Control of membrane biofouling in MBR for wastewater treatment by quorum quenching bacteria

오현석 서울대학교 대학원 2013 국내박사

고도 하폐수처리 공정의 하나로써 주목 받고 있는 분리막 생물반응기(MBR)는 분리막 표면에 형성되는 생물막오염을 해결해야 하는 문제점을 안고 있다. 최근 들어 미생물 간의 정족수 감지(Quorum sensing)가 MBR의 생물막오염에 중요한 역할을 한다는 사실이 밝혀졌고, 효소를 이용한 정족수 감지 억제(Quorum quenching) 기술이 생물막오염 제어에 적용되어 그 가능성을 증명하였다. 하지만 효소를 실제 공정에 적용하는 데에는 여전히 효소 추출 및 정제에 드는 비용문제와 효소의 안정성 문제가 해결되어야 하므로, 보다 더 효과적인 정족수 감지 억제 기술의 개발을 필요로 한다. 본 연구에서는, 새로운 정족수 감지 억제 전략으로서, 정족수 감지 억제 세균을 이용한 종간 정족수 감지 억제 (interspecies quorum quenching)를 MBR에 적용하였고, 효과적이고 경제적인 생물막오염 방지 기술로서의 가능성을 증명하였다. 첫 번째로는, 아실 호모세린 락토나아제(N-acyl homoserine lactonase)를 생산하는 재조합 대장균을 정족수 감지 억제 세균으로 선택하였고, 이 세균을 ‘미생물 용기(Microbial-vessel)’라 불린 미소다공성의 중공사막 내부에 가둔 형태로 MBR에 적용하였다. 미생물 용기를 이용한 MBR에서의 생물막오염 억제는 80일 이상 그 효과가 입증되었다. 이를 통하여 세균을 이용한 정족수 감지 억제 기술이 MBR에서의 생물막오염 저감에 효과적으로 이용될 수 있다는 사실을 증명했다. 두 번째로는, 실제 MBR 플랜트에서 분리된 토착 정족수 감지 억제 세균 중에서 가장 정족수 감지 억제 활성이 우수한 Rhodococcus sp. BH4의 특성 및 정족수 감지 억제 메커니즘을 분석하였다. LC-ESI-MS을 이용한 BH4의 AHL 분해산물 분석에서는 락톤링을 열어 활성을 없애는 락토네이즈의 메커니즘을 확인할 수 있었다. BH4는 다양한 형태의 AHL 분자를 잘 분해하였는데, 각각의 AHL에 대한 분해속도는 Rhodococcus 속에 속한 다른 세균과는 많은 차이를 보였다. BH4의 정족수 감지 억제 활성은 Luria-Bertani 배지와 합성폐수에서 모두 확인 되었다. 마지막으로, BH4 세균을 MBR에 적용하여 분리막에서 일어나는 생물막오염을 성공적으로 억제하였다. 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM)을 이용해 관찰한 결과 BH4를 적용한 MBR의 분리막 위에서 생물막오염이 현저히 저하되었음을 확인하였다. 또한 미생물용기에 가둬진 BH4의 양과 미생물용기의 재료가 정족수 감지 억제 활성에 미치는 영향을 조사하였고, 이는 실제 MBR 플랜트에서 생물막오염을 억제하기 위해 정족수 감지 억제를 적용할 때 고려해야 할 공학적 관점에서의 다양한 정보들을 제공한다. 종간 정족수 감지 억제 기술을 이용한 실험실 규모 MBR에서의 성공적인 생물막오염 제어는, 이 기술이 플랜트 규모의 MBR 또는 다양한 환경공학 시스템에 경제성을 갖고 확대 적용될 가능성이 있음을 보여주었다. Recently, enzymatic quorum quenching has proven its potential as an innovative approach to biofouling control in the membrane bioreactor (MBR) for advanced wastewater treatment. However, practical issues on the cost and stability of enzymes are yet to be solved, which requires more effective quorum quenching methods. In this study, a novel quorum quenching strategy, interspecies quorum quenching by bacterial cell, was elaborated and proved to be efficient and economically feasible biofouling control in MBR. Firstly, a recombinant Escherichia coli, which produces N-acyl homoserine lactone hydrolase (AHL-lactonase), was applied to MBR for the control of biofouling, and the feasibility of interspecies quorum quenching application was confirmed. A ‘Microbial-vessel’ was designed to encapsulate these quorum quenching bacteria using a microporous hollow fiber membrane. The effect of biofouling inhibition by the Microbial-vessel was evaluated over 80 days of MBR operation. Secondly, various characteristics of an indigenous quorum quenching bacterium, Rhodococcus sp. BH4, which was isolated from a real MBR plant was investigated to elucidate its behaviors in the mixed liquor of MBR. The LC-ESI-MS analysis of the degradation product by strain BH4 confirmed that it inactivated AHL activity by hydrolyzing the lactone bond of AHL. It degraded a wide range of N-acyl homoserine lactones (AHLs), but there was great difference in the degradation rate of each AHL compared to other reported AHL-lactonase producing strains belonging to Rhodococcus genus. In addition, its quorum quenching activity was confirmed not only in the Luria-Bertani medium, but also in the synthetic wastewater. Lastly, the strain BH4 was applied to control biofouling in MBR and it has efficiently inhibited the biofouling. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) observation showed that the Microbial-vessel encapsulating strain BH4 inhibited the biofilm formation on the membrane surface during the continuous MBR operation. Furthermore, the amount of strain BH4 encapsulated in the vessel as well as the material of vessel substantially affected the quorum quenching activity of strain BH4, which would provide useful information particularly for the biofouling control in a real MBR plant from the engineering point of view. Successful control of biofouling in a laboratory scale MBR suggests that the biofouling control through the interspecies quorum quenching could be expanded to the plant scale of MBR and various environmental engineering systems with economic feasibility.

Bioorthogonal Click Chemistry for Precise Tracking of Implanted Stem Cells

임승호 서울대학교 대학원 2021 국내박사

재생의학에서 줄기세포의 세포이식치료를 위한 안전성과 효율성을 확보하기 위해 줄기세포를 추적하는 분자영상 기술이 최근 발전하고 있음에도 불구하고 생체적합성, 안전성, 특정 결합성, 고유 세포 기능에 영향을 주지 않는 효과적인 줄기세포 표지기술이 여전히 필요하다. 따라서 이식된 줄기세포의 생착 효율과 행동에 대한 정보를 얻기 위해서는 보다 단순하고 선택성이 높으며 독성이 없는 새로운 분자영상 기법이 필요하다. 이러한 점에서 생물직교성 클릭반응을 이용한 표지방식은 기존 표지기술의 한계를 극복하고 안전성과 함께 선택적인 높은 표지효율을 제공할 수 있다. 따라서, 본 논문에서는 재생의학에서 이식된 줄기세포의 정확한 추적을 위해 생물직교성 클릭화학을 통해 줄기세포에 다양한 영상 분자들을 표지하고 이를 질환 동물 모델에 이식하여 추적 관찰하였다. 생물직교성 클릭화학을 통한 효과적인 줄기세포 표지를 위해서는 대사공학 과정을 통해 아지드기가 세포 표면에 효율적으로 발현이 되어야 한다. 이에 논문의 제 2장에서는 다양한 아지드기를 포함한 단당류들을 통해 세포 표면으로의 발현이 가장 효과적인 단당류를 선정하고 생물직교성 클릭화학 반응을 통해 최적화된 표지 효능을 도출하였다. 더불어 생물직교성 클릭화학 반응을 통해 다양한 분자와 나노입자를 세포에 표지할 수 있기 때문에 영상 추적이 가능한 근적외선 형광 단분자와 금나노입자를 각각 세포에 표지하였다. 근적외선 형광 단분자와 금나노입자 모두 세포에 효과적으로 생물직교성 클릭화학 반응을 통해 부착되었으며, 줄기세포 고유의 기능에 영향을 주지 않았다. 이러한 장점으로 생물직교성 클릭화학 반응은 선택적이고 효과적이며 세포에 독성을 나타내지 않는 안전한 세포 표지 기술로 사용될 수 있다. 다음으로 본 논문에서는 생물직교성 클릭화학을 통해 표지된 줄기세포를 질환 동물모델에 이식하여 이를 추적하는 연구를 진행하였다. 제 3장에서는 생물직교성 클릭화학을 통해 근적외선 형광 단분자로 표지된 배아줄기세포 유래 혈관내피 전구세포를 하지허혈이 유도된 쥐의 허벅다리에 주입한 후 4주간 3차원 입체 구조 분석이 가능한 형광분자 단층촬영 장비를 통하여 세포의 거동을 분석하였다. 생물직교성 클릭화학을 통해 표지된 혈관내피 전구세포는 4주간 이식된 부위에서 혈관에 제거된 방향으로 서서히 이동하는 것인 관측되었다. 더불어 초기에 이식된 세포의 형태가 4주 뒤 치료결과에도 영향을 주는 것을 확인하여 재생의학에서의 이식된 줄기세포 추적 및 거동 연구의 중요성을 보여주었다. 제 4장에서는 자기공명영상과 형광영상이 가능한 나노입자를 개발하여, 이를 생물직교성 클릭화학을 통해 줄기세포에 표지하여 뇌졸중 질환 동물 모델에 이식하여 추적 관찰하는 연구를 진행하였다. 생체 적합성을 지닌 글리콜 키토산 기반의 고분자에 근적외선 형광 분자와 생물직교성 클릭화학 반응이 가능한 상대입자를 화학적으로 결합하였다. 이후 자기공명영상 추적이 가능한 철입자를 담지하여 형광영상과 더불어 자기공명영상 분석이 가능한 나노입자를 개발하였다. 나노입자는 줄기세포에 생물직교성 클릭화학 반응을 통하여 특이적이면서도 효과적으로 세포 표면에 부착되었으며, 뇌졸중 동물모델에 이식된 세포는 2주간 자기공명영상과 형광영상 정보를 통해 세포의 이식위치 및 거동을 확인할 수 있었다. 종합적으로, 본 논문에서는 생물직교성 클릭화학을 이용하여 줄기세포를 형광분자와 나노입자로 효과적으로 표지하였다. 생물직교성 클릭화학의 일련의 과정은 독성이 없고 줄기세포 고유 기능에 영향을 주지 않으면서 이미징 프로브와 클릭화학을 통해 선택적인 결합반응을 보여주었다. 생물직교성 클릭화학을 통해 표지된 줄기세포는 질환 동물모델에 이식된 후 다양한 비침습적 영상장비를 통해 장시간 효과적으로 세포의 영상정보를 제공하였다. 본 연구를 통해 재생의학에서 생물직교성 클릭화학 기반 표지기술은 하지허혈, 뇌졸중과 같은 난치정 질환에 사용되는 줄기세포의 이식 후 체내에서의 정확한 거동 정보를 제공할 수 있을 것으로 기대된다. 더나아가 초기 이식된 세포치료제의 이식된 형태와 초기 이동 특성을 관찰하여 치료 반응성을 예측하고 이를 통해 치료 전략을 수립할 수 있도록 함으로써 다양한 세포치료제 개발 및 치료 효능 향상에 활용할 수 있을 것으로 기대한다. Even though with the recent advances in molecular imaging technology for tracking stem cells to understand their therapeutic roles, effective stem cell labeling technology with biocompatibility, safety, specific bound, and not disturbing native cell function is still needed. Consequently, novel molecular imaging techniques with more simple, high sensitivity, strong selectivity, and non-toxic are necessary to investigate implanted stem cell fate and behavior. In this respect, the labeling approach using bioorthogonal click reaction can overcome current limitations and offer unique properties for specific labeling and tracking cells. Here, we developed bioorthogonal click chemistry with metabolic glycoengineering to stem cells for effective cell labeling and tracking. First, we validated the bioorthogonal click chemistry with metabolic glycoengineering labeling method using various azide containing sugars and optimized labeling efficacy. We screened the azide containing sugars (Ac4ManNAz, Ac4GalNAz, and Ac4GlcNAz) on human mesenchymal stem cells (hMSCs) and selected Ac4ManNAz which has the most effective labeling property. Then, we optimized labeling efficiency by treatment concentrations and incubation times of Ac4ManNAz using clickable near-infrared fluorescence dye. Also, we developed and labeled gold nanoparticles, which were widely used in stem cell labeling and tracking, through bioorthogonal click reaction. Both near-infrared fluorescence dye and nanoparticles were selectively and effectively bound on hMSCs surface via bioorthogonal click reaction without affect cell native functions. This labeling strategy can be used for selective and effective labeling stem cells with small molecules and nanoparticles. Second, we applied bioorthogonal labeling strategy on human embryonic stem cells-derived endothelial progenitor cells (hEPCs) for precise track hEPCs after transplantation in vivo. Bioorthogonally labeled hEPCs with near-infrared fluorescence dye (DBCO-Cy5) showed a significant strong NIRF signal without any change of cellular function in vitro. The migration and distribution in vivo after implantation of bioorthogonally labeled hEPCs were successfully monitored in the ischemic hind limb mouse models using fluorescence molecular tomography (FMT) imaging system for 28 days. Also, we demonstrated the initial transplanted form of cells correlated with therapeutic efficacy such as blood reperfusion and neovascularization. Therefore, bioorthogonal click reaction method can be used for the effective labeling of hEPCs and to predict therapeutic efficacy for regenerative medicine. Third, we developed dual-modal nanoparticles (BCN-dual-NPs) which can be selectively bound stem cell surface via bioorthogonal click reaction and provide an accurate signal of labeled stem cell transplanted in brain stroke mouse model. Glycol chitosan-based NPs were chemically conjugated with BCN, as complementary bioorthogonal moiety, and near-infrared fluorescence dye (Cy5.5). Superparamagnetic iron oxide nanoparticles were also encapsulated into NPs therefore it can be tracked by MR and NIRF imaging systems. BCN-dual-NPs were specifically conjugated on hMSCs via bioorthogonal click reaction and it showed not any change of cell functions and cytotoxicity. Bioorthogonally BCN-dual-NPs labeled hMSCs were effectively observed using NIRF and MR imaging system and provided information on stem cell migration in the stroke-induced brain for two weeks. Taken together, we demonstrated a promising stem cell labeling strategy using bioorthogonal click chemistry with metabolic glycoengineering. The bioorthogonal labeling technique showed specific and selective reactions with very few toxic and change cell functions. Furthermore, bioorthogonally labeled stem cells can be easily tracked using non-invasive imaging methods with precise information of stem cell fate after implantation. Our stem cell labeling strategy via bioorthogonal click reaction will provide valuable information in regenerative medicine based on stem cell therapy for various intractable diseases, including hind limb ischemia and brain stroke.

생물전기화학적 방법을 이용한 수질 내 세균 수 측정

尹錫敏 建國大學校 大學院 2009 국내석사

A novel bioelectrochemical sensor for the detection ad enumeration of bacteria was investigated. The reducing action of bacteria on the electrochemical mediator and the interaction between a charged electrode and the bacteria were used as the basis of an amperometric measuring system. A range of bacteria including E. coli, B. subtilis, and S. aureus was studied. For the concentration of bacteria, electrodes were charged (0.1 to 0.7V) for a given time (generally 1 hr). The bacteria attached electrode was then used as a working electrode. Using a simple three electrode cell, mediator which has been reduced by the bacterial electron transport system is reoxidized at a platinum working electrode, poised at a positive potential. The amperometric reoxidation current and its rate of increase were found to be dependent on the concentrations of bacteria and mediator. Linear correlations between initial rate currents and bacterial concentrations were established (1× 10³ cfu/ml). Methylene blue (MB) was selected as a most appropriate redox mediator, and the system was most sensitive and stable using a working electrode poised at 0.3 V (vs. the reference), pH 7.0, an MB concentration of 0.0001 M, a working electrode surface area of 550 mm², and a temperature of 30 ℃. 수질 내 미생물 개체수의 빠르고 정확한 측정을 위해 전기화학적 방법을 적용하여 바이오센서를 개발하였다. 미생물의 대사 작용에서 발생하는 전자가 일정 전압 하에서 mediator를 통해 전극으로 전달되는 현상을 기본 측정 원리로 이용하였으며, 3전극계를 사용하여 기준전극과 작업전극 사이에 인가되는 전압을 미생물 대사의 전자 수용체로 사용하였다. 측정 감도 향상과 개체 수 측정 범위를 넓히기 위해 미생물 시료의 농축방법도 연구되었으며 실험균주는 Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis였으며, 연구된 mediator는 methylene blue를 비롯하여 HNQ, DCPIP, Resazurin, TPMD 등이었다. 미생물 농축의 경우, 최대 10³의 농도까지 효율적으로 측정이 가능하다는 것을 확인하였으며, 미생물농도와 발생전류신호와의 상관관계를 분석하였을 때 0.95이상의 높은 상관계수를 가지는 것으로 확인되었다

자력을 이용한 미생물연료전지 양극부의 성능 개선

최창호 건국대학교 대학원 2008 국내석사

효율적인 미생물연료전지를 개발하기 위하여 자력을 적용한 양극부가 설치된 미생물연료전지를 개발하였다. 양이온교환막을 사용하지 않은 미생물연료전지의 산소에 대한 문제점을 개선하기 위하여 양극과 음극 사이와 양극 하부에 자석을 설치하였고 발생되는 전류의 변화를 관찰한 결과 자석을 적용한 미생물연료전지의 전류밀도가 증가함을 확인할 수 있었다. 양극과 음극 사이에 설치한 자석은 음극부로의 산소 확산 속도를 감소시켰으며 이로 인해 산소 확산에 의한 저해를 감소시킴으로써 전류생산의 안정성을 증가시켰다. 양극에 자석을 부착시킨 미생물연료전지는 최대 78 %의 전력 밀도가 증가하였다. 자석을 이용한 성능 개선은 큰 비용이 소모되지 않으며 설치 후 추가로 에너지의 소비나 산소제거제와 같은 물질을 공급할 필요가 없어서 유용한 방법이라 할 수 있다. 자석에 의한 산소의 조절은 양이온교환막이 없는 미생물연료전지 외에 다른 종류의 미생물연료전지의 성능향상에도 유용할 것으로 예상되며 자석의 구조 및 자력의 세기, 적용 방법을 변경하여 더 향상된 성능의 미생물연료전지 제작을 위한 연구가 진행될 예정이다. The application of magnetic force to a cathode compartment of membrane-less microbial fuel cell (ML-MFC) increases both the oxygen supplement efficacy to a cathode and power generation. Magnetic force prevents oxygen diffusion into anode compartment and decrease of current generation. An increase of power production was observed when a permanent magnet was attached to a cathode When a permanent magnet was set under the cathode, both current density and power density increased, as compared to MFCs without a magnet. 2.71 mA/m2, 0.15 mW/m2 increased to 4.72 mA/m2, 0.26 mW/m2 in non-aerated MFCs. 19.17 mA/m2, 1.15 mW/m2 increased to 22.51 mA/m2, 1.36 mW/m2 in aerated MFCs. The effect of the magnet in aerated MFCs was lower than the effect in non-aerated MFCs. The magnetic force effect can be explained by an increased dissolving and diffusion rate of oxygen by the magnetic attractive force acting on oxygen gas. The use of permanent magnets is effective in promoting oxygen reduction. The experiment’s results promote a new method for improving the performance of ML-MFC without consuming energy.

Deciphering Salt Tolerance Mechanisms and Enhancing Poly(3-hydroxybutyrate) Production in the Novel Bacterium Halomonas getboli

Yeonjae Yoo 고려대학교 대학원 2024 국내박사

Extremophiles, characterized by their unique biological features adapted to harsh environments, have gained significant attention in the field of biotechnology. Although these microorganisms hold high potential in diverse applications such as the production of unique metabolites and environmental purification, research focused on extremophiles remains sparse. This study delved deep into one such unexplored area, emphasizing the ecological and industrial relevance of a halophilic bacterium, Halomonas getboli, residing in abandoned salterns. Previous investigations revealed a notable decrease in microbial diversity in high-salinity environments resulting from comparing microbial communities between tidal flats and abandoned salterns. Based on these findings, culturable halophilic bacteria were isolated from sediment samples of these salt fields. From the sediment of salterns in Yongyudo, a total of 31 halophilic bacterial species were identified and subjected to halotolerance tests. Remarkably, over half of these isolates, totaling 18 strains, were identified as potential novel species. Among them, the newly identified strain Halomonas sp., which demonstrated the broadest range of salinity tolerance, was phylogenetically and physiologically characterized as Halomonas getboli. Further analyses, including whole-genome and transcriptome sequencing at various salinities, were conducted to elucidate the adaptive mechanisms and ecological roles of this novel halophile. The cheA gene, which can detect surrounding salinity, was found to be highly overexpressed. The bacterium primarily overexpressed genes related to ABC transporters responsible for ion and solute transport, and genes associated with cell motility like flagellar. Interestingly, while accumulating osmolytes within the cytoplasm to withstand osmotic pressure, this bacterium was also identified to secrete siderophores, growth hormones beneficial to nearby microorganisms, algae, and plants. These findings suggest the pioneering potential of this halophilic bacterium in colonizing and aiding the settlement of other organisms in salt-depleted areas. Lastly, focusing on the salt-adaptive mechanisms of the bacterium, the production capacity of extremolytes by Halomonas getboli was explored. Special attention was given to the biopolymer Poly(3-hydroxybutyrate) (P3HB). By irradiating with gamma rays, mutants with enhanced salinity resistance were generated. Among these, the halo6 mutant exhibited an 11% increase in P3HB production. This novel approach to improving halophilic strains provides promising prospects for the bioplastic industry and widens the potential industrial applications of extremophiles. In conclusion, this research successfully unearthed the novel halophilic bacterium, Halomonas getboli, from the unexplored environments of abandoned salt fields. It has opened new frontiers in the study of extremophilic microbes, offering fresh insights into their adaptive strategies and potential industrial applications. Moreover, by underscoring their ecological significance and diverse industrial potentials, this study lays a pivotal foundation for future advancements in biotechnological research. 극한환경 미생물은 극단적인 환경에 적응한 독특한 생물학적 특성으로 인해 생물공학 분야에서 주목받고 있다. 이들 미생물은 특이 대사물질 생성 및 환경 정화와 같은 다양한 응용 분야에서 높은 잠재력을 지니고 있지만, 아직까지 극한환경 미생물에 대한 연구는 부족한 실정이다. 본 연구는 이러한 미개척 분야 중 하나인 폐염전에 서식하는 극한환경 미생물, 특히 호염성 신종 Halomonas getboli의 생태학적 및 산업적 가치에 집중하여 깊이 있는 연구를 수행하였다. 본 연구자는 극한환경 미생물을 분리하고자 우리나라 서해안의 버려진 염전을 연구지역으로 선정하여, 이곳의 폐염전 퇴적물에서 배양 가능한 호염성 세균을 분리하였다. 용유도의 폐염전에서 총 31종의 호염성 세균을 분리 및 동정하고, 이들의 내염성 테스트를 진행하였다. 분리된 전체 31균주 중 절반이 넘는 18개의 균주가 신종후보군으로 확인되었고, 이 중 가장 넓은 범위의 염분 내성을 보인 신종후보 Halomonas sp. 를 진화계통분석, 생리 화학적 분석을 통해 Halomonas getboli로 보고하였다. 다음으로, 폐염전에서 발굴된 호염성 신종 세균 Halomonas getboli의 고염분환경 적응기작 및 생태적 역할을 밝히고자, 전장 유전체분석 및 다양한 염도에서 전사체 분석을 진행하였다. 그 결과, 주변환경의 염도를 인식할 수 있는 cheA 유전자가 가장 크게 과발현되었으며, 세포 내외로 이온 및 물질 수송 역할을 하는 ABC transporter와 세포의 운동기관인 flagellar와 관련된 유전자를 주로 과발현함으로써 고염도 환경에 적응하였다. 특히, 세포가 osmostic pressure에 견디기 위한 결과로 적합 용질을 세포질내에 축적함과 동시에 주변 미생물 및 조류, 식물의 생장을 도울 수 있는 생장호르몬인 siderophore를 분비하는 것으로 확인하였다. 이러한 결과를 통해, 이 호염성 신종 세균이 염분으로 황폐화되어 미생물 다양성이 낮아진 지역에 처음으로 번성하여, 다양한 이온 및 용질의 교환으로 적응하고, 다른 미생물도 정착해 살아갈 수 있게 하는 선구자적 종으로서의 잠재력을 지니고 있음을 제시하였다. 마지막으로, 호염성 신종 세균의 고염분 삼투압에 대한 적응기작을 중심으로 Halomonas getboli의 extremolytes 생산능력을 탐구하였다. 특히, 이차대사 연구를 통해 세균이 주로 생산하는 Poly(3-hydroxybutyrate) (P3HB)에 주목하였다. 이를 바탕으로, 호염성 세균의 PHA 대사 수율을 향상시키는 새로운 방법으로 감마선 조사를 통한 고염 내성을 갖는 돌연변이 유도를 시도하였고, 이 중 halo6 균주에서 P3HB의 생산량이 11% 증가하는 결과를 얻었다. 이 연구에서 제시한 호염성 균주 개량에 대한 새로운 접근 방법은 바이오플라스틱 산업에 혁신적인 전망을 제공하며, 극한환경 미생물의 다양한 산업적 활용에 대한 가능성을 더욱 넓힐 것으로 기대된다. 본 연구는 폐염전이라는 미개척지에서 신종 호염성 세균 Halomonas getboli를 성공적으로 발굴하였고, 이를 통해 극한환경 미생물 연구의 새로운 지평을 개척하였으며, 해당 세균의 고염분 환경에서의 적응기작과 산업적 응용 방안에 대한 신선한 시각을 제시하였다. 특히, 생태학적 중요성과 함께, 극한환경 미생물의 연구와 활용에 대한 새로운 기회와 가능성을 제시하며, 이를 다양한 생물공학 분야에 활용할 수 있을 것으로 사료된다.

Fungal to Bacterial Quorum Quenching: Potent Anti- Biofouling Strategies in Membrane Bioreactor

박정미 전남대학교 2024 국내석사

Autoinducer-2 Quorum Quenching For Enhanced Membrane Biofouling Control in Membrane Bioreactors

박혜연 전남대학교 2024 국내석사

Recombinant Expression of Human Antimicrobial Peptides,LL-37/Dermcidin, in Microbial Systems

Hong, In-Pyo 강원대학교 대학원 2009 국내박사

Rapid spread of antibiotic resistance in microorganisms has been a driving force in search for new classes of antibiotics possessing novel modes of action as well as different cellular targets compared to existing antibiotics in order to decrease the likelihood of development of resistance. The antimicrobial peptides (AMPs) are good candidates for new class of antibiotics, produced naturally by various organisms, including bacteria, plants, insects, fish, and mammals. Although they have different amino acid composition, most of them share similar features, such as a net positive charge and the ability to form amphipatic α-helix or β-sheet structure in which clusters of hydrophobic and hydrophilic amino acids are spatially separated. The human cationic antimicrobial protein of 18 kDa (hCAP-18) belongs to the class of cathelicidins. It is released from activated neutrophil granulocytes. After release, the 37-amino acid α-helical C-terminal end is cleaved off, forming the functional antimicrobial peptide LL-37. Since LL-37 is the only human antimicrobial peptide in the cathelicidin family and shows a broad spectrum of antimicrobial activity, there is a significant interest in developing this peptide for pharmaceutical applications. Dermcidin (DCD) is a recently discovered AMP with no homology to other known AMPs. Full length product of the dermcidin gene consists of 110 amino acid residues with an N-terminal 19 amino acid signal peptide characteristic for secreted proteins. It is proteolytically processed to form C-terminal peptides of 48 amino acid residues (DCD-1L), 47 amino acid residues (DCD-1), and shorter fragments. These two peptides have a broad spectrum of antimicrobial activity over a broad pH range and in high salt concentrations. These characteristics make it viable alternatives to conventional-synthetic antibiotics. Antimicrobial peptides with a short length of amino acid sequence can be prepared by a solid phase chemical synthesis, but it could be very expensive. On the other hand, recombianant method using microorganism as host could be an alternative choice. In this study, both LL-37 and DCD-1L gene were cloned from human fetal cDNA library and were expressed as soluble, active form of LL-37 and DCD-1L in Escherichia coli or Pichia pastoris. Furthermore, expressed DCD-1L peptide in E.coli, was purified by one step chitin column. 인류가 항생제를 사용하고, 사용량이 증가함에 따라서 항생제 저항성 균주가 급증하였고, 기존 항생제와 구분되는 새로운 작용기작을 가진 항생제를 필요로 하게 되었다. 이런 관점에서, 항미생물펩타이드는 새로운 항생제로 사용되기에 충분하다. 항미생물펩타이드는 세균, 식물, 어류 및 포유동물등의 다양한 생물에서 생산된다. 비록 각각의 항미생물펩타이드가 다른 아미노산 서열로 구성되어 있으나, 대부분은 net charge가 양의 값을 가지고 양극성의 α-helix 혹은 β-sheet구조를 이루며, 친수성과 소수성 클러스터가 분리되어 있다는 공통점을 가진다. 인간유래의 18kDa 크기의 양이온성 항미생물 단백질(hCAP-18)은 cathelicidin에 속하며, 활성화된 호중구(백혈구의)에서 생성된다. 이후 C-말단의 37개의 아미노산이 분리되어 활성을 가진 항미생물펩타이드인 LL-37이 된다. LL-37이 인간에게 유일한 cathelicidn이고 폭넓은 항미생물활성능을 보이는 이유 때문에, 이 펩타이드의 의약적 응용에 대한 많은 관심이 모아지고 있다. Dermcidin(DCD)은 최근에 발견된 항미생물펩타이드로 이전에 알려진 다른 항미생물펩타이드와 상동성이 없다. Dermcidin 유전자에서 만들어진 단백질은 분비단백질의 특징인 N-말단의 19개의 분비신호 아미노산을 포함한 110개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 이후 C-말단의 48개의 아미노산(DCD-1L), 47개의 아미노산(DCD-1), 그리고 더 짧은 아미노산으로 변형된다. 이러한 LL-37과 Dermcidin, 두개의 펩타이드는 넓은 항미생물능을 가지며 넓은 pH범위와 높은 염 농도에서 활성을 유지 한다. 이러한 특성은 상용화된 합성 항생제를 대체하는데 사용될 수 있다. 짧은 길이의 아미노산 서열로 구성된 항미생물펩타이드는 고체상 합성법으로 합성될 수 있으나, 비용이 많이 드는 단점을 가진다. 때문에 미생물을 이용한 재조합단백질 생산법이 대안으로 사용될 수 있다. 본 연구에서는 LL-37과 DCD-1L펩타이드를 인간 태아 cDNA library에서부터 클로닝하고, 활성형의 LL-37과 DCD-1L을 대장균 혹은 Pichia pastoris발현계를 사용하여 발현하였다. 또한 DCD-1L펩타이드는 chitin column을 사용하여 정제하였다.

토양미생물과 계피추출물 혼합에 의한 고구마뿌리혹선충(Meloidogyne incognita)의 생물학적 방제

박문현 忠南大學校 大學院 2013 국내박사

The present investigation was aimed at assessing the potential use of Arthrobotrys thaumasia Nema-1, a nematophagous fungi and Pseudomonas monteilii C-5, Bacillus subtilis C-9, and Burkholderia stabilis SAph-24 which possess the ability to degrade collagen, gelatin and albumin, as a biological nematicide. The microbes were isolated from soils collected from oriental melon fields at Kyungpook Sungju-gun, Seonnam-myun and tomato fields at Chungnam Gongju-gun, Woosung-myun in South Korea. Melodogyne incognita, a nematode was treated with 5,000 ㎕/L culture of A. thaumasia Nema-1, and the nematicidal activity was measured as 55% after 3days of the treatment. The nematicidal activity could be increased up to 65% by treating the culture mixture of 5,000 ㎕/L A. thaumasia Nema-1 and P. monteilii C-5. Addition of cinnamon extract (50 mg/L) to the mixture of 5,000 ㎕/L of A. thaumasia Nema-1 and P. monteilii C-5 culture resulted in nematicidal activity of 89% after 3days. Meanwhile, treating with 2.5 mg/L of chemical nemato pesticide Fosthiazate (a.i. 5%) and 2,000 ㎕/L of neem oil (azadiractin 0.3%) resulted in 17% and 57% of nematicidal activity, respectively. When Meloidogyne incognita containing pots were treated with 5,000 mg/kg of A. thaumasia Nema-1 nematicide powder, the number of nematode's egg sac, which is an index of nematicidal activity, decreased to 35% compared to that of the control. The number of nematode's egg mass decreased to 67% when the nematicide powder mixture of 5,000 mg/kg A. thaumasia Nema-1 and B. subtilis C-9 was used in treating the pots. Furthermore, the mixture containing cinnamon extract 10 mg/kg, 5,000 mg/kg of A. thaumasia Nema-1 and B. subtilis C-9 nematicide powder decreased the number of nematode's egg sac to 81%, whereas the corresponding reduction caused by 1.2 mg/kg of chemical nemato pesticide Fosthiazate (a.i. 5%) was recorded as 24%. Based on the results, the mixture of microorganisms and cinnamon extract could be recognized as more effective biological nematicide than the use of microorganism or plant extract along for the control of nematodes. A protease of Burkholderia stabilis SAph-24 (NHB: Nematophagous fungus Helper Bacteria) was purified to homogeneity by a combination of ammonium sulphate precipitation and gel filtration chromatography. The molecular weight of the enzyme was 45 kDa by SDS polyacrylamide gel electrophoresis. When the protease production was estimated using the growth medium containing 0.7% KH2PO4, 0.2% K2HPO4, 0.01% MgSO4.∙7H2O, 0.05% citric acid dehydrate, 0.1% yeast extract 0.2% casein with 1% inoculum, the optimum protease activity was recorded as 116.4 U/mL after 48 hr shaking incubation at 150 rpm. The enzyme was active in pH range of 5-11 and temperature range of 30 ~ 80oC. The optimum pH and temperature for protease activity were recorded as being pH 8 and 50oC respectively. The protease activity was inhibited by Zn2+, Ni2+ and Sn2+ and enhanced by Ca2+, Mg2+ and Mn2+. The maximum enzyme activity was displayed with casein as the substrate, followed by egg albumin, gelatin and BSA. When the casein was used as a substrate, Vmax and Km values were 89.28 U/mL and 0.82 mg/mL respectively. 친환경 선충 방제제 개발을 위해 경북 성주군 선남면 및 충남 공주군 우성면의 시설원예 재배지 토양으로부터 선충 포식성이 뛰어난 곰팡이 Arthrobotrys thaumasia Nema-1과 선충 표피성분인 collagen, gelatin, albumin 단백질 등을 분해하는 protease 생성능력이 뛰어난 Pseudomonas monteilii C-5, Bacillus subtilis C-9 과 Burkholderia stabilis SAph-24를 분리하였다. 이들 분리 균의 선충 치사효과를 실내 검정한 결과, A. thaumasia Nema-1 곰팡이 배양액 5,000 ㎕/L의 농도로 처리 시 방제가는 3일 후에 55%이었으나, 선충포식곰팡이 A. thaumasia Nema-1과 근권세균 P. monteilii C-5 배양액 각각 5,000 ㎕/L 씩 혼합 처리구에서는 65%로 상승하였다. 또한 선충 치사효과를 증진시키기 위하여 살선충 활성이 있다고 보고된 계피추출물 50 mg/L와 A. thaumasia Nema-1, P. monteilii C-5 배양액을 각각 5,000 ㎕/L의 농도로 혼합하여 처리하였을 때 3일 경과 후의 치사율은 89%로 상승되므로서, 대조구로 사용한 살선충제인 Fosthiazate(a.i. 5%) 원제농도 2.5 mg/L로 처리 시 방제가 17%와 님오일(azadiractin 0.3%) 2,000 ㎕/L로 처리 시 방제가 57% 보다 높은 수준이었다. 이들 분리 균을 대상으로 토마토 포트실험을 통해 선충 치사효과의 지표인 난낭수 감소를 검토한 결과, A. thaumasia Nema-1 곰팡이 제제 5,000 mg/kg의 농도로 처리 시 고구마뿌리혹선충의 난낭수가 무처리 대비 35% 감소하였다. 선충포식곰팡이 A. thaumasia Nema-1과 세균 B. subtilis C-9 제제를 각각 5,000 mg/kg의 농도로 혼합한 처리구에서는 난낭수가 무처리 대비 67% 감소하였다. 또한 선충 치사효과를 증진시키기 위하여 살선충 활성이 있다고 보고된 계피추출물 제제 10 mg/kg와 A. thaumasia Nema-1, B. subtilis C-9 제제를 각각 5,000 mg/kg의 농도로 혼합처리 하였을 때 난낭수가 무처리 대비 81% 감소하여 대조구인 Fosthiazate(a.i. 5%)의 표준사용 농도 1.2 mg/kg 처리 시 난낭수가 26% 감소한 결과와 비교해 볼 때 높은 수준의 방제효과를 보였다. 이상의 결과는 생물학적 선충 방제제는 미생물 또는 식물체 추출물 단제보다는 혼합물 형태로 사용하는 것이 더 효과적이라는 결과를 제시하였다. 분리세균 중 단백질 분해 활성이 가장 우수한 B. stabilis SAph-24 균주의 protease 생성 최적 배양조건을 검토하고, 배양여액으로부터 protease를 정제하여 효소적 특성을 검토하였다. 최적 배양조건은 0.7% KH2PO4, 0.2% K2HPO4, 0.01% MgSO4․7H2O, 0.05% citric acid dehydrate, 0.1% yeast extract, 0.2% casein 배지에서, 1% inoculum, 온도 40oC, 150 rpm의 조건에서 48시간 진탕 배양 시 116.4 U/mL의 최대 protease 활성을 보였다. 또한 배양여액으로 부터 정제한 protease의 분자량은 SDS-PAGE법에 의해 45 kDa로 측정되었으며, 최대 protease 활성은 pH 8, 온도는 50oC 이었고, 효소활성은 온도 40oC 이상 과 pH 9 이상에서도 안정성을 보였다. 정제효소는 Zn2+, Ni2+, Sn2+에 의해 저해되었으나 Ca2+, Mg2+, Mn2+에 의해서는 효소활성이 증진되었으며, 사용한 기질 casein, egg albumin, gelatin, BSA에 대해 casein에서 가장 높은 활성을 나타내었다. 또한 casein 기질에 대한 정제효소의 Vmax는 89.28 U/mL, Km 값은 0.82 mg/mL 이었다.

한국형 육포의 미생물학적 안전성 및 품질 특성

김현욱 건국대학교 대학원 2006 국내석사

한글초록:육포는 축산물보다는 농산물에 의존적이었던 우리의 전통적인 식생활에서 육가공품 중 유일하게 건조법에 의해 가공된 식품이다. 전통식품인 육포는 풍부한 단백질 함량에 비해 질량이 적고 상온저장이 가능한 식품이다. 현재 육포의 제조방법은 전통적인 천일건조 방법에서 신속하고 대량생산이 가능한 열풍건조와 같은 건조방법으로 변하였으나, 국내의 육포 제조기술은 아직 초보적인 단계에 있으며, 육포의 영양적 측면, 저장성 및 중간수분식품으로서의 육포개발, 육포의 미생물 안전성 등에 관한 연구 보고는 아직 미미한 실정이다.최근 식생활 수준의 향상으로 식품의 맛과 더불어 식품에 대한 안전성이 주요한 관심사로 등장하고 있다. 2000년도 우리나라 식중독 발생원인 중 발병환자의 49.1%가 육류 및 육가공 식품에 기인한 것으로 나타났으며, 최근에는 Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Escherichia coli O157:H7에 의한 식중독 사고가 세계 각국에서 문제시 되고 있고 우리나라에서도 수입 쇠고기에서 E. coli O157:H7이 검출된 바 있다.따라서 본 연구에서는 한국 식단에 적용될 수 있는 육류 식자재의 위생적인 공급을 위하여 원료육의 미생물 분포를 측정하였고, Clostridium botulinum, L. monocytogenes 등과 같은 식육제품과 관련된 식중독 균을 분리하여 잠정적인 위해를 조사하고, 육포의 제조에 사용되는 원료 및 양념, 제조 전 과정에서의 미생물 균수를 측정하고 식중독세균의 분포를 측정하여 식자재의 원료의 잠정적 위해를 조사하였다. 또한, 육포의 제조 시 문제시 되는 병원성 미생물의 inoculated pack study에 의한 식자재의 안전성을 조사하고, 육포의 저장 중 미생물의 변화를 관찰함으로써 육포의 가공 공정 시 위생적으로 공급할 수 있는 기초 자료로 활용하기 위하여 육포의 원료육, 조성성분, 제품에 대하여 연구를 수행하였다.시중의 정육점 및 백화점 등에서 유통 중인 10종의 우육과 돈육 원료에 대한 일반세균수, 저온균수, 고온균, 혐기성균 및 진균류, 대장균군에 대한 미생물학적 분포와 병원성 미생물에 대한 분리 및 동정을 실시하였다. 실험결과, 원료 우육에서 중온균은 3.8×103 ~ 1.4×105 CFU/g으로 높은 분포를 보였다. 저온균은 9.2×103 ~ 1.0×105 CFU/g으로 지표세균 중에서 가장 높은 분포를 나타내었고, 혐기성균은 중온균, 저온균과 유사한 분포를 보였으나 상대적으로 적게 검출되었고, 고온균은 모든 검체에서 검출되지 않았다. 대장균군 또한 모든 시료에 대해서 검출되지 않았다. 효모와 곰팡이류는 2.2×101 ~ 7.8×102 CFU/g으로 검출되었다. 병원성 미생물은 우육 sample B, G, H에서 B. cereus 만이 검출되었고, 동정결과 99.8%의 상동성을 보였다. 돈육 원료에 대한 실험결과 원료 돈육에서 중온균은 3.9×102 ~ 3.9×105 CFU/g으로 높은 분포를 보였고, 저온균은 1.5×103 ~ 8.6×102 CFU/g, 혐기성균은 중온균, 저온균과 유사한 분포를 보였으나 상대적으로 적게 검출되었고, 고온균은 모든 검체에서 검출되지 않았다. 대장균군 또한 모든 검체에 대해서 검출되지 않았으며, 곰팡이와 효모 등 진균류는 3.8×101 ~ 5.1×102 CFU/g으로 검출되었다. B. cereus는 돈육 sample B와 J에서 분리되었고, S. aureus의 경우 돈육 sample B에서만 검출되었다. B. cereus는 99.8%의 상동성을 보였고, S. aureus는 97.8%의 상동성을 보였다. 육포의 제조과정에 따른 미생물 분포를 조사한 실험결과 초기 원료육에서는 102 ~ 104 CFU/g 정도의 미생물 분포를 보였으며, 양념은 10 ~ 102 CFU/g 정도의 미생물 분포를 나타내었다. 육포를 제조하기 전 단계인 양념육의 미생물 분포는 102 ~ 104 CFU/g 정도였다. 그러나 육포를 제조한 후에는 미생물의 수가 급격히 줄어들었다. 이는 육포의 건조를 위해 70℃의 열로 가열하였기 때문이라고 생각되며, 육포의 제조 전 과정에서 미생물의 오염은 없었던 것으로 생각된다. 또한 식품에서 문제시되는 포자생성균이나 대장균군은 모든 검체에서 검출되지 않았다.육포의 품질을 향상시키기 위하여 보습제와 연화제를 첨가하여 제조한 육포의 물성을 측정하였다. 경도는 보습제와 연화제를 첨가한 육포가 모두 대조구(일반육포)보다 낮은 값을 나타내었으며, 특히 돈육 육포에서는 TB1가, 우육육포는 TS1이 가장 낮은 경도를 나타내었다. 모든 육포에서 0.70 ~ 0.72 정도의 수분활성도를 나타내었고, 색상과 pH는 유의적인 차이를 보이지 않았다.육포의 저장 중 미생물의 변화 및 inoculated pack study 에서는 육포의 안전성을 알아보기 위하여 천연항생물질인 nisin을 2개의 농도(100 IU/g, 500 IU/g)로 첨가하여 실험하였다. 실험결과, 일반미생물 검사에서는 대조군과 B. cereus 접종군은 저장 기간에 따라 꾸준히 증가하다가 저장 28일 이후 점차적으로 감소한 반면, nisin을 첨가한 실험군들은 초기에는 nisin의 영향으로 검출되지 않다가 100 IU/g 첨가 실험군은 경우 1일, 500 IU/g 실험군은 21일이 지난 후 증가하기 시작하였다. Inoculated pack study의 실험결과는 일반 미생물과 유사한 실험결과를 나타내었다. B. cereus 접종군은 저장기간에 따라 꾸준히 증가하다가 저장 28일 이후 점차적으로 감소하였고, 100 IU/g 첨가 실험군은 경우 1일, 500 IU/g 실험군은 21일이 지난 후 증가하기 시작하였다. 이 실험에서의 B. cereus의 최대 균체 농도는 103 CFU/g 이었다