냉장 신선육의 저장성 증진을 위한 항균 천연물소재 탐색

이수희 충북대학교 2023 국내석사

The objective of this study was to determine the inhibitory effect of natural extracts on psychrotrophic bacteria (Aeromonas hydrophila, Pseudomonas fluorescence, Brochothrix thermosphacta, Listeria monocytogenes,) in chilled carcass meat. This study was designed to investigate the antimicrobial activities of 20 natural extracts. Among 20 screened natural extracts, Rosmarinus officinalis L, Ponus denstifora. and Camellia sinensis L. showed the highest antimicrobial activity. In paper agar diffusion, 3 natural material extracts by 75% ethanol showed antimicrobial effect against A. hydrophila, L. monocytogenes and B. thermosphacta, but did not show antimicrobial effect against P. fluorescence. All 3 natural extracts showed stabilities against pH and heat. The minimum inhibitory concentration (MIC) of the natural extracts were less than 50 mg/mL, but none of the 3 natural extracts showed batericidal effect. Among the 9 natural materials showing antibacterial activities, Camellia sinensis L showed the highest total contents of polyphenol and flavonoid, DPPH and ABTS free radical scavenging. The total bacterial counts and volatile basic nitrogen (VBN) were lowered when the 3 extracts was treated on meat surface. There was no significant difference in antimicrobial activities between the selected extracts and commercial food additives. Consequently, Rosmarinus officinalis L, Ponus denstifora. and Camellia sinensis L could be possibly used to extend storage life of fresh carcass meat at chill temperature.

Functional Components and Physiological Activities of Sweet Potato (Ipomoea batatas L.) Tips and Tubers

홍채영 충북대학교 2021 국내석사

This study was conducted to evaluate the functional components, physiological activities, skin whitening, and wrinkles effect of sweet potato tips and tubers. The cultivar used in the experiment were sweet potato tips (Hayanmi, Pungwonmi, and Juhwangmi) and tubers (Sinjami and Juhwangmi) which are known to contain large amounts of lutein, β-carotene, and anthocyanidin. Antioxidant activity of ABTS and DPPH radical scavenging activities were the highest value of 3245.75 mg AAE/g and 1510.48 mg AAE/g, respectively in ‘Pungwonmi' tips. ACE inhibitory activity ranged between 47.72% in 'Sinjami' tubers and 62.25% in ‘Pungwonmi' tips at extract concentration of 10 mg/mL. α-Glucosidase inhibitory activity was highest vaule of 78.81% in ‘Pungwonmi' on the tips and was highest vaule of 62.93% in ‘Juhwangmi' on the tubers. In particular, ‘Pungwonmi' tips most effectively inhibited intracellular ROS level oxidative stress induced HepG2 cell. Nitric oxide (NO) inhibitory activity was highest value of 18.35% in ‘Pungwonmi' tips. Wound healing assay result confirmed the wound healing ability by checking the level at which the scratch was recovered after creating a scratch on the ARPE-19 cell. In the 100 µg/mL treatment, 'Sinjami' showed 75% wound healing effect. As for the wrinkle improvement effect, positive control showed 65% activity, whereas tips and tubers showed low effect with less than 10%. As for the skin whitening effect, ‘Pungwonmi' tips showed 63% activity at 10 mg/mL, which was as effective as 71% of vitamin C (1 mg/mL). These results suggest that sweet potato tips and tubers can be used to develop functional food materials with physiological activity. It also suggests that sweet potato tips and tubers can be used as whitening cosmetics materials. In conclusion, these results could increase the production and consumption of sweet potato tips and tubers, and use a beneficial material for health such as anti-hypertension, anti-diabetes, hepatoprotective, antioxidant, anti-inflammatory, eye function effect, skin whitening, and wrinkle effect.

Effect of Bezafibrate on In Vitro-maruted Oocyte Aging in Pigs

김주연 충북대학교 2021 국내석사

고지질혈증의 치료제로 지질을 낮추는 약물인 Bezafibrate는 peroxisome proliferator-activated receptor alpha의 작용제이다. Bezafibrate는 미토콘드리아 지방산 산화, 산화적 인산화, 미토콘드리아 생합성을 향상시킬 수 있다. 배란된 후에, 난자는 MII 단계에서 정지하여 수정을 기다릴 때 까지 다소 시간이 걸릴 수 있는데, 이를 배란 후 노화라고 부른다. 배란 후 노화는 DNA, 미토콘드리아 및 산화적 시스템의 분해같은 여러 질병적 증상을 나타내기 때문에, 배아 발달과 질적 능력에도 부정적 영향을 끼친다. 그러나, Bezafibrate가 이 과정동안에 미치는 영향은 밝혀진 바가 없다. 이 연구에서, 우리는 체외로 노화시킨 과정에 대항하는 Bezafibrate의 효과를 돼지의 메커니즘에서 확인하고자 한다. 노화과정동안 적절한 Bezafibrate의 농도를 첨가한 후 산화적 스트레스, 활성산소의 하류점, 미토콘드리아 생합성 및 기능을 면역형광염색법과 real-time PCR로 분석하였다. 난자와 배아에서의 결과를 살펴보면, Bezafibrate가 활성산소종을 중화하고 항산화제인 글루타치온을 향상하였다. Bezafibrate은 DNA damage인 H2A.X뿐만 아니라 산화스트레스에 의해 생성된 CASPASE 3 또한 분해하였다. 미토콘드리아의 경우 미토콘드리아/TOM20 비율과 mtDNA copy number의 감소에도 불구하고 미토콘드리아 기능과 배반포의 질적 능력이 향상되었다. 이것은 우리가 추후 확인한 바와 같이 PARKIN의 증가에 의한 것으로 확인되었다. 종합하면, Bezafibrate는 돼지 난자의 배란 후 노화를 항산화작용과 미토콘드리아 보호를 통하여 억제한다. Bezafibrate, a fibrate drug used as a lipid-lowering agent to treat hyperlipidemia, is a pan-agonist of peroxisome proliferator-activated receptor alpha. It can enhance mitochondrial fatty acid oxidation, oxidative phosphorylation, and mitochondrial biogenesis. After ovulation, oocytes may get arrested at the MII stage until fertilization beyond optimal timing, which is termed as post-ovulatory aging. Post-ovulatory aging is a disease that degrades DNA, mitochondria, and oxidative system, and has a negative impact on embryo development and quality; however, the impact of bezafibrate during this process has not been fully defined. In the present study, we assessed the ability of bezafibrate to prevent the progression of aging in in vitro conditions as well as the underlying mechanisms in pigs. An appropriate concentration (50 μM) of this drug was added, and then oxidative stress, reactive oxygen species downstream, mitochondrial biogenesis, and mitochondrial function were analyzed via immunofluorescence staining and real-time polymerase chain reaction. Bezafibrate significantly alleviated reactive oxygen species and ameliorated glutathione production simultaneously in oocytes and embryos. Moreover, it diminished H2A.X and attenuated CASPASE 3 expression produced by oxidative stress in oocytes and embryos. Furthermore, bezafibrate remarkably improved the mitochondrial function and blastocyst quality as well as markedly reduced the mitochondria/TOM20 ratio and mtDNA copy number. This led to elevated PARKIN levels. Collectively, these results suggest that bezafibrate beneficially affects against porcine post-ovulatory oocyte aging in porcine by its antioxidant property and mitochondrial protection.

화학적 처리를 통한 쓴메밀의 생리활성 증대 및 식품 산업적 활용

양진우 충북대학교 2019 국내박사

The objectives of this study are optimization conditions for deglycosylation of rutin and the enhanced biological activities of quercetin converted from rutin were investigated through cell and animal systems. This study also examined the increased physiological activity of tartary buckwheat of acid treatment through cell and animal systems. We evaluated the quality of noodles made from acid treated tartary buckwheat with increased functionality As a result, this study was confirmed that most rutin was converted to quercetin when rutin was hydrolyzed for 2 h at 80 °C using 0.5 M HCl in 80% ethanol. The 80% ethanol as solvent for reaction faster than water. This conversion of rutin to quercetin increased the antioxidant capacity, such as the radical scavenging ability, the reducing power, and the lipid peroxidation inhibitory effect. And the enhanced the antioxidant activity of acid hydrolyzed rutin was able to more effectively protect the damaged cells by oxidative stress in HepG2 liver cells. In addition, the conversion of rutin to quercetin has been shown to increase the inhibitory effect on TG accumulation and inflammation response in cell systems. This study also investigated the effect of acid hydrolyzed rutin on obese mice. As a result, the body weight gain more decreased by administration of quercetin (9.37 ± 1.01 g/7 weeks) and acid treated rutin (10.43 ± 2.30 g/7 weeks) than rutin (12.75 ± 1.74 g/7 weeks). In addition, the blood levels of triglyceride (TG) and total cholesterol and LDL-cholesterol, as well as AST and ALT levels were more decreased by administration of quercetin and acid treated rutin. These results of cell and animal systems indicate that the physiological activities of the glycoside flavonoids can be increased by chemical treatment using acid. Tartary buckwheat treated with various concentration of HCl (0.1, 0.5, and 1.0 M) increased the conversion of rutin to quercetin. These changes of flavonoid composition in tartary buckwheat by acid treatment were effected on antioxidant activities with increasing the acid concentration. The antioxidant capacity of tartary buckwheat extracts increased as the amount of quercetin increased by conversion of rutin to quercetin. The increase of antioxidant activity of acid treated tartary buckwheat increased the protective effect against oxidative stress in HepG2 liver cells. Incase of HCl of 1.0 M treated tartary buckwheat extract, reduced cell viability by TBHP (32.6%) restored about 69.7% of viability, and the ROS production decrease by about 12%. Acid treatment of tartary buckwheat more effectively inhibited lipid accumulation in adipocytes and more effectively decreased the inflammatory responses in macrophages than that not treated tartary buckwheat. This study investigated the effect of acid treated tartary buckwheat on dyslipidemia and obesity in high fat diet mice. The acid treated tartary buckwheat extracts showed better weight loss effect than not treated tartary buckwheat and it was found the effect of reducing the TG, total cholesterol and LDL-c. The decrease of LDL-c significantly decreased AI and CFR. This suggest that acid treated tartary buckwheat reduced the incidence of metabolic diseases. This study also evaluated the quality of noodles made from acid treated tartary buckwheat. As a result, when the acid treatment of tartary buckwheat, the hydrolysis of starch increased with increased HCl concentration. This was confirmed by the change of characteristics of the gelatinization and dough formation properties. These results indicate that the acid treatment of 0.5 M or less is required to maintain the properties of starch to make noodle. The antioxidant activity of buckwheat noodle increased with increased HCl concentration. When cooked noodles were made using 0.1 M concentration of HCl-treated buckwheat, the antioxidant capacity were increased about 1.4 ~ 3.4 fold compared with not treated noodle. However, high acid concentration treatment caused loss of flavonoid during cooking. These loss of flavonoid decreased the antioxidant activity of noodles. Therefore, this study indicate that appropriate acid treatment of tartary buckwheat can be used as a method for enhancing the physiological activities, while minimizing the influence of physical properties for the production of noodles. In conclusions, this study investigated how to convert glycoside flavonoids through chemical treatment using acid and applied this method for food materials to improve the functional properties of glycoside flavonoids. This results suggest new method for development of functional food materials by enhancing the physiological activities. These results provide information on potential new source of functional food for preventing or treating metabolic syndrome. 현대사회에서 식습관 및 생활패턴의 변화에 따라 비만, 당뇨, 심혈관계질환 등을 포함한 대사질환의 발병이 증가함에 따라서 이를 예방 및 치료 하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 특히 식물에서 유래한 의약품이 아닌 성분으로 부작용이 적은 소재에 대한 탐색 및 관련 기작의 규명에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 이러한 소재 중 하나인 플라보노이드는 식물이 만들어내는 2차 대사산물로서 체내에서 다양한 효능이 있는 것으로 알려져 있다. 자연계에 존재하는 플라보노이드는 대부분 단당류 또는 이당류가 결합한 배당체로 식물의 세포벽에 결합하여 존재하는 것으로 알려져 있다. 하지만 이러한 배당체의 경우 체내 당 부분이 제거 후 체내에서 이용가능하며, 또한 많은 연구를 통해 배당체에 결합한 당으로 인해 그 생리활성이 감소하는 것으로 보고되고 있다. 따라서 배당체에서 당을 제거하여 생체이용률을 증가시키고, 그 활성을 증가시키기 위한 연구가 많이 있다. 하지만 이와 관련된 대부분의 연구는 효소나 미생물을 이용한 생물학적 방법을 통해 이루어지고 있다. 생물학적 방법은 효소나 미생물에 따른 소재의 특이성에 따른 효소와 미생물 선별 및 반응의 최적화에 대한 연구가 필요하다. 하지만 산을 이용한 화학적 방법을 이용할 경우 생물학적 방법에 비하여 빠른 반응 속도, 넓은 범용성, 및 경제적 측면 등 다양한 장점들을 가지고 있다. 하지만 산을 이용한 배당체의 가수분해에 대한 연구는 아직 부족한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 자연계에 다량 존재하는 rutin을 대상으로 rutin의 비배당체 형태인 quercetin 으로 전환을 위한 산을 이용한 방법에 대하여 최적화 조건을 제시하고, 이를 통해 생성된 quercetin 의 rutin 보다 뛰어난 활성을 세포 및 동물실험을 통해 규명하고자 하였다. 또한 rutin 같은 분리된 순수물질뿐만 아니라 rutin을 다량 함유하고 있는 쓴메밀을 대상으로 산처리를 적용하여, 식품에 포함된 배당체에 대한 산처리에 의한 비배당체로의 전환을 규명하였다. 또한 쓴메밀을 대상으로 산 처리 전/후를 비교하여, 증가된 생리활성을 세포와 동물실험을 통해 규명하였다. 그 결과, 순수물질인 rutin을 0.5M HCl 을 함유한 80% 에탄올을 용매로 사용하고 섭씨 80도에서 2시간동안 가수분해 반응을 진행하였을 때, 대부분의 rutin 이 quercetin으로 전환된 것을 확인 할 수 있었다. 또한 이러한 전환은 라디칼 소거능, 환원력 및 지질의 과산화를 억제 효과 등 항산화력을 증가시켰으며, 이러한 항산화력의 증가는 HepG2 간 세포에서도 증가된 항산화력을 통해 산화적 스트레스로부터 세포를 보호할 수 있는 효과를 나타내었다. Rtin 의 quercetin으로의 전환은 3T3-L1 지방세포에서 지질축적의 주요 전사인자를 조절하여 지질의 억제효과를 증가시키는 것을 규명하였다. 그리고 이러한 플라보노이드의 구조변환은 대식세포에서 LPS로 유도된 염즘반응을 염증유발인자인 NO 및 TNF-α의 생성의 억제를 통해 염증을 완화효과를 규명하였다. 또한 세포 시스템에서 규명된 효과들이 고지방식이를 통해 비만을 유도한 쥐 모델에서도 대사질환에 대한 효과가 있는지 알아보고자 하였다. 그 결과, quercetin과 산처리한 rutin 의 경우, rutin보다 고지방식이로 유도된 체중의 증가를 더 감소시켰으며, 이러한 체중의 감소는 다양한 조직에서 지질의 축적을 억제하는 것과 연관이 있다. 또한 고지방식이로 인하여 높은 혈액 내 TG 및 콜레스트레롤의 함량을 개선시키는 효과가 더 뛰어났으며, 이와 더불어 간의 손상지표인 AST와 ALT를 낮추는 효과도 개선된 것을 알 수 있었다. 이러한 결과를 통해 배당체 플라보노이드를 비배당체로 변환을 통해 그 활서을 증가시키는 것을 규명할 수 있었다. 이러한 플라보노이드의 변환을 직접 식품에 적용하고자, rutin을 다량 함유하고 있다고 알려진 쓴메밀을 대상으로 실험한 결과, 순수물질뿐만 아니라 식품에 포함된 플라보노이드에도 영향을 미치는 것을 알 수 있었다. 1.0 M의 HCl을 이용할 경우 쓴메밀에 포함된 대부분의 rutin이 quercetin 으로 변환 되었으며, 이러한 플라보노이드의 구조적 변화는 다양한 항산화 활성을 증가시키는 것을 알 수 있었다. 또한 항산화 활성의 증가는 HepG2 간 세포에서 산화적 스트레스에 대한 보호효과를 증가시켰다. 이와 더불어 지방세포에서 지질의 축적을 억제시키고, 대식세포에서 염증의 반응을 완화시키는 것을 알 수 있었다. 또한 산처리를 한 쓴메밀 추출물을 이용하여 기존의 쓴메밀의 추출물과 비교하여 고지방식이를 한 쥐에 대한 대시질환에 대한 개선효과를 알아보고자 하였다. 그 결과 산처리한 쓴메밀 추출물이 체중의 감소효과가 더 뛰어나다는 것을 알 수 있었으며, 이와 더불어 혈액 내 지질과 관련된 다양한 지표들을 감소시키는 효과가 더 뛰어나다는 것을 규명하였다. 특히 산처리한 메밀은 LDL 콜레스테롤의 함량을 더 많이 감소시켜 AI와 CFR를 감소시켜 대사질환으로 유도된 질병에 대하여 그 발병율을 유의적으로 낮추는 효과가 있는 것을 규명하였다. 또한, 기능성이 증가된 메밀을 대상으로 국수을 만들어 그 국수의 품질을 평가하고자 하였다. 다양한 산의 농도 0.1, 0.5, 그리고 1.0 M 의 HCl을 쓴메밀에 처리 후 제분하여 중력분과 혼합하여 국수제조를 위한 전분의 특성 및 증가된 항산화 활성을 연구하였다. 그 결과, 산을 처리하였을 때, 산의 농도가 증가 할수록 쓴메밀이 가지고 있는 전분이 가수분해가 가속화되고, 전분이 가지고 있는 호화특성 및 반죽 형성에 미치는 다양한 특성들을 잃게 되는 현상이 발생하였다. 따라서 0.5 M 이하의 산 처리가 필요할 것으로 예상된다. 또한 산을 처리를 하였을 때, 식물의 세포벽의 분해에 따른 플라보노이드의 추출 효율이 증가하는 현상이 나타났으며 이에 낮은 농도의 산을 처리하였을 때에도 플라보노이드의 추출효율이 높아졌으며 이에 다른 항산화 활성도 증가하였다. 또한 0.5 M 에서 quercetin으로의 변환율이 약 35-40%으로 변환에 따라서 항산화 활성이 증가하는 것으로 나타났다. 따라서 쓴메밀에 대하여 적절한 농도의 산처리는 국수의 제조에 있어서 물성의 영향은 최소화 하면서 기능성을 높힐 수 있는 하나의 방법으로 이용 가능 할 것으로 생각된다. 따라서 본 연구는, 배당체 플라보노이드를 대상으로 화학적 처리를 통해 비배당체 플라보노이드를 얻을 수 있는 방법을 연구하고, 이를 통해 직접 식품에 적용하여 식품내 함유하고 있는 배당체 플라보노이드의 구조변환을 통해 기능성을 강화한 식품소재의 개발에 대한 방법을 제시하고 이를 통해 직접 식품을 제조하여 그 품질을 측정하여 그 가능성을 제시하고자 하였다. 또한 쓴메밀 뿐만 아니라, 배당체 플라보노이드를 다량 함유하고 있는 식품에 대한 새로운 활용방법을 제시하고, 이를 통해 농산물의 활용가치 및 부가가치의 증대가 가능 할것으로 예상된다.

곡물소재 팽화식품에서 장내유익균의 증진효과 분석 및 공초점 현미경을 이용한 부착능 평가

정명교 충북대학교 2017 국내석사

The purpose of this study was to examine the adhesiveness of beneficial intestinal bacteria to whole-grains using Confocal Scanning Laser Microscopy(CLSM), to prove prebiotic effects of whole–grains, and to develop prebiotic puffed snacks with this whole-grains. CLSM has been used to observe adhesiveness of Lactobacillus acidophillus that belongs to beneficial intestinal bacteria to whole-grain powders using optical sectioning techniques. We selected Lactobacillus acidophillus, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, Streptococcus salivarius subsp. thermophilus, and Bifidobacterium bifidum for prebiotic effect test. The enhanced effects on the growth beneficial intestinal bacteria with hot water grain extract were verified using indirect count method. Finally, we produced a puffed snack with prebiotic effect and evaluated quality by checking chromaticity, degree of hardness, a sensory test. As a result, L. acidophilus showed adhesive ability to whole–grain powders and significantly improved growth of selected beneficial intestinal bacteria were verified. The Hunter L value of developed puffed snack increased when seasoning was added. The hardness levels of the puffed snack with seasoning was higher than control. The results of a sensory evaluation revealed that the puffed snack with seasoning was highly rated in overall preference compared with the control.

Quality Characteristics and Biological Activities of Plant-based Fermented Foods Using Anti-inflammatory Probiotics

Kim, Ga Yun 충북대학교 2022 국내석사

최근 채소식품에 대한 관심이 높아짐에 따라 과일이나 채소를 발효시킨 발효식품이 건강을 생각하는 소비자들에게 큰 관심을 끌고 있다. 이 연구의 목적은 항염증성 프로바이오틱스 전달을 위한 식물성 발효 제품을 개발하는 것이다. 이를 위해 먼저 선행 연구에서 항염 효과가 우수한 Limosilacobacillus reuteri(LBRE14)를 선별하여 배추김치(CK), 나박김치(NK), 백김치(BK) 등 다양한 김치에 적용하였다. 다음으로, 항염증 활성 균주(Limosilactobacillus reuteri LBRE14, L. fermentum LBF16, L. fermentum MG7011, Leuconostoc citreum EFEL2061)를 함유한 발효 케일 주스를 개발하여 이들의 시너지 효과를 분석하였다. 그 결과 발효 7일째에 CK가 적정 pH(4.2~4.5)에 도달한 반면, NK와 BK는 발효 3일째에 적정 pH(3.9~4.2)에 도달하였다. GC/MS 분석결과 모든 김치의 초기발효에 있어서 diallyl disulfide, allyl methyl sulfide와 같은 황화물 휘발성 대사산물이 주성분인 것으로 나타났다. 또한, 히트맵 분석을 통한 휘발성 데이터의 통계적 평가는 LBRE14로 발효된 모든 발효 후 화합물이 CK에서, 에스테르 화합물이 NK에서, 벤젠 화합물이 BK에서 증가함을 보여주었다. 대사산물 분석 결과 김치는 발효 후 탄수화물이 감소하고 알코올과 유기산이 증가하는 것으로 나타났다. LBRE14 균주로 발효시킨 김치에서는 아미노산과 succinate가 공통적으로 증가하였다. 관능평가에서는 LBRE14가 있는 NK가 가장 높은 선호도를 보였으나 유의하지는 않았다. 따라서 LBRE14는 김치의 품질을 크게 변화시키지 않았다. 케일 주스의 경우 모든 균주가 8.5-9 Log CFU/mL에 도달하였고 pH는 72시간 발효 후 pH 4.6-4.7로 감소하였다. 또한 발효 후 kaempferol과 quercetin의 농도가 증가하였고 항산화 활성도 특히 LBRE14와 LBF16에서 향상되었다. 발효 케일 주스는 6.25-12.5 μg/mL 농도 범위 내에서 세포독성을 나타내지 않았으며, LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 산화질소 생성을 유의하게 감소시켰다. 또한, LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 LBRE14-KJ 및 LBF16-KJ 처리 후 염증유발 사이토카인 (IL-1ß와 IL-6) mRNA 발현량이 유의하게 감소하였고, 항염증 사이토카인 IL-10이 증가하였다. 결론적으로 LBRE14는 김치를 잘 발효시키고 김치 고유의 맛과 건강한 성분을 촉진시켜 다양한 김치에 적합한 프로바이오틱스 스타터이다. 또한 LBRE14 또는 LBF16로 발효한 케일 주스는 균주의 높은 성장률을 보이고, 플라보놀 함량 증가와 함께, 항산화 및 항염 활성을 나타내어 건강기능성 식물성 발효식품의 스타터로써 잠재력이 있어 식물 기반발효식품산업에서 유용하게 사용될 것으로 사료된다. In recent years, with the growing interest in veganism, fermented products from fruits or vegetables have been gotten considerable attention from health-conscious consumers. The purpose of this study was to develop a plant-based fermented product for delivery of anti-inflammatory probiotic. For this, firstly, Limosilactobacillus reuteri (LBRE14) which has superior anti-inflammatory effect in previous study was selected and applied to various kimchi including Cabbage-kimchi (CK), Nabak-kimchi (NK), and Baek-kimchi (BK). Secondly, fermented kale juices with anti-inflammatory activity strains (Limosilactobacillus reuteri LBRE14, L. fermentum LBF16, L. fermentum MG7011, and Leuconostoc citreum EFEL2061) were developed and their synergistic effects were analyzed. As the results, CK reached proper pH (4.2~4.5) on the 7th day, whereas NK and BK reached their proper pH (3.9~4.2) on 3rd day of fermentation. GC/MS analysis showed that sulfides volatile metabolites such as diallyl disulfide and allyl methyl sulfide were dominant compounds in the initial fermentation of all kimchi. In addition, statistical assessment of the volatile data via heatmap analysis demonstrated that fermented with LBRE14, all compounds after fermentation were increased in CK, ester compounds increased in NK, and benzenes compounds increased in BK. Metabolite analysis results showed, all kimchi samples showed a decrease in carbohydrates and an increase in alcohol and organic acids after fermentation. In kimchi fermented with LBRE14 strain, amino acids and succinate were increased in common. The sensory evaluation test revealed that NK with LBRE14 showed the highest preference, but it was not significant. Thus, LBRE14 did not significantly change the quality of kimchi. In case of kale juice, all strains reached 8.5-9 Log CFU/mL, and pH decreased to 4.6-4.7 after 72 h fermentation. In addition, the concentrations of kaempferol and quercetin were increased after fermentation, and the antioxidant activity was also improved, especially in LBRE14 and LBF16. Fermented kale juice did not show cytotoxicity within the concentration range of 6.25-12.5 μg/mL, and significantly reduced the nitric oxide production in LPS-induced RAW 264.7 cells. Moreover, mRNA expression levels of pro-inflammatory factors were significantly reduced and IL-10, an anti-inflammatory factor, was increased after treatment with LBRE14-KJ and LBF16-KJ in LPS-induced RAW 264.7 cells. In conclusion, LBRE14 is a suitable probiotic starter for various type of kimchi because it fermented kimchi well and promotes the unique taste and healthy compounds of kimchi. Moreover, LBRE14 and LBF16 show a high growth rate in kale juice, increased flavonol content, antioxidant, and anti-inflammatory activity during kale juice fermentation. Taken together, this study demonstrates that LBRE14 and LBF16 have potential as starters for health functional plant-based fermented food.

Elimination of Cryptic Plasmid in Leuconostoc citreum and its Effect on Heterologous Gene Expression

장예지 충북대학교 2019 국내석사

Leuconostoc citreum EFEL2700은 김치에서 분리되고 여러 유전대사공학 연구에서 주요한 숙주로 이용되고 있다. 하지만 해당 균주에는 원래 잠복 플라스미드 pCB42가 존재하는데 이는 유전공학 이용에 방해 요인이 될수 있다. 따라서 효율적인 유산균 발현시스템을 확립하기위해 잠복 플라스미드가 없는 L. citreum EFEL2700 균주 제작이 필요하다. 본 연구에서는 이를 위해 다음 두 절차를 따라 수행하였다. 첫번째, 류코노스톡 균주에 Cas9 엔도뉴클레이즈와 잠복 플라스미드 pCB42의 특정서열을 타겟하는 gRNA를 발현하는 킬러플라스미드(killer plasmid)를 형질전환해서 잠복 플라스미드 pCB42가 제거된 균주를 얻었다. 두번째, 앞선 균주를 항생제가 없는 배지에 연속계대배양해서 킬러플라스미드를 제거하는 방법으로 플라스미드가 없는 균주를 구축했다. 그리고 잠복 플라스미드 pCB42의 제거가 류코노스톡 균주에 어떤 영향을 주는지를 성장 속도, 탄수화물 기질 이용능, 형질전환 효율, 플라스미드 안정성, 플라스미드 카피수, 이형단백질로 발현된 β-glucosidase 활성을 비교 분석하였다. 그 결과, Cas9과 gRNA를 발현하는 류코노스톡 형질전환체의 세포추출물과 gRNA에 의해 인식되는 특정서열을 가진 PCR 단편과 반응하였을 때, 해당 PCR 단편은 절단되었다. 잠복 플라스미드 pCB42는 Cas9과 gRNA를 발현하는 킬러플라스미드를 류코노스톡 EFEL2700에 형질전환 한 후에 성공적으로 제거되었다. 그리고 킬러플라스미드를 보유한 균주를 항생제 없는 배지에서 연속적으로 계대배양하여 플라스미드가 제거된 균주를 얻을 수 있었으며, 해당 균주는 L. citreum EFEL2701 로 명명하였다. 그리고 해당 균주의 특성을 모균주인 L. citreum EFEL2700과 비교 분석하였다. 30℃ MRS 배지에서 성장속도를 측정했을 때, 유의한 차이는 보이지 않았으며, API 50CHL 키트로 탄수화물 기질 이용능을 조사했을 때 다른 점은 관찰되지 않았다. 플라스미드 pCB4270을 이용하여 형질전환효율을 비교했을 때, EFEL2700 균주는 7.7 x 10^3 CFU/μg DNA, EFEL2701 균주는 2.1 x 10^4CFU/μg DNA 로 2.8 배 높은 효율을 보였다. 그리고 pCB4270에 대한 플라스미드 안정성은 두 균주 모두 100세대 이후에도 90%의 높은 안정성을 보였다. Paenibacillus mucilagiunosus 유래된 β-glucosidase 발현 플라스미드인 pCBBgl을 각 균주에 형질전환 한 후, 플라스미드 카피 수를 측정했을 때, EFEL2701 균주가 EFEL2700 보다 약 4배 높았다. β-glucosidase의 효소활성을 측정했을 때, 잠복 플라스미드가 제거된 EFEL2701 균주가 EFEL2700보다 3.2배 높은 경향을 보였다. 결론적으로, 본 연구를 통하여 CRISPR-Cas9 시스템을 이용하면 L. citreum의 유전자를 효과적으로 잘라 제거할 수 있음을 보였고, 이렇게 잠복 플라스미드를 제거했을 때 L. citreum은 보다 높은 형질전환율, 플라스미드 카피수, 효소발현량을 보임을 알게 되었다. 그리고 본 연구에서 사용한 Cas9 및 gRNA 발현 플라스미드는 L. citreum 및 다양한 유산균에서 게놈 DNA를 편집하기 위한 유용한도구로 사용가능하다. 또한, 본 연구로서 개발된 잠복 플라스미드가 제거된 L. citreum EFEL2701 균주는 장차 다양한 생물공학 연구에서 숙주 균주로 이용될 것이다. Leuconostoc citreum EFEL2700 isolated from kimchi has been used as a host strain for genetic and metabolic engineering studies. However, the species contained a cryptic plasmid and its existence might hinder genetic engineering of the strain. In this study, L. citreum EFEL2700 which has no cryptic plasmid was created by using a DNA scissor technology and the effect of plasmid elimination was investigated on the microbial and physiological attributes of the mutant strain. For these, a plasmid-free L. citreum strain was efficiently constructed through a two-step procedure: 1) transformation of the “killer” plasmid expressing Cas9 endonuclease and a guide RNA (gRNA) targeting for a specific sequence in the cryptic plasmid, and 2) serial subculture without antibiotics for curing the killer plasmid. As results, when the cell extract of L. citreum transformant expressing Cas9 and the guide RNA was incubated with a PCR fragment containing the specific sequence recognized by the guide RNA, the PCR fragment was cleaved. The cryptic plasmid pCB42 was successfully eliminated from the host strain after transforming the plasmid harboring Cas9 and the guide RNA. After curing of the killer plasmid by serial subculture, we created plasmid-free L. citreum EFEL2700 strain and named it as L. citreum EFEL2701. Next, we analyzed the characteristics of EFEL2700 (P-cells) and EFEL2701 (F-cells) in terms of growth rate, biochemical properties, transformation efficiency, plasmid segregational stability, plasmid copy number, and β-glucosidase activity after heterologous gene expression. As results, when growth rate was measured in MRS medium at 30℃ and biochemical property was tested using API 50CHL kit, no significant differences (p>0.01) were observed. When the transformation efficiency was measured using pCB4270, F-strain showed significantly higher values (2.1 x 10^4 CFU/ μg DNA) than P-strain (7.7 x 10^3 CFU/ μg DNA). When the plasmid stability was measured after transformation of pCB4270, both strains maintained over 90% of plasmids after 100 generations. When the copy number was counted after transformation of pCBBgl which express heterologous β-glucosidase, F-strain showed 4-fold higher value than P-strain. When the β-glucosidase activity was assayed in the above experiment, F-strain showed 3.2-fold higher value than P-strain. Taken together, this study demonstrates not only the feasibility of CRISPR/Cas9-based tools to edit DNA of Leuconostoc spp. but also beneficial effects of plasmid curing on biotechnological application. L. citreum EFEL2701 developed in this study can be used as an efficient host strain for heterologous gene expression and the plasmid with Cas9 gene and gRNA can be utilized for genome editing of diverse lactic acid bacteria.

Effects of High Hydrostatic Pressure Treatment on Physicochemical Properties of Rice Flour at Different Moisture Levels

서정현 충북대학교 2021 국내석사

High hydrostatic pressure(HHP) is one of the non-thermal treatment techniques and can be used to gelatinize starch at a certain pressure. This study investigated the effect of high hydrostatic pressure(HHP) treatment on the physicochemical properties of rice, and investigated the quality characteristics of rice noodles made by HHP treated rice flour according to moisture levels in order to develop new materials for rice processed foods. Rice variety used were Samkwang variety at normal type and Shingil, Misiru, and Hangaru variety at processing type. The moisture content of rice flour was adjusted to 35-55% and treated with HHP treatment at 400-600 MPa. The water absorption capacity, solubility, and swelling power of rice flour according to the moisture levels and HHP treatment tended to increase as the moisture content and pressure increased. The 55% moisture content and 600 MPa treated rice flour of enzymatic hydrolysis and iodine blue value showed similar results for heat treatment. Scanning electron microscope(SEM) was observed low cavity, resulting in a dense structure when the moisture content or pressure is low and that the starch granules collapsed and gelatinized as the moisture content and pressure increased. X-ray diffraction was confirmed that the 23° peak indicating degree of gelatinization decreased with increasing moisture content and pressure. The HHP treated rice noodles made by the Shingil variety had the lowest moisture absorption, volume, cooking loss, and turbidity, so the cooking properties were excellent, but it was not suitable for making noodles due to its low tensile strength and hardness. Misiru and Hangaru was suitable for making noodles due to its improved cooking properties and excellent tensile strength and texture during HHP treatment. The HHP treatment of rice flour were changed that physicochemical properties according to the moisture content and pressure and affects the quality of rice noodles. This changes in properties is thought to be applicable to various foods.

Protective Effect of Edible Insects against H₂O₂-induced Oxidative Damages in Skeletal Muscle Cells

정택영 충북대학교 2021 국내석사

Oxidative stress caused by the excessive production of reactive oxygen species (ROS) is an important initiating factor in various chronic diseases. ROS are generated by muscle contraction and physical exercise in skeletals. Continuous high-intensity exercises generate high levels of ROS, which promote a skeletal muscle contractile dysfunction resulting in muscle damages and/or muscle fatigues. Edible insects contatin abundant protein of a high biological value with good amino acid profiles and high levels of digestibility. Furthermore, edible insects are a potential source of a variety of micronutrients such as minerals and vitamins. Edible insects are known to exhibit antioxidant, hepatoprotective, and antidiabetic activities. However, few investigations have reported the protective effect of edible insects on H₂O₂-induced oxidative stress in skeletal muscle cells. The aim of this study was to investigate the protective effect of edible insects on H₂O₂ induced oxidative stress in C2C12 muscle cells. The contents of total polyphenolics and flavonoids in edible insects were significantly higher in Oxya chinensis sinuosa. Edible insects showed significant protective effect on H₂O₂-induced cell damages in C2C12 cells. Furthermore, H₂O₂-induced ROS generation was markedly attenuated by pretreatment of edible insects, demonstrating that edible insects are to be a potent ROS scavenger. Edible insects significantly decreased lactate dehydrogenase and creatine kinase activity in media. Moreover, edible insects increased the protein and mRNA levels of MyHC, a marker of myscle differentiation, and increased the size of the diameter of myotubes, thereby affecting the the increase of muscle hypertrophy. These results indicate that edible insects protect skeletal muscle cells from H₂O₂-induced oxidative damages and therefore have the potential for use in health functional foods.

Bacteriocin-Producing Probiotic Enterococcus faecium EFEL8600 Isolated from Meju

김다혜 충북대학교 2022 국내석사

발효 식품과 관련된 식중독 발병이 꾸준히 보고되고 있다. 열처리는 병원성 세균을 억제할 수 있지만 김치, 소시지, 된장과 같은 비 가열 발효식품에는 적용하기 어렵다. 유산균에서 생산되는 박테리오신은 일반적으로 열에 안정하고, 가공식품에서 문제가 되는 많은 미생물의 성장을 억제할 수 있기 때문에 식품 산업에서 사용할 수 있다. 따라서 병원성 세균을 억제할 뿐만 아니라 인간에게 건강상의 이점을 주는 스타터로도 사용할 수 있는 프로바이오틱스의 개발이 필요하다. 이를 위해Enterococcus faecium EFEL8600의 프로바이오틱 특성 (안전성, 위장 안정성 및 건강 증진 효과)과 박테리오신 생산 능력을 평가했다. 한국 메주에서 분리된 EFEL8600은 위장 소화기 환경 내성과 인간 유래 장 상피 세포(Caco-2 및 HT-29)에 부착하는 능력을 가졌다. 또한, 용혈 활성, D-lactate 생성 및 담즙염 분해능은 이 균주에서 관찰되지 않았다. 그러나 EFEL8600은 tyramine을 생성하는 biogenic amine 관련 유전자를 가지고 있었으며, 항생제 내성 평가에서 erythromycin에 내성을 보였다. 건강 기능성 분석에서 이 균주는 장벽 보호, 항산화, 항염 작용 등의 건강증진 효과를 나타냈다. 또한, 이 균주는 Listeria monocytogenes를 억제하는 4.6 kDa 크기의 박테리오신을 생성하였다. Hybrid assembly sequencing를 통해, EFEL8600이 1개의 chromosome과 5개의 plasmid로 구성됨을 확인하였고, Orthologous average nucleotide identity analysis을 사용하여 EFEL8600이 E. faecium 종에 속하는 것을 증명하였다. BlastKOALA 및 VFDB는 EFEL8600의 14개의 독성 유전자와 13개의 항생제 내성 관련 유전자를 검출하였다. 발견된 항생제 내성 유전자는 prophage 영역에 위치하지 않아 낮은 전이성을 시사하였다. 또한 프로바이오틱 관련 유전자를 검출하였으며, 4개의 박테리오신 생합성 유전자 클러스터가 plasmid에서 발견되었다. EFEL8600이 생산하는 항균 펩타이드는 enterocin P와 동일한 크기의 분자량을 가졌다. 결론적으로, 이 연구는 E. faecium EFEL8600이 L. monocytogenes를 억제하기 위한 건강 증진 스타터로서 잠재력이 있음을 보여준다. Some notable outbreaks of foodborne illness associated with fermented foods have been reported. Conventional thermal treatments can inhibit pathogenic bacteria but are difficult to apply to non-heated fermented foods such as kimchi, sausage, and soybean paste. The bacteriocin, which is produced from lactic acid bacteria, can be used in food industry because they are generally heat stable and can suppress the growth of many problematic microorganisms in processed foods. Therefore, it is necessary to develop a microorganism that can be used not only as a starter to inhibit pathogenic bacteria but also as a probiotic to confer health benefits to human. In this study, we evaluated bacteriocin production capacity and probiotic property of Enterococcus faecium EFEL8600 isolated from Korean meju. E. faecium EFEL8600 produced a bacteriocin, enterocin P, with molecular weight of 4.6 kDa and it inhibited the growth of Listeria monocytogenes. EFEL8600 had tolerance to gastrointestinal conditions and ability to adhere to Caco-2 and HT-29 cells, revealing its stability and colonizing ability in human gut. In addition, this strain exhibited health-promoting effects such as high protective effects of intestinal barrier layer, antioxidant, and anti-inflammatory activities. Also, a hemolytic activity, D-lactate production and, bile salt deconjugation were not observed in this strain, showing its safety for human use. However, EFEL8600 had biogenic amine related gene and exceeded MIC cut off value in erythromycin. To understand the above physiological characteristics of EFEL8600 at the levels of genome and metabolic pathways, the whole genome sequences were analyzed. As results, EFEL8600 has one circular chromosome and five plasmids. Orthologous average nucleotide identity analysis showed that EFEL8600 belongs to the E. faecium group with above 95% similarity to E. faecium strains. Undesirable genes (14 genes) and antibiotic resistance genes (13 genes) were detected in BlastKOALA and VFDB. These antibiotic resistance genes were not located in prophage regions, suggesting low transferability to other microorganisms. In addition, probiotic related genes, such as acid or bile salt tolerance, adhesion to epithelial cells, and stress scavenging were found. Furthermore, four bacteriocin biosynthetic gene clusters were found in the plasmids of EFEL8600. Among them, a bacteriocin gene was annotated as enterocin P and its calculated molecular weight was same as the antibacterial peptide produced by EFEL8600. Taken together, this study demonstrates that E. faecium EFEL8600 is a potential lactic acid bacterium as a starter to inhibit pathogenic bacteria and also as a probiotic to confer health benefits to human.