Fusarium 속 7종에 대한 미토콘드리아 DNA의 RFLP 분석

임경혁 한양대학교 대학원 1996 국내석사

암컷 백서에서 단백질 결핍에 따른 미토콘드리아 DNA양의 변화

김숙경 서울대학교 2000 국내박사

Electrochemical detection of single-base mismatched DNA on novel linker modified gold electrode arrays

강은경 서울大學校 大學院 2005 국내석사

미토콘드리아 DNA와 Y-STR 프로파일링을 이용한 세포치료제 원료 세포의 검증 및 유전적 안정성 분석

이동규 성균관대학교 일반대학원 2021 국내석사

세포치료제 및 유전자치료제를 포함한 첨단바이오의약품의 기본 원료물질인 세포의 특성 분석은 치료제의 개발 및 제조 과정과 품질 규격 검사에 필수적이다. 세포의 유전적 특성 분석을 위해 개발된 다양한 방법들 중에서 핵 DNA 상염색체 STR(A-STR) 분석법이 국제적인 표준 시험법으로 자리 잡게 되었다. 세포 검증(Cell authentication)을 위한 가이드라인에 의하면 두 세포의 STR 프로필의 공유 비율이 56-79%인 경우 추가 분석을 권고하고 있다. 법과학 분야에서 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 과변이부위(HVI/II)의 염기서열 분석법과 Y 염색체 STR(Y-STR) 분석법은 높은 하프로타입 다양성(haplotype diversity)을 보여주므로 A-STR 분석에 의한 세포 검증을 보조하는 수단이 될 수 있다. 본 연구에서는 대표적인 세포․유전자치료제 3종(면역세포치료제, 역분화줄기세포치료제, 성체줄기세포치료제)에 사용된 원료 세포에 대해 유전적 안정성을 검증하는 방법으로써 mtDNA 프로파일링과 Y-STR 프로파일링의 유효성을 알아보고자 하였다. mtDNA 염기서열 분석과 Y-STR 분석 결과는 표준 시험법인 A-STR 분석 결과와 마찬가지로 세포에서 제조 공정에 따른 유전적 특성 변화가 나타나지 않았으며, 세포 혼입 확인 분석에서 오염 여부 확인 및 오염원 식별을 mtDNA 염기서열 분석과 Y-STR 분석으로 확인이 가능하였다. 또한 인간 세포주 23종에 mtDNA 및 Y-STR 프로파일링을 수행하였고, 향후 세포의 mtDNA 하프로타입 및 Y-STR 프로필을 체계적으로 관리하기 위한 데이터베이스를 구축하였다. 인간 세포주에서 핵 DNA의 상염색체와 Y 성염색체 STR 분석 결과 대체적으로 무시할 수 없는 대립유전자가 다수 검출되었지만, mtDNA 염기서열 분석에서는 비교적 안정적인 것을 확인하였다. 이에 293 계열 세포주 3종(HEK-293, 293T, 293FT)의 A-STR 프로필과 mtDNA 하프로타입 비교 분석에서 A-STR 프로필의 공유 비율은 80% 미만 이였지만, mtDNA 하프로타입은 헤테로플라즈미(heteroplasmy) 없이 모두 같았다. 핵 DNA에 비해 돌연변이율이 높은 mtDNA 특성상 세포의 유전적 특성 변화가 많이 나타날 것으로 예상하였지만 본 실험 조건에서는 안정적인 것을 확인할 수 있었다. 또한 인간 세포주에서 돌연변이가 자주 발생하는 암세포의 특성이 핵 DNA에 영향을 많이 미친 것으로 보이고 mtDNA에서는 그 영향이 적어 인간 세포주에서 mtDNA의 안정성을 확인할 수 있었다. 따라서 세포 검증 및 유전적 안정성 분석에 A-STR 프로파일링의 보조 수단으로 mtDNA 및 Y-STR 프로파일링이 유용하게 쓰일 수 있을 것이라 판단하였다. Characterization of cells, the raw material of cell therapy, is essential for the development and manufacturing process. The autosomal STR(A-STR) profiling has become an international standard test for cell authentication. According to the guidelines for cell authentication, further analysis is recommended when the percent matching of the STR profiles of two cells is between 56-79%. The mitochondrial DNA(mtDNA) and Y chromosomal STR(Y-STR) profiling showed highly haplotype diversity and can be used as supplementary tests for cell authentication. In this study, the mtDNA and Y-STR profiling were performed for three representative cell and gene therapy as cell authentication and genetic stability analysis. The results of the mtDNA sequencing and Y-STR analysis, like the A-STR analysis, there was no change in genetic characteristics according to the manufacturing process in cells, and identification of contamination and contaminant could be confirmed by mtDNA sequencing and Y-STR analysis. In addition, the mtDNA haplotypes and Y-STR profilies produced from 23 commonly used cell lines were stored on in-house database, which could be used for cell authentication. Although the autosomal and Y chromosomal STR analysis resulted in a large number of alleles that could not be ignored in human cell lines, but mtDNA sequencing showed that they were relatively stable. In the comparative analysis of A-STR profiles and mtDNA haplotypes of three 293 cell lines (HEK-293, 293T, 293FT), the percent match of the A-STR profiles was less than 80%, but the mtDNA halpotypes were identical without heteroplasmy. Due to the characteristics of mtDNA, which has a higher mutation rate than nuclear DNA, it was expected that the genetic characteristics of cells would change a lot, but it was found to be stable under this experimental condition. In addition, the characteristics of cancer cells where mutations occur frequently in human cell lines seem to have a lot of influence on nuclear DNA, and the effects of mtDNA are small, so the stability of mtDNA in human cell lines could be confirmed. Therefore, the mtDNA and Y-STR profiling could be usefully used as an supplementary tests for cell authentication and genetic stability analysis.

한국산 아무르산개구리의 미토콘드리아 DNA 크기 차이의 분석

김인숙 인하대학교 대학원 1993 국내석사

한국산 아무르산개구리의 자연집단에서 발견되는 미토콘드리아 DNA의 유전자 크기와 제한효소 인식위치의 변이가 있는 두 집단인 경기도 시흥시 매화집단과 강원도 강릉집단을 선정하였다. 이들의 미토콘드리아 DNA를 총 10개의 제한효소로 처리 분석한 결과 매화집단은 21.0±0.2Kb, 강릉집단은 21.5±0.2Kb의 크기가 관찰되어 두 집단 사이에 약 0.5Kb의 미토콘드리아 DNA크기 차이가 확인되었다. 제한효소 처리 후 나타난 총 절편수는 매화집단이 24개, 강릉집단이 25개로 1개의 절편수가 차이를 나타냄은 염기치환에 기인된 것이다. 공통절편수에서는 대부분의 제한효소에서 1개의 절편이 약 0.5Kb크기차이가 있으므로 공통절편수가 13개로 큰 차이를 보인다. 이는 미토콘드리아 DNA크기 차이의 원인이 되는 부분이 특정부위에 존재함을 알 수 있다. 두 집단의 제한효소 인식위치도 절편수와 같이 매화집단은 24개, 강릉집단은 25개로 나타났으며 두 집단이 공유하는 제한효소 인식위치수는 23개로 거의 차이가 없다. 즉 제한효소인식위치에서는 보존성이 강함을 알 수 있다. 미토콘드리아 DNA크기차이가 나타난 부위와 그 유전적 기작을 알아보기 위해 이중제한효소 처리를 한 후 두 집단의 제한효소지도를 작성하여 비교한 결과 Bcl I과 Eco Rl 인식위치 사이에서 매화집단을 기준으로 했을 때는 0.5Kb절편의 삽입, 강릉집단을 기준으로 했을 때는 0.5Kb절편의 결실이 일어났다고 볼 수 있다. 절편양상분석에서 나타난 두 집단의 공통절편수(F 값)와 염기서열 분화정도(p 값)는 각각 0.531과 3.68%이고 인식위치를 기준으로한 S값과 p값은 각각 0.939와 1.044%로 나타났다. Maehwa(MH) and Kangrung(KR) populations were selected to clarify the mtDNA size difference and the restriction site variation in Rana amurensis. Mt DNAs were digested with 10 restriction endonucleases, and two types of mtDNA size were obtained from two populations. Mt DNA size in MH population is 21.0±0.2 and the other is 21.5±0.2Kb in KR population. Total number of mtDNA restriction fragment of MH and KR were 24 and 25 respectively. One fragment difference could be caused by base substituition. Because of the occurrence of 0.5Kb size difference in one fragment, the shared fragments between two types were only 13. The 0.5Kb fragment which cause mtDNA size difference is located in a specific site of mtDNA. On the other hand, total number of restriction sites were equal to restriction fragments. This result suggests that there are strong conservance in restriction sites between 2 groups, therefore their shared number of restriction sites were 23. Double enzyme digestions were performed to compare restiction maps between two types of mtDNA size difference, and the genetic mechanism of it. The addition of 0.5Kb fragment was observed between enzyme sites of Bcl I and Eco RI in KR population, or the deletion of 0.5Kb fragment in MH population. According to the restriction fragments analyses, the fragment homology(F) and the nucleotide sequence divergence(p) were 0.531 and 3.68%. Estimating from the patterns of restriction sites, the site homology(S) and the p value were 0.939 and 1.044%, respectively.

기분장애 환자에서 미토콘드리아 DNA 복제 수 및 DNA 메틸화의 역할 탐색

정재경 을지대학교 대학원 2020 국내박사

연구목적 : 본 연구는 기분장애 환자를 대상으로 말초 혈구세포 내에서 미토콘드리아 DNA 복제 수 및 DNA 메틸화의 발현상태를 포괄적으로 분석하여, 기분장애에 관여하는 분자생물학적 기전을 이해하고자 하였다. 연구방법 : 연구 대상자는 주요우울장애 환자 118명, 제Ⅰ형 양극성장애 환자 187명, 제 II형 양극성장애 환자99명이었다. 주요우울장애, 제Ⅰ형 양극성장애, 제 II형 양극성장애 각각의 질환에 대하여 연령 및 성별을 일치시킨 대조군이 모집되었다. 모집단에 대하여 말초 혈액 세포에서의 미토콘드리아 DNA 복제 수를 측정하여서, 미토콘드리아의 기능을 간접적으로 평가하였다. 또한, 주요우울장애 환자의 경우에는 미토콘드리아 복제 수의 변화를 야기할 수 있는 인자를 확인하기 위하여 peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha (PGC1α) promoter와 미토콘드리아 DNA의 displacement loop (D-loop) 부위에서 DNA 메틸화 정도의 차이를 조사하였고, 주요우울장애 환자 및 양극성장애의 다양한 임상양상과 미토콘드리아 DNA 복제 수의 관련성을 분석하였다. 결과 : 본 연구에서는 주요우울장애 환자군에서 대조군보다 말초 혈액 샘플에서 미토콘드리아 DNA 복제 수가 더 높았고, PGC1α promoter에서 DNA 메틸화 비율이 감소된 것을 확인하였다. 제 I형 양극성장애 환자군은 대조군보다 미토콘드리아 DNA 복제 수가 더 낮았으나, 제 II형 양극성장애 환자군은 대조군에 비하여 미토콘드리아 DNA 복제 수가 더 높게 나타났다. 주요우울장애 환자에서 미토콘드리아 DNA 복제수가 더 낮은 것과 유의한 관련성을 보인 변수들로는 나이가 더 많을 때, 정신 운동 초조 및 신체화 증상을 가진 경우였고, 미토콘드리아 DNA 복제수가 더 높은 것과 유의한 관련성을 보인 변수로는 체중 증가를 가진 경우가 해당이 되었다. 제Ⅰ형 양극성장애 환자군에서는 기분장애의 삽화 수가 많을 수록 미토콘드리아 DNA 복제 수가 낮아졌고, 제Ⅱ형 양극성장애 환자군에서는 기분장애의 삽화 수가 많을수록 미토콘드리아 DNA 복제 수가 높아졌다. 결론 : 주요우울장애와 양극성장애의 병태생리학에서 미토콘드리아의 기능 장애와의 연관성은 고려될 수 있으며, 주요우울장애의 경우에는 PGC1α promoter의 DNA 메틸화를 통한 후성 유전적 조절도 역할을 하는 것으로 보여진다.

Genotype-phenotype correlations of the mitochondrial DNA mutations in Leigh syndrome

나지훈 Graduate School, Yonsei University 2019 국내박사

리이 증후군은 소아기의 미토콘드리아 질환의 가장 흔한 질환군이다. 리이 증후군은 미토콘드리아 DNA 연관-리이 증후군과 핵유전자 연관-리이 증후군으로 나뉘는데, 이 둘은 유전형, 임상증상 등에서 큰 차이를 보인다고 알려져있다. 그 중에서, 미토콘드리아 DNA 연관-리이 증후군은 돌연변이 유전형 그 자체 뿐만 아니라, 이종조직성을 고려해야하기 때문에 연구에 어려움이 있다. 우리는 미토콘드리아 DNA 연관-리이 증후군에서 돌연변이 부하를 고려하여 유전형-표현형 연관분석을 시행하였다. 우리는 한국의 한 3차 의료기관에서, 임상적으로 리이 증후군으로 진단된 환자 130명에게 차세대 염기서열 분석 기술을 이용하여 전체 미토콘드리아 DNA 염기서열 분석을 수행하였다. 그 결과 27명의 환자들이 유전적으로 미토콘드리아 DNA 연관-리이 증후군으로 진단되었으며, 이들에게 돌연변이 부하를 조사하였다. 또한, 임상적인 특징, 실험실 데이터, 뇌영상들 그리고 장기간 추적검사 데이터를 정리하여 돌연변이 부하와 연관분석을 하였다. 이를 위해서 우리는 데이터 시각화 방법을 이용하여 데이터 패턴을 분석하였다. 전체 미토콘드리아 DNA 염기 서열 분석 후, 돌연변이 유전자가 확인된 미토콘드리아 DNA 연관-리이 증후군은 6개의 유전자형, 그리고 10개의 미토콘드리아 DNA 뉴클레오타이드 변이로 분류될 수 있었다. 그 중, 세 가지 주요 유전자의 돌연변이에서 돌연변이 부하 분포의 차이는 통계적으로 유의하게 차이가 있었다. MTATP6 유전자는 상대적으로 높은 돌연변이 부하를 보인 반면, MT-ND5 유전자는 상대적으로 낮은 돌연변이 부하를 보였다. 다른 유전형과 비교하여 MT-ATP6 유전자는 돌연변이 부하가 훨씬 높고, 여러가지 장기에 침범하는 양상을 보였다. MT-ND3는 뇌전증과 매우 밀접한 관계가 있다고 생각되며, 관련 병리학적 뉴클레오타이드 변화로는 m.10191T>C 가 관찰되었다. 호흡 보조제, 산소 의존성 및 장 튜브와 같은 지지 치료의 필요성은 다른 유전자형보다 MT-ND3 유전자 돌연변이 환자에게서 더 높았다. MT-ND5 유전자 (m.13513G>A)의 돌연변이를 가진 환자에서 75% (n =3)의 특징적인 심장 관련 침범이 관찰되었는데 이는 MT-ATP6 돌연변이에서 심장 관련 침범이 발견되지 않은 것과는 대조적이다. 결론적으로 우리는 이전의 여러 연구에서 발견되지 않은 미토콘드리아 DNA 연관-리이 증후군의 특징을 발견했다. 첫째, 돌연변이 부하의 분포는 유전자에 따라 다르므로 동일한 유전자 또는 동일한 뉴클레오타이드 변화에 대해 충분한 환자를 수집하면 더욱 구체적이고 일반적인 결론을 내릴 수 있다고 생각된다. 둘째, 미토콘드리아 유전형과 뉴클레오타이드의 병리학적 변이가 미토콘드리아 DNA의 일부 표현형과 관련이 있는 것으로 관찰되었다. 통계 분석의 어려움에도 불구하고 이것은 기존의 질적 분석 방법의 유전자형 - 표현형 상관 관계보다 한 걸음 더 나아간 연구이며, 이 연구는 궁극적으로 리 증후군의 임상 결과의 해석, 유전 상담 및 유전자 표적 치료를 위한 기초를 제공할 것으로 기대된다. Leigh syndrome is the most common clinical presentation of mitochondrial diseases in children and is genetically divided into mitochondrial DNA (mtDNA)-associated Leigh syndrome and nuclear gene-encoded Leigh syndrome, both of which differ in genotypes, prevalence and clinical features. The mtDNA-associated Leigh syndrome is influenced not only by the pathogenicity of the mutant gene itself, but also by the relative amounts of mutant and wild-type mtDNA, heteroplasmic mutant load. We aim to investigate the genotype-phenotype correlations by a quantitative analysis of heteroplasmic mutant load and subgrouping of genotypes in genetically confirmed patients with mtDNA-associated Leigh syndrome. We performed whole mitochondrial DNA sequencing with next generation sequencing (NGS) technology on 130 patients clinically diagnosed with Leigh syndrome in a single tertiary medical institution in Korea. As a result, mtDNA mutations were detected in 31 patients with clinical Leigh syndrome. However, four of them were excluded from this study because they had currently unverified variants in the academic literature. Finally, 27 patients with Leigh syndrome were identified as having Leigh syndrome with mtDNA mutation. The patients with genetically confirmed Leigh syndrome with mtDNA mutations were additionally tested for mutant load by NGS. We reviewed the clinical manifestations of the patients included in this study with reference to stringent diagnostic criteria for clinical diagnosis of Leigh syndrome. Laboratory findings, brain imaging (MRI, MRS) and data from long-term follow-ups are investigated for phenotype analysis. In order to investigate the relationship between genotypes and various phenotypes around mutant loads, we tried to understand patterns and relationships through scatter plots and bar-plots for data visualization. The first symptom of the patients was developmental delay or declining, which accounted for the majority of the whole (48.1%), followed by seizure (11.1%), ataxia (11.1%), hypotonia (11.1%), visual disturbance (11.1%) and gait disturbance (7.4%). Basal ganglia involvement was found in all patients regardless of the pathologic genotype or nucleotide change, and high involvement was observed in the brain stem (N = 18, 66.7%), followed by involvement of the thalamus (N = 14, 51.9%), cerebral atrophy (N = 14, 51.9%) and cerebellar atrophy (N = 12, 44.4%). The median year from diagnosis of Leigh syndrome to last follow-up was 5.4 years (ranged from 0.1 to 12.1 years). Nine patients received respiratory support (33.3%) and 10 patients deteriorated with oxygen dependence (37.0%). Nine patients (33.3%) were assisted by enteral tube feeding. After whole mtDNA sequencing, gene confirmed mtDNA Leigh syndrome could be classified as 6 genotypes or 10 mtDNA nucleotide changes. The range of mutant load of the patients ranged from 55.5 to 100%, and the median value was 96.3%. The difference of distribution of the mutant load of these three major genes was statistically significant. MT-ATP6 showed a relatively high mutant load, while MT-ND5 had a relatively low mutant load. Compared with other genotypes, the MT-ATP6 gene has a significantly higher amount of mutant load, a wider organ involvement status, and a greater number of first symptoms. In particular, MT-ND3 is thought to have a very strong association with epilepsy, and related pathologic nucleotide changes are noted as m.10191T>C. The need for supportive equipment, such as respiratory supports, oxygen dependency and enteral tubes, also were greater in MT-ND3 than other genotypes. In patients with a mutation of the MT-ND5 gene (m.13513G> A), a characteristic cardiologic involvement of 75% was observed (N = 3), which is in contrast to the absence of cardiac involvement in MT-ATP6. In conclusion, we found features of mtDNA Leigh syndrome that were not found in several previous studies. First, the distributions of heteroplasmic mutant loads vary according to the gene, so if we collect enough patients for the same gene or the same nucleotide change, we can conclude a more specific and general conclusion. Second, pathologic variants of mitochondrial genotypes and their associated pathologic nucleotide changes have newly been found to be associated with some phenotypes of mtDNA associated with Leigh syndrome. Even with the difficulty of statistical analysis, this is a further step forward than the previous genotype-phenotype correlation of existing qualitative analysis, and this study would ultimately provide a good basis for interpretation of clinical results, genetic counseling and genetic targeted therapy of Leigh syndrome.

차세대 염기서열 분석법을 이용한 한국인 미토콘드리아 전체 DNA염기서열변이 분석

김보민 연세대학교 대학원 2020 국내석사

법유전학 분야에서 미토콘드리아 DNA는 분해된 시료나 모근이 없는 머리카락과 같이 핵 DNA를 분석할 수 없는 경우에 동일 모계 확인을 위한 유용한 분석 대상이다. 그 동안의 미토콘드리아 DNA 분석은 Sanger 방식의 효율 한계 및 분석 가능한 시료 양의 제한으로 인해 조절 영역에만 집중되어 왔다. 하지만 미토콘드리아 DNA의 분석 범위를 전체 영역으로 확장하면, 조절 영역만을 대상으로 하였을 때보다 더 높은 식별력을 얻을 수 있음이 여러 연구를 통해 보고되었다. 한편, 최근 차세대 염기서열 분석법(Massively Parallel Sequencing, MPS)의 발전으로 미토콘드리아 전체 DNA를 효율적으로 분석하는 것이 가능해졌고, 기존의 Sanger 방법으로는 한계가 있었던 미토콘드리아 DNA의 이형질 변이를 분석하는 것도 보다 용이해졌다. 본 연구에서는 한국인 376명의 미토콘드리아 DNA 전체 영역을 긴 범위 PCR을 통해 두 개의 절편으로 나누어 증폭시키고, Nextera XT DNA Library preparation kit을 사용해 MPS 라이브러리를 생성하였다. MPS는 MiSeq 장비를 이용해 수행한 후, 생성된 자료는 GATK Mutect2 파이프라인을 이용해 분석되었다. 미토콘드리아 DNA의 분석 범위를 조절 영역에서 전체 영역으로 확장함으로써 조절 영역에 비해 추가로 58개의 하플로타입을 관찰할 수 있었고, 변별력 (Discrimination capacity)은 조절 영역 0.8138에서 전체 영역 0.9681로 증가하였다. 미토콘드리아 DNA 점 이형질 변이는 5%의 검출 한도로 분석되었으며 조절 영역 36개 및 암호 영역 94개로 총 130개가 관찰되었다. 가장 많이 관찰된 점 이형질 변이는 152번 위치로 총 5번 발견되었다. 미토콘드리아 DNA 길이 이형질 변이는 양방향 리드를 통합하는 기존의 MPS 자료 분석 방법으로는 한계가 있어, 단방향 리드 분석을 통해 특정화를 시도해 볼 필요가 있었다. 본 연구를 통해 미토콘드리아 DNA 식별력에 있어 전체 영역 분석의 효용성을 확인하였고, 점 이형질 변이에 대한 정보를 축적함으로서 동일인 혹은 동일 모계 판단에 유용한 정보를 제공할 수 있었다. 미토콘드리아 DNA 전체 영역에 걸친 한국인 집단의 유전학적 통계량은 법과학 실무 기초 자료로 활용될 것으로 기대된다.

임신성 당뇨환자에서 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 미토콘드리아 DNA copy 수의 정량적 분석과 미토콘드리아 A3243G 돌연변이 분석

장성운 포전중문의과대학교 2004 국내박사

임신 중 처음 발병하거나 발견되는, 임신성 당뇨병 (gestational diabetes mellitus, GDM)은 모든 임산부의 2-5%에서 발병하며, 임신성 당뇨환자들의 대부분 출산 후 정상 혈당을 유지하게 된다. 그러나 임신성 당뇨병이었던 여성은 나이가 들면서 인슐린 비의존형 당뇨병 (NIDDM, non-insulin independent diabetes mellitus)으로 진행될 수 있다. 임신성 당뇨의 감수성이 유전적인 결정요인으로 제시되고 있으나 임신성 당뇨가 발생하게 되는 유전적인 기전은 아직까지 불분명하다. 그러나 최근 연구들에 따르면 미토콘드리아의 돌연변이와의 관련성을 나타내는 여러 보고들이 있었다. 또한 미토콘드리아의 양과 관련해 인슐린 비의존형 당뇨병 (NIDDM)의 모형인 Goto-Kakizaki (GK) 쥐의 이자 섬와 미토콘드리아의 transcriptional factor A (Tfam)-defective 생쥐에서 미토콘드리아 DNA 양의 감소가 보고 되었다. 그리고 제 1형과 제 2형의 당뇨 환자의 골격근에서도 미토콘드리아 DNA 양적인 감소가 발견되었다. 본 실험에서는 임신성 당뇨환자와 정상임신 군의 혈액을 채취하여, 내재적인 reference인 28S rRNA 유전자에 대한 미토콘드리아 DNA copy수의 상대적인 비를 비교한 바, 미토콘드리아 양은 임신성 당뇨환자 군에서 1.2053±0.8307이였고 정상 임신 군에서는 1.7975±1.1355여서 임신성 당뇨환자 군에서 유의한 감소를 나타내었다 (p-value = 0.0004). 미토콘드리아 A3243G 돌연변이 분석에서 임신성 당뇨환자 68명 중에서 오직 한 명에서만 (1.47%) 미토콘드리아의 nt3243부위에서 A와 G 두 가지를 모두 갖는 비균질적인 패턴을 나타내었다. 본 연구에서는 임신성 당뇨환자 혈액에서 미토콘드리아 DNA copy 수를 실시간 중합효소연쇄반응을 이용하여 정량적으로 분석하고 임신성 당뇨환자와 미토콘드리아 DNA copy 수 사이의 연관이 있음을 나타내었으며 이를 이용하여 임신성 당뇨병의 병태생리를 밝히고, 실시간 중합효소 연쇄반응의 유효성을 검증하며, 이를 이용하여 임신성 당뇨가 의심이 되는 가임 여성을 대상으로 하는 선별검사로서의 가능성을 확인하고자 하였다. The incidence of gestational diabetes mellitus (GDM), with onset or first recognition during, varies from 2-4%. Women with gestational diabetes mellitus (GDM) are at risk of subsequent development of overt diabetes, mainly NIDDM (non-insulin-dependent mellitus), later in life. Although susceptibility to GDM has been suggested to have genetic determinant, the precise genetic basis for GDM is yet unclear. But in recent years several studies showed GDM is related with mitochondrial DNA mutations. And there are some reports that mitochondrial DNA content is specifically decreased in adult, but not fetal, pancreatic islets of the Goto-Kakizaki (GK) rat, a genetic model of NIDDM, and in mitochondrial transcriptional factor A (Tfam)-defective mice. Decreased mitochondrial DNA found in skeletal muscle of type 2 diabetic patients. Peripheral blood samples were collected from 68 patients with GDM and from 79 controls. For the quantification of mtDNA content, a comparative analysis was performed by the amplification of endogenous control (nuclear DNA, 28S rRNA). The ratio of mtDNA/28S rRNA was 1.205304±0.830688 in GDM patients and 1.797466±1.13551 in control group (p = 0.0004), respectively. Among 68GDM patients, the mutation in tRNA nt 3243 was detected in only one subject. The A3243G mutation in tRNA-Leu gene, implicated in GDM was reported in 1 of 68 (1.47%) but not in controls. In this investigation, blood samples from GDM patients using the real-time polymerase chain reaction will be applied to confirm the relationship between the mitochondrial DNA copy number and the GDM. It is hypothesized that this method will help to predict GDM, and aid in developing early diagnostic methods and treatment modalities. Key Words ; Gestational diabetes mellitus, Real time PCR, Mitochondrial DNA, Mitochondrial A3243G mutation

PNA 프로브 및 융해곡선분석에 의한 첨단바이오의약품 원료세포 미토콘드리아 DNA의 신속 스크리닝

김지윤 성균관대학교 일반대학원 2022 국내석사

전 세계적으로 세포⋅유전자치료제 등 첨단바이오의약품 시장은 빠르게 성장하고 있으며, 2025년에는 약 13.9조원 규모로 확대될 것으로 전망되고 있다. 세포치료제 등 첨단바이오의약품의 검증(cell authentication)이 매우 중요하다. 일반적으로 상염색체 STR 프로파일링이 세포 검증 및 유전적 안정성 확인을 위해 사용되고 있지만, 이를 보조하는 검증법은 많지 않다. 본 연구에서는 STR 프로파일을 보조할 수 있는 세포 검증 시험법인 미토콘드리아 DNA(mitochondria DNA) 스크리닝을 위한 PNA-융해곡선분석(Melting Curve Analysis.MCA)를 활용하고자 하였다. 6개의 PNA 프로브를 사용하여 첨단바이오의약품 3가지 세포주 NSC(Neural Stem Cell), CAR-T(Chimeric Antigen Receptor-T cell), iPSC(induced Pluripotent Stem Cells)에서 계대배양에 따른 세포 변화를 융해곡선분석을 통해 확인할 수 있는 방법을 제시하였다. 인간 미토콘드리아 DNA의 과 변이 영역인 HV1과 HV2의 돌연변이를 대상으로 하는 총 2세트의 PNA 프로브를 설계하여 수행하였다. DNA와 유사한 구조를 가진 PNA(peptide nucleic acid)는 아마이드 골격(N-(2-aminoethyl)glycine)으로 DNA보다 표적에 대한 결합력이 강하기 때문에 민감도(sensitivity)가 높아 염기서열 차이를 쉽게 분별할 수 있다. 본 연구에서 수행한 PNA 프로브 기반 미토콘드리아 DNA 스크리닝 방식은 총 2단계로 세포에서 DNA를 정제한 후 Coventional PCR 장비로 HV1⋅2 영역을 동시 증폭 후, 첫 번째 PCR 산물에 HV1 4개, HV2 2개 총 6개의 PNA 프로브를 적용하여 Real – time PCR 장비로 빠르고 정확하게 스크리닝(screening)하였다. Melting Temperature(TM 값)의 구간을 나누어 6개의 숫자로 코드화(Code화)하여 쉽게 확인하고 데이터화 할 수 있도록 하였다. 이 방법은 DNA 염기서열 분석(Sanger sequencing)보다 다량의 샘플에 적용할 시에 경제적이고, Real-time PCR 장비를 이용해 빠르고 편리하게 수행할 수 있다는 장점이 있다. PNA 프로브와 융해곡선분석을 통한 미토콘드리아 DNA 신속 스크리닝 방법은 세포 검증에 있어 STR 프로파일링을 보조할 수 있는 방법으로, 다양하고 대량의 세포를 다루는 바이오의약품 연구개발 연구소와 제조공정 및 공정관리에서 유용하게 사용할 수 있을 것이며, 또한 세포은행이나 자동유전자형분석기가 없는 상황에서 신속하게 결과를 확인하고 싶을 때 활용할 수 있을 것이다. The global high-tech biopharmaceutical market, such as cell and gene therapy, is growing rapidly and is expected to expand to about 13.9 trillion won in 2025. Cell authentication of advanced biopharmaceuticals such as cell therapy is very important In general, autosomal STR profiling is used for cell verification and genetic stability verification, but there are not many verification methods that support it. In this study, we tried to utilize PNA-Melting Curve Analysis (MCA) for mitochondria DNA screening, a cell verification test that can support STR profile. A method for confirming cell changes according to subculture in three high-tech biopharmaceutical cell lines NSC(Neural Stem Cell), CAR-T(Chimeric Antigen Receptor-T cell), and iPSC(induced Pluripotent Stem Cells) using six PNA probes through MCA was presented. A total of two sets of PNA probes were designed and performed to target mutations in HV1 and HV2, which are hypervariable regions of human mitochondrial DNA. PNA (peptide nucleic acid), which has a structure similar to DNA, has an amide backbone (N-(2-aminoethyl) glycine) and has a stronger binding force to a target than DNA. In the PNA probe-based mitochondrial DNA screening method performed in this study, DNA was purified from cells in two steps, and then the HV1,2 region was simultaneously amplified with Coventional PCR (Polymerase Chain Reaction) (PCR) equipment, total of 6 PNA probes, 4 HV1 and 2 HV2, were applied to the first PCR product, and screening was performed quickly and accurately with real-time PCR equipment. This method is economical when applied to a large amount of samples than DNA sequencing (Sanger sequencing), and has the advantage that it can be performed quickly and conveniently using real-time PCR equipment. The rapid screening method for mitochondrial DNA through PNA probe and melting curve analysis is a method that can assist STR profiling in cell validation, it will be useful in biopharmaceutical R&D labs and manufacturing processes and process control that deal with various and large amounts of cells, it can be used when you want to quickly check the results in a situation where there is no single cell bank or automatic genetc analysis.