Extremophile-Derived Cyclopropane Fatty Acid Synthase-Based Membrane Phospholipid Manipulation for Cell Robustness and Bioplastic Production Enhancement

Tae-Rim Choi 건국대학교 대학원 2025 국내박사

미생물 세포막은 지질과 단백질로 구성되어 있으며 주변 환경과 미생물 세포질을 구분하며 외부의 여러 저해요소에 대한 직접적인 방어막으로써 작용하는 중요한 역할을 한다. 이러한 미생물 세포막은 온도, pH, 염도 등 다양한 환경 조건에 대응하여 항상성을 유지하기 위해 세부적인 구성 요소들의 종류 및 조성을 변화시키며 적응한다. 이러한 세포막의 변화를 보여주는 지표로써 세포막 무결성, 유동성, 투과성이 존재하며 지질, 단백질을 포함한 다양한 세포막 관련 요소에 대한 유전공학, 대사공학적 접근을 통해 변화시켜 다양한 환경요소에 대한 미생물의 내성을 증가시킬 수 있다. 이러한 이유에서 본 연구는 세포막 구성 요소 중 인지질을 구성하는 지방산에 주목하여 유전공학적 개량을 통한 지방산 조성 변화와 이로 인해 발생하는 세포막의 변화를 통한 미생물의 강인성 증대 가능성을 모색하기 위해 시작되었다. 그 과정에서 독특한 인지질 조성을 가진 미생물을 분리하기 위해 극한환경 유래 극한미생물에 대한 분리 및 선정과 유전공학적 접근을 통한 지방산 조성 변화, 각종 저해물질에 대한 미생물 강인성 증대와 이를 통한 폴리하이드록시알카노에이트 (Polyhydroxyalkanoate (PHA)) 생산 증대 과정을 제시하고 있다. 이러한 목표를 달성하기 위한 실험에서 극지 미생물 Pseudomonas sp. B14-6과 해양 미생물 Halomonas socia CKY01을 선별하였고 각각의 미생물에 대한 생장과 세포막 인지질 지방산 조성 변화를 확인하였으며, 온도와 염도로 대표되는 환경조건의 변화에서 주요 불포화지방산인 palmitoleic acid, elaidic acid와 cyclopropane fatty acids인 methylenehexadecanoic acid, methyleneoctadecanoic acid의 큰 변동을 확인할 수 있었다. 해당 변화와 각각의 균주에 대한 whole genome sequencing을 통해 관련된 생합성 유전자인 cyclopropane fatty acid synthase (cfa)의 서열을 성공적으로 확보할 수 있었다. 세 종류의 미생물 Escherichia coli, Pseudomonas sp. B14-6, H. socia CKY01로부터 각각의 유래 cfa를 대장균에 도입하여 생장을 확인하였을 때, H. socia CKY01 유래 cfa가 생장 측면에서 가장 효과가 좋다는 결론을 얻어 robustness 확인을 위한 저해실험 및 PHA 생산실험을 진행하였다. 그 결과 목질계 바이오매스 유래 생장 저해 물질들인 furfural, 4-hydroxybenzaldehyde, vanillin, acetate 존재 하에서 대조군 대비 각각 1.58배, 3.30배, 2.19배, 1.79배 상승한 생장을 보여 저해 물질에 대한 미생물의 강인성이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이어진 PHA 생산을 위한 적용 실험에서 포도당을 탄소원으로 사용하였을 때 3.35 g/L의 건조중량 및 39.2 %의 PHA content로 대조군 대비 각각 1.43배 및 3.45배 증대된 생산을 보여주었으며 furfural, vanillin 등 저해물질이 포함된 목질계 바이오매스 유래 당을 탄소원으로 사용한 실험에서도 5.89 g/L의 건조중량과 47.4 %의 PHA content로 대조군 대비 1.42배의 생장과 2.14배의 PHA 생산량이라는 결과를 얻을 수 있었다. 이러한 연구 결과들을 통해 극한 미생물 유래 지방산 합성 유전자의 도입을 통해 대장균 내 인지질 조성을 변화시킬 수 있음을 확인하였으며, 인지질 지방산의 변화로 인해 발생하는 세포막 변화로 인해 다양한 미생물 생장 저해 물질에 대한 저항성이 증대되는 것을 확인하고 증대된 미생물의 강인성으로 저해물질을 포함한 탄소원을 활용한 PHA 생산에 활용할 수 있다는 결과를 얻을 수 있었다. 지방산 합성 유전자 도입 시 지방산 조성의 변화, 생장의 변화, 생산량의 변화라는 형질에 관한 결과에 집중했다는 한계점이자 추가적인 연구가 가능한 부분이 존재하나, 생물공학적 물질 생산의 개선 및 미생물 강인성 증대의 가능성을 생리학적, 유전공학적 관점을 통해 수행해낸 연구라 할 수 있다. Extremophile-Derived Cyclopropane Fatty Acid Synthase-Based Membrane Phospholipid Manipulation for Cell Robustness and Bioplastic Production Enhancement Tae-Rim Choi Department of Biological Engineering Graduate School of Konkuk University Microbial cell membranes, composed of phospholipids and proteins, play a critical role in distinguishing the microbial cytoplasm from the external environment and act as a primary defense barrier against various inhibitory compounds and conditions. In response to diverse environmental conditions, such as type of microbes, temperature, pH, and salinity, microbial cell membranes adapt by altering the composition and types of specific characteristics to maintain membrane homeostasis. Membrane integrity, fluidity, and permeability serve as indicators of these adaptive changes, and genetic and metabolic engineering approaches targeting phospholipids, proteins, and other membrane-related elements can enhance microbial resistance to various environmental factors. In this context, the present study focuses on phospholipids, particularly the fatty acids that constitute them, aiming to explore the possibility of enhancing microbial robustness by modifying fatty acid composition through genetic engineering. This research includes the isolation and selection of extremophilic microorganisms from extreme environments with unique membrane lipid compositions and explores genetic modifications to alter fatty acid composition and enhance microbial resistance to various inhibitory compounds, ultimately improving polyhydroxyalkanoate (PHA) productivity. As a result, the polar microorganism Pseudomonas sp. B14-6 and marine microorganism Halomonas socia CKY01 were selected, and their growth and phospholipid fatty acid composition changes were examined. Significant fluctuations in major unsaturated fatty acids, such as palmitoleic acid and elaidic acid, as well as cyclopropane fatty acids like methylenehexadecanoic acid and methyleneoctadecanoic acid, were observed under varying environmental conditions represented by temperature and salinity. Through whole-genome sequencing, the gene sequence of cyclopropane fatty acid synthase (cfa), a key biosynthetic gene, was successfully obtained for each strain. When each of the cfa genes from Escherichia coli, Pseudomonas sp. B14-6, and H. socia CKY01 were introduced into E. coli, it was found that the cfa derived from H. socia CKY01 yielded the most favorable growth outcomes, leading to further inhibition tests and PHA production experiments to confirm enhanced robustness. In the presence of lignocellulosic biomass-derived growth inhibitors, such as furfural, 4-hydroxybenzaldehyde, vanillin, and acetate, the cfa overexpression strain had increased optical density at 595 nm by 1.58-fold, 3.30-fold, 2.19-fold, and 1.79-fold, respectively to control strain, confirming improved microbial resistance. Further application in PHA production using glucose as a carbon source achieved a dry weight of 3.35 g/L and a PHA content of 39.2 %, representing a 1.43-fold and 3.45-fold increase, respectively, over controls. When barley straw-derived sugar, containing inhibitors such as furfural and vanillin, was used as a carbon source, dry weight and PHA content were 5.89 g/L and 47.4 %, showing a 1.42-fold increase in growth and a 2.14-fold increase in PHA production relative to the control. These findings demonstrate that the introduction of fatty acid biosynthetic genes derived from extremophiles can alter cyclopropane fatty acid composition in E. coli, thereby enhancing microbial resistance to a variety of growth inhibitors through alterations in phospholipid fatty acid composition. Additionally, this enhanced robustness supports increased PHA production using biomass derived sugars containing inhibitory substances. While this study focused on phenotypic changes in fatty acid composition, growth, and productivity upon gene introduction, further research could expand on these findings. This work contributes to the field by providing insights into the enhancement of microbial robustness and bioproduction efficiency from physiological and genetic engineering perspectives.

Deciphering Salt Tolerance Mechanisms and Enhancing Poly(3-hydroxybutyrate) Production in the Novel Bacterium Halomonas getboli

Yeonjae Yoo 고려대학교 대학원 2024 국내박사

Extremophiles, characterized by their unique biological features adapted to harsh environments, have gained significant attention in the field of biotechnology. Although these microorganisms hold high potential in diverse applications such as the production of unique metabolites and environmental purification, research focused on extremophiles remains sparse. This study delved deep into one such unexplored area, emphasizing the ecological and industrial relevance of a halophilic bacterium, Halomonas getboli, residing in abandoned salterns. Previous investigations revealed a notable decrease in microbial diversity in high-salinity environments resulting from comparing microbial communities between tidal flats and abandoned salterns. Based on these findings, culturable halophilic bacteria were isolated from sediment samples of these salt fields. From the sediment of salterns in Yongyudo, a total of 31 halophilic bacterial species were identified and subjected to halotolerance tests. Remarkably, over half of these isolates, totaling 18 strains, were identified as potential novel species. Among them, the newly identified strain Halomonas sp., which demonstrated the broadest range of salinity tolerance, was phylogenetically and physiologically characterized as Halomonas getboli. Further analyses, including whole-genome and transcriptome sequencing at various salinities, were conducted to elucidate the adaptive mechanisms and ecological roles of this novel halophile. The cheA gene, which can detect surrounding salinity, was found to be highly overexpressed. The bacterium primarily overexpressed genes related to ABC transporters responsible for ion and solute transport, and genes associated with cell motility like flagellar. Interestingly, while accumulating osmolytes within the cytoplasm to withstand osmotic pressure, this bacterium was also identified to secrete siderophores, growth hormones beneficial to nearby microorganisms, algae, and plants. These findings suggest the pioneering potential of this halophilic bacterium in colonizing and aiding the settlement of other organisms in salt-depleted areas. Lastly, focusing on the salt-adaptive mechanisms of the bacterium, the production capacity of extremolytes by Halomonas getboli was explored. Special attention was given to the biopolymer Poly(3-hydroxybutyrate) (P3HB). By irradiating with gamma rays, mutants with enhanced salinity resistance were generated. Among these, the halo6 mutant exhibited an 11% increase in P3HB production. This novel approach to improving halophilic strains provides promising prospects for the bioplastic industry and widens the potential industrial applications of extremophiles. In conclusion, this research successfully unearthed the novel halophilic bacterium, Halomonas getboli, from the unexplored environments of abandoned salt fields. It has opened new frontiers in the study of extremophilic microbes, offering fresh insights into their adaptive strategies and potential industrial applications. Moreover, by underscoring their ecological significance and diverse industrial potentials, this study lays a pivotal foundation for future advancements in biotechnological research. 극한환경 미생물은 극단적인 환경에 적응한 독특한 생물학적 특성으로 인해 생물공학 분야에서 주목받고 있다. 이들 미생물은 특이 대사물질 생성 및 환경 정화와 같은 다양한 응용 분야에서 높은 잠재력을 지니고 있지만, 아직까지 극한환경 미생물에 대한 연구는 부족한 실정이다. 본 연구는 이러한 미개척 분야 중 하나인 폐염전에 서식하는 극한환경 미생물, 특히 호염성 신종 Halomonas getboli의 생태학적 및 산업적 가치에 집중하여 깊이 있는 연구를 수행하였다. 본 연구자는 극한환경 미생물을 분리하고자 우리나라 서해안의 버려진 염전을 연구지역으로 선정하여, 이곳의 폐염전 퇴적물에서 배양 가능한 호염성 세균을 분리하였다. 용유도의 폐염전에서 총 31종의 호염성 세균을 분리 및 동정하고, 이들의 내염성 테스트를 진행하였다. 분리된 전체 31균주 중 절반이 넘는 18개의 균주가 신종후보군으로 확인되었고, 이 중 가장 넓은 범위의 염분 내성을 보인 신종후보 Halomonas sp. 를 진화계통분석, 생리 화학적 분석을 통해 Halomonas getboli로 보고하였다. 다음으로, 폐염전에서 발굴된 호염성 신종 세균 Halomonas getboli의 고염분환경 적응기작 및 생태적 역할을 밝히고자, 전장 유전체분석 및 다양한 염도에서 전사체 분석을 진행하였다. 그 결과, 주변환경의 염도를 인식할 수 있는 cheA 유전자가 가장 크게 과발현되었으며, 세포 내외로 이온 및 물질 수송 역할을 하는 ABC transporter와 세포의 운동기관인 flagellar와 관련된 유전자를 주로 과발현함으로써 고염도 환경에 적응하였다. 특히, 세포가 osmostic pressure에 견디기 위한 결과로 적합 용질을 세포질내에 축적함과 동시에 주변 미생물 및 조류, 식물의 생장을 도울 수 있는 생장호르몬인 siderophore를 분비하는 것으로 확인하였다. 이러한 결과를 통해, 이 호염성 신종 세균이 염분으로 황폐화되어 미생물 다양성이 낮아진 지역에 처음으로 번성하여, 다양한 이온 및 용질의 교환으로 적응하고, 다른 미생물도 정착해 살아갈 수 있게 하는 선구자적 종으로서의 잠재력을 지니고 있음을 제시하였다. 마지막으로, 호염성 신종 세균의 고염분 삼투압에 대한 적응기작을 중심으로 Halomonas getboli의 extremolytes 생산능력을 탐구하였다. 특히, 이차대사 연구를 통해 세균이 주로 생산하는 Poly(3-hydroxybutyrate) (P3HB)에 주목하였다. 이를 바탕으로, 호염성 세균의 PHA 대사 수율을 향상시키는 새로운 방법으로 감마선 조사를 통한 고염 내성을 갖는 돌연변이 유도를 시도하였고, 이 중 halo6 균주에서 P3HB의 생산량이 11% 증가하는 결과를 얻었다. 이 연구에서 제시한 호염성 균주 개량에 대한 새로운 접근 방법은 바이오플라스틱 산업에 혁신적인 전망을 제공하며, 극한환경 미생물의 다양한 산업적 활용에 대한 가능성을 더욱 넓힐 것으로 기대된다. 본 연구는 폐염전이라는 미개척지에서 신종 호염성 세균 Halomonas getboli를 성공적으로 발굴하였고, 이를 통해 극한환경 미생물 연구의 새로운 지평을 개척하였으며, 해당 세균의 고염분 환경에서의 적응기작과 산업적 응용 방안에 대한 신선한 시각을 제시하였다. 특히, 생태학적 중요성과 함께, 극한환경 미생물의 연구와 활용에 대한 새로운 기회와 가능성을 제시하며, 이를 다양한 생물공학 분야에 활용할 수 있을 것으로 사료된다.

Engineering synthetic probiotics for the biosensor-based production of (s)-equol and CRISPR-based biocontainment system

조성원 서울대학교 대학원 2025 국내박사

미생물은 유전적 유연성, 생리활성 화합물 생산의 효율성, 숙주 환경 내의 적응성 덕분에 치료 플랫폼으로서의 활용도가 증가하고 있다. 그러나 미생물 숙주 내에서 생리 활성 화랍물을 안정적이고 안전하게 생산하기 위해서는 유전적 구조의 최적화, 대사 산물 생산의 균형적 조절, 환경 안전성 보장이 필요하다. 본 논문에서는 이러한 치료 플랫폼으로서 미생물이 활용되기 위해 필요로 하는 섀시 최적화, 센서 모듈, 생산 모듈 그리고 생물 봉쇄 모듈을 순차적으로 개발함으로써 치료 미생물이 필요로 하는 다양한 전략들을 수립하고 구현해보는 연구를 수행하였다. 제 2 장에서는 숙주 균주 내의 불필요한 플라스미드를 제거하여 대사 부담을 줄이고, 시스템의 안정성을 높여 섀시를 최적화하는 데에 중점을 둔다. 전사체 분석을 통해 플라스미드 삭제를 통한 세포 내 간섭이 최소화됨을 검증하고, 자원 할당을 최적화하여 표적 대사 산물의 안정적 생합성을 위한 기반이 입증되었다. (S)-에쿠올은 호르몬 유사체로 활동하는 생리 활성 물질로, 화장품을 비롯한 건강기능성 성분으로 인체에 유익한 기능을 하지만, 인체 내에서 자체적으로 합성할 수 없다는 한계를 지닌다. 제 3 장에서는 (S)-에쿠올의 자가 조절적인 기질 반응성 생산 균주를 제작하였다. 생산성 최적화를 위해 코돈 최적화를 수행하고, 기질 반응성을 향상시키기 위해 단백질 공학 기술을 도입하여 10배 개선된 감도의 센서 모듈을 확보하였다. 이를 기반으로 합성된 치료 균주는 환경 입력에 따라 유전자 발현을 조절하여 외부 유도체의 의존성을 낮추고, 경제성을 확보한다. 생태계 안전을 위한 생물 봉쇄 모듈은 합성생물학 기술 기반의 인공 미생물의 다양한 산업에의 적용이 확대됨에 따라 그 필요성이 증가해왔다. 제 4장에서는 일시적인 억제만으로도 고효율 세포 사멸 효과를 보이는 CRISPR-Cas9 기술 기반의 생물 봉쇄 기술을 설계한다. 이러한 설계는 별도의 독성 물질을 생산하지 않아, 치료 및 진단 목적의 인공 미생물의 안전한 배포를 가능하게 한다. 본 연구의 전략은 최적화된 세포 구조, 통제된 대사 산물 생산, 강력한 생물 안전 봉쇄 기술을 갖춘 치료 플랫폼으로서의 미생물을 개량하는 전략적 접근법을 제시한다. 이와 같은 전략은 미생물 치료제의 발전을 위한 종합적인 틀을 제공하며, 생물의학, 진단, 지속 가능한 바이오 생산 등 다양한 분야에서 응용 가능성을 보유한다. Microorganisms are increasingly leveraged as therapeutic platforms due to their genetic flexibility, efficiency in producing bioactive compounds, and adaptability within host environments. Among them, Escherichia coli Nissle 1917 is a promising candidate for developing therapeutic microorganisms capable of producing beneficial compounds like (S)-equol, known for its health benefits such as hormone balance and anti-inflammatory effects. However, achieving reliable and safe production of bioactive compounds within microbial hosts requires optimizing genetic frameworks, balancing metabolite production, and ensuring environmental safety. In this thesis, a multi-dimensional strategy was developed to be utilized in living therapeutic microorganisms, aimed at the efficient and safe production of (S)-equol, a bioactive compound known for its health benefits, including hormone balance and anti-inflammatory effects. EcN was selected for its probiotic properties and adaptability to genetic engineering, making it an ideal chassis for developing a self-regulating and biosafe therapeutic platform. This research leverages four core synthetic biology strategies; chassis refinement, sensor and production module engineering, and biocontainment design to create a versatile platform for advancing microbial therapeutics. The chassis refinement focused on improving EcN’s stability and metabolic efficiency as a therapeutic host by eliminating cryptic plasmids, thus reducing metabolic burden and enhancing system robustness. This refined chassis provides a reliable foundation for targeted metabolite biosynthesis by minimizing cellular interference and optimizing resource allocation. To enable autonomous, substrate-responsive (S)-equol production, the sensor and production modules were optimized through gene refactoring, including codon optimization and protein engineering, achieving a biosensor with 10-fold improved sensitivity to daidzein. This high-performance sensor allows for dynamic and self-regulated control of (S)-equol synthesis, reducing dependence on costly inducers and facilitating scalable, cost-effective production by adapting gene expression in real-time to environmental inputs. The biocontainment design integrated a CRISPR-Cas9-based self-killing mechanism that achieves high-efficiency repression using temporary suppression alone, ensuring stringent containment. This biosafety measure is essential for mitigating ecological risks and aligns with responsible deployment of engineered organisms in therapeutic and diagnostic contexts. Together, these efforts present a strategic approach for engineering microorganisms as therapeutic platforms, encompassing optimized cellular architecture, controlled metabolite production, and robust containment measures. This research demonstrates a comprehensive framework for advancing microbial therapeutics, with potential applications across biomedicine, diagnostics, and sustainable bio-manufacturing.

생물전기화학적 방법을 이용한 수질 내 세균 수 측정

尹錫敏 建國大學校 大學院 2009 국내석사

A novel bioelectrochemical sensor for the detection ad enumeration of bacteria was investigated. The reducing action of bacteria on the electrochemical mediator and the interaction between a charged electrode and the bacteria were used as the basis of an amperometric measuring system. A range of bacteria including E. coli, B. subtilis, and S. aureus was studied. For the concentration of bacteria, electrodes were charged (0.1 to 0.7V) for a given time (generally 1 hr). The bacteria attached electrode was then used as a working electrode. Using a simple three electrode cell, mediator which has been reduced by the bacterial electron transport system is reoxidized at a platinum working electrode, poised at a positive potential. The amperometric reoxidation current and its rate of increase were found to be dependent on the concentrations of bacteria and mediator. Linear correlations between initial rate currents and bacterial concentrations were established (1× 10³ cfu/ml). Methylene blue (MB) was selected as a most appropriate redox mediator, and the system was most sensitive and stable using a working electrode poised at 0.3 V (vs. the reference), pH 7.0, an MB concentration of 0.0001 M, a working electrode surface area of 550 mm², and a temperature of 30 ℃. 수질 내 미생물 개체수의 빠르고 정확한 측정을 위해 전기화학적 방법을 적용하여 바이오센서를 개발하였다. 미생물의 대사 작용에서 발생하는 전자가 일정 전압 하에서 mediator를 통해 전극으로 전달되는 현상을 기본 측정 원리로 이용하였으며, 3전극계를 사용하여 기준전극과 작업전극 사이에 인가되는 전압을 미생물 대사의 전자 수용체로 사용하였다. 측정 감도 향상과 개체 수 측정 범위를 넓히기 위해 미생물 시료의 농축방법도 연구되었으며 실험균주는 Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis였으며, 연구된 mediator는 methylene blue를 비롯하여 HNQ, DCPIP, Resazurin, TPMD 등이었다. 미생물 농축의 경우, 최대 10³의 농도까지 효율적으로 측정이 가능하다는 것을 확인하였으며, 미생물농도와 발생전류신호와의 상관관계를 분석하였을 때 0.95이상의 높은 상관계수를 가지는 것으로 확인되었다

Engineering of Probiotic Escherichia coli Nissle 1917 Optimized for Gut Microbiome of Astronauts with Sialyllactose Poduction System

임재우 서울대학교 대학원 2025 국내박사

Long-term space exploration brings new concerns about the health risks associated with changes in the gut microbiome during space travel. Studies have shown that astronauts experience shifts in their gut microbiome composition compared to those on Earth, influencing the balance of both beneficial and harmful microbes. These alterations may increase the risk of developing conditions such as inflammatory bowel disease during space missions. To better understand how microbial gene networks change in the unique environment of microgravity, a systems biology approach is essential. This method enables the detailed analysis of genetic adaptations within microbial communities under new environmental conditions. By providing a comprehensive view of dynamic interactions within microbial gene networks, systems biology offers valuable insights into how these systems respond and adapt to the conditions of space exploration. In this thesis, Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) was introduced as a potential therapeutic solution to address the dysbiosis observed in the gut microbiome during space travel. To ensure its effective application, experiments were conducted to examine how the unique spaceflight gut environment influenced the viability and functionality of EcN. The space gut microbiome environment was found to differ significantly from standard culture conditions, with key factors including microgravity, microaerobic conditions, and co-culture with pathogens. Additionally, a system was developed within EcN to produce sialyllactose, which is known to strengthen the host's immune system, thus enhancing the probiotic's therapeutic potential. In the first phase of this study (Chapter 2), EcN was investigated to assess how microgravity affects its physiology and viability during long-term space missions. While probiotics are considered a promising solution for managing gut microbiome imbalances in space, few studies have explored their response to microgravity. To fill this gap, transcriptomic analysis was performed to compare EcN’s gene expression during exponential and stationary growth phases under simulated microgravity and normal gravity conditions. The results revealed that microgravity influenced several key physiological aspects of EcN, including its growth profile, biofilm formation, stress responses, metal ion transport, and adaptation to carbon starvation. In the Chapter 3, the transcriptomic response of EcN was examined when co-cultured with Pseudomonas aeruginosa PAO1 (PAO1) under simulated microaerobic and microgravity conditions. EcN responded to low oxygen by enhancing anaerobic respiration, biofilm formation, and metal ion uptake. However, in co-culture with PAO1, EcN’s growth was disrupted, with reduced energy production and biofilm formation. Metal ion utilization increased, and a shift in tryptophan and methionine metabolism under microgravity further hindered EcN’s growth. To optimize EcN under these conditions, improvements in biofilm formation and metal ion uptake systems were explored. The co-culture with PAO1 in simulated microgravity conditions was analyzed to lead to an earlier entry into the death phase for EcN, highlighting significant metabolic stress and reduced growth capacity. Finally, in Chapter 4, EcN was engineered to produce sialyllactose from sialic acid and lactose, aiming to enhance its probiotic efficacy in the gut environment. To achieve this, the catabolic pathways for both substrates were knocked out, and a biosynthesis pathway was introduced to enable sialyllactose production. After optimizing gene expression, a substantial yield was achieved to be 0.99 g/L. Additionally, sialyltransferases from biosafety level 1 organisms were used to ensure safety without compromising productivity. As a result, the final sialyllactose production reached approximately 1.21 g/L demonstrating the potential of this engineered EcN strain to combat gut microbiome imbalances in space conditions. This three-phase study demonstrates a novel approach to enhancing probiotic functionality for managing gut microbiome imbalances, particularly in the challenging conditions of spaceflight. By optimizing EcN for resilience and therapeutic efficacy, this research paves the way for future applications of engineered probiotics in both space exploration and terrestrial health management. 장기 우주 탐사 비행이 인체에 미치는 영향에 대한 연구 보고에 따르면, 우주 환경에서 장내 미생물군의 구성이 변화하면서 건강에 관련된 위험이 새롭게 제기된다. 연구에 따르면, 우주 비행사는 지구에 있는 사람들과 비교할 때 장내 미생물의 균형이 달라지며, 이로 인해 유익균과 유해균 사이의 균형이 변한다. 이러한 변화는 염증성 장질환과 같은 질병의 발생 위험을 높일 수 있다. 미세 중력 환경에서 미생물 유전자 네트워크가 어떻게 변화하는지 이해하기 위해서는 시스템 생물학적 접근이 필요하다. 시스템 생물학적 전사체 분석을 통해 새로운 환경 조건에서 미생물 군집 내 유전적 적응을 보다 정밀하게 분석할 수 있으며, 우주 탐사 시의 유전자 네트워크의 동적 상호작용을 파악하는 데 귀중한 통찰력을 제공한다. 본 연구에서는 우주 비행 중 장내 미생물 환경의 이상 현상을 해결하기 위한 잠재적인 해결책으로 Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) 균주를 도입하였다. 효과적인 EcN 균주의 적용을 위해, 우주 환경이 EcN 균주의 생존력과 기능에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 분석을 진행하였다. 우주 장내 미생물 환경은 일반적인 배양 조건과 크게 다르며, 미세 중력, 미세 산소 조건, 병원균과의 공배양이 중요한 요소로 작용할 수 있다. 추가로, EcN 균주에서 시알릭산과 유당을 바탕으로 시알릴락토스를 생산하는 시스템을 구축하여, 장내 면역 체계를 강화하고자 하였다. 연구의 첫 번째 단계(2장)에서는 재현된 미세 중력이 EcN 균주의 생리적 반응과 생존력에 미치는 영향을 평가하였다. 프로바이오틱스가 우주 환경에서 장내 미생물 불균형을 관리할 수 있는 유망한 해결책으로 간주될 수 있지만, 미세 중력이 프로바이오틱스에 미치는 영향을 다룬 연구는 부족하다. 이를 해결하기 위해, 재현된 미세 중력 및 정상 중력 조건에서 EcN 균주의 성장기와 정지기의 유전자 발현을 비교하는 전사체 분석을 수행하였다. 연구 결과, 미세 중력은 EcN 균주의 성장, 바이오필름 형성, 스트레스 반응, 금속 이온 운반 및 탄소 기아 적응 등 여러 주요 생리적 측면에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 3장에서는 EcN 균주가 재현된 미세 산소 및 미세 중력 조건에서 대표적인 병원균인 Pseudomonas aeruginosa PAO1 (PAO1) 균주와 공배양되었을 때의 전사체 반응을 분석하였다. EcN 균주는 미세 산소 조건에 적응하여 혐기성 호흡, 바이오필름 형성, 금속 이온 흡수를 강화하였으나, PAO1균주와의 공배양에서는 성장과 에너지 생산이 강하게 저하되었고, 바이오필름 형성 역시 감소하는 모습을 보였다. 또한 미세 중력 하에서 금속 이온 사용이 증가하고, 트립토판 및 메티오닌의 대사 경로 변화가 확인되었으며, 이로 인해 EcN 균주의 성장이 더욱 저해된 것으로 보여진다. 이러한 조건에서 EcN 균주의 성장을 개선하기 위해서는 바이오필름 형성과 금속 이온 흡수 시스템의 개선이 필요하다는 결론을 도출하였다. PAO1 균주와의 공배양이 EcN 균주의 세포 사망 단계에 조기 진입을 유도하여, 대사적 스트레스를 초래한다는 점도 분석되었다. 마지막으로 4장에서는 합성생물학적 툴을 적용하여, EcN 균주를 공학적으로 변형하여 시알릭산과 유당으로부터 시알릴락토스를 생산하는 시스템을 구축하였다. 이를 위해 두 기질의 이화 경로를 제거하고, 시알릴락토스 생산을 위한 생합성 경로를 도입하였다. 유전자 발현을 최적화한 결과, 상당한 수준의 시알릴락토스 생산이 이루어졌다. 또한, 안전성을 확보하기 위해 생물안전 1등급 (BSL1) 유래 시알릴전이효소를 사용하여 생산성을 유지하였다. 그 결과 최종 시알릴락토스 생산량은 약 1.21 g/L에 도달하였으며, 이로써 우주 환경에서 장내 미생물 불균형을 해결하는 데 있어 이 공학적으로 변형된 EcN 균주의 가능성을 입증하였다. 이 3단계 연구는 우주 비행과 같은 극한 환경에서 장내 미생물 불균형을 관리하기 위한 해결책으로 활용될 수 있는 프로바이오틱스의 기능 향상에 있어 새로운 접근법을 제시한다. Escherichia coli Nissle 1917 균주를 최적화하여 그 회복력과 치료 효과를 높임으로써, 우주 탐사와 지구상의 건강 관리 모두에서 활용될 수 있는 공학적 프로바이오틱스 균주의 미래 적용 가능성을 열어준다.

Control of membrane biofouling in MBR for wastewater treatment by quorum quenching bacteria

오현석 서울대학교 대학원 2013 국내박사

고도 하폐수처리 공정의 하나로써 주목 받고 있는 분리막 생물반응기(MBR)는 분리막 표면에 형성되는 생물막오염을 해결해야 하는 문제점을 안고 있다. 최근 들어 미생물 간의 정족수 감지(Quorum sensing)가 MBR의 생물막오염에 중요한 역할을 한다는 사실이 밝혀졌고, 효소를 이용한 정족수 감지 억제(Quorum quenching) 기술이 생물막오염 제어에 적용되어 그 가능성을 증명하였다. 하지만 효소를 실제 공정에 적용하는 데에는 여전히 효소 추출 및 정제에 드는 비용문제와 효소의 안정성 문제가 해결되어야 하므로, 보다 더 효과적인 정족수 감지 억제 기술의 개발을 필요로 한다. 본 연구에서는, 새로운 정족수 감지 억제 전략으로서, 정족수 감지 억제 세균을 이용한 종간 정족수 감지 억제 (interspecies quorum quenching)를 MBR에 적용하였고, 효과적이고 경제적인 생물막오염 방지 기술로서의 가능성을 증명하였다. 첫 번째로는, 아실 호모세린 락토나아제(N-acyl homoserine lactonase)를 생산하는 재조합 대장균을 정족수 감지 억제 세균으로 선택하였고, 이 세균을 ‘미생물 용기(Microbial-vessel)’라 불린 미소다공성의 중공사막 내부에 가둔 형태로 MBR에 적용하였다. 미생물 용기를 이용한 MBR에서의 생물막오염 억제는 80일 이상 그 효과가 입증되었다. 이를 통하여 세균을 이용한 정족수 감지 억제 기술이 MBR에서의 생물막오염 저감에 효과적으로 이용될 수 있다는 사실을 증명했다. 두 번째로는, 실제 MBR 플랜트에서 분리된 토착 정족수 감지 억제 세균 중에서 가장 정족수 감지 억제 활성이 우수한 Rhodococcus sp. BH4의 특성 및 정족수 감지 억제 메커니즘을 분석하였다. LC-ESI-MS을 이용한 BH4의 AHL 분해산물 분석에서는 락톤링을 열어 활성을 없애는 락토네이즈의 메커니즘을 확인할 수 있었다. BH4는 다양한 형태의 AHL 분자를 잘 분해하였는데, 각각의 AHL에 대한 분해속도는 Rhodococcus 속에 속한 다른 세균과는 많은 차이를 보였다. BH4의 정족수 감지 억제 활성은 Luria-Bertani 배지와 합성폐수에서 모두 확인 되었다. 마지막으로, BH4 세균을 MBR에 적용하여 분리막에서 일어나는 생물막오염을 성공적으로 억제하였다. 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM)을 이용해 관찰한 결과 BH4를 적용한 MBR의 분리막 위에서 생물막오염이 현저히 저하되었음을 확인하였다. 또한 미생물용기에 가둬진 BH4의 양과 미생물용기의 재료가 정족수 감지 억제 활성에 미치는 영향을 조사하였고, 이는 실제 MBR 플랜트에서 생물막오염을 억제하기 위해 정족수 감지 억제를 적용할 때 고려해야 할 공학적 관점에서의 다양한 정보들을 제공한다. 종간 정족수 감지 억제 기술을 이용한 실험실 규모 MBR에서의 성공적인 생물막오염 제어는, 이 기술이 플랜트 규모의 MBR 또는 다양한 환경공학 시스템에 경제성을 갖고 확대 적용될 가능성이 있음을 보여주었다. Recently, enzymatic quorum quenching has proven its potential as an innovative approach to biofouling control in the membrane bioreactor (MBR) for advanced wastewater treatment. However, practical issues on the cost and stability of enzymes are yet to be solved, which requires more effective quorum quenching methods. In this study, a novel quorum quenching strategy, interspecies quorum quenching by bacterial cell, was elaborated and proved to be efficient and economically feasible biofouling control in MBR. Firstly, a recombinant Escherichia coli, which produces N-acyl homoserine lactone hydrolase (AHL-lactonase), was applied to MBR for the control of biofouling, and the feasibility of interspecies quorum quenching application was confirmed. A ‘Microbial-vessel’ was designed to encapsulate these quorum quenching bacteria using a microporous hollow fiber membrane. The effect of biofouling inhibition by the Microbial-vessel was evaluated over 80 days of MBR operation. Secondly, various characteristics of an indigenous quorum quenching bacterium, Rhodococcus sp. BH4, which was isolated from a real MBR plant was investigated to elucidate its behaviors in the mixed liquor of MBR. The LC-ESI-MS analysis of the degradation product by strain BH4 confirmed that it inactivated AHL activity by hydrolyzing the lactone bond of AHL. It degraded a wide range of N-acyl homoserine lactones (AHLs), but there was great difference in the degradation rate of each AHL compared to other reported AHL-lactonase producing strains belonging to Rhodococcus genus. In addition, its quorum quenching activity was confirmed not only in the Luria-Bertani medium, but also in the synthetic wastewater. Lastly, the strain BH4 was applied to control biofouling in MBR and it has efficiently inhibited the biofouling. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) observation showed that the Microbial-vessel encapsulating strain BH4 inhibited the biofilm formation on the membrane surface during the continuous MBR operation. Furthermore, the amount of strain BH4 encapsulated in the vessel as well as the material of vessel substantially affected the quorum quenching activity of strain BH4, which would provide useful information particularly for the biofouling control in a real MBR plant from the engineering point of view. Successful control of biofouling in a laboratory scale MBR suggests that the biofouling control through the interspecies quorum quenching could be expanded to the plant scale of MBR and various environmental engineering systems with economic feasibility.

자력을 이용한 미생물연료전지 양극부의 성능 개선

최창호 건국대학교 대학원 2008 국내석사

효율적인 미생물연료전지를 개발하기 위하여 자력을 적용한 양극부가 설치된 미생물연료전지를 개발하였다. 양이온교환막을 사용하지 않은 미생물연료전지의 산소에 대한 문제점을 개선하기 위하여 양극과 음극 사이와 양극 하부에 자석을 설치하였고 발생되는 전류의 변화를 관찰한 결과 자석을 적용한 미생물연료전지의 전류밀도가 증가함을 확인할 수 있었다. 양극과 음극 사이에 설치한 자석은 음극부로의 산소 확산 속도를 감소시켰으며 이로 인해 산소 확산에 의한 저해를 감소시킴으로써 전류생산의 안정성을 증가시켰다. 양극에 자석을 부착시킨 미생물연료전지는 최대 78 %의 전력 밀도가 증가하였다. 자석을 이용한 성능 개선은 큰 비용이 소모되지 않으며 설치 후 추가로 에너지의 소비나 산소제거제와 같은 물질을 공급할 필요가 없어서 유용한 방법이라 할 수 있다. 자석에 의한 산소의 조절은 양이온교환막이 없는 미생물연료전지 외에 다른 종류의 미생물연료전지의 성능향상에도 유용할 것으로 예상되며 자석의 구조 및 자력의 세기, 적용 방법을 변경하여 더 향상된 성능의 미생물연료전지 제작을 위한 연구가 진행될 예정이다. The application of magnetic force to a cathode compartment of membrane-less microbial fuel cell (ML-MFC) increases both the oxygen supplement efficacy to a cathode and power generation. Magnetic force prevents oxygen diffusion into anode compartment and decrease of current generation. An increase of power production was observed when a permanent magnet was attached to a cathode When a permanent magnet was set under the cathode, both current density and power density increased, as compared to MFCs without a magnet. 2.71 mA/m2, 0.15 mW/m2 increased to 4.72 mA/m2, 0.26 mW/m2 in non-aerated MFCs. 19.17 mA/m2, 1.15 mW/m2 increased to 22.51 mA/m2, 1.36 mW/m2 in aerated MFCs. The effect of the magnet in aerated MFCs was lower than the effect in non-aerated MFCs. The magnetic force effect can be explained by an increased dissolving and diffusion rate of oxygen by the magnetic attractive force acting on oxygen gas. The use of permanent magnets is effective in promoting oxygen reduction. The experiment’s results promote a new method for improving the performance of ML-MFC without consuming energy.

Bioorthogonal Click Chemistry for Precise Tracking of Implanted Stem Cells

임승호 서울대학교 대학원 2021 국내박사

재생의학에서 줄기세포의 세포이식치료를 위한 안전성과 효율성을 확보하기 위해 줄기세포를 추적하는 분자영상 기술이 최근 발전하고 있음에도 불구하고 생체적합성, 안전성, 특정 결합성, 고유 세포 기능에 영향을 주지 않는 효과적인 줄기세포 표지기술이 여전히 필요하다. 따라서 이식된 줄기세포의 생착 효율과 행동에 대한 정보를 얻기 위해서는 보다 단순하고 선택성이 높으며 독성이 없는 새로운 분자영상 기법이 필요하다. 이러한 점에서 생물직교성 클릭반응을 이용한 표지방식은 기존 표지기술의 한계를 극복하고 안전성과 함께 선택적인 높은 표지효율을 제공할 수 있다. 따라서, 본 논문에서는 재생의학에서 이식된 줄기세포의 정확한 추적을 위해 생물직교성 클릭화학을 통해 줄기세포에 다양한 영상 분자들을 표지하고 이를 질환 동물 모델에 이식하여 추적 관찰하였다. 생물직교성 클릭화학을 통한 효과적인 줄기세포 표지를 위해서는 대사공학 과정을 통해 아지드기가 세포 표면에 효율적으로 발현이 되어야 한다. 이에 논문의 제 2장에서는 다양한 아지드기를 포함한 단당류들을 통해 세포 표면으로의 발현이 가장 효과적인 단당류를 선정하고 생물직교성 클릭화학 반응을 통해 최적화된 표지 효능을 도출하였다. 더불어 생물직교성 클릭화학 반응을 통해 다양한 분자와 나노입자를 세포에 표지할 수 있기 때문에 영상 추적이 가능한 근적외선 형광 단분자와 금나노입자를 각각 세포에 표지하였다. 근적외선 형광 단분자와 금나노입자 모두 세포에 효과적으로 생물직교성 클릭화학 반응을 통해 부착되었으며, 줄기세포 고유의 기능에 영향을 주지 않았다. 이러한 장점으로 생물직교성 클릭화학 반응은 선택적이고 효과적이며 세포에 독성을 나타내지 않는 안전한 세포 표지 기술로 사용될 수 있다. 다음으로 본 논문에서는 생물직교성 클릭화학을 통해 표지된 줄기세포를 질환 동물모델에 이식하여 이를 추적하는 연구를 진행하였다. 제 3장에서는 생물직교성 클릭화학을 통해 근적외선 형광 단분자로 표지된 배아줄기세포 유래 혈관내피 전구세포를 하지허혈이 유도된 쥐의 허벅다리에 주입한 후 4주간 3차원 입체 구조 분석이 가능한 형광분자 단층촬영 장비를 통하여 세포의 거동을 분석하였다. 생물직교성 클릭화학을 통해 표지된 혈관내피 전구세포는 4주간 이식된 부위에서 혈관에 제거된 방향으로 서서히 이동하는 것인 관측되었다. 더불어 초기에 이식된 세포의 형태가 4주 뒤 치료결과에도 영향을 주는 것을 확인하여 재생의학에서의 이식된 줄기세포 추적 및 거동 연구의 중요성을 보여주었다. 제 4장에서는 자기공명영상과 형광영상이 가능한 나노입자를 개발하여, 이를 생물직교성 클릭화학을 통해 줄기세포에 표지하여 뇌졸중 질환 동물 모델에 이식하여 추적 관찰하는 연구를 진행하였다. 생체 적합성을 지닌 글리콜 키토산 기반의 고분자에 근적외선 형광 분자와 생물직교성 클릭화학 반응이 가능한 상대입자를 화학적으로 결합하였다. 이후 자기공명영상 추적이 가능한 철입자를 담지하여 형광영상과 더불어 자기공명영상 분석이 가능한 나노입자를 개발하였다. 나노입자는 줄기세포에 생물직교성 클릭화학 반응을 통하여 특이적이면서도 효과적으로 세포 표면에 부착되었으며, 뇌졸중 동물모델에 이식된 세포는 2주간 자기공명영상과 형광영상 정보를 통해 세포의 이식위치 및 거동을 확인할 수 있었다. 종합적으로, 본 논문에서는 생물직교성 클릭화학을 이용하여 줄기세포를 형광분자와 나노입자로 효과적으로 표지하였다. 생물직교성 클릭화학의 일련의 과정은 독성이 없고 줄기세포 고유 기능에 영향을 주지 않으면서 이미징 프로브와 클릭화학을 통해 선택적인 결합반응을 보여주었다. 생물직교성 클릭화학을 통해 표지된 줄기세포는 질환 동물모델에 이식된 후 다양한 비침습적 영상장비를 통해 장시간 효과적으로 세포의 영상정보를 제공하였다. 본 연구를 통해 재생의학에서 생물직교성 클릭화학 기반 표지기술은 하지허혈, 뇌졸중과 같은 난치정 질환에 사용되는 줄기세포의 이식 후 체내에서의 정확한 거동 정보를 제공할 수 있을 것으로 기대된다. 더나아가 초기 이식된 세포치료제의 이식된 형태와 초기 이동 특성을 관찰하여 치료 반응성을 예측하고 이를 통해 치료 전략을 수립할 수 있도록 함으로써 다양한 세포치료제 개발 및 치료 효능 향상에 활용할 수 있을 것으로 기대한다. Even though with the recent advances in molecular imaging technology for tracking stem cells to understand their therapeutic roles, effective stem cell labeling technology with biocompatibility, safety, specific bound, and not disturbing native cell function is still needed. Consequently, novel molecular imaging techniques with more simple, high sensitivity, strong selectivity, and non-toxic are necessary to investigate implanted stem cell fate and behavior. In this respect, the labeling approach using bioorthogonal click reaction can overcome current limitations and offer unique properties for specific labeling and tracking cells. Here, we developed bioorthogonal click chemistry with metabolic glycoengineering to stem cells for effective cell labeling and tracking. First, we validated the bioorthogonal click chemistry with metabolic glycoengineering labeling method using various azide containing sugars and optimized labeling efficacy. We screened the azide containing sugars (Ac4ManNAz, Ac4GalNAz, and Ac4GlcNAz) on human mesenchymal stem cells (hMSCs) and selected Ac4ManNAz which has the most effective labeling property. Then, we optimized labeling efficiency by treatment concentrations and incubation times of Ac4ManNAz using clickable near-infrared fluorescence dye. Also, we developed and labeled gold nanoparticles, which were widely used in stem cell labeling and tracking, through bioorthogonal click reaction. Both near-infrared fluorescence dye and nanoparticles were selectively and effectively bound on hMSCs surface via bioorthogonal click reaction without affect cell native functions. This labeling strategy can be used for selective and effective labeling stem cells with small molecules and nanoparticles. Second, we applied bioorthogonal labeling strategy on human embryonic stem cells-derived endothelial progenitor cells (hEPCs) for precise track hEPCs after transplantation in vivo. Bioorthogonally labeled hEPCs with near-infrared fluorescence dye (DBCO-Cy5) showed a significant strong NIRF signal without any change of cellular function in vitro. The migration and distribution in vivo after implantation of bioorthogonally labeled hEPCs were successfully monitored in the ischemic hind limb mouse models using fluorescence molecular tomography (FMT) imaging system for 28 days. Also, we demonstrated the initial transplanted form of cells correlated with therapeutic efficacy such as blood reperfusion and neovascularization. Therefore, bioorthogonal click reaction method can be used for the effective labeling of hEPCs and to predict therapeutic efficacy for regenerative medicine. Third, we developed dual-modal nanoparticles (BCN-dual-NPs) which can be selectively bound stem cell surface via bioorthogonal click reaction and provide an accurate signal of labeled stem cell transplanted in brain stroke mouse model. Glycol chitosan-based NPs were chemically conjugated with BCN, as complementary bioorthogonal moiety, and near-infrared fluorescence dye (Cy5.5). Superparamagnetic iron oxide nanoparticles were also encapsulated into NPs therefore it can be tracked by MR and NIRF imaging systems. BCN-dual-NPs were specifically conjugated on hMSCs via bioorthogonal click reaction and it showed not any change of cell functions and cytotoxicity. Bioorthogonally BCN-dual-NPs labeled hMSCs were effectively observed using NIRF and MR imaging system and provided information on stem cell migration in the stroke-induced brain for two weeks. Taken together, we demonstrated a promising stem cell labeling strategy using bioorthogonal click chemistry with metabolic glycoengineering. The bioorthogonal labeling technique showed specific and selective reactions with very few toxic and change cell functions. Furthermore, bioorthogonally labeled stem cells can be easily tracked using non-invasive imaging methods with precise information of stem cell fate after implantation. Our stem cell labeling strategy via bioorthogonal click reaction will provide valuable information in regenerative medicine based on stem cell therapy for various intractable diseases, including hind limb ischemia and brain stroke.

Plant Microbial Fuel Cell를 이용한 Solanum lycopersicum의 활성도 변화 측정

이은빈 건국대학교 대학원 2021 국내석사

본 연구에서는 식물 미생물 연료전지를 이용하여 미생물의 활성도를 측정하는 시스템을 개발하였다. 식물은 광합성을 통하여 양분을 생산하고 일부를 뿌리를 통해 배출한다. 이로 인해 뿌리 부근의 미생물 활성에 영향을 주게 된다. 기존의 식물 활성도의 확인은 경험에 의한 육안 확인이 일반적 이였으나, 이 시스템 이용 시 비침투식이며 직접적인 방법으로 식물의 활성도 모니터링이 가능하다. 실험 식물은 토마토(Solanum lycopersicum)씨로부터 재배하여 사용하였다. 식물 배양 조건에 따른 전기화학 신호와 미생물 군집 비교 분석, 그리고 식물 생장 호르몬 IAA(Indole acetic acid) 함량을 확인하였다. 그 결과 이를 식물의 활성도로 활용할 수 있음을 확인하였다. 식물 수에 따른 전기신호와 미생물 군집 비교를 위하여 토마토 씨를 아무것도 뿌리지 않은 것과 토마토 씨 10립을 골고루 뿌린 것으로 나누어 진행하였다. 두 그룹을 비교한 경우, 약 0.1V의 전압 차이가 나타나는 것을 확인하였다. 또한 빛에 따른 전기신호와 미생물 군집 비교, 식물 생장 호르몬 IAA의 함량 분석을 위하여 적외선 (λmax 849nm), 적색 (λmax 660nm), 황색 (λmax 600nm), 녹색 (λmax 500nm), 청색 (λmax 450nm), 자외선 (λmax 300nm), control로 나누어 진행하였다. 모든 빛의 광량은 700lux로 맞추었으며 다른 빛에 비해 적색과 청색에서 약 0.12V의 높은 신호가 측정되었다. Control의 경우 다른 빛에 비해 약 0.04V로 가장 낮은 신호가 측정되었다. 근권부 미생물의 동정을 통해 토마토 씨 10립을 뿌린 식물에서 Electrochemically Active Bacteria (EAB)의 종류가 많이 발견되었다. Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)를 통해 식물 수와 빛 변화 시 미생물 군집이 변화하는 것을 확인하였다. 본 연구를 통해 식물 조직에 삽입하는 센서와는 달리, 식물에 손상을 주지 않는 비삽입형 센서를 사용한 방법으로서 식물-미생물 연료 전지를 이용한 식물 활성도 모니터링 시스템을 개발하였다. 1개의 소형 식물만이 아니라 대량 재배 시설에도 쉽게 적용할 수 있기 때문에 현재 주목 받고 있는 식물 공장과 식물 관련 연구 및 산업에도 쉽게 적용이 가능 할 것으로 판단된다. In this study, plant activity monitoring sensor using Plant Microbial Fuel Cell (PMFC) was investigated. The experimental plant for the system was the Solanum lycopersicum. The electrical potential development from of the PMFCs during the growth of the plant on the various cultivation condition was the basis of the experiment. The results indicated that the electrical potential developments from the PMFCs were closely related to plant activity. Preliminary results showed that the monitoring of seed germination from the soil was possible using the system. When the PMFC systems with the experiment plants were operated with different color of light (i.e. Infrared ray (λmax 849nm), Ultraviolet (λmax 300nm) and visible light(400-700nm)) over 40 day, the red (λmax 660nm) and the blue light (λmax 450nm)induced the highest potential generation accompanying with the higher plant growth rate. Under the red and the blue light condition, high concentrations of indole-3-acetic acid (IAA) were observed in the roots and the leaves of the plant. To identify bacteria in the rhizosphere, soil sample near the root surface were collected and bacterial community was compared by denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) method. The results indicated that the different light condition induced different bacterial species in the plant rhizospheres. These experimental results suggest that the PMFC technology can be implemented in plant activity monitoring, and plant related researches and industries.

Development of an in vitro gut simulation device and multiomics based investigation of host-microbe interaction

송원석 서울대학교 대학원 2021 국내박사

After the advent of multiomics technologies to improve our knowledge of the gut microbial ecosystem, studies revealed that the gut microbiota has an important role in the maintenance of human health and in disease pathogenesis. Specifically, they have triggered interest in developing short-chain fatty acid producers as next-generation probiotics, targeted at increasing colonic short-chain fatty acid (SCFA) production and countering disease-associated microbiota alterations. Nonetheless, the development of next-generation probiotic strains has progressed slowly since conventional animal experiment models have a variety of limitations, i.e. high-cost, labor-intensive, time-consuming, and genetic dissimilarities. In addition, the previous analytical techniques to quantify SCFAs have limited sensitivities and reliabilities for the high-throughput screening of SCFA producers. Therefore, this thesis developed an in vitro gut simulation device for the evaluation of anaerobic bacteria by multiomics analysis and a chemical derivatization method for the sensitive analysis of SCFAs in small volumes of bacteria culture. Based on these techniques, the thesis screened the highest butyrate production in the human gut bacteria and evaluated its biological effects on the host cells in vitro. First, this study elaborates on the development of the in vitro device that simulates the gut epithelium to elucidate the biological effects of living anaerobic bacteria via multiomics analysis: the Mimetic Intestinal host-Microbe Interaction Coculture System (MIMICS). Both human gut epithelial cells (Caco-2) and the anaerobic bacterium, Akkermansia muciniphila, can remain viable for 12 hours after coculture in the MIMICS. The changes of transcriptomics and proteomics (i.e. cell-cell junctions, immune responses, and mucin secretion) in gut epithelial cells after the treatment with A. muciniphila closely correspond with those reported in previous animal studies. In addition, multiomics results revealed that A. muciniphila activates glucose and lipid metabolism in gut epithelial cells, leading to the increase in ATP production. This study suggests that the MIMICS may be an effective general tool for evaluating the effects of anaerobic bacteria on gut epithelial cells. Second, a chemical derivatization method was developed to quantify SCFAs by liquid chromatography tandem mass spectrometry with multiple reaction monitoring mode. SCFAs were chemically derivatized by Girard’s reagent T, providing a permanent cationic charge. This technique demonstrated an excellent quantitative capacity, showing good linearity (R2> 0.99) and limit of quantification (femtomole levels) for five SCFAs (i.e., acetate, propionate, butyrate, valerate, and caproate). Next, this study applied this derivatization method to quantitate SCFAs from a small volume of total extracellular metabolites produced by Eubacterium rectale (E. rectale), one of main butyrate-producing gut bacteria. These results suggest that this highly sensitive method would be useful for quantifying SCFAs extracted from stool in an aqueous solution to monitor gut health. Third, 96 well-based culture and SCFA analysis method were manipulated to discover that Roseburia intestinalis produces the highest amount of butyrate among the major butyrate-producing bacteria in human gut. In addition, this study verified that R. intestinalis also upregulated the mRNA expression of tight-junction proteins and improved the gut barrier integrity of caco-2 cells. The MIMICS revealed that R. intestinalis improves gut epithelial barrier and activates metabolism for producing cellular energies. Consequently, this study suggests the highest butyrate-producing bacterium R. intestinalis as a promising next-generation probiotic candidate for the improvement of human gut health. In short, the MIMICS and mass spectrometry based analytical methods presented herein would be powerful tools for screening SCFA-producing bacteria and analyzing the biological effects of anaerobic bacteria on gut epithelial cells and predicting underlying mechanisms. 최근 인간 장내미생물총의 변화가 숙주인 인체 건강에 막대한 영향을 미친다는 것이 보고되면서 이들에 대한 영향 평가 연구가 활발하게 이루어지고 있다. 차세대 유익균으로서 장내 미생물 유래 단쇄지방산 중 장에 유익한 영향을 야기하는 대표적 대사산물인 부티르산 (butyrate)을 과생산하는 장내 미생물을 탐색하고, 본 균주의 장 상피세포에 대한 영향 평가를 실행하고자 했다. 첫 번째로, 장내 혐기성 미생물에 대한 영향 평가를 수행할 수 있는 체외 인체 장 모사 공동 배양 장치 (in vitro human gut simulation coculture device)를 개발하였다. 전통적으로 장내 혐기성 미생물에 의한 장 상피세포의 생물학적 표현형 변화를 관찰하기 위해서는 쥐와 같은 동물 실험 모델을 사용하였다. 하지만 동물 실험 모델은 혐기성 미생물에 대한 영향 평가를 하는 것에 있어 여러 가지 치명적인 한계점 (동물 모델 양육에 고비용이 필요, 높은 수준의 노동력 요구, 장기간의 실험 시간 소모, 인간과의 유전적 상이성, 그리고 동물 실험 모델을 사용함에 있어 윤리적 문제 등)이 존재한다. 따라서 본 연구에서는 기존의 동물 실험 모델의 한계점을 극복하여 장내 혐기성 미생물에 대한 영향 평가를 진행할 수 있는 체외 인간 장 모사 공배양장치를 개발하였다. 본 기기는 장 상피세포주가 배양되는 다공성 막 지지체를 혐기성 배양액과 호기성 배양액 사이에 위치시킴으로 기기 내 장내 혐기성 미생물과 장 상피세포의 공동 배양이 가능한 구조이다. 본 기기를 활용하여 차세대 유익균으로 주목 받는 장내 혐기성 미생물 균주인 Akkermansia muciniphila를 장 상피세포와 공동 배양한 결과, 두 종류의 세포 모두 배양 후 12시간동안 생활성이 유지되는 것을 확인하였다. 또한 A. muciniphila에 의한 장 상피세포의 단백질체적 변화를 전통적인 체외 호기성 배양 방법의 결과와 비교하여, 본 기기에서 진행한 혐기성 미생물에 대한 영향 평가가 전통적인 공동 배양 방식보다 동물 실험 결과 (세포간 접합 단백질, 점액질 생성 및 분비, 그리고 면역 반응 관련 단백질 변화)와 더욱 유사한 것을 보았다. 본 연구는 이렇게 기존의 동물 실험의 결과를 본 기기에서 재현할 뿐만 아니라, 다중 오믹스 분석을 통해 A. muciniphila가 장 상피세포의 에너지 대사를 촉진시키는 것을 분석하였다. 본 연구는 이렇듯 장내 혐기성 미생물에 대한 영향 평가를 진행할 수 있는 체외 인간 장 모사 공동 배양 장치를 개발하였고, 차후 다음과 같은 기기를 이용하여 장내 혐기성 미생물 평가에 이용할 수 있음을 제시하였다. 두 번째로, 액체크로마토그래피 텐뎀 질량분석장비 (Liquid chromatography tandem mass spectrometry, LC-MS/MS) 분석법 기반의 Girard’s reagent T (GT)를 이용한 고감도 단쇄지방산 화학적 유도체화법을 개발하였다. 장내 미생물 유래 단쇄지방산은 인체 내 단쇄지방산 중 대부분을 차지하며, 이들은 인체 전반적으로 유익한 영향 (에너지 공급, 장벽 강화, 그리고 면역 시스템 발달 등)을 미친다. 하지만 단쇄지방산의 화학적 특성 (높은 휘발성, 낮은 분자량)으로 인해 주요한 대사체 분석 장비인 LC-MS/MS에서 분석하기 어렵다는 한계점이 있다. 본 연구에서는 위와 같은 문제점을 해결하기 위해 영구적인 양이온을 지니고 있는 분자인 GT를 단쇄지방산 (acetate, propionate, butyrate, valerate, and caproate)에 결합하는 화학 반응을 최적화하고, 이에 대한 LC-MS/MS 분석법을 개발하였다. 그 결과, 전통적으로 단쇄지방산 분석에 활용되었던 기체크로마토그래피 텐뎀 질량분석장비 (GC-MS)와 LC-MS 분석법과 비교하여 월등히 민감도가 상승한 것을 확인하였다. 뿐만 아니라 본 분석법은 정량성이 우수하고, 유도체화물을 4°C 에서 보관 시 7일간 정량성에 변화가 없음을 보았다. 본 연구는 개발한 분석법을 이용하여 장내 주요 부티르산 생산균인 Eubacterium rectale이 자일란 영양 배지에서 가장 부티르산을 과생산하는 것을 확인하였다. 또한 대표적인 유산균인 Bifidobacterium longum과의 공동 배양을 통해 기존에 E. rectale이 소화하지 못하는 이눌린 영양 배지에서도 부티르산 생산이 가능한 것을 보았다. 따라서 본 연구에서는 장내 미생물 유래 단쇄지방산을 LC-MS/MS에서 고민감도로 분석할 수 있는 GT 화학적 유도체화법을 개발하였고, 이를 통해 장내 미생물의 단쇄지방산 생산력 정량 분석을 진행할 수 있음을 보였다. 마지막으로, 본 연구는 장내 부티르산 생산 균주 중 부티르산을 과생산하는 균주를 스크리닝하고, 체외 인체 장 모사 공동 배양 장치에서 본 균주에 대한 영향 평가를 진행하였다. 최근 부티르산 생산 균주에 대한 인체 건강 증진 효과들이 보고되면서, 이들이 차세대 유익균으로 각광받고 있다. 하지만 제한적인 동물 실험 모델 프로세스로 인해 관련 연구가 지지부진한 상황이다. 본 연구에서는 장내 부티르산 생산균 중 부티르산 생산력이 높은 균주를 신속하게 스크리닝하기 위해 96웰 플레이트 기반의 장내 부티르산 생산균 배양법 및 부티르산 분석법을 최적화하였다. 그 결과, 4 종의 주요 장내 부티르산 생산균 (Eubacterium rectale, Faecalibacterium prausnitzii, Roseburia hominis, and Roseburia intestinalis) 중 R. intestinalis가 가장 부티르산 생산량이 높고, 다양한 종류의 식이섬유를 소화할 수 있는 것을 확인하였다. 이들에 대한 장 상피세포의 세포간 접합 단백질 (ZO-1, occluding, and claudin 3) 발현 변화를 관찰하기 위해 부티르산 생산균 배양추출액을 caco-2 cell에 처리하고 전사체 발현을 확인하여, R. intestinalis의 배양추출액이 세포간 접합 단백질의 발현을 가장 증강시킴을 보였다. R. intestinalis의 인체 장 내 영향 평가를 하기 위해 본 연구에서 개발한 체외 인체 장 모사 공동 배양 시스템에서 장 상피세포와 공동 배양하였고, R. intestinalis가 에너지 대사를 증가시킴을 보였다. 본 연구를 통해 R. intestinalis가 차세대 유익균으로서 인체 건강 증진을 위해 유용하게 사용될 수 있음을 예측하였다. 본 연구를 통해 개발된 체외 인체 장 모사 공동 배양 시스템 및 단쇄지방산의 화학적 유도체화법은 차후 장내 혐기성 미생물 스크리닝 및 다양한 유래의 단쇄지방산 정량 분석에 있어 강력한 도구가 될 것으로 기대한다.