IL1B C-31T and IL1RN VNTR polymorphisms and gastric cancer risk

유지은 Graduate School of Education Sungshin Women's Univ 2002 국내박사

IL1B 는 생체 내 염증 반응과 관련해 다양한 기능을 하는 염증성 사이토카인으로 위산의 분비를 감소시키는 기능을 하는 것으로 알려져 있다. 또한 IL1RN 은 동물실험 결과 IL1B 의 양을 증가시키는 기능을 하는 것으로 알려져 있다. 염증반응에 관여하는 사이토카인인 IL1B 의 IL1B-31*T/*-와 IL1RN 의 IL1RN*2/*2 의 유전자형이 위산 분비가 낮은 위암가족 및 위암환자를 대상으로 한 연관성 연구에서 위장의 암세포화와 관련되어 있는 것으로 보고되었다. 이들 염증성 사이토카인의 유전형질이 한국인 위암과도 관련이 있는지를 알아보기 위하여 190 명의 위암 환자와 성별과 나이가 일치하는 172 명의 정상인을 대상으로 IL1B(-31) TATA promoter 와 IL1RN intron2 VNTR 다형성과의 연관성을 조사하였다. IL1B-31*T 과 IL1RN*2 의 대립인자 빈도는 한국인에서 각각 49%, 6%로 유럽인 (70%, 27%)에 비해 매우 낮게 나타났다. IL1B-31*C/*C 유전자형을 대상으로 IL1B-31*T/*T 유전자형을 가진 집단과 위암과의 관계를 규명하기 위하여 회귀분석을 실시한 결과, IL1B-31*T/*T 유전자형은 한국인 집단에서 위암의 위험유전인자가 아니었다(Adjusted OR = 1.11, 95% CI = 0.61-2.01). IL1RN*2 도 IL1RN*1 유전형질을 가진 집단을 표준으로 삼아 회귀분석을 실시한 결과 위암 발병과 관계가 없는 것으로 나타났다. 이상의 한국인 위암환자를 대상으로 한 연관성 연구에서는, IL1B-31*T-IL1RN*2 다형성이 위암을 증가시키는 위험유전인자라는 이전의 보고와는 달리, IL1B-31*T-IL1RN*2 다형성이 위암을 증가시키는 위험유전인자가 아니었다. IL1B is a pro-inflammatory cytokine with multiple biological effects and a potent inhibitor of gastric acid secretion. IL1RN is also shown to be associated with enhanced IL1B production in vitro. Recently, it was reported that the pro-inflammatory cytokines, IL1B-31*T/*- and IL1RN*2/*2, were associated with a significantly increased risk of pre-cancerous change of stomach in a Caucasian population. In this study, it was tested an association between IL1B(-31) TATA promoter and IL1RN intron2 VNTR polymorphisms and gastric cancer risk in Korean population. The allele frequency of IL1B-31T and IL1RN*2 allele were less prevalent in Korean (49% and 6%, respectively) than in Caucasian (70% and 27%, respectively ). When the IL1B-31*C/*C genotype was used as a reference group, the TT genotype was not associated with an increased risk of gastric cancer in the Korean population (OR = 1.11, 95% CI = 0.61-2.01). Neither ILLRN*2 was a risk genotype for gastric cancer. In the present study, the result did not support the previous report that IL1B-31*T-IL1RN*2 polymorphisms were associated with an increased risk of gastric cancer.

마우스 대식세포에서 TGF-b1과 IL-4에 의한 APRIL 발현 기작에 관한 연구

장영생 강원대학교 일반대학원 2007 국내석사

APRIL은 새로운 TNF family로서 B cell의 생존과 종양 세포의 분화에 관여하며 주로 대식세포, 수지상세포와 활성화된 T cell에서 수용성 단백질로 분비된다고 알려져 있다. 그러나 APRIL 자체 발현에 어떠한 요소들이 관여하는지는 명확하지 않다. 본 연구에서는 마우스 대식세포주인 P388D1에서 APRIL 발현에 미치는 TGF-b1과 IL-4의 영향에 대해 조사하였다. TGF-b1과 IL-4는 상호 보완 상승작용으로 APRIL의 전사를 유도하였고 단백질 수준의 APRIL 발현도 비슷한 양상을 보였다. TGF-b1에 의한 APRIL 전사 유도는 1 ng/ml의 농도에서 최적을 보였고 자극 후 3시간부터 나타났다. transfection 실험을 통해서 TGF-b1 유도성 APRIL 발현에서는 Smad3 비 의존적으로 CREB, ATF2에 의해 매개되는 p38 MAPK 신호 전달이 관여함을 알 수 있었다. 반면 IL-4에 의해 유도되는 APRIL 발현에서는 Stat6 의존적 신호 전달과 CREB에 의해 매개되는 p38 MAPK가 관여하였다. 이러한 결과는 TGF-b1과 IL-4가 APRIL 발현에 대해 공통된 신호전달 경로와 각각의 특화된 신호전달 경로를 통해 발현 조절에 관여함을 제시한다. p38 MAPK와 CREB은 APRIL 발현 유도에 대한 TGF-b1과 IL-4의 공통된 신호 전달 매개자이며 Stat6는 IL-4 특이적인 신호전달 매개자임을 알 수 있다. APRIL (a proliferation-inducing ligand), a new TNF family member, supports B-cell survival and tumor cell proliferation. APRIL is secreted as a soluble protein by macrophages, dendritic cells and activated T cells. However, it is unknown what factors are involved in regulation of APRIL expression. In this study, we investigated the effects of TGF-b1 and IL-4 on APRIL expression in P388D1, mouse macrophage cell line. Both TGF-b1 and IL-4 induced APRIL mRNA expression and showed additive effect. Protein levels of APRIL expression were also induced by TGF-b1 and IL-4 as additive effect. We found that 1 ng/ml of TGF-b1 is an optimal dose and the APRIL transcripts appear as early as 3 h after stimulation. Based on transfection experiments, it appeared that CREB, p38 MAPK, ATF2 but not Smad3, are involved in TGF b1-induced APRIL expression. On the other hand, STAT6 and CREB, p38 MAPK were associated with IL4-induced APRIL transcription. These results suggest that TGF-b1 and IL-4 utilize both common and specific pathways in the regulation of APRIL gene expression. Thus, CREB-p38 MAPK acts as a common mediator, while STAT6 as specific mediators of IL-4 signaling, respectively.

Polymorphisms of the IL-1 gene in Korean men : association with serum CRP and LDL-cholesterol concentrations and coronary artery disease

정승현 Graduate School, Yonsei University 2008 국내석사

Interleukin-1 (IL-1) 과 같은 염증성 지표의 혈청 농도의 증가는 심혈관계 질환에 영향을 미친다고 알려져 있다. 본 연구에서는 한국 남성의 IL-1의 유전자 다형성과 혈액 내 CRP, LDL 콜레스테롤 농도가 심혈관계 질환에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.CAD의 질병을 가진 남성 594명과 건강한 남성 711명을 대상으로 IL-1A(+4845 G>T), IL-1B(-3737 C>T, -1464 G>C, -511 T>C, +3877 A>G, +3954 C>T), IL-1RN(+2018 T>C)에서의 유전자 다형성을 측정하였다. 각종 Lipid, CRP, fibrinogen의 수치에 따른 CAD발병 위험 확률을 알아보았다.IL-1 -1464G>C에서 C allele를 가지고 있는 그룹에게서 나이, 체질량 지수, 흡연, 알코올 섭취 인자의 보정 후에CAD의 위험이 높은 것으로 나타났다 [OR 1.43 (95%CI 1.13-1.83), p=0.003].IL-1B-3737C/-1464C/-511T를 가지고 있지 않은 그룹이 CCT allele를 가지고 있는 그룹에 비해 CAD의 위험이 감소하는 것으로 나타났다 [OR 0.71 (95%CI 0.56-0.89), p=0.003].정상인 그룹에서 IL-1B -3737 C>T와 -511 T>C에서는 우성 대립유전자형을 가지고 있는 경우에 혈중 LDL 콜레스테롤 농도가 높았던 반면, IL-1B -1464 G>C에서는 열성 대립유전자형을 가지고 있는 경우에 혈중 LDL콜레스테롤 농도가 높음을 알 수 있었다.정상인 그룹에서 IL-1B -3737C/-1464C/-511T 가 아닌 다른 조합의 유전자형을 가지고 있는 그룹이 CCT형을 가지고 있는 집단에 비해 혈중LDL 콜레스테롤 농도(117±1 mg/dL vs. 111±2, P=0.01)와 CRP 농도(1.73±0.32 mg/dL vs. 1.07±0.13, P=0.043)가 유의적으로 낮게 나타났다.본 연구의 결과 IL-1B -1464G>C에서 C allele를 가지고 있는 경우 CAD의 위험률이 증가하는 상관관계를 보였다. 특히 CCT(IL-1B -3737C>T/-1464G>C/-511T>C) 유전자형의 조합을 가지고 있지 않은 건강한 남성 집단에게서 혈청 내 CRP, LDL 콜레스테롤이 감소하였으며, 이는 CAD의 위험을 감소시켜준다.Objectives : We aimed to investigate the relationship between IL-1 gene polymorphisms and risk of coronary artery disease (CAD), inflammatory markers, and lipid variables.Methods : 594 male patients with CAD and 711 healthy male controls were genotyped for polymorphisms in IL-1A (+4845G>T), IL-1B (-3737C>T, -1464G>C, -511T>C, +3877A>G, +3954C>T) and IL-1RN (+2018T>C). We calculated odds ratio (OR) for CAD risk and measured lipid variables, CRP, and fibrinogen level.Results : The presence of the minor allele at the -1464G>C SNP was significantly associated with an increased risk of CAD [OR 1.43 (95% CI 1.13-1.83), P=0.003] after adjusting for age, BMI, smoking, and alcohol consumption. The individuals with the absence of IL-1B -3737C/-1464C/-511T (nCCT/nCCT) was associated with a decreased risk of CAD [OR 0.71 (95% CI, 0.56-0.89), P=0.003] compared with those carrying the CCT allele (CCT/CCT + CCT/nCCT). Controls carrying the common allele of the -3737 and -511 SNPs had higher mean levels of serum LDL cholesterol, whereas carriers of the minor C allele of -1464 SNP showed higher LDL-cholesterol. Controls carrying the protective haplotype (nCCT/nCCT) showed significantly lower levels of LDL cholesterol (117 ± 1 mg/dL vs. 111 ± 2, P=0.01) and CRP (1.73 ± 0.32 mg/dL vs. 1.07 ± 0.13, P=0.043) compared to non-carriers (CCT/CCT + CCT/nCCT).Conclusion : Our results show an association between the IL-1B -1464C allele and increased risk of CAD. Moreover, non-carriage of CCT (IL-1B -3737C>T/-1464G>C/-511T>C) is associated with reduced risk of CAD and significantly decreased concentrations of CRP and LDL cholesterol in healthy men.

Participation of nitric oxide pathways in the interleukin 1b-induced mechanical allodynia in the orofacial area of rats : Interleukin-1b에 의해 유도되는 이질통증에 nitric oxide pathways의 조절작용

강영묵 경북대학교 대학원 2008 국내석사

The purpose of the present study was performed to examine role of peripheral nitric oxide (NO) pathways in the IL-1b-induced mechanical allodynia in the orofacial area. To achieve this purpose, the present study investigated effects of L-NAME, a NOS inhibitor, on IL-1b-induced mechanical allodynia and examined effects of L-NAME on the c-fos immunoreactive neurons in the trigeminal spinal nucleus in rats. Experiments were carried out on male Sprague-Dawley rats weighing 230-280 gm and surgical procedures were performed under pentobarbital sodium (40 mg/kg, i.p.). Under anesthesia, a polyethylene tube (PE10) was implanted into the subcutaneous area of one vibrissa pad, which enabled us to inject IL-1b or chemicals. We injected 50 mL of IL-1b into a vibrissa pad subcutaneously through implanted the polyethylene tube with 100mL Hamilton syringe. After the administration of 0.01, 0.1, 1, or 10 pg of IL-1b, we examined withdrawal behavioral responses produced by 10 successive trials of constant pressure of air puffs (4 sec duration, 10 sec interval) applied to an IL-1b injection site. Allodynia was defined as an intensity of air puffs when rats attempted to escape or aggressive behavioral responses including biting to stimulation. A NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME, 100 mg, 30 mL), a NOS inhibitor, or NG-nitro-D-arginine methyl ester (D-NAME, 100 mg, 30 mL), an inactive isomer of NAME, was administered through the implanted tube 10 min prior to injection of 10 pg IL-1b. The normal animals usually did not respond to below 25 psi pressure. The subcutaneous injection of saline had no effects on the air-puff thresholds. After the subcutaneous injection of 0.01, 0.1, 1, or 10 pg of IL-1b, the threshold of air puffs decreased significantly to 12 ± 3, 7 ± 2, 5 ± 1, or 5 ± 1 psi respectively, in a dose dependent manner. Pretreatment with L-NAME, NOS inhibitor, blocked IL-1b-induced mechanical allodynia. However, neither D-NAME, an inactive isomer of L-NAME, nor vehicle affected IL-1b-induced mechanical allodynia. IL-1b increased the number of c-fos like immunorectative neurons and pretreatment with L-NAME decreased the number of c-fos like immunorectative neurons. These results suggest that pro-inflammatory cytokines and NO are important contributors to the pathogenesis of persistent and exaggerated pain states. Based on our observation, peripheral application of NOS inhibitors may be of therapeutic value in treating pain disorders in clinic. 본 연구는 안면부위에 주입한 IL-1b가 유발하는 이질통증에서 말초 nitric oxide (NO)의 역할을 규명하기 위해 수행되었다. 이를 위하여 IL-1b에 의해 유도된 이질통증 행위반응을 이용하여 NO 합성 억제제인 L-NAME효과를 조사하였고, 흰쥐의 삼차신경 척수감각핵에서 c-fos가 면역염색되는 신경세포를 평가하여 L-NAME의 효과를 검증하였다. 실험동물로는 체중 230-280g 사이의 수컷 흰쥐 (Sprague-Dawley)를 pentobarbital sodium (40 mg/kg, i.p.)으로 마취한 다음 수술을 진행하였다. IL-1b 또는 약물을 주입하기 위해 한쪽 안면 피부 피하조직으로 polyethylene tube (PE10)를 삽입하였다. 삽입된 polyethylene tube를 통해 100 mL Hamilton syringe를 이용하여 안면 피부 피하조직으로 50 mL의 IL-1b를 주입하였다. IL-1b (0.01, 0.1, 1, or 10 pg)를 투여한 후, 일정한 압력 (4 sec duration, 10 sec interval)으로 air-puff 자극을 IL-1b 투여 위치에 연속적으로 10회 가하여 나타나는 동물의 회피반응을 관찰하였다. 이질통증은 흰쥐가 자극에 대하여 깨물기를 포함하여 회피 또는 공격적인 행동반응을 보일 때 air-puff의 세기로 규정하였다. NO 합성 억제제인 NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME, 100 mg, 30 ml)와 L-NAME의 불활성이성질체인 NG-nitro-D-arginine methyl ester (D-NAME, 100 mg, 30 ml)를 IL-1b (10 pg) 투여 10분 전에 투여하였다. 정상군은 25 psi 압력 보다 낮은 자극에서는 반응하지 않았다. 생리식염수 투여군에서는 air-puff의 문턱값(역치)에 영향을 미치지 못하였다. 그러나 IL-1b (0.01, 0.1, 1, or 10 pg) 투여하면, air-puff 문턱값은 각각 12 ± 3, 7 ± 2, 5 ± 1 또는 5 ± 1 psi로 농도의존방식으로 유의하게 감소하였다. NO 합성 억제제인 L-NAME를 전처치 하였을 때 IL-1b로 유발된 이질통증을 억제하였다. 그러나 L-NAME의 불활성 이성질체인 D-NAME과 매개체(vehicle)의 투여는 IL-1b로 유발된 이질통증에 영향을 주지 않았다. IL-1b은 c-fos 면역염색 신경세포의 수를 증가시켰고, L-NAME의 전처치는 IL-1b 투여에 의해 증가된 c-fos 면역염색 신경세포의 수를 감소시켰다. 이와 같은 결과는 pro-inflammatory cytokines와 NO가 만성통증과 통증과민현상의 발병기전에 중요하게 기여하고 있음을 제시한다. 본 연구 결과를 기초로 하여 NOS 억제제의 말초 적용은 임상적으로 통증장애를 다루는데 하나의 치료법으로 제시할 수 있다.

Polymorphisms in the Interleukin-1B and Its Receptor Antagonist Genes and the Risk of Chronic Obstructive Pulmonary Disease : Interleukin-1B 와 그 receptor antagonist gene의 다형성(Polymorphism)과 만성 폐쇄성 폐질환(Chronic Obstructive Pulmonary Disease)의 발생 위험과의 상관

강예림 경북대학교 대학원 2008 국내석사

배경 : 만성 폐쇄성 폐질환 (COPD)의 발생에 있어서 IL-1B와 IL-1RN 다형성의 역할을 이해하기 위해, 저자는 한국인을 대상으로 환자-대조군 연구를 시행하였다. 본 연구에서 저자는 4 가지 IL-1B 다형성 (-3737C>T, -1464G>C, -511C>T, -31T>C) 및 haplotype과, COPD의 발생 위험도와의 상관관계에 대하여 조사하였다. 또한 저자는 COPD의 발생 위험을 결정하는데 있어서, IL-1B 다형성과 IL-1RN VNTR (Variable Number of Tandem Repeat) 다형성 간에 상관관계에 대하여서도 연구하였다. 방법: IL-1B 다형성의 4 가지 유전자형은 중합효소연쇄반응 (PCR)과 형광 hybridization probe를 이용한 melting-curve analysis로 확인하였다. IL-1RN VNTR 다형성은 전기영동 (agarose gel electrophresis)을 이용하여 확인하였다. 결과: IL-1B -511C>T과 -31T>C 다형성중 적어도 1개의 variant allele을 가지는 경우, homozygous wild-type allele을 가지는 경우에 비해, COPD의 발생위험도 유의하게 높았다. (adjusted OR=1.53, 95% CI=1.03-2.26, P=0.03; and adjusted OR=1.50, 95% CI=1.02-2.24, P =0.04, respectively). 환자군을 COPD의 질병 중증도에 따라 분류하였을 때, 적어도 한 개의 -511T 와 -31C allele이 중증 COPD와 의미있게 연관되어 있었으나 (adjusted OR=2.80, 95% CI=1.47-5.33, P =0.002; and adjusted OR=2.33, 95% CI=1.24-4.40, P=0.01, respectively), -511C>T 및 -31T>C 유전자형과 경도 및 중등도의 COPD 간에는 의미있는 연관성이 없었다. IL-1BRN VNTR 다형성에 있어서는, IL-1RN*2 allele의 빈도가 환자군에서 대조군에 비해 의미 있게 낮았다 (2.4% vs 5.6%, P = 0.003). 최소한 한 개의 IL-1RN*2 allele을 가지고 있는 경우 COPD 위험이 유의하게 낮았다. (adjusted OR = 0.51, 95% CI = 0.26-0.98, P = 0.04). 고찰: 본 연구 결과는 IL-1B와 IL-1RN 유전자가 COPD에 대한 유전적 감수성에 기여할 것임을 시사한다. Background: In order to understand the role of IL-1B and IL-1RN polymorphisms on the risk of COPD, we carried out a case-control study in a Korean population. In this study, I evaluated the association of four IL-1B polymorphisms (-3737C>T, -1464G>C, -511C>T and -31T>C) and their haplotypes with the risk of COPD. In addition, I explored a potential interaction of the IL-1B polymorphisms with the IL-1RN VNTR polymorphism in determining the risk of COPD. Methods: Genotypes of the four IL-1B polymorphisms were determined by PCR and melting-curve analysis using fluorescence labeled hybridization probes. The IL-1RN VNTR polymorphism was genotyped using PCR followed by agarose gel electrophoresis. Results: Individuals with at least one variant allele of the -511C>T and -31T>C polymorphisms were at a significantly increased risk for COPD in comparison to the carriers with each homozygous wild-type allele (adjusted OR = 1.53, 95% CI = 1.03-2.26, P = 0.03; and adjusted OR = 1.50, 95% CI = 1.02-2.24, P = 0.04, respectively). When the cases were stratified according to disease severity, the presence of at least one -511T and -31C alleles was significantly associated with severe COPD (adjusted OR = 2.80, 95% CI = 1.47-5.33, P = 0.002; and adjusted OR = 2.33, 95% CI = 1.24-4.40, P = 0.01, respectively), whereas there was no significant association between the -511C>T and -31T>C genotypes and mild-to-moderate COPD. For the IL-1BRN VNTR polymorphism, the frequency of the IL-1RN*2 allele was significantly lower in the cases than in the controls (2.4% vs 5.6%, P = 0.003). Individuals carrying at least one IL-1RN*2 allele were at a significantly lower risk for COPD (adjusted OR = 0.51, 95% CI = 0.26-0.98, P = 0.04) Conclusions: These results suggest that the IL-1B and IL-1RN genes may contribute to a genetic predisposition to COPD.

Regulation of Interleukin-1b secretion in innate inflammatory response by NKT cell

안지예 서울대학교 대학원 2013 국내석사

IL-1b is very potent pro-inflammatory cytokine and related with many inflammatory diseases. It is essential as an early inflammation inducer to defend against foreign invaders and protect our intact integrity. But, because of its potency, unless it is finely controlled, Il-1b can cause severe inflammatory damages to our body like auto-inflammation. Natural killer (NK) T cells are a specialized subset of regulatory T lymphocytes, which share several features with NK cells. NKT cells are well-known for its regulatory function of immune response. They can boost or attenuate immune responses with different use of various cytokines and surface molecules. Until now, relation between NKT cell and its effect on IL-1b production by antigen presenting cells has not been explored deeply. Here we have investigated the interaction between macrophage and NKT cell during pathogen-free and IL-1b dependent auto-inflammation showing how NKT cells affect IL-1b production. To mimic auto-inflammatory response in body, alum and mono-sodium urate crystal were used in vitro and in vivo experiments. When aGC-activated NKT cells and macrophages were co-cultured in vitro, NKT cells can increase IL-1b secretion through soluble factors. Among various cytokines, 2 cytokines do affect IL-1b level that is, IL-4 decreases IL-1b while GM-CSF significantly increases it. In in vivo alum-induced peritonitis model, correlated results have been shown. When peritonitis occurred, activated NKT cell expressing CD 69 infiltrated into peritoneum and secreted IL-4 and GM-CSF. Our results indicate that NKT cells can be activated in an auto-inflammatory response and regulate the severity of inflammation by producing IL-4 and GM-CSF in order to control IL-1b secretion level. Although, only alum- or MSU- induced inflammation were used as inflammation models, IL-1b is also essential in many other inflammatory diseases. Therefore, our result support that by modulating NKT cell's activity and the kinds of secreted cytokines, IL-1b production and severity of inflammatory responses can be regulated. IL-1b는 아주 강력한 염증성 싸이토카인으로 다양한 염증 반응에 관련되어 있고, 외부의 침입자로부터부터 우리 몸의 고유성을 유지하기 위한 초기 면역 반응에 아주 필수적이다. 하지만 그런 강력한 영향으로 인해, 아주 미세한 분비의 조절이 이루어지지 않으면 IL-1b는 자가 염증반응과 같은 심각한 염증반응을 일으킬 수 있다. NKT 세포는 조절성 T 세포의 한 종류로 여러 면역 반응을 강화하거나 약화시키는 등의 조절기능이 잘 알려져 있다. 하지만 지금까지 IL-1b와의 관계에 대해서는 심도있는 연구가 이루어지지 않았다. 이에 본 연구에서는 IL-1b에 의존적인 비감염성 염증반응에서 NKT 세포가 대식세포에서 분비되는 IL-1b에 미치는 영향을 확인하였다. 체내에서 일어나는 자가 염증 반응을 재현하기 위하여 alum 과 mono-sodium urate (MSU) crystal을 이용하여 반응을 유도하였다. in vitro에서 aGC에 의해서 활성화된 NKT 세포를 대식세포와 함께 배양하였을 때 IL-1b의 분비가 증가되는 패턴을 보였고, NKT 세포가 분비하는 여러 싸이토카인 중에 IL-4와 GM-CSF가 관련되어 있음을 확인하였다. 두 싸이토카인은 서로 결과는 야기하였는데 즉, IL-4는 IL-1b의 분비를 감소 시켰고, GM-CSF는 아주 강력하게 IL-1b의 분비를 증가시켰다. in vitro에서 얻은 이 결과가 in vivo 에서도 적용될 수 있는지 알아보기 위해 alum을 주사하여 마우스에 복막염을 일으켜서 NKT 세포가 자연적인 상태에서도 활성되는지 확인하였다. 복막염이 유도되었을 때 많은 NKT 세포가 복강내로 모여들었으며 활성화 정도를 보여주는 세포 표면 단백인 CD69의 발현이 증가되는 것이 관찰되었다. 또한 IL-4와 GM-CSF를 분비하고 있는 것을 확인할 수 있어서 이 결과는 NKT 세포가 병원체의 침입 없이 일어나는 자가 염증 질환에 관련되며, 염증 반응에 따라 IL-4 또는 GM-CSF를 분비함으로써 반응의 정도를 조절할 수 있음을 보여준다. 본 연구에서 alum 이나 MSU이 염증을 일으키는 물질로 사용되었지만 이 외에도 IL-1b는 여러 많은 염증성 질환에서 중요한 역할을 하는 것으로 잘 알려져 있다. 따라서 본 연구의 결과는 IL-1b와 관련된 여러 염증성 질병의 치료에 NKT 세포의 조절이 이용될 수 있는 가능성을 제시한다.

꾸지뽕으로부터 추출한 당단백질의 RAW 264.7 세포에서 lipopolysaccharide (LPS)에 의해 유도된 염증과 관련된 인자들 (iNOS, COX2, IL-1b], IL-6, and TNF-a)의 조절기작에 대한 연구

朱憲領 전남대학교 대학원 2009 국내석사

Glycoprotein of Cudrania tricuspidata Bureau (CTB) was isolated from CTB fruits which have been used to heal various disorders of the injury and lung as an herbal agent in Korea since long time ago. The CTB glycoprotein was identified to have a molecular weight of 75 kDa and consists of carbohydrate (72.5%) and protein moiety (27.5%). To know inhibitory ability of the CTB glycoprotein for inflammation mediated by reactive oxygen radicals, firstly anti-oxidative activity [1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), superoxide anion, and hydroxyl radicals] of CTB glycoprotein was examined in cell free system, and then evaluated changes of inflammation-related signals [intracellular reactive oxygen species (iROS), nitric oxide (NO), nuclear factor-kappa B (NF-kB), cyclooxygenase (COX)-2, and inductible nitric oxide synthase (iNOS)], and pro-inflammatory cytokines [interleukin (IL)-1b], interleukin (IL)-6, and tumor necrosis factor (TNF)-a] in the lipopolysaccharide (LPS) (1 ug/ml)-treated RAW 264.7 cells. The results in this study showed that CTB glycoprotein (100 ug/ml) has a strong scavenging activity against DPPH, superoxide anion, and hydroxyl radicals without any pro-oxidant activity in vitro. Expressions of iROS, NO, NF-kB, COX-2, iNOS, and pro-inflammatory cytokines (IL-1b], IL-6, and TNF-a) were inhibited by treatment with CTB glycoprotein (50ug/ml) in the presence of LPS (1ug/ml). Data obtained from these experiments indicate that the CTB glycoprotein suppresses expression of inflammation-mediated factors (COX-2, iNOS, IL-1b], IL-6, and TNF-a) through regulation of NF-kB. Thus, this study provides evidence that CTB glycoprotein could be to use as an herbal agents for the treatment of inflammatory diseases.

내이세포 염증 및 소실의 분자기전과 Prednisone의 보호효과 : Molecular Mechanism on Inflammation and Loss of Cochlear Cells, and Protective Effect of Predinosone

홍화 계명대학교 대학원 2010 국내박사

감각신경성 난청은 달팽이관 내부의 청신경세포가 손상되어 약한 음에 대한 민감도가 떨어지는 경우와 뇌에 이르는 신경이 손상되거나 종양 등이 있는 경우 등이 있다. 감각신경성 난청의 원인으로는 여러 가지가 있는데 염증, 허혈성 손상 또는 ototoxic 약물 등이 알려져 있다. 하지만 지금까지 이들에 의한 감각신경성 난청의 분자적 기전은 잘 알려져 있지 않고 있다. 따라서 본 실험에서는 (1) 염증성 인자인 IL-1β 또는 저산소 처리에 따른 내이세포 HEI-OC1 에서의 여러 염증성 단백질들의 발현 여부를 관찰하였고, (2) 저산소와 또는 ototoxic 약물인 aspirin과 cisplatin 노출시켜 HEI-OC1 세포의 생존율에 대한 영향을 관찰하였고, (3) (1) 또는 (2) 에서의 PDN에 의한 항염증, 세포보호 효과 및 기전에 대해 알아보았다. HEI-OC1 세포에 IL-1β 처리하였을 때 염증성 단백질인 COX-2와 MMP-9, -13의 발현이 증가하였다. IL-1β 처리 시 extracellular signal-regulated protein kinases (ERKs), c-Jun N-terminal kinases (JNKs), p38 mitogen-activated protein kinases (MAPK) and NF-κB의 활성이 관찰되었다. 또 다른 모델 시스템인 저산소에 HEI-OC1 세포를 노출 시켰을 때 NO를 생성하는 염증성 단백질인 iNOS의 과 발현과 MMP-13의 과 발현이 관찰되었고, JNKs and PKB의 활성도 관찰되었다. PDN을 공동 처리 시 IL-1β에 의하여 과 발현된 COX-2와 MMP-9, -13이 전사단계에서 억제 되는 것을 관찰할 수 있었다. PDN은 또한 IL-1β 에 의하여 활성화된 ERKs, JNKs, and AP-1 전사인도 억제 하였다. 흥미롭게도 PDN의 ERKs와 JNKs의 활성 억제는 MKP-1을 증가함으로서 이루어짐을 관찰할 수 있었고, 이는 MKP-1 siRNA 실험을 통하여 검증하였다. PDN은 또한 저산소에 의한 iNOS의 발현증가를 부분적으로 억제하였다. 지금까지의 결과를 종합해 볼 때, 염증 혹은 저산소는 HEI-OC1 세포에서 염증인자인 COX-2/PGE₂, MMP-9, -13 혹은 iNOS/NO의 과 발현을 일으킨다. 저산소, cisplatin, 또는 aspirin은 HEI-OC1 세포의 소실을 일으킨다. 이때 PDN은 염증성 인자인 COX-2, iNOS 그리고 MMP-13의 과 발현과 내재적으로 존재하는 MMP-9를 억제할 수 있지만, 저산소, cisplatin, 또는 aspirin에 의한 HEI-OC1 세포의 소실에는 보호효과가 없음을 알 수 있었다. Hearing loss may be induced by multiple causatives such as inflammation and ischemic damage. Hearing loss is also linked to loss of auditable cells. Little is known about basic molecular and cellular mechanisms associated with hearing loss. In this study. I investigated (1) the effect of inflammatory cytokine (IL-1β) or hypoxia (1% O2) on expression of inflammatory mediators in HEI-OC1 cells, a rat auditable cell line, (2) growth suppression effect on hypoxia, cisplatin, and aspirin of HEI-OC1 cells, and (3) any modulatory effect of predinosone, a well-known steroid clinically used in the treatment of hearing loss, on the IL-1β- or hypoxia-mediated inflammatory gene expression and growth change. In HEI-OC1 cells, treatment with IL-1β led to increased expression of COX-2 and MMP-9, or -13, inflammatory enzymes involved in PGE₂ synthesis and ECM degradation, respectively, and it was due to their transcriptional up-regulation. The IL-1β treatment also elicited activation of many intracellular signaling proteins, including ERKs, JNKs, p38 MAPK, and NF-κB. In different kinetic, hypoxia treatment also induced high expression of iNOS and MMP-13 an enzyme producing NO, a toxic radical and activation of JNKs and PKB. Profoundly, treatment with predinosone strongly inhibited the IL-1β-induced expression of COX-2 and MMP-9 or -13 at their transcriptional levels in HEI-OC1 cells. Distinctly, predinosone also blocked activation of ERK-1/2, JNK-1, and AP-1 transcription factor by IL-1β. Interestingly, the predinosone-mediated inhibition of ERKs and JNKs was associated with the ability of predinosone to up-regulate MKP-1, a negative regulator of ERKs and JNKs, as confirmed by siRNA of MKP-1. Predinosone was also shown to slightly inhibit the hypoxia-induced iNOS and MMP-13 expression and the endogenous MMP-9. Moreover, the exposure of hypoxia, cisplatin or aspirin leads to growth suppressive effect of HEI-OC1 cells. However, predinosone did not protect hair cell loss induced by hypoxia, cisplatin, or aspirin. The present findings collectively suggest that the exposure of IL-1β or hypoxia into HEI-OC1 cells leads to increased expression and production of many inflammatory and cytotoxic mediators, including COX-2, iNOS, MMP-9, MMP-13, PGE₂, and NO. Moreover, the author demonstrates that the exposure of hypoxia, cisplatin, or aspirin into HEI-OC1 cells leads to growth suppression of HEI-OC1 cells. and also that predinosone may have a protect effect on hearing loss in response to those insults by blocking COX-2 and iNOS expression. Interestingly, PDN has no protective effect on the hypoxia, cisplatin, and aspirin induced growth suppression in HEI-OC1 cells.

쥐의 흑색종 세포주 B16F10에서 NLRP3 Inflammasome 활성화와 세포사멸 기전

최원석 강원대학교 대학원 2015 국내석사

종양이 발달하는 과정에서 이를 둘러싸는 미세환경은 종양세포뿐 아니라 많은 면역세포, 상피세포 등을 포함한다. 이러한 세포들에서 생성되는 사이토카인과 케모카인 등에 의해서 염증반응이 유도되고 지속적으로 일어나는 염증반응은 종양의 성생과 전이에 중요한 영향을 미친다. Inflammasome은 병원체에 대항하는 숙주의 방어기작 중 하나이며 인체의 항상성을 유지하는 역할을 하지만 종양 미세환경에서 암세포에서 유발되는 inflammasome의 역할은 잘 알려져 있지 않다. 본 연구에서는 쥐의 흑색종 세포주인 B16F10에서 NLRP3 inflammasome 활성화에 의한 세포사멸과 이에 관여하는 신호전달 기전을 밝히고자하였다. NLRP3 inflammasome을 활성화하기 위하여 lipopolysaccharide (LPS)와 adenosine triphosphate (ATP)를 B16F10 세포에 처리하였을 때 시간과 농도 의존적으로 세포사멸이 증가하는 것을 관찰하였으며 IL-1β의 생성 또한 증가하였다. Inflammasome 활성화 시 autophagy 관련 신호 전달 분자들의 발현도 증가하였다. 세포사멸 기전을 확인하기 위하여 다양한 억제제를 사용하여 P2X7 수용체를 통한 신호전달이 세포사멸의 주원인임을 검증하였다. 또한 종양 성장 시 일반적으로 나타나는 저산소 조건에서 LPS와 ATP를 처리한 경우에 종양세포의 세포사멸이 정상조건보다 감소되어 있었다. 또한 P2X7 수용체의 억제제를 처리하면 저산소하에서의 LPS와 ATP에 의해 나타나는 세포사멸로부터 회복되는 것을 통해 B16F10 세포의 NLRP3 inflammasome 생성 억제가 저산소하의 종양 미세환경에서 염증 반응에 대한 생존 전략이 될 수 있음을 시사하고 있다. 저산소 조건에 놓여있는 고형암에서 ATP는 P2X7 수용체를 통해 생성되는 ROS(Reactive Oxygen species)로 인하여 autophagy를 유도하며 항암치료제 및 보조제 개발의 기초연구로 사용될 수 있을 것이다. The tumor microenvironment is consisted of tumor cells and surrounding blood vessels, immune cells, fibroblasts, and stromal cells. The tumor and its surrounding microenvironment have a great influences on each other dynamically. As tumors release extracellular signals, such as cytokines, chemokines and growth factors, tumors promote angiogenesis and induce immune tolerance, while the immune cells in the microenvironment. Inflammasome is known as against to pathogenic multiprotein complex but its immunological activities in tumor cells is not defined well. This study was designed to verify inflammasome activation and cell death mechanism in mouse melanoma cell line, B16F10. For inflammasome activation, Inflammasome activated B16F10 cells was increased time-and dose- dependent cell death and IL-1β secretion, Inflammasome activated in B16F10 cells increase autophagy-related protein expression. To identify the cellular mechanism of improved cell death effect of ATP and LPS, expression level of the molecules related with inflammasome and autophagy were detected. The expression level of procaspase-1 and proIL-1β was not changed but secreated IL-1β protein was increased in inflammasome activated cells during nomoxia condition. When B16F10 cells were treated hypoxia condition, secreated IL-1β protein level was decreased. These B16F10 cells' death and autophagy activation was dependent on P2X7 receptor signaling. In hypoxia condition B16F10 cells treatment LPS and ATP increased cell death and ROS production compared with normoxia condition. The ratio of localization of autophagosome formation marker, LC3-II, significantly increased in LPS and ATP treated cells. These finding suggested the potential application of ATP and LPS for synergistic anti-cancer adjuvant for melanoma cancer therapy by the induction of cancer cell death in hypoxia condition.

대식세포의 염증 반응에 대한 GPR40 리간드의 양극성 효과

강병석 서울대학교 대학원 2018 국내석사

지방산은 에너지원으로 이용될 뿐만 아니라 수용체의 리간드로도 작용한다. 최근 연구에서 이들을 내인성 리간드로 인지하는 GPCR family가 밝혀졌다. 이 중 Long chain fatty-acid를 리간드로 갖는 GPCR은 GPR40과 GPR120이 알려져 있다. GPR40은 주로 이자의 베타세포나 장내분비 세포(enteroendocrine cell)에 많이 발현되어 있다. 반면 GPR120은 대식세포에 많이 발현되어 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 long chain fatty-acid의 대식 세포에 대한 영향에 대한 연구는 주로 GPR120에 초점이 맞춰져 있다. 반면, GPR40 자극이 대식 세포에 미치는 영향에 대한 연구는 미흡한 상태이다. 본 연구에서는 먼저 대식 세포에서 GPR40의 발현을 측정하고, GPR40의 선택적 리간드인 TAK-875, AM-837, AM-1638을 이용하여, GPR40 선택적 리간드의 염증 반응에 대한 역할을 평가하였다. 우선 잘 알려진 단구/대식세포주인 Raw264.7, J774.A1 세포 및 일차배양 면역세포의 GPR40 발현 여부를 확인하였다. 기존에 알려진 바와 달리 이들 세포에서 GPR40 mRNA의 발현이 확인되었다. 염증 반응에 대한 GPR40 리간드의 작용을 살펴보기 위하여 lipopolysaccharide(LPS)와 GPR40 리간드 3종을 Raw264.7 세포에 처리하였다. GPR40 리간드 처리에 따라 염증성 인자인 iNOS의 발현 감소를 확인하였으며, 이 때 TAK-875가 가장 강한 억제 작용을 보였다. 또한 TAK-875 처리시 염증성 cytokine인 IL-6, chemokine인 MCP-1의 발현 감소도 확인하였다. 한편 GPR40 antagonist인 GW1100 처리 시, TAK-875에 의한 iNOS 발현 억제가 역전되지 않았다. 따라서 GPR40 리간드에 의한 iNOS 감소 반응은 GPR40을 경유하는 작용이 아니라, TAK-875 화합물의 구조적 특성에 기인한 작용으로 보인다. iNOS, IL-6, MCP-1 등의 염증 단백질의 발현을 공통적으로 조절하는 전사인자로 NF-B가 알려져 있다. 따라서 가장 강한 항염증 효과를 보인 TAK-875를 이용하여, NF-B의 활성화에 대한 영향을 평가하였다. TAK-875를 전처리한 뒤 LPS를 처리하여 염증 반응을 유도한 뒤, NF-B 활성 조절의 상위 단백질인 IB, IKK 의 인산화를 확인하였다. 하지만 TAK-875에 의한 유의적인 변화는 관찰되지 않았다. 또한 p65의 핵질 이동에도 영향이 없는 것을 확인하였다. 따라서 TAK-875에 의한 항염증 효과는 NF-B pathway와 무관한 반응으로 생각된다. 흥미롭게도, J774.A1 세포를 이용하여 동일한 실험을 시행했을 때, iNOS의 감소가 관찰되지 않았다. J774.A1 세포의 GPR40 리간드에 의한 항염증 반응성 감소의 원인을 살펴보기 위하여 Raw264.7 세포와 J774.A1 세포의 기질적 상이점에 주목하였다. Raw264.7 세포는 inflammasome 구성 요소 중 하나인 ASC가 결손된 세포임이 알려져 있고, 실험을 통하여 이 사실을 확인하였다. 또한 Raw264.7 세포에 LPS/ATP 처리로 NLRP3 inflammasome을 활성화 했을 때에도 IL-1가 방출되지 않는 것을 확인하였다. 반면 J774.A1세포는 LPS/ATP 처리시 IL-1가 방출 되는 것을 확인하였으며, 특히 LPS 처리 이후 TAK-875 처리 시에도 IL-1가 미약하게 증가하는 것을 확인하였다. IL-1 또한 iNOS 등의 염증 단백질 발현을 유도하므로, TAK-875에 의하여 발생한 IL-1가 항염증 반응성 감소의 원인이 될 수 있다. 또한, GPR40 리간드가 NLRP3 inflammasome 활성 증폭에 영향을 주는지 확인하기 위하여, LPS 처리 후 ATP와 함께 GPR40 리간드를 동시 처리하였다. GPR40 리간드 처리군에서 현저한 IL-1의 방출 증가와 함께 IL-1의 활성화에 영향을 주는 cleaved caspase-1의 발현 증가를 확인하였다. 또한 pyroptosis 마커인 LDH 방출과 활성형 gasdermin-D의 증가를 확인하였다. 따라서 J774.A1 세포에서 GPR40 리간드가 NLRP3 inflammasome 반응 증폭을 통한 염증 증폭 효과를 일으킴을 보였다. 반면, LPS/ATP 조건에 TAK-875를 추가적으로 처리하였을 때, 골수유래 수지상세포를 대상으로 하는 실험에서는 유의한 변화가 나타나지 않았고, 일차배양 대식세포 및 Kupffer cell를 대상으로 하는 실험에서는 오히려 NLRP3 inflammasome 반응이 감소한 결과를 보였다. 따라서 면역세포마다 GPR40 자극에 따른 NLRP3 inflammasome 반응 양상이 다르다는 결론을 내렸다. 본 연구에서는 단구/대식세포주와 일차배양 면역세포에서 GPR40의 발현을 보였다. 또한, inflammasome 구성요소인 ASC가 결손된 Raw264.7 세포 및 일차배양 대식세포에서 GPR40 리간드가 항염증 효과를 보이는 것을 보였다. 한편, J774.A1 세포에서는 항염증 효과는 미미하였고, 오히려 NLRP3 inflammasome 활성 증폭을 통하여 염증 반응을 매개할 수 있음을 확인하였다. 따라서 TAK-875가 대식 세포의 염증 반응에 대하여 양극성 반응을 보일 수 있음을 제시하였다. 하지만 실제 in-vivo 조건에서 어떤 반응이 나타나는지, 어떠한 조건에서 항염증 반응과 염증 반응이 차별적으로 나타나는 지에 대한 후속 연구가 필요하다.