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- 저자 : 최주광 (검색결과 1 건)
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섬유아세포는 생체조직에서 발견되는 대표적인 결합조직 세포이며, 특히 골격근 섬유아세포는 전반적인 신체 곳곳에 분포해있다. 조직공학기법에서 세포를 생체 내로 주입하는 방법 중 하나인 근육내 주사법의 경우, 주입한 세포와 처음으로 상호작용하게 될 세포는 골격근 섬유아세포가 된다. 그러나, 각기 다른 다양한 조직으로부터 유래한 섬유아세포에 비해 골격근 유래 섬유아세포의 분리방법은 명확히 알려진 것이 없다. 따라서, 본 연구에서는 마우스 골격근 섬유아세포의 분리방법을 최적화하고, 일반적으로 다양하게 활용되는 마우스 배아 섬유아세포와의 형태학적 모양과 배가시간, 골격근에 생물학적 영향을 미칠 수 있는 기능성 유전자의 발현수준 차이를 조사하였다. 조직공학적으로 의료용 세포를 사용할 때 세포의 저장이 필수적이므로, 본 연구는 세포의 근원과 저장기간에 따라 기능성 유전자의 발현수준 변화여부를 조사함으로써, 조직공학에서의 골격근 섬유아세포 효용성을 높이고자 하였다. 배아 섬유아세포의 분리는 마우스 배아의 머리와 내부장기를 제거한 후, 조직을 절단하고 트립신을 사용한 효소분해법으로 진행되었다. 또한, 골격근 섬유아세포의 분리는 마우스의 골격근 조직을 절단한 후, 콜라겐 분해효소 type Ⅱ를 사용한 효소분해법으로 진행되었다. 조직에서 분리한 일차 섬유아세포의 양성대조군으로써 섬유아세포 세포주 (McCoy)를 사용하였다. 분리된 두 섬유아세포는 형태학적으로 유사했지만, McCoy를 기준으로 배아 섬유아세포와 골격근 섬유아세포의 배가시간은 각각 7.5 ± 4.4 시간, 16.3 ± 3.3 시간이 느린 것으로 조사되었다 (p < 0.0001). 분리된 배아 섬유아세포 및 골격근 섬유아세포의 기능성 유전자 발현정도 (vimentin, fibroblast specific protein-1; FSP-1, fibronectin, α-smooth muscle actin; α-SMA)를 조사한 결과는 다음과 같았다. Vimentin, FSP-1의 유전자 발현수준은 분리된 섬유아세포간에 유의적인 발현차이는 나타나지 않는 것으로 조사되었다. Fibronectin의 유전자 발현수준은 McCoy를 기준으로 골격근 섬유아세포에서 유의적인 발현차이가 나타나지 않았지만, 배아 섬유아세포에 비해 골격근 섬유아세포에서 0.6 ± 0.1 배로 유의하게 낮은 것으로 조사되었다 (p < 0.01). α-SMA의 유전자 발현에 대한 밀도차이는 McCoy를 기준으로 배아 섬유아세포 및 골격근 섬유아세포에서 각각 13.9 ± 0.9 배, 11.1 ± 0.8 배로 유의하게 높은 것으로 조사되었다 (p < 0.0001). 이는, 섬유아세포의 근원에 따른 세포의 기본적 형태에는 큰 차이가 없으나, 섬유아세포의 근원에 따른 유전적 변화 및 골격근에 영향을 미칠 수 있는 생물학적 기능에는 차이가 있다는 것을 의미한다. 또한, 장기간 저장기간에 따른 (12 주) 배아 섬유아세포에서 fibronectin의 유전자 발현수준은 저장기간이 경과함에 따라 (8 – 12 주), 저장하지 않은 세포와 비교시 1.5 ± 0.2 배로 유의하게 증가하는 것으로 조사되었다 (p < 0.05). 이는, 배아 섬유아세포의 경우, 장기간 저장과정이 fibronectin 관련 연구 결과에 영향을 줄 수 있음을 의미한다. 본 연구에서는 광범위하게 활용될 수 있는 골격근 섬유아세포의 효율적인 분리방법을 확립하였으며, 마우스 배아 섬유아세포와 골격근 섬유아세포와의 생물학적으로 기능적인 차이를 제시하였다. 본 연구는 연구목적에 따른 세포선정을 위한 기초자료로 제공될 수 있다. 또한, 확립된 골격근 섬유아세포 분리법은 향후 연구에서 골격근 섬유아세포의 응용성 및 효용성 극대화에 활용될 수 있을 것으로 기대된다. Fibroblasts are representative connective tissue cells found in biological tissues, and in particular, skeletal muscle-derived fibroblasts are distributed throughout the body. In the case of intramuscular injection, which is one of the methods of injecting cells into vivo in tissue engineering techniques, the cells that will first interact with the injected cells are skeletal muscle-derived fibroblasts. However, compared to fibroblasts derived from various different tissues, there is no clearly known method of isolating fibroblasts derived from skeletal muscle. Therefore, in this study, we optimized the method of isolating mouse skeletal muscle-derived fibroblasts, investigated the morphological shape, doubling time and the difference in expression levels of functional genes that may have biological effects on skeletal muscle, compared to commonly used mouse embryonic fibroblasts (MEFs). Since storage of cells is essential for the medical use of the cells for tissue engineering, this study aimed to improve the utility of skeletal muscle-derived fibroblasts in tissue engineering by investigating whether the expression level of functional genes changes depending on the source and storage period of the cells. Isolation of MEFs was performed by removing the head and internal organs of mouse embryos, chopping the tissues, and enzymatic digestion using trypsin-EDTA. Then, isolation of skeletal muscle-derived fibroblasts was performed by enzymatic digestion using collagenase type II after chopping the skeletal muscle tissue of the adult mouse. Fibroblast cell line (McCoy) was used as a positive control for the characterization of primary fibroblasts. Though two isolated fibroblasts were morphologically similar, the doubling times of MEFs and skeletal muscle-derived fibroblasts were 7.5 ± 4.4 hours and 16.3 ± 3.3 hours slower, respectively compared to McCoy (p < 0.0001). The results of functional gene expression levels (vimentin, fibroblast specific protein-1; FSP-1, fibronectin, α-smooth muscle actin; α-SMA) in MEFs and skeletal muscle-derived fibroblasts were as follows. The gene expression levels of vimentin and FSP-1 were found to have no significant difference between MEFs and skeletal muscle-derived fibroblasts. The gene expression level of fibronectin was found to be significantly lower in skeletal muscle-derived fibroblasts than MEFs, 0.6 ± 0.1 times (p < 0.01), although there was no significant difference in skeletal muscle-derived fibroblasts compared to McCoy. The difference in density for gene expression of α-SMA was significantly higher in MEFs and skeletal muscle-derived fibroblasts, 13.9 ± 0.9 times and 11.1 ± 0.8 times, respectively, compared to McCoy (p < 0.0001). This means that there is no significant difference in the basic morphology of cells according to the source of fibroblasts, but there are differences in genetic changes and biological functions that may affect skeletal muscle according to the source of fibroblasts. In addition, the gene expression level of fibronectin in MEFs according to the long-term storage period (12 weeks) was significantly increased by 1.5 ± 0.2 times as compared to the non-stored cells as the storage period proceed (8 – 12 weeks) (p < 0.05). This means that a long-term storage can affect the results of fibronectin-related studies in the case of MEFs. In this study, an efficient isolation method for skeletal muscle-derived fibroblasts that can be widely used has been established, and the biologically functional differences between MEFs and skeletal muscle-derived fibroblasts were observed. This study can provide as basic data for the selection of optimal fibroblasts for tissue engineering according to the each research purpose. Furthermore, the established skeletal muscle-derived fibroblasts isolation method is expected to be utilized to maximize the applicability and utility of skeletal muscle-derived fibroblasts in the future studies.
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