Optimization of cationic gelatin/alginate coacervates for topical delivery of miR-497

유영운 차의과학대학교 일반대학원 2023 국내석사

[ABSTRACT IN KOREAN] miR-497의 국소 전달을 위한 양이온성 젤라틴/알긴산 코아세르베이트의 최적화 <지도교수 김 애 리> 차의과학대학교 대학원 약학과 유 영 운 최근 miRNA는 다양한 질병의 치료제로서 주목을 받고 있다. miRNA는 특정 유전자를 대상으로 하여 치료 효과를 나타낼 수 있어, 효과적인 치료제로 간주되어 왔다. 그러나 miRNA의 효과적인 세포 내 전달은 여러 가지 제약 요인으로 어려움을 겪고 있는 상황이다. 본 연구에서는 CG/SA coacervates를 이용한 효과적이고 안전한 miRNA 전달 시스템을 개발하였다. 입자 크기, 다분산 지수, 제타전위, 봉입률 등의 기준을 근거로 최적의 조성물인 LC.Coa-ED x0.5, x1, x2는 뛰어난 전달 효율과 함께 염증성 사이토카인 수준을 유의하게 감소시켰다. 이러한 결과는 coacervates가 miRNA 전달 시스템으로서 큰 잠재력을 가지고 있음을 시사한다. 그러나 당뇨병성 마우스 상처 치유 실험에서는 coacervate의 적용이 큰 효과를 나타내지 못했다. 따라서 이러한 만성 상처 치료에 대한 효과를 향상시키기 위해 epidermal growth factor (EGF)나 fibroblast growth factor (FGF)와의 조합 등 다른 치료제들과의 연구가 필요할 것으로 사료된다. 핵심 되는 말 : miR-497, 코아세르베이트, 양이온성 젤라틴, 알긴산, 에틸렌다이아민, 항염증, 상처 치유. [Abstract] Optimization of cationic gelatin/alginate coacervates for topical delivery of miR-497 Youngun Yu Department of Pharmacy The Graduate school CHA University (Directed by Professor Aeri Kim) microRNAs have gained increasing attention as potential therapeutic agents for various diseases. They possess the ability to target disease-causing genes, making them promising and specific therapeutic agents. However, effective delivery of miRNAs into cells poses several challenges, including nuclease degradation, unstable pharmacokinetic parameters, and limited cell membrane permeability. In this study, CG/SA coacervates were explored as an efficient and safe delivery system for miR-497. The optimal coacervate formulations, LC.Coa-ED x0.5, x1, and x2, demonstrated remarkable transfection efficiency and significant reduction in pro-inflammatory cytokine levels. These findings highlight the potential of coacervates as miRNA delivery systems. However, in the in vivo wound healing assay conducted on diabetic mice, the application of coacervates did not yield substantial improvement in wound closure. These results suggest that combination with other therapeutic agents such as epidermal growth factor or fibroblast growth factor may be more effective for chronic wound healing. Keywords: miR-497, Coacervates, Cationized gelatin, Sodium alginate, Ethlylenediamines, Anti-inflammation, Wound healing

cloning, Expression and Purification of Arylsulfate Sulfotransferase, α-L-Arabinosidase and β-D-Glucosidase From Intestinal Anaerodes

김보미 경희대학교 대학원 2007 국내석사

Bifidobacterium longum H-1 이 생산하는 두종류의 a-L-Arabinosidase의 클로닝, 발현 및 정제 경희대학교 대학원 약학과 미생물및 면역학 전공 석사과정 김보미 (지도교수)김동현 인삼 ginsenoside의 주요성분인 ginsenoside Rc를 대사시킬수있는 두 종류의 α-L-Arabinosidase가 사람의 장내 세균인 Bifidobacterium longum H-1 으로부터 크로닝되었다. 기존에 보고 된 Bifidobacterium longum 균주의 염기서열로부터 각각 두종류의 Primer 가 제작되었고, 이로부터 PCR 한 결과 각 효소들의 염기서열이 밝혀졌다. Sequencing 결과, 두종류의 α-L-Arabinosidase 의 염기서열은 각각 1548bp, 1569bp 임이 알려졌다. 기존에 알려진 Bifidobacterium longum 과는 각각 99%,99%의 homology 를 보였다. 이들 gene들은 발현 vector 인 pET-39b(+)에 삽입되었으며, E. coli BL21(DE3)에 형질전환되었고, 발현된 효소들은 His Bind Column Chromatography에 의해 정제되었다. 이들의 specific Activity는 각각 3.16,3.33 mmole/min/mg이었다. 이제조합효소는 p-nitraphenyl-α-L-Arabinosidase와 and ginsenoside Rb2는 대사시키지 못하였지만, p-nitraphenyl-α-L-Arabinosidase와and ginsenoside Rc를 ginsenoside Rd 로 대사시켰다

압타머 복합체 형성과 신규 리포좀 캐리어 시스템을 이용한 비타민 C의 안정성 및 피부 흡수 개선 연구

박동우 단국대학교 대학원 2021 국내석사

(국문초록) 압타머 복합체 형성과 신규 리포좀 캐리어 시스템을 이용한 비타민 C의 안정성 및 피부 흡수 개선 연구 단국대학교 대학원 약학과 제약산업 전공 박 동 우 지도교수 : 강 명 주 비타민 C (ascorbic acid, Vit C)는 피부조직에서 콜라겐 생성 및 촉진, 산화적 손상으로부터 보호하는 항산화 역할, 피부 방어기능을 강화하는 작용을 하지만 외부환경에 쉽게 분해되며 낮은 피부 흡수의 문제점이 있다. 본 연구는 Vit C/aptamer complex(complex), liposomal system이 Vit C의 안정성, 피부흡수 등에 미치는 영향을 평가하였다. 먼저, Vit C에 aptamer를 결합하여 물리적 복합체 (complex)를 형성하여 화학적 안정성을 개선하였지만, 피부 전달 또는 흡수에 미치는 영향이 보고된 바 없다. 본 연구에서는 안정성을 개선하고, 피부 투과 또는 전달을 촉진하기 위한 방안으로 Oil을 포함한 Liposome 제형을 설계하고 평가하였다. Ethanol injection method를 이용하여 Lipo-oil-some(LOS)을 제조하였으며, 조성으로는 Phospharidylcholine(PC), DPPG, cholesterol, tricaprylin을 사용하였다. PC는 20mg/ml, DPPG는 1 mg/ml, cholesterol은 2 mg/ml, tricaprylin은 10 mg/ml로 Lipo-oil-some을 제조하였으며, vit C가 약 35% 탑재되었으며, 크기는 1 ㎛ 내외이며, cryo-tem을 통하여 성상을 확인하였다. 제조된 LOS는 광안정성 평가를 통해 빛에 대한 안정성을 확인하였으며, sink condition에서 신속한 용출패턴을 나타냈다. 돼지피부에서 피부 투과 및 침적 양상을 평가한 결과 기존 복합체의 투과율인 20% 보다 낮은 10% 정도로 투과양상이 나타났으며, 복합체에 비해 유의적인 개선은 보이지 않았다. 그러므로, 피부 투과도를 개선할 수 있는 oil을 선정하는 추가 연구가 필요할 것으로 생각된다.

Expression, Purification and Characterization of Long-chain Acyl-

박보람 영남대학교 대학원 2013 국내석사

석사학위논문 Streptomyces toxytricini의 장쇄 Acyl-CoA Carboxylase 유전자의 발현 및 이의 특성 연구 박보람 영남대학교 대학원 약학대학 약학과 (지도교수 남 두 현) 요 약 문 Acyl-CoA carcoxylase (ACCase)는 지방산과 같은 1차 대사산물, 또는 Polykeptide와 같은 2차 대사산물의 생합성 관여하는 효소이다. Streptomyces toxytricini는 lipase 저해 활성화를 가진 비만치료제로 사용하는 lipstatin을 생산하는 균주로, tetradecadienoyl CoA와 octanoyl CoA가 결합하여 lipstatin을 생합성하는 것으로 알려져 있으며, 이 때 octanoyl CoA의 활성화에 ACCase가 관여할 것으로 추정된다. ACCase는 α subunit과 β subunit로 구성되어 있으며 α subunit에는 biotin이 결합되어 활성화된 후, 이 biotin에 carboxyl기를 포집하여 β subunit인 carboxyl-transferase에 의한 acetyl-CoA 또는 propionyl-CoA와 같은 유기산 α-carbon에 carboxyl기를 도입하도록 한다. Lipstatin 생산균주인 Streptomyces toxytricini로부터 ACCase 복합체를 지령하는 유전자로 추정되는 10.6kb 와 7.4kb 크기의 유전자군이 발견되었다. 10.6kb 유전자 조각에서는 pccB, accA3 및 pccE 유전자가 발견되었으며, 7.4kb 조각에서는 accD1 및 accA1 유전자가 존재하였다. 따라서 본 연구에서는 이 두 종의 ACCase 복합체의생화학적 특성을 조사하기 위해, 상기 5개 유전자를 대장균의 발현 운반체인 pET28a(+) vector 또는 pGEx4T-3a vector에 클로닝하여 발현시키고, 재조합 단백질들을 각각 Ni2+ affinity column chromatography 또는 gluthatione Sepharose 4B를 이용한 친화성 크로마토그래피법으로 정제하였다. 정제된 ACCase complex를 대상으로 기질 특이성을 조사한 결과, AccA1/AccD1 complex는 acetyl-CoA 및 propionyl-CoA 모두 carboxylation시켰지만, AccA3/PccB complex는 propionyl-CoA 만 carboxylation시켰고, acetyl-CoA 는 carboxylation시키지 못했다. 이로부터, AccA3/PccB complex는 장쇄의 acyl-CoA를 carboxylation시키는 ACCase임을 확인할 수 있었다.

Identification of GSPT1 as a Regulator of Apoptosis Signal-regulating Kinase 1 (ASK1) : 단백질 상호 작용에 의한 Apoptosis Signal-regulating Kinase 1 (ASK1)의 조절자인 GSPT1 의 동정

Lee, Jung A Graduate School Chungnam National University 2005 국내석사

Apoptosis signal-regulating kinase 1 (ASK1), a member of mitogen-activated protein (MAP) kinase kinase kinase family, is a Ser/Thr kinase that plays a critical role in mediating apoptosis signals initiated by a variety of death stimuli, such as hydrogen peroxide and TNF-??. Due to its critical role in inducing apoptosis, ASK1 activity is tightly regulated by various mechanisms such as posttranslational modification and protein-protein interaction. In this study, to characterize the mechanism of ASK1 signal regulation, we searched for ASK1-interacting proteins using the yeast two-hybrid screening method. Several clones were found and one of them was identified as a GSPT1. The GSPT1 protein is essential for the G1 to S phase transition of cell cycle, and has function as a polypeptide chain release factor 3 (eRF3). We show that ectopically expressed GSPT1 interacts with ASK1-induced apoptotic activity. However, the interaction between two proteins is independent of hydrogen peroxide, a stimulator of ASK1, suggesting that the expression level of GSPT1 is the key factor for regulating ASK1. GSPT1 also increases the transactivation activity of cJUN that is a downstream transcription factor of the ASK1-mediated apoptotic signal transduction pathway. In vitro kinase assay data show that GSPT1 enhances ASK1 autophosphorylation and its kinase activity on MKK6. Phosphorylation of cJUN was increased with the increasing amount of GSPT1 in the presence of ASK1. Overexpression of GSPT1 inhibits the binding of ASK1 to the 14-3-3 protein, a well-known ASK1 inhibitor, while GSPT1 has no effect on the interaction between ASK1 and TRAF2, a C-terminal binding activator of ASK1. The result suggest that GSTP1 activates ASK1 by acting as a competitive inhibitor of the 14-3-3 protein. Taken together, our results provide a novel role GSPT1 in regulating ASK1-mediated apoptosis. Apoptosis signal-regulating kinase 1 (ASK1)은 mitogen-activated protein kinase kinase kinase (MAPKKK) family 에 속하는 키나아제로 Ser/Thr 키나아제이다. 이것은 사이토카인과 산소성 스트레스에 의해 유도되는 세포사멸에서 중요한 역할을 한다. ASK1 의 활성은 유전자 번역 후 과정에서 일어나는 변형과 단백질-단백질 상호 작용과 같은 다양한 기작에 의해 조절된다. 본 연구에서 우리는 ASK1 신호 조절 기작의 보다 세밀한 이해를 위해서 ASK1 과 상호 작용하는 단백질을 효모 이중 보합을 통해 동정하였고 이렇게 동정 된 단백질 중 하나가 GSPT1 이다. 현재 GSPT1 은 세포주기에서 G1 에서 S 기로 전환될 때 필수적으로 작용하는 단백질로써 polypeptide chain release factor 3 (eRF3)의 기능을 가지고 있다고 알려져 있다. 우리는 세포 내에서 GSPT1 과 ASK1 이 상호작용하고 있음을 확인하였다. 그리고 두 단백질의 상호작용은 ASK1 을 활성화 시키는 산소성 스트레스 (H2O2)에는 독립적으로 작용한다는 것을 알았다. 이것은 GSPT1 의 발현 정도가 ASK1 을 조절하는 중요한 요인임을 시사해 준다. 더 나아가 배양 세포에서 GSPT1 이 ASK1 을 활성화 시키고 Caspase signal 을 통해서 ASK1 에 의해 유도되는 세포사멸을 증가 시킨다는 것을 알았다. GSPT1 은 ASK1 에 의해 유도되는 세포사멸 신호전달 과정의 downstraem 에 있는 전사인자인 cJUN 의 활성을 증가시킨다. In vitro kinase assay 를 통해서도 GSPT1 이 ASK1 의 자기 인산화와 MKK6 의 인산화 활성을 증가시키고, ASK1 의 존재 하에 GSPT1 의 농도가 증가함에 따라 cJUN 의 인산화가 증가한다는 것을 알았다. 또한 GSPT1 의 과발현은 ASK1 의 음성 조절자인 14-3-3 단백질과 ASK1 의 상호작용을 억제함을 알았다. 그러므로 GSPT1 과 14-3-3 단백질은 ASK1 과의 상호작용에 있어 경쟁적인 관계에 있다고 말할 수 있다. 이런 연구 결과를 종합해 볼 때 GSPT1 은 ASK1 의 양성 조절자로 작용함으로써 ASK1 에 의해 유도되는 세포사멸 신호전달 기작에 대한 새로운 정보를 제시해 준다.

DL-2-하이드록시 3-메틸 부틸산을 배위자로 한 항암성 백금(Ⅱ) 착체의 암세포와 정상 신장세포에 대한 선택적 세포독성

홍언표 경희대학교 대학원 2003 국내석사

Glimepiride의 건강한 지원자의 혈당강하 작용에 대한 PK/PD modeling

朴喜贊 忠南大學校 大學院 2005 국내석사

Glimepiride is an oral blood glucose lowering drug of the sulfonylurea class. Glimepiride has been used for the treatment of non-insulin dependent diabetes mellitus(NIDDM). Glimepiride induced insulin secretion and increased peripheral insulin sensitivity. The relationships between plasma concentration of glimepiride and its glucose-lowering effect in healthy humans were analyzed by PK/PD model developed. The pharmacokinetics and pharmacodynamics of glimepiride were studied in healthy humans at fasting state over 10hours. After single oral administration of 2mg glimepiride tablet to twenty healthy humans, time versus plasma concentration profiles were described over 12hr by HPLC/MS/MS determination. All volunteers were consumed with 12g of white sugar 30 minutes after drug intake to maintain standard initial plasma glucose concentration. In order to evaluate the glucose-lowering effect of glimepiride, the plasma concentrations of glucose were measured for a period of 9 hours followed by the administration of glimepiride 2mg and placebo, respectively. The time courses of the plasma concentration of glimepiride and the glucose-lowering effects were analyzed with PK/PD modeling using ADAPT II program. The time versus plasma concentration curve of glimepiride was fitted to an oral one compartment model with lag. The estimated Cmax, Tmax, CL/F(apparent clearance), V/F(apparent volume of distribution), and half life of glimepiride were 187.0 ng/ml, 2.5 hr, 3.1 L/hr, 5.4 L and 1.1 hr. The maximal decrease in plasma glucose concentration was 22.7 mg/dl detected at 2hour administration of the drug. Developed PD models were biophase model which was tested for the glucose-lowering effect. These PK/PD models could describe successfully the relationship between plasma concentration of glimepiride and its glucose-lowering effect.

Inhibitory effects of some natural products on HeLa cell vacuolation induced by Helicobacter pylori VacA toxin

김종미 경희대학교 대학원 2003 국내석사

Purification and Characterization of Novel α-L-Arabinopyranosidase and α-L-Arabinofuranosidase Metabolizing Ginsenoside Rb2 and Rc from Bifidobacterium breve K-110, a Human Intestianl Anaerobic Bacterium

신호영 경희대학교 대학원 2003 국내석사

Effect of rufinamide on the kainic acid-induced excitotoxic neuronal death in the mouse hippocampus : 카인산에 의해 유발된 해마 신경세포사멸에 대한 rufinamide의 효과

박진아 단국대학교 2017 국내석사

Rufinamide는 Lenox-Gastauts syndrome을 포함한 여러 간질 발작 치료에 사용중인 항경련제이다. 본 연구에서는 카인산 투여에 의해 나타나는 마우스 해마 CA3 영역에서의 흥분성 신경세포 사멸에 대한 Rufinamide의 신경세포 보호효과에 대해 알아보고자 하였다. Rufinamide 투여는 카인산에 의해 유발된 마우스 해마 CA3 영역에서의 세포사멸에 대해 용량의존적으로 신경세포 보호효과를 나타내었다. 또, 카인산 투여에 따른 산화적 스트레스와 신경염증반응이 Rufinamide 투여에 의해 유의적으로 감소하였다. 이러한 결과는 Rufinamide가 카인산에 의해 유발된 흥분성 신경세포사멸에 대해 보호효과를 가지고 있으며, 이러한 신경세포 보호효과는 Rufinamide의 항산화 및 항염증 효과에 의해 나타난다는 것을 의미한다. Rufinamide (RUF), a structurally unique anti-epileptic drug, has been used in the treatment of Lennox-Gastaut syndrome and various seizure disorders. In the present study, we investigated whether RUF had a neuroprotective effect on excitotoxic neuronal damage in the mouse hippocampal CA3 region following intraperitoneal kainic acid (KA) injection. Treatment with 25, 50, 100 mg/kg RUF could significantly decrease the KA-induced neuronal death in the hippocampal CA3 region in a dose-dependent manner. In addition, 100 mg/kg RUF treatment reduced the KA-induced increase of MDA level as well as KA-induced decrease of total SOD activity in the hippocampus. KA-induced increases of pro-inflammatory cytokines, such as TNF-α and IL-1β, levels as well as KA-induced microglial activation were also suppressed by RUF treatment. These results indicate that RUF displays the neuroprotective effect against KA-induced excitotoxic neuronal death in the mouse hippocampus through anti-oxidant and anti-inflammatory actions.