아직 명확하게 밝혀져 있지 않다. 본 연구에서는 H. pylori 에 의한 위 상피 세포고사에서 중요한 역할을 하는 것으로 추정되는 NF-κ B의 역할을 밝히고자 하였다. 실험 재료로는 인간 위상피 세포주인 AGS를 사용하였으며, NF-κ B와 세포고사의 관계를 규명하기 위해 AGS 세포에 NF-κ B 아형인 p50에 대한 안티센스 (antisense)를 처리하거나, 돌연변이 IκBα 유전자를 도입하였다. AGS 세포를 항생제가 없는 배양액에서 H. pylori (NCTC11637, 세균:세포, 300:1)와 24시간 동안 배양한 후, 세포 수 측정, DNA 분절 정량화, Hoechst 염색법으로 세포고사를 측정하였다. 또 다른 지표로 p53, bax, bcl-2의 발현을 역전사중합연쇄법 (RT-PCR)과 웨스턴 블럿법 (Western blotting)으로 측정하였다. 그 결과 H. pylori는 p53과 bax의 증가, bcl-2의 감소를 동반하여 세포고사를 유도함을 관찰할 수 있었다. H. pylori로 유도된 세포고사는 안티센스를 처리하거나, 또는 돌연변이 IκBα 유전자를 도입한 경우 억제된 반면, 센스를 처리하거나, 또는 대조 유전자를 도입한 경우 세포고사가 유도되었다. H. pylori에 의한 p53, bax, bcl-2의 변동도 안티센스를 처리하거나, 또는 돌연변이 Iκ B-α 유전자 도입으로 억제되었다. 더 나아가 bcl-2 유전자를 과발현 시킴으로 H. pylori로 유도된 세포고사가 감소됨을 확인할 수 있었다. 이상의 결과들을 종합하여 보면 H. pylori는 위 상피 세포에서 NF-κ B를 활성화시키고, p53, bax, bcl-2의 조절을 매개하여 세포고사를 유도한다고 생각한다. Helicobacter pylori (H. pylori) causes gastric epithelial cell damage. But thorough investigations into H. pylori-induced apoptosis and subsequent molecular mechanisms are rare. The present study examined the role of NF-κB in H. pylori-induced apoptosis in human gastric epithelial cells. To investigate the relationship between NF-κB and apoptosis, human gastric epithelial cells (AGS) were treated with antisense ODN for NF-κB p50 (AS ODN) subunit or were transfected with a mutated IκBα gene (MAD-3 mutant). AGS cells were stimulated with H. pylori (NCTC11637) in antibiotic-free culture medium for 24 hr (bacterium:cell, 300:1). Apoptosis was determined by cell counting, quantification of DNA fragmentation, and Hoechst staining. As apoptotic indices, expression of p53, bax and bcl-2 were examined using Western blotting and RT-PCR analysis. As a result, H. pylori induced apoptosis, accompanied with the increase of p53 and bax and decrease of bcl-2. H. pylori-induced apoptosis was inhibited in the cells treated with AS ODN or transfected with a mutated IκBα gene, while apoptosis was shown in the cells treated with sense ODN of NF-κB p50 subunit (S ODN) or transfected with a control vector (pcDNA-3), by H. pylori. H. pylori-induced alterations of p53, bax and bcl-2 were inhibited in the cells treated with AS ODN or transfected with a mutated IκBα gene. Moreover, overexpression of bcl-2 attenuated H. pylori-induced apoptosis. These results suggest that H. pylori induces apoptosis in gastric epithelial cells through activation of NF-κB, mediating regulation of p53, bax and bcl-2.

Constitutive activation of NF-κB and tumor cell proliferation by Romo1-induced ROS

정진실 고려대학교 대학원 2013 국내박사

Deregulation of nuclear factor-κB (NF-κB) and related pathways contribute to tumor cell proliferation and invasion. Mechanisms for constitutive NF-κB activation are not fully explained; however, the underlying defects appear to generate and maintain pro-oxidative conditions. In hepatocellular carcinoma (HCC) tissues, up-regulation of reactive oxygen species modulator 1 (Romo1) correlates positively with tumor size (P=0.004). In the present study, I showed that Romo1 expression is required to maintain constitutive nuclear DNA-binding activity of NF-κB and transcriptional activity through constitutive IκBα phosphorylation. Overexpression of Romo1 promoted p65 nuclear translocation and DNA-binding activity through an IκB kinase complex. Interestingly, continuous hydrogen peroxide treatment increased the constitutive DNA-binding activity of NF-κB through Romo1 expression. I also show that Romo1 depletion suppressed anchorage-independent colony formation by HCC cells and suppressed tumor growth in vivo. Based on these findings, Romo1 may be a principal regulatory factor in the maintenance of constitutive NF-κB activation in tumor cells. In the interest of anti-proliferative treatments for cancer, Romo1 may also present a productive target for drug development.

암세포형성과정에 중요한 NF-κB 전사조절인자의 작용 메카니즘 연구 : Study on the mechanism of NF-κB transcription factor during tumorigenesis

최용석 단국대학교 일반대학원 2005 국내박사

The transcription factor NF-κB is a critical regulator of genes encoding cytokines, cytokine receptors, and cell adhesion molecules, which play an important role for immune and inflammatory responses. NF-κB is implicated in the various biological processes and its activation is regulated through several signaling pathways. NF-κB activation is essentially mediated through the proteosome pathway that leads to degradation of the inhibitory proteins, subsequent nuclear translocation, and DNA-binding of the NF-κB subunits. NF-κB activation is also regulated by modification of p65 or p50 subunit, such as phosphorylation, acetylation, ubiquitination or proly isomerization. These post-tanslational modifications of NF-κB subunits are related to DNA binding as well as transcriptional co- activators/co-repressors binding of NF-κB. Full activation of NF-κB is regulated by diverse signaling pathways acted on different steps of transcriptional activation. The mechanism of NF-κB transcriptional activation was studied as two parts in this thesis. In Part I, the signaling pathway that leads to NF-κB activation after treatment of a chemotherapeutic agent, etoposide, was investigated. I focused on the PI3-Kinase pathway that is implicated in cell survival and anti-apoptosis. I found that the PI3-Kinase pathway was involved in enhancing DNA binding of p50 as well as dissociating HDAC1 from p65. In addition, it was observed that PI3-Kinase mediated-suppression of apoptosis was regulated by the p50 subunit of NF-κB. In Part II, I explored the possible target genes which are regulated by PI3-Kinase mediated activation of p50 subunit. I demonstrated that CRP and Bcl-2, which play an important role in inflammation and apoptosis, are regulated by the phosphorylated p50 subunit. It was previously reported that CRP is regulated by p50 after IL-1 and TNF-α treatment. In addition, anti apoptotic genes, such as Bcl-2, were proposed to be regulated by NF-κB. Taken together, I propose that PI3-Kinase-mediated NF-κB activation, especially through p50 subunit, is important for anti-apoptosis as well as inflammation. Molecular characterization of the NF-κB subunits as shown in this thesis will provide valuable information for the development of more systemic therapy for cancer and other NF-κB-related disease. 전사조절인자 NF-κB는 면역과 염증반응에 중요한 역할을 수행하는 싸이토카인 과 싸이토카인수용체, 세포접합 분자의 발현에 중요한 전사조절인자이다. NF-κB는 다양한 생물학적 반응과정에 중요하고 활성화과정은 여러 종류의 신호전달과정에 의해서 조절된다. NF-κB의 활성화는 단백질분해를 통해서 불활성화분자들의 분해를 유도하며, 이에 따라 NF-κB가 핵으로 이동하고 DNA에 결합한다. 또한 NF-κB의 활성화는 이들의 소 단위체인 p65와 p50의 인산화 및 아세틸화, ubiquitination 혹은 proly isomerization 등 화학적 변형에 의해 조절된다. 이런 NF-κB의 번역 후 변형은 DNA와의 결합력과 전사조절 활성화분자 및 불활성화분자들과의 결합에 영향을 준다. NF-κB의 완전한 활성화는 전사 활성의 각기 다른 단계에 작용하는 다양한 신호 전달과정에 의해 유도된다. 본학위 논문에서는 NF-κB의 전사활성 기작을 두 부분으로 나누어 연구하였다. 제1장에서는 항암치료제인 etoposide를 처리한 후 NF-κB 활성화에 관여하는 신호전달 과정을 연구하였다. 우선 세포생존과 세포사멸억제 과정에서 강조되는 신호전달과정인 PI3-Kinase pathway 에 초점을 두었다. 연구결과 PI3-Kinase pathway에 의하여 p65로 부터 전사조절 공동불활성분자인 HDAC1이 분리되고 p50의 DNA 결합력을 증진시킴을 발견하였다. 또한 PI3-Kinase pathway를 매개로한 세포사멸의 억제과정이 p50에 의해서 조절됨을 관찰하였다. 제2장에서는 PI3-Kinase의존적인 p50에 의해서 조절 받는 표적유전자를 조사하여 연구하였다. 실험결과 염증반응과 세포사멸에서 중요한 역할을 수행하는 CRP 분자와 Bcl-2 분자가 전사수준에서 p50 소 단위체의 인산화에 의존적으로 조절됨을 관찰하였다. 기존의 연구결과에 따르면 간세포에 IL-1과 TNF-α 처리하면 CRP 분자의 전사과정에 50소 단위체가 작용한다. Bcl-2의 전사 역시 NF-κB에 의해서 조절됨이 보고되었다. 이런 결과들은 세포사멸억제와 염증반응에 PI3-Kianse를 매개로 한 NF-κB 활성화, 특히 p50 소단위체의 활성이 중요함을 제안한다. 그러므로 각각의 NF-κB 단위체의 활성을 유도하는 신호전달 과정들에 대한 분자생물학적 연구는 악성종양과 NF-κB 관련 질병에 대한 더욱 체계적인 치료법의 개발에 유용한 정보를 제공할 것이다.

IKKγ Facilitates the Activation of NF-κB by Hsp90

이정아 창원대학교 2022 국내석사

NF-κB 및 JAK-STAT 경로 차단을 통한 사이토카인-유발 췌장 베타세포 손상의 억제

여나 전북대학교 대학원 2009 국내박사

췌장 베타 세포의 손상에 cytokine이 중요한 역할을 수행함은 잘 알려져 있다. 본 연구는 cytokine과 streptozotocin을 이용한 췌장 베타세포 손상 모델을 만들고, 이를 이용한 손상 기전 연구와 손상 과정을 차단하는 항당뇨 약물 개발을 목표로 하였다. 첫 번째 부분은 guggulsterone의 효과에 관련된 내용이다. Guggulsterone은 몰약의 주성분으로서 인도에서 오래전부터 고지혈증, 관절염 및 비만 치료를 위해 사용되어 왔던 약물이다. 인슐린 분비 세포주인 RINm5F 세포에 cytokine인 interleukin-1β와 interferon-γ를 처리하면, NF-kB 활성화를 통해 downstream genes인 iNOS와 COX-2의 발현이 증가되고, NO와 PGE2 생성을 증가시켜 궁극적으로 세포사를 유도함을 밝혔다. 또한 상기 cytokine은 JAK-STAT pathway를 활성화시키고 JAK-STAT pathway의 negative regulator로 알려진 SOCS-3의 발현을 억제하여 세포사를 일으켰다. Guggulsterone은 NF-kB, JAK-STAT pathways의 활성을 억제하고, SOCS-3 감소를 억제하여 췌장 베타세포의 손상을 방지하였다. 두 번째 부분은 JAK-3 specific inhibitor인 JANEX-1을 이용하여 JAK-STAT pathway 억제를 통한 cytokine 독성 억제에 관한 실험이다. 이 실험에서는 rat로부터 직접 islets을 분리하여 실험에 사용하였다. JANEX-1은 cytokine에 의한 glucose-stimulated insulin secretion저하를 억제하였다. 또한 JAK-3 knock out mouse로부터 islets을 분리하여 normal mouse로부터 분리한 islets과 cytokine에 대한 toxicity를 비교하였을 때 JANEX-1 처리와 비슷하게 cytokine toxicity로부터 보호됨을 밝혀 췌장 베타세포 손상에 있어 JAK-STAT pathway의 중요성을 보여주었다. 마지막은 dihydroavenanthramide D의 항당뇨 효과에 관한 연구이다. Dihydroavenanthramide D는 피부과 영역에서 피부 손상을 치료하기 위해 사용되고 있는 약물이다. 이 연구에서는 RINm5F 세포, islets, streptozotocin-induced diabetes 모델을 사용하였고, dihydroavenanthramide D는 NF-kB pathway를 억제하여 췌장 베타세포 손상을 억제하였다. 이상의 연구를 통해 cytokine 혹은 streptozotocin에 의한 췌장 베타세포 손상에 NF-kB와 JAK-STAT 경로가 관여하고 있음을 확인하였으며, 이 경로들을 억제하여 당뇨병의 발병 혹은 진행을 억제할 수 있는 유용한 후보 약물로 guggulsterone, JANEX-1, dihydroavenanthramide D를 제시 하였다 Diabetes is characterized at the cellular level by a deficit in β-cell mass. It has been reported that NF-κB and JAK-STAT signaling pathways are activated by cytokines in pancreatic β cells. Also, the NF-κB pathway plays important roles in STZ-induced diabetes models. In this study, I used in vitro cytotoxicity model of pancreatic β cell by cytokines and in vivo diabetes animal model with streptozotocin. The aim is to find the reagents, which can protect the β cells by inhibiting the NF-κB or JAK-STAT signaling pathway. In the first part, the protective effects of guggulsterone on RINm5F cell lines and isolated rat islets were presented. Guggulsterone inhibited the IL-1β and IFN-γ-stimulated NF-κB and JAK/STAT signaling cascades, and up-regulated the SOCS3 protein expression. In the second part, I evaluated the effect of JANEX-1 on IL-1β and IFN-γ-mediated cytotoxicity using isolated rat islets and JAK3-/- mice islets. In the last part, I examined the effects of dihydroavenanthramide D on the IL-1β and IFN-γ-induced NF-κB signaling pathways in RINm5F cells and isolated rat islets, and also assessed its protective effects on streptozotocin (STZ)-induced diabetes mouse model. These results indicate that NF-κB and JAK-STAT signaling pathways play important roles in the development of type 1 diabetes, and are potential targets for drug development.

P38, NF-κB 및 COX-2의 조절에 의한 Stephania delavayi Diels. 추출물의 항암효능

徐洪德 강원대학교 대학원 2009 국내박사

World Health Organization (WHO)는 2005년 사망원인별 통계결과 제 1의 사망원인이 악성신생물에 의한 것이며 전체 사망자 58,000,000명 중 13% (7,600,000명)를 차지한다고 발표하였으며 미국의 경우 유방암으로 인한 사망의 경우 남녀를 포함하여 두 번째로 높은 사망률 (전체의 15%)을 보이고 여성의 경우 가장 높은 사망률을 갖는다고 보고하였다. 이러한 이유로 다양한 경로를 통한 항암제의 개발은 활발하고 특히 천연물질 중 항암성분을 발굴하는 연구는 매우 다양하며 많은 결과를 얻고 있다. 본 연구 또한 천연물질을 통한 항암 후보물질을 발굴하기위하여 human-origin cancer cell-line (MDA-MB-231, MCF-7)과 Caenorhabditis elegans (C. elegans)를 이용하여 400가지의 식물기원 추출물을 검사하여 가장 가능성이 높은 S. delavayi Diels.를 후보물질로 선정하였다. S. delavayi Diels.는 방기과 (Menispermaceae)의 쌍자엽식물로써 쓰고 (苦) 찬 (寒) 성질을 갖고 있으며 중국에서 오랜 기간 靑熱解毒, 利濕, 止痛, 急性胃腸炎 治療劑로 활용되어 왔다. S. delavayi Diels.는 MDA-MB-231과 MCF-7 cell line에서 apoptosis와 cell cycle arrest를 통하여 세포증식을 억제하였으며 그 기전을 확인한 결과 염증과 암에 있어서 중요한 기전인 p38 MAPK, NF_(-κ)B 및 COX-2를 조절하는 것을 확인하였다. 즉 NF_(-κ)B의 인산화와 COX-2 단백질의 발현을 용량과 시간 의존적으로 억제하였다. NF_(-κ)B의 인산화 억제는 p38 MAPK의 인산화를 증가시키는 결과이며 이러한 p38 MAPK의 인산화가 S. delavayi Diels.의 가장 주된 항암기전임을 알 수 있었다. 이러한 결과를 검증하기 위해 S. delavayi Diels.와 함께 NF_(-κ)B 혹은 COX-2 siRNA를 동시에 처리한 결과, 비록 다른 기전이 존재하기는 하지만 세포증식을 억제하는 중요한 기전은 NF_(-κ)B 인산화 억제와 COX-2 단백질 발현 억제임을 확인할 수 있었다. 한편 S. delavayi Diels.의 독성학적 안전성을 검토하기 위해 일주일간 50 ㎎/㎏의 S. delavayi Diels.를 복강으로 투여한 결과 몸무게, 혈구, 혈장내 생화학적 인자 등의 생리적인 변화가 없었으며 병리조직학적인 변화 또한 관찰할 수 없으나 B 세포의 활성화를 통한 면역증강효과는 확인 할 수 있었다. 그러나 T 세포, 자연살해세포, 마크로파지 등에는 변화가 없었다. 결론적으로 S. delavayi Diels.는 독성학적으로 안전한 항암후보물질로 B 세포면역증강효과를 갖고 있으며 주로 p38 MAPK/NF_(-κ)B/COX-2 신호전달체계를 통해 항암효능을 갖고 있으며 항암제로의 가능성이 높은 물질로 확인되었다. The World Health Organization reported that cancer was the leading cause of death in the world and was responsible for 7.6 million (13%) deaths of all (58 million) deaths in 2005. In the United States, breast cancer is the second leading cause of death (15% of total) and the most common form of malignant cancer in women. Recently research and development about anticancer drug through the various resources increase, especially drug developments from natural products have been rosen. Stephania delavayi Diels. was identified as the most promising candidate from a screen of 400 plant extracts. Treatment with S. delavayi Diels. extract inhibited cell proliferation effectively by inducing G₂/M phase arrest and inducing cell death in the breast cancer cell lines; MDA-MB-231 and MCF-7. S. delavayi Diels. has been used in traditional Chinese medicine for relieving pain and curing acute gastroenteritis. To apply and develop S. delavayi Diels for cancer therapy, its inhibitory mechanisms of cell proliferation were investigated. This study focuses on the effects of the extract on p38 MAPK, NF_(-κ)B, and COX-2, proteins with important roles in inflammation and cancer. S. delavayi Diels. also downregulated NF_(-κ)B phosphorylation and COX-2 expression in a dose- and time-dependent manner. In particular, inhibition of NF_(-κ)B phosphorylation by S. delavayi Diels. coincided with p38 MAPK activation, suggesting that p38 MAPK activation followed by NF_(-κ)B downregulation may be a major pathway for S. delavayi Diels. activity. Experiments involving co-treatment of NF_(-κ)B or COX-2 siRNAs with S. delavayi Diels demonstrated the involvement of other minor pathways and also provided further support for NF_(-κ)B and COX-2 as major targets of S. delavayi Diels. on cell proliferation. We examined the immune modulation effect and 7-days repeated-dose toxicity to validate its biological safety and efficiency. Mice were repeatedly administrated with 50 ㎎/㎏ S. delavayi Diels. daily by I.P for 7 days. S. delavayi Diels.-treated group exhibited no statistical significance from the control group in physical conditions; body weight, complete blood count (CBC), serum biochemical indexes etc. There was no difference between the control group and S. delavayi Diels.-treated group in gross findings such as histopathological alteration. S. delavayi Diels. induced B cell activation but had no effect on other immune cells such as T cell, natural killer (NK) cell, and macrophage (Mφ). In conclusion, S. delavayi Diels. is safe above the dose of immune modulation by activating B cells and may function primarily through inhibition of the p38 MAPK/NF_(-κ)B/COX-2 signaling cascade. And then S. delavayi Diels. may be a potent anticancer agent with specificity and low toxicity.