누에 미화용 판별 마커 개발 및 새로운 형질전환 방법 구축

손봉희 慶熙大學校 2008 국내박사

The registered Penylether and Carbamate caused the silkworms to be non-spinning. The characteristics of non-spinning silkworms caused by these ingredients was similar to those of non-spinning silkworms occurred in rearing-houses. Normal silkworms should spin a cocoon at 7th or 8th day of 5th instar, whereas non-spinning silkworms in rearing-house could not spin cocoons normally and stay as larvae after 20th day of 5th instar. The characteristics of external shape was hypertrophy of body and silk gland. The two ingredients of Benzohydrazide caused body shrinking and yellowing, thinning of body segment, and transparency of body skin. Each ingredient of Thiadiazine and Triazin lines showed similar characteristics to control silkworms which showed no change of body color. The silkworms poisoned by ingredients of Benzoylurea showed apparent external shape characteristics such as breakage of body due to thinning of body skin, browning of body color, and anal prolapse. To analyze non-spinning silkworms through molecular biological approach and to develop markers for early diagnosis of non-spinning silkworms, microarray experiments were conducted using silkworm cDNA chip after inducing non-spinning silkworms by Fenoxycarb which caused similar symptoms of non-spinning silkworms in rearing-houses. The over-expressed genes were the genes related with defense mechanisms and down-regulated genes were those related with metamorphosis and ecdysis. In normal silkworms, genes related with cuticle proteins were over-expressed at 48 hr and 72 hr corresponding to 2nd and 3rd day of 5th instar. However, in non-spinning silkworms, those genes were suppressed. For stable artificial insemination of silkworms, portable insemination instrument was developed, and with this equipment collection and fertilization of semens were done at the sametime, and could reduce time and labor. The artificial fertilization ratio was 41.4%; however, it was meaningful considering the injected fluid was a mixture of semen, foreign genes, liposome and other medium. The semens used in this study were both in vesicula seminalis and bursa copulatrix. The semen collection ratio from bursa copulatrix was higher than that of vesicula seminalis. For collecting semens from moth body, it took 5 minutes in vesicula seminalis and 30 seconds in bursa copulatrix. Average volumes of collection were 4㎕/ea from vesicula seminalis and 10㎕/ea from bursa copulatrix, respectively. The collected volume was highest at 4 hours after mating. The transfer sperm was used to introduce foreign genes. into silkworms. To make transfer sperms, sperms in bursa copulatrix were mixed with DNA and liposome mixture of same volume and incubated for 1 hr in 27℃, then these sperms were used for artificial insemination. The GFP expression of commercial silkworm races were compared. All races showed more than 50% of fertilization ratio except Jam143 race. The Chinese races showed especially higher fertilization ratio than Japanese race. It is probable that the Chinese races would be suitable for artificial insemination. To develop transgenic silkworm using artificial fertilization, sperms were used as a transporter of foreign gene. The insertion of foreign gene was confirmed by PCR. The expression ratios in each generation were also compared. The expression in G0 generation was 7% and higher than those of existing methods (3 - 4%). The new system developed in this study could be applied to all races, diapause and non-diapause eggs to yield higher expression of foreign genes in silkworms. This novel transgenic silkworm production method using artificial insemination has a merit of low cost and can be very useful for mass production of transgenic silkworm. 한국의 양잠농가에서는 1995년 봄부터 고치를 짓지 않는 미화용누에가 발생하기 시작하여 ’98, ’99, 2002년 전국적으로 확대 발생하여 적지않은 경제적 피해를 입었었다. 이와같은 원인으로 춘잠기 기간, 주변에 살포된 IGR농약이 발생원인 중의 하나일 것으로 추정하였다. 이에 한국내 등록 및 시판 중인 IGR계 농약 6계통 13성분에 대한 누에영향조사를 실시하였다. 수행한 결과, 등록된 IGR계 농약 중 유약호르몬 유사체(Juvenile hormone analog)인 페닐에테르계와 카바마이트계 2계통 2성분에서 미화용누에가 유발되었다. 이 약제들에 의해 유발된 미화용누에의 특성은 농가발생 미화용누에의 특성과 일치하였다. 즉 5령7일,8일째 고치를 지어야 하나 정상적인 시기에 고치를 짓지 못하며 5령20일이후까지도 유충상태로 머물러 있으며 몸체와 실샘이 비대해해지는 외형적 특성을 갖고 있다. 벤조하이드라자이드계 2성분은 몸체축소 및 황변, 유충마디가 얇아지고 투명하게 비치는 중독증상을 보인다. 키아디아진계 및 트리아진계 각 1성분은 대조와 유사하여 체색변화는 거의 없는 중독 특성을 보여주며 벤조일우레아계 7성분은 피부가 얇아져 몸체 터짐현상이 나타나며 몸체색 갈변, 탈항잠 발생 등 농약 중독에 의한 외형적 특성이 확실히 나타났다. 이들 결과를 바탕으로 분자생물학적 연구를 통한 미화용누에 유발 원인 분석과 생리기작, 농가발생 미화용누에의 조기 판별이 가능한 마커를 개발하기 위하여 미화용누에 증상이 양잠농가 발생 미화용잠의 증상과 일치하였던 카바마이트계의 fenoxycarb를 누에에 처리하여 미화용누에를 유발한 후 누에cDNA chip을 이용하여 마이크로어레이 분석을 실시하였다. 본 연구를 수행한 결과, 과발현된 유전자는 생체방어기작 관련 genes들이었으며 과억제된 유전자들은 변태 탈피 관련 유전자였다. 정상적인 누에는 48시간째와 72시간째 5령2일째와 3일째에 cuticle protein 관련 gene이 과발현되지만 미화용누에의 경우는 이 시기에 발현되어야할 cuticle protein 관련 gene이 억제되는 결과를 보였다. 곤충의 변태 탈피 기작을 이용한 특수용도 형질전환누에를 개발하기 위하여 새로운 형질전환누에 시스템을 도입, 구축하였다. 닭 등 가금류, 소가축 등에 이용되고 있는 인공수정을 이용한 형질전환 연구를 누에 인공수정기를 이용하여 곤충에서 처음으로 누에를 재료로 하여 도입하는데 성공하였다. 인공수정기법을 이용한이 새로운 형질전환누에 생산시스템은 조작방법이 간단한 장점이외에도 기존 단점들을 모두 보완할 수 있는 획기적인 방법이다. 본 실험을 통하여 누에 정자를 매개로 하여 유전자 전이 기술의 가능성을 알아보고 특수 기능성 누에 품종 육성 및 치료용 단백질 생산 누에, 덧붙여 기존의 양잠기술에 고 부가가치를 창출할 수 있는 신 기능성 누에의 생산 연구, 더 나아가 탈피 변태 관련 gene의 이용한 형질전환누에 누에 생산 목적 등을 위한 연구에 필요한 기초자료를 확보하기 위하여 수행하였다. 수행한 결과는 다음과 같다. 안정적인 누에 인공수정 시스템을 구축하기 위하여 정액 채취 일체형 탁상용 누에인공수정기를 개발하였다. 기존 인공수정기의 경우 먼저, 스포이드로 정액을 채취한 후 다시 미세 캐필러리를 사용하여 정액을 채취한 후 인공수정하는 2단계를 거치는 불편함이 있었으나 새로 개발한 인공수정기는 정액채취기와 인공수정기 일체형으로 정액채취 후 바로 인공수정하는 1단계 시스템으로 작업시간과 노동력을 절약할 수 있었다. 누에 인공수정 실험결과, 인공수정율은 41.4%로 자연교미율 86.1%에는 못미치나, 인공수정에 이용되는 주입액이 정액외에도 외래유전자, liposome, 기타 곤충배지가 섞여있는 희석 혼합액임을 감안할 때 상대적 가치가 높은 수정효율이다. 실험에 이용되는 정액은 암나방내 교미낭의 정액과 숫나방의 저정낭내 정액을 모두 이용할 수 있었다. 정액 채취는 암나방 교미낭내 정액이 저정낭 정액보다 수율이 높을 뿐만 아니라 채취노력도 생력적이었다. 나방내 적출에서 정액 추출 시까지 소요시간 조사 결과 저정낭 5분, 교미낭이 30초정도 소요되었으며 정액수율은 평균 저정낭 4㎕/두, 교미낭 10㎕/두였다. 교미낭 내 정액 채취시기는 교미 후 4시간째가 가장 수율이 높았다. 외래유전자 도입을 위하여 운반체 정자를 개발하였다. 운반체 정자 제작은 교미낭내 정자와 DNA와 liposome이 혼합된 동량의 solution을 잘 섞은 후 27℃, 4시간 동안 incubation한 후 이를 인공수정에 이용하였으며 이방법을 이용하여 농가보급용 품종 원종 별 GFP 발현 효율을 비교한 결과, 품종 별 인공수정율은 잠143을 제외한 실용품종 모두 50%이상을 나타내었으며 특히 일본종계통보다 중국종 계통이 인공수정 효율이 높은 것으로 나타나 중국종계통이 인공수정에 적합한 품종임을 알 수 있었다. 누에의 외래유전자 도입 및 확인, 그리고 인공수정 기법을 이용하여 형질전환누에를 개발하고자, 정자를 운반체로 하여 외래유전자를 생체내 도입한 결과, 당대 암나방과 암나방이 산란한 누에알에서 외래유전자가 발현됨을 PCR 결과, 확인하였다. 이때 liposome 처리구의 발현량에 비해 무처리구의 발현량은 거의 없어 DNA에 Liposome의 첨가 유무에 따라 DNA 발현량이 달라지는 것을 확인하였다. G0세대부터 G3세대까지의 GFP 발현효율 조사 결과 G0세대에서의 발현효율(7%)은 기존 방법들(3~4%)보다 높았으며, 실험방법 및 인공수정 기술 숙련이 이루어질수록 현재의 효율보다 높은 효율을 기대할 수 있을 것으로 생각된다. 이 새로운 시스템 개발의 의의는 기존 방법의 단점을 보완한 즉, 비휴면란, 휴면란 등 계통 구분하지 않고 모든 품종에의 적용이 가능하며 기존방법보다 높은 발현효율을 나타내는 새로운 외래유전자 도입 시스템이다. 인공수정기법을 이용한 형질전환누에 생산 방법은 그 방법이 간단하고 비용이 적게 든다는 장점 외에도 기존 방법들의 효율성을 제고해 볼 때 충분히 활용할 가치가 있으며 향후 형질전환누에 생산에 있어서도 많은 결과들을 도출할 수 있다.

항바이러스성 감자 개발을 위한 분자 유전학적 연구

이홍선 조선대학교 대학원 2005 국내석사

감자(Solanum tuberosum L.)의 cyclin D3 遺傳子 cloning 및 鹽基序列의 分析 : Cloning and sequence analysis of cyclin D3 gene in potato (solanum tuberosum L.)

강인홍 成均館大學校 大學院 2002 국내박사

세포주기에는 두 개의 check point가 있는데 바로 G1/S와 G2/M 사이이며, 이를 조절하는 조절자가 존재한다. 그것이 바로 cyclin D 계열 유전자이다. cyclin D 유전자는 세포주기에서 G1기에서 S기로 transition될 때와 G2에서 M기로 지나갈 때 이를 결정하는 역할을 한다. 이미 보고된 바에 의하면 cyclin D 계열의 유전자를 over-expression했을 경우 Arabidopsis의 초기 성장이 보통의 경우 보다 잘 자라게 된다는 것을 알았다. 이런 점에 착안하여 본 실험에서는 감자에서 cyclin D 유전자를 분리하고 그 기능을 연구한 뒤 더 나아가 형질전환을 통하여 감자의 초기 생육을 촉진함으로써 감자의 수확량을 증대시키는데 그 목적을 두고 있다. 감자에서 cyclin D3 유전자를 분리하기 위하여 가지과에 속한 토마토와 담배로부터 분리되어진 Cyclin D계열의 유전자와 유사성을 검토한 뒤 그 염기서열을 바탕으로 primer를 제작하여 감자로부터 부분적인 cyc D3 유전자를 분리할 수 있었다. 또한 부분적인 cyc D3을 토대로 GenomeWalker kit를 이용하여 전체 염기서열을 찾을 수 있었다. 감자로부터 분리되어진 Sol;cycD3는 총 1881개의 nucleotides, 438개의 아미노산으로 구성되어있다. 그리고 계통분석을 해본 결과 예상대로 cyclin D3 계열에 포함되는 것을 알 수 있었으며, 토마토에서 분리되어진 cycD3.2와 유연관계가 높은 것을 알 수 있었다. 예상대로 Sol;cycD3는 세포분열이 활발히 일어나는 부분에서 많이 발현되는 것을 알 수 있었다. D­type cyclins are believed to regulate the G1 to S phase transition in response to nutrient and hormonal. Therefore D­type cyclins are key regulators of cell commitment to division. During this period, various signals that affect the cells' ability to divide must be assessed and integrated. G1 culminates in the entry of cells into S phase, when DNA replication occurs. In addition, it is likely that several types of differentiation decision may be taken by cells in the G1 phase. In both animals and plants, it appears that D­type cyclins play an important role in the cell cycle responses to external signals, by forming the regulatory subunit of cyclin­dependent kinase complexes. The phosphorylation targets of D­cyclin kinases in mammalian cells are the retinoblastoma (Rb) protein and close relatives. Unphosphorylated Rb can associate with E2F transcription factors, and then preventing transcription of genes under E2F control until the G1/S boundary is reached. The conservation of Rb and E2F proteins in plants suggests that this pathway is therefore common in all higher eukaryotes, although it is absent in fungi and yeasts. In this study, we investigated the expression characteristics of the key cell­cycle regulators, mitotic and G1 cyclins in potato (Solanum tuberosum L.). We show that three D cyclin genes and specific promoter were isolated from potato. They were classified as D3 cyclins by sequence similarities and a phylogenetic analysis. We named this as Sol;CycD3. The accumulation of transcripts was predominantly associated with mitotically active organs, such as stolons, roots, flower, leaf, and stem, and cell cultures under appropriate sugar, cyctokinin and auxin feeding conditions.

Molecular cloning and characterization of regulatory and secreted genes that respond to phosphate-starvation in rice

허연재 동아대학교 대학원 2007 국내석사

벼는 세계적으로 많이 재배되는 작물이며, 아시아 등지에서 주식으로 많이 소비되고 있다. 또한 게놈사이즈가 작아 단자엽 식물의 기능유전체학 분야에서 사용되는 모델 식물이기도 하다. 벼와 같은 식물이 생장하기 위해 는 여러 가지 영양소가 필요한데 그 중 인산은 작물재배에 있어서 매우 중요한 요소 중의 하나이다. 그러나 인산은 물에 잘 용해되지 않고 토양과 쉽게 흡착하여 식물이 쉽게 이용할 수 없다. 이러한 환경조건에서 식물은 뿌리털의 길이나 수를 늘리거나 고친화성 인산 운반체, hosphatase, RNase 등을 분비하여 여러 가지 형태학적이고 생리학적인 변화를 일으킨다. 이렇듯 식물은 여러 가지 환경 스트레스에 대해 다양한 변화를 일으켜 스스로를 보호하게 된다. 이러한 변화는 식물이 환경으로부터 특이적인 신호를 전달받는 것으로부터 시작된다. 식물의 신호전달경로에서 중요한 두가지 요소는 Ca2+와 protein kinase 이다. 본 연구는 인산결핍에 의해 유도되는 purple acid phosphatase 와 transcription factor에 중점을 두고 연구를 수행하였다. 본 연구의 결과 벼로부터 2개의 purple acid phosphatase와 3개의 transcription factor를 분리했다. purple acid phosphatase인 OsPAP1과 OsPAP2 유전자는 다른 식물 체의 purple acid phosphatase와 높은 유사도를 보였다. 그리고 유전자 구조 분석 결과 일반적으로 purple acid phosphatase가 가지고 있는 conserved metal binding domain이 존재하는 것을 확인하였으며 OsPAP1 유전자는 N-말단에 signal peptide를 가지고 있었다. transcription factor인 OsMAPK3 유전자는 다른 식물체의 MAPK 유전자들과 최고 93% 의 높은 유사도를 보였다. 그리고 다른 MAPK 유전자들과 함께 11개의 subdomain을 가지고 있는 것을 확인하였다. OsU-box 유전자는 다른 식물 유전자들과 52% 정도의 유사도를 보였고, 70개의 아미노산으로 구성된 U-box domain을 가지고 있었다. 벼 캘러스 현탁 세포를 다양한 인산결핍조건을 처리하여 각 유전자들의 발현 정도를 확인하였다. OsPAP1과 OsPAP2 유전자는 인산 결핍 3일째에서 가장 강한 발현을 보였고, 인산의 농도별 처리결과 인산이 결핍된 조건에서 강하게 발현하였다가 인산양이 증가하면서 서서히 감소하였다. OsMAPK3, OsMAPK2, OsU-box 유전자는 인산결핍 처리 후 30분에 강한 발현을 보였다가 시간이 경과할수록 발현양이 줄어들었고, 여러 가지 영양결핍 처리를 주었을 때 특이적으로 인산과 철의 결핍에서만 강한 발현을 보였다. 식물체 내에서 이들 유전자의 조직특이적인 발현을 위한 실험을 수행한 결과 OsPAP2, OsU-box, OsMAPK3 유전자는 인산이 결핍된 뿌리에서 강하게 발현하였고 OsMAPK2 유전자는 대체적으로 뿌리에서 발현하 였으며 OsPAP1 유전자는 여러 번의 반복 실험에서도 전혀 발현하지 않았다. OsPAP1과 OsPAP2 유전자는 baculovirus-system을 이용하여 유전자가 삽입된 재조합 단백질을 얻어 SDS-PAGE에서 단백질 발현을 확인하였다. OsPAP1, OsPAP2, OsU-box, OsMAPK3 유전자는 벼와 애기장대에 형질 전환시켜 형질전환체를 얻었으며, PCR과 Northern blot을 통하여 유전자 과발현 계통을 선발하였다. 형질전환된 OsPAP2 애기장대는 pNPP를 이용하여 효소활성을 측정하였고, 그 결과 형질전환식물체의 효소활성이 야생종보다 2배정도 높은 것을 확인하였다.

양식장으로부터 quorum quenching 균주의 분리 및 Rhodococcus sp. BH4 유래 AHL-lactonase 유전자들에 관한 연구

유두환 배재대학교 대학원 2018 국내석사

Bacteria recognize changes in their population density by sensing the concentration of signal molecules, N-acyl-homoserine lactones (AHLs). AHL-mediated quorum sensing (QS) plays a essential role in virulence in pathogenic bacteria, so the interference of QS, called as quorum quenching (QQ), has received great attention. A QQ strategy can be applied to development of alternative anti-infective agent for preventing bacterial disease. In particular, close correlation between QS and biofilm formation related to fish pathogen has been reported. In this study, we isolated diverse AHL-degrading bacteria from fish farms that can inhibit biofilm formation. Samples were collected from the fish farm of the National Institute of Fisheries Science (NIFS) and the fish farm near Geumriver. Enrichment culture method containing AHL as the sole carbon source was used for the screening of quorum quenching bacteria. Diverse AHL-degrading strains of Enterococcus sp., Raoultella sp., Dermacoccus sp., Bacillus sp., Paenarthrobacter sp., Microbacterium sp and Rhodococcus sp. were identified by 16S rDNA sequence analysis. The isolated strains were characterized for their QQ activities and analyzed for hemolytic activity. As a result, The strain with high AHL degrading activity and non-hemolytic activity was finally selected, which is Rhodococcus sp. GLH1. Rhodococcus sp. GLH1 was genetically very similar to Rhodococcus sp. BH4. Besides a known AHL- lactonase (QsdA) of Phosphotriesterase (PTE) type, we found an additional gene for a QQ enzyme from sequenced genome of Rhodococcus sp. BH4. The putative QQ enzyme of Rhodococcus sp. BH4 showed 46% and 45% amino acid sequence identities with AHL-lactonase and AHL-acylase (AidH and AiiO) from Ochrobactrum sp. T63 and Ochrobactrum sp. A44, respectively. In this study, we revealed that the QQ enzyme gene named jydB encodes an AHL-lactonase through AHL restoration experiment and HPLC analysis using the recombinant E. coli. Several completely unrelated families of enzymes with AHL-lactonase activity, including metallo-β-lactamase, phosphotriesterase (PTE), α/β hydrolase, and GDSL-like hydrolase, have been described. The deduced amino acid sequence of the BH4 AHL-lactonase analyses revealed that it shares many of the known characteristics of α/β hydrolases fold family. The G-X-Nuc-X-G motif or the histidine residue conserved in α/β hydrolases is known as a critical point for the AHL- degradation activity. Although, many bacteria possess only a single type of quorum-quenching enzyme, Rhodococcus sp. strains have been reported to possess activities for AHL-lactonase, AHL-acylase and oxidoreductase. In this study, we have identified the presence of different type of AHL-lactonase besides QsdA in Rhodococcus sp. BH4. High AHL-degrading activity and prominent biofilm inhibition capacity of Rhodococcus sp. BH4 compared to other QQ strains may be due to the presence of multiple QQ enzymes including two types of AHL-lactonases aside from the AHL-acylase and oxidoreductase. 세균은 상호 간의 의사소통을 위한 신호 분자로서 N-acyl-homoserine lactones (AHLs)를 사용한다. 세균의 quorum sensing (QS) 시스템은 자신이 세포 외로 분비하는 AHL의 농도를 감지함으로써 동료 세균들의 밀도 변화를 인식하고, 밀도 의존적으로 다수의 유전자 발현을 조절한다. AHL을 매개로 하는 quorum sensing 시스템은 많은 병원성 세균에서 병독성 유전자 발현 유도에 핵심적인 역할을 하기 때문에, 이러한 QS 시스템을 차단하는 quorum quenching (QQ) 전략이 많은 관심을 받고 있다. 따라서 QQ 전략은 세균 감염을 억제하기 위한 대체 항감염제의 개발에 응용할 수 있는데, 특히 양식 어류의 세균병과 관련되어 QS과 대표적 병독요소인 생물막 형성 사이에는 아주 밀접한 관계가 있다고 보고되고 있다. 본 연구에서는 양식장에서 어병과 관련된 QS 차단 및 생물막 형성 억제를 위한 전략으로서 양식장 유래 QQ 균주를 탐색하였다. 국립수산과학원의 넙치 시험용 양식조와 금강 주변의 양식장에서 sample을 채취하여 AHL을 분해하는 세균들을 분리하였다. 분리된 AHL 분해 미생물들의 16S rDNA 염기서열을 분석한 결과 국립수산과학원의 양식조로부터 Enterococcus sp., Raoultella sp., Dermacoccus sp. 및 Bacillus sp. 균주를 분리하였고, 금강 주변의 양식장에서는 Paenarthrobacter sp. Microbacterium sp. 및 Rhodococcus sp. 균주를 분리하였다. 분리된 균주 모두 높은 AHL 분해활성을 보였으며, AHL 분해활성이 가장 우수하고 용혈성을 띄지 않는 균주를 최종 선별하여 Rhodococcus sp. GLH1으로 명명하였다. Rhodococcus sp. GLH1의 16S rDNA 분석 및 특정 QQ 효소 유전자의 분석 결과 기존 실험실 분리 QQ 균주인 Rhodococcus sp. BH4와 유전적으로 매우 유사한 균주임을 확인하였다. Rhodococcus sp. BH4의 전장 유전체 분석 결과를 이용하여 in silico 분석을 통해 기존에 보고된 Phosphotriesterase (PTE) type의 AHL-lactonase 이외에 추가적인 QQ 효소의 존재를 확인하였다. 새로운 QQ 효소를 암호화하고 있는 유전자 (No. 1288)의 아미노산 서열은 AHL-lactonase(AidH) 및 AHL-acylase(AiiO)와 각각 46% 및 45%의 동일성을 보였다. 본 연구에서는 유전자 No. 1288을 jydB로 명명하고 대장균에서 발현하여 효소 반응 후 반응산물에 산을 첨가하여 AHL 복구 실험 및 HPLC 분석을 통해, 추가적 QQ 유전자가 암호화하는 효소는 최종적으로 AHL-lactonase 임을 확인하였다. 또한 JydB의 아미노산 서열 및 추정되는 활성부위 분석결과 α/β hydrolase superfamily의 AHL-lactonase 와 많은 특징을 공유하는 것을 확인하였다. 따라서 본 연구를 통해 Rhodococcus sp. BH4는 기존에 알려진 PTE type의 AHL-lactonase 이외에 α/β hydrolase type의 AHL-lactonase를 가지고 있음을 규명하였다. 궁극적으로, Rhodococcus sp. BH4가 가지고 있는 여러 다양한 QQ 효소 중에서 유전적으로 아직 밝혀져 있지 않은 AHL-acylase 와 oxidoreductase 이외에 서로 다른 두 가지 type의 AHL-lactonase를 동시에 가지고 있음을 규명하였다.

Thermus caldophilus GK24로부터 耐熱性 β-galactosidase 遺傳子의 cloning 및 發現

유진상 성균관대학교 대학원 1997 국내석사

내열성 효소는 산업적으로 유용하게 이용할 수 있다. 특히, β-galactosidase는 유당을 가수 분해하여, galactosidase는 유당을 가수 분해하여, galactose와 glucose를 생산하는 효소이며, transgalactosylation의 활성을 갖고있어 올리고당(oligosaccharides)을 합성할 수 있는 효소이다. 이와 같은 효소 활성에 내열성을 추가하게 되면 산업적인 이용 가치는 더욱 증가된다. 내열성 β-galactosidase를 탐색하기 위하여 9종의 호열성 균주를 대상으로 β-galactosidase 활성을 조사하여 상대적으로 활성이 매우 높은 Thermus caldophilus GK24(Tca)를 선발하였다. 선발된 T. caldophilus GK24(Tca)를 선발하였다. 선발된 T. caldophilus GK24(Tca) β-galactosidase는 표준배지에 lactose,galactose,cellobiose를 첨가한 배지에서 유도할 수 있었다. 다양한 농도로 위의 기질들을 첨가함으로써 최적생산 조건을 조사한 결과 최적 유도 배지는 0.3 % bactotryptone과 0.3% yeast extract,basal, salts, 10mM Tris/HCl buffer(pH 7.8)에 기질로써 0.2% cellobiose를 첨가한 것이었다. Tca β- galactosidase의 정제는 최적 유도 조건에서 배양한 균체를 회수 및 파쇄하여 60% ammonium sultase 로 농축 후, DE32 anion exchage, PABTG(p- aminobenzyl-β1,4-D-galactopyranoside) affinity column chromatography 및 Rotofor cell을 이용하여 정제하였다. 정제된 효소의 기질 특이성은 다양하여 ONPG 와 PNPG및 lactose, cellobiose를 모두 가수분해하는 능력을 나타내었다. 또한 Km값은 ONPG 와 PNPG 에서 각각 2.6mM 0.107mM이였다. 정제된 Tca β- galactosidase의 N-말단 아미노산 서열을 결정하고, 이를 바탕으로 한 oligonucleotide probe를 제작하였다. 이를 probe로 하여 southern hybridization과 rehybridization과정을 통하여 pTBS (0.6 kb) pTBL(1.7kb) pTS(1kb)를 cloning하였고, 이들 clone의 restriction map을 작성하여 subcloning하였다. 이렇게 만들어진 subclone들의 DNA 염기서열을 결정한 결과, Tca β- galactosidase 유전자는 1296 nucleotodes의 open reading frame(ORF)를 포함하여, 48,628 Da의 단백질을 coding하는 것으로 나타났다. 결정된 염기서열을 바탕으로 하여 DNA sequence 상에서 Tca β- galactosidase coding region의 N-말단과 C-말단 쪽의 primers를 합성하여 PCR을 수행하였다. 1.3kb 크기의 PCR 산물을 발현 벡터 pUC18,pJR2,pTRP2에 ligation하여 E.coli XL1-Blue에 clonig하여 발현시켰으며 정제한 Tca β- galactosidase와 동일한 크기의 효소가 생산됨을 확인하였다. On the respect of industrial application, thermostable enzyme is very useful. Because β -galactasidase can hydrolyze lactose into galactase and glucose, and can catalyze transgalactbsylation resulting oligosaccharides, we can expect synergy effects of the enzyme application with tkerrnostability. fAermus cgfdofAifus GK24 was selected as sources of thermostable β -galactosidase from a survey of genus fHermus strains. f, ccfdofAifus GK24 (fog) β -galactosidase was found to be inducible and enzyme induction was achieved by addition of lactose, galactose and cellobiose to basal media. fog was tested for production of β -galactosidase by addition of various concentration of lactose, galactose and cellobiose to standard media. The optimal induction medium for production of β -galactosidase was composed of 0.2% cellobiose, 0.3% bactotryptone, 0.3% yeast extract, basal salts and Tris/HCl (pH 7.8). Sonicated crude extract of cells containing Tca β- galactosidase was purified by 60% ammonium sulfate precipitation and using DE32 anion exchange, PABTG affinity column chromatography and Rotofor cell. Molecular weight of the purified enzyme was 53,000 Da and existed monomeric form. We could observe an extraordinary substrate specificity of the enzyme that it could hydrolyze each β -1,4-galactusidic linkages and β -1,4-glucosidic linkages. Amino acid serluencing of the enzyme was performed and oligonucleotide probe for hybridization was synthesized based on the N-terminal sequence. Southern analysis was used for cloning of Tca β- galactosidase gene and we could get the clones, PTBS, PTBL, pTS. These clones were restricted by various restriction endonuclease. We made subclones based on the restriction map. Nucleotide sequence analysis of Tca β- galactosidase gene revealed a 1296 nucleotide open reading frame (ORF) encoding a protein with a Mr of 47,400Da. For the expression of fm f -galactosidase gene, we synthesized the N-terminal and C-terminal primers for PCR and PCR amplified fragments were cloned to 3, oofi XLI-Blue by the vector puc18, pJR2, PTRP2. This material is based on work supported by Daesang Central Research Institute.

Aminoglycoside-(3)-N-acetyltransferase Ⅱ 유전자의 Promoter 부위에 관한 연구

신창호 한양대학교 1992 국내석사

증금속 환원성 미생물로부터 Chromium(VI) 환원성 효소 유전자의 분리 및 형질전환 담배 개발

진태은 한림대학교 대학원 2000 국내석사

Chromium can exist in various oxidation states from -2 to +6, with +3 and +6 being the most stable forms. Hexavalent chromium compounds are considered to be extremely toxic, mutagenic, and carcinogenic. The reducing the hexavalent ion level of the compounds is very important for the protection against the environmental damage. Recently it is reported that some bacteria reduced the chromium(VI) to chromium(III) and resulted in significant reduction of the toxicity, The enzyme of chromium(VI) reductase reduces the compounds to the relative stable and non-toxic chromium(III) state. A chromium reductase gene was cloned a NADH-dependent chromium(VI) reductase gene from heavy metal reducing bacteria Pseudomomas aeruginosa HP014. For the construction of the binary vector, chromium reductase gene was subcloned into plant transformation vector pBinAR. The pBinAR-rtd contains the chimeric gene casette encoding the duplicated CaMV35s, chromium(VI) reductase gene and terminator of octopine. The chromium(VI) reductase gene was transferred to tobacco plant by leaf disk infection via A. tumefaciens. Tabacco leaf disks were cultured with A. tumefaciens (pBinAR-rtd) for 2 days and selected on the culture medium containing 300mg/l kanamycin, 500mg/l carbenicillin, 1.0mg/l NAA and 0.1mg/l BA, respectively, After 4 weeks, it was observed that shoots were induced from leaf disks. And it was observed that roots was induced 2 weeks later on the root inducing medium. Hybridization experiments demonstrated that the Cr (VI) reductase gene was located and expressed in the regenerated plants. The Cr (VI) reduction activity showed that the transgenic plants may be an another way to reduce the pollution of the toxic Cr (VI) in environment.

벼 잡종세대의 유전분석

박희근 동아대학교 대학원 2007 국내석사

벼 육성 재료로는 밀양183호, 밀양165호, 일미벼, 신동진벼, 동진찰벼, 사사니시끼, 고시히까리 등 7품종과 밀양165호☓일미벼, 일미벼☓밀양 165호, 밀양183호☓사사니시끼, 일미벼☓신동진벼, 동진찰벼☓고시히까리, 밀양165☓동진찰벼 등 6개 교배조합에서 19계통의 F4세대를 사용하여 초장, 지엽장, 지엽폭, 수장, 분얼수, 1수립수, 등숙율, 1000립중 및 10a당 수량 등 9개 형질을 조사하였다. 그리고 F4세대의 계통 및 교배친에 대한 생육 및 수량형질을 유전분석한 결과는 다음과 같다. 1. 교배모본의 생육 및 수량특성에서는 초장은 고시히까리가 가장 길었으며, 수장은 신동진벼와 동진찰벼가 길었고, 지엽폭은 신동진벼가 1.74㎝로 가장 넓었다. 1수립수는 신동진벼가, 등숙율은 밀양165호가, 1000립중은 밀양165호 및 신동진벼가 높았다. 10a당 수량은 신동진벼가 595.55㎏으로 가장 높았다. 2. 교배조합간 생육 및 수량특성은 초장에서는 일미벼×밀양165호의 조합에서 가장 길었고, 지엽장 및 지엽폭은 교배조합간 유의성은 인정되지 않았다. 1수립수는 일미벼×밀양165호의 조합에서 많았고, 1000립중 및 수량은 동진찰벼×고시히까리의 조합에서 높게 나타났다. 3. 교배모본과 교배조합간의 유전분산, 환경분산 및 유전력을 비교한 결과 전체적으로 유전분산이 환경분산보다 높게 나타났다. 교배모본의 유전분산은 단위면적당 생산량이 가장 높았으며, 유전력은 1수립수가 99.90%로 높았다. 교배조합별 유전분산 및 유전력은 단위면적당 생산량이 가장 높았다. 4. 교배모본에 대한 형질간의 표현형상관과 유전상관을 분석한 결과는 1수립수와 천립중, 지엽장과 10a당 생산량, 1수립수와 10a당 생산량, 천립중과 10a당 생산량에서 유의한 정의 상관을 나타냈으며, 초장과 지엽장, 초장과 10a당 생산량은 유의한 부의 상관을 나타내었다. 5. 교배조합별의 각 형질에 대한 표현형 상관과 유전상관을 분석한 결과는 초장과 지엽장, 1수립수와 10a당 생산량에서 유의한 정의 상관을 나타내었으며, 수장과 천립중이 유의한 정의 상관을 나타내었으며, 초장과 분얼수는 유의한 부의 상관을 보였다. 그리고 수량형질인 천립중은 10a당 생산량과 는 유의하지 않았으나 정의 상관을 보였다.

I-SSR 표지자에 의한 안면도 소나무 천연림의 모수 및 차대 층위별 유전변이

문희종 고려대학교 대학원 2009 국내석사

소나무 천연집단에서 층위별 유전 다양성의 차이를 분석하기 I-SSR 표지자를 이용하여 안면도 내 모수 집단인 상층임분과 천연갱신된 하층임분 및 치수층으로 (3개 층위) 구성되어 있는 3개 지역을 조사하였다. 선정된 7개의 primer를 이용하여 384개 개체를 분석한 결과, 총 66개의 I-SSR 변이체가 관찰되었다. 발견된 전체 199개 대립유전자 중에 희귀 대립유전자 비율이 최소 16.5%에서 19.0% (평균 17.8%)에 달했다. 상층임분의 대립유전자 중 하층임분에서 1~2개 대립유전자가 손실되었고 1~4개 대립유전자가 생성되었다. 대립유전자의 차대 손실은 해당 모수층에서 선택된 수목이 차대임분에서는 종자 생산을 하지 않았거나 차대임분 수목의 표본추출시 누락됨으로 인한 결과일 가능성이 높아 보인다. 이형접합율의 기대치 (h) 및 Shannon's information index (S.I.)를 이용하여 모수집단 및 차대집단간 유전 다양성의 경향을 볼 때, 기존 다른 수종에 대해 이행된 연구들과 마찬가지로 모수층과 차대임분간 뚜렷한 차이는 발견되지 않았다. 그러나 근소하게나마 상층임분에서 하층임분으로 갈수록 증가되는 경향을 보이고 있었고, 치수층에서도 하층임분보다는 낮으나 상층임분보다는 높은 값을 나타냈다. 본 연구의 이러한 결과는 실제로 치수층의 유전다양성이 낮아졌다기보다는 최소 10년 이상의 연령폭을 가진 모수층 및 하층임분과 비교하여 치수층 연령이 1~2년생에 불과한 점과 함께 편향된 공간확보로 인해 전체 모수가 아닌 일부 모수에서만 하종되었을 가능성이 있어 보인다. AMOVA를 이용하여 유전적 분화를 분석한 결과, 지역간 유전적 분화는 거의 없는 반면, 층위간 유전적 분화는 2.6%로서 상대적으로 결코 적다고 볼 수 없으므로, 본 조사결과를 근거해 볼 때 유전적 분화가 무시될 정도로 동일한 공간적인 분포를 가지더라도 층위별 유전적 분화는 상당 부분 발생된다는 점을 추정해 볼 수 있었다. 유전적 거리값을 이용한 유집분석 결과도 지역보다는 층위에 따라 묶이는 경향을 보이고 있었다. 본 조사와 같이 차대임분에서 모수층에는 없던 새로운 대립유전자가 발견된 경우는 주변 소나무 집단으로부터 화분 확산이 가장 주요한 원인으로 보이는데, 유집분석시 치수층이 유전적으로 가장 이질적이며 차대임분에서 새로운 대립유전자의 빈도가 대부분 5%이상으로 높게 나타나고 채종원과 가까운 JJ 지역의 차대집단에서 새로운 대립유전자가 상대적으로 많은 것을 고려해 볼 때, 약 30년 전에 조성된 주변 소나무 채종원을 통해 기존 유전자와 다른 변이를 가진 화분이 유입되었을 가능성도 생각해볼 만하다. 현재 안면도 소나무림은 치수층이 추후 2~3년에 걸쳐 지속적으로 하종이 일어난다 하더라도 모수층을 대표할 만한 충분한 수의 개체에서 발생되지 않을 것으로 보이는 바, 소나무의 유전다양성을 유지하기 위해서는 인위적인 천연갱신 작업이 필요할 것으로 사료된다. To analyze the temporal genetic diversity and difference in the natural populations of Pinus densiflora, three cohorts of the maternal stands (adults) and their natural progenies (juveniles and natural regenerations) were investigated in three regions of Anmyondo. The genetic diversity and difference of selected cohorts were analyzed using the inter-simple sequence repeat (I-SSR) markers. As a result, 66 I-SSR variants from selected 7 primers were observed in 384 individuals. The rare alleles of 16.5% to 19.0% (mean of 17.8%) at the total 199 alleles that were found in the investigated populations were detected. While 1~2 alleles were not transferred from maternal stands to their progenies, 1~4 alleles were created in progenies. The lost alleles of progenies might be caused by collecting different seeds or no seeds production from progenies of selected maternal trees. As the results of similar studies, the genetic variation of progeny cohorts was found in the similar level compared with the genetic variation of the observed maternal cohorts. However, the genetic variation showed an increasing tendency in juveniles and decreased in natural regenerations. Particularly, the lower gene diversity of natural regenerations was caused by relatively restricted age of 1~2 years and biased space in investigated natural regenerations. As a result of analysis of molecular variance (AMOVA) test of each cohorts, the genetic differentiation (2.6%) among temporal cohorts within investigated regions was occurred little, compared with the genetic differentiation among those regions. These results imply that the temporal genetic variation can be appeared, even if pine stands are distributed closely to each other in Anmyondo. Clustering analysis using unweighted pair-group arithmetic average (UPGMA) also combined into cohorts rather than regions. The occurrance of new alleles in the progenies may be due to the external pollen spreading from surrounding populations. It means that a pollen flow may be from the neighboring seed orchard of Japanese red pines planted before approximately 30 years, in the aspect that natural regenerations were different from the others by clustering analysis using the UPGMA methods, band frequency of new alleles was mostly higher than 5%, and new alleles occurred relatively in progeny cohorts of JJ region located closely in seed orchard of Japanese red pines. Although the seeds of Japanese red pines in Anmyondo might have been shed continuously for 2~3 years, the enough number of individuals representing maternal stands would have not be generated. Therefore, it is needed to regenerate Japanese red pines artificially for keeping up its genetic diversity.