Development of cartilage tissue engineering applications using mesenchymal stem cells

조혜란 인천대학교 일반대학원 2019 국내석사

Osteoarthritis (OA) is a common chronic disease caused damage on focal area of the articular cartilage and caused by extreme exercise and aging. Current surgical treatments for OA had a series of disadvantages such as fibrocartilaginous tissue formation and donor site morbidity. Therefore, in order to overcome these problems, researchers developed advanced treatments with the aid of mesenchymal stem cell (MSCs) including (bone-marrow derived stem cells (BMSCs) and adipose-derived stem cell (ADSCs)). Recent stem cell therapies based on tissue engineering and regenerative medicine have been developed combining with scaffolds and exogenous growth factors. MSC has self renewal ability and multipotency that can differentiate into bone/cartilage tissue, and is well known for pro-inflammatory effect within inner body conditions. Additionally MSC can be isolated easily from bone-marrow or adipose tissue with high yields. Therefore, it has been used as a common cell source utilized under various conditions in tissue engineering. For enhanced stem cell differentiation, exogenous growth factors (GFs) are administrated by using various delivery carriers (i.e., micelle, liposome, synthetic polymeric platform etc.). Especially, transforming growth factor-beta family (TGF-β) and insulin-like growth factor (IGF) are widely used as an exogenous growth factor for chondrogenesis of stem cell. IGF-1 and TGF- β could enhance the chondrogenesis of stem cells by developing morphological changes and inducing excretion of extracellular matrix (ECM) components. Hence, tissue engineering strategies for chondrogenesis of stem cells have been developed by varying (1) cell culture methods, (2) exogenous biological cues, (3) composition of ingredients, and (4) modification of scaffolds. This article summarized engineering applications for cartilage regeneration using stem cells, by suggesting (1) co-culture stratgies using MSC and chondrocytes, (2) recent clinical trials for ADSC-mediated joint repair, and (3) optimization of serum types (i.e., bovine serum (BS), new-born calf serum (NCS)) for enhanced chondrogenesis of ADSC. Administration of a single cell population of either stem cells or chondrocytes does not guarantee a full recovery of cartilage defects. Therefore, current tissue engineering approaches using co-culture techniques have been developed to mimic complex and dynamic cellular interactions in native cartilage tissues and facilitate changes in cellular phenotypes into chondrogenesis. Therefore, this article introduces recently developed co-culture systems using two major cell populations of, MSCs and chondrocytes. Furthermore, the present article also summarizes the recent clinical applications utilizing ADSC and its clinical and therapeutic efficacy which evaluated by scoring systems for OA treatment. Current ADSC treatments in clinical system have been developed by direct injection of ADSC with additional compounds such as platelet-rich plasma (PRP) and stromal vascular fraction (SVF) for enhancing differentiation of stem cells. In addition, optimization of serum types for a large-scale stem cell production/culture is also critical parameter to develop a cost-effective and biologically functional chondrogenesis process. Fetal bovine serum (FBS) is the most essential supplement in culture media for cellular proliferation, metabolism, and differentiation. However, due to a limited supply and subsequently rising prices, a series of studies have investigated a biological feasibility of replaceable serums to substitute FBS. Along with the increasing interests to manufacture stem cell-based cellular products, optimizing the composition of culture media including serums and exogenous GFs is of importance. Hence, the effect of BS and NCS on proliferation and chondrogenic differentiation capacity of human ADSCs was evaluated, especially in the chondrogenically supplemented culture condition. Our findings demonstrated that (1) co-culture methods using stem cells with chondrocytes could effectively augment chondrogenesis and stem cell differentiation as compared with monoculture, (2) clinical ADSC treatment could be an effective cell therapy by improving physical function of damaged cartilage sites, and (3) serum types and exogenous supplements of GFs could also be important parameters to optimize culture media composition, especially in order to maintain the enhanced levels of both proliferation and chondrogenic differentiation of ADSCs during expansion. Therefore, it could be speculated that stem cell therapy utilizing stem cell population could be an effective OA treatment in tissue engineering and regenerative medicine. 골관절염은 흔한 만성 질환으로 관절 연골의 국소 부위에 손상을 주며 심한 운동과 노화로 인해 생기는 질병이다. 관절의 특성상 한번 다치면 회복되기 어렵다는 점으로 인해, 관절을 치료하기 위해서는 물리적, 외과적 방법들이 이용되고 있다. 현재 사용하고 있는 골관절염의 치료 방법들은 (미세 천공술, 관절세포 이식 등) 공여 부위의 또 다른 관절염 유발이 된다는 것과 섬유조직으로 잘못 재생되는 것과 같은 많은 단점을 가지고 있다. 따라서 이 문제를 극복하기 위해 연구자들은 앞서서 중간엽 줄기 세포와 지방 세포 유래 줄기 세포를 활용한 치료법을 개발했다. 중간엽 줄기 세포는 뼈 / 연골 조직으로 분화 할 수 있는 능력과 자가 재생 능력을 가지고 있으며, 신체 내부에 이식 되었을 때에는 염증을 억제하는 효과까지 있다고 잘 알려져 있다. 또한 중간엽 줄기 세포는 혈액이나 지방 조직으로부터 쉽게 분리 될 수 있고 그 수율 또한 다른 줄기세포에 비해 높다는 장점으로 인해 조직 공학 분야의 다양한 조건에서 활용되는 일반적인 세포원으로 사용되어왔다. 줄기 세포의 분화 가능성을 높여 주기 위해, 일반적으로 많은 연구가 다양한 전달 매체 (엑소좀, 리포솜, 합성 중합체 등)에 외인성 성장 인자를 담지 하여, 줄기세포와 함께 투여한다. 특히, 줄기 세포의 연골 형성을 위한 외인성 성장 인자로는 형질전환생장인자-베타 계열과 인슐린 유사 성장 인자가 널리 사용된다. 이전의 많은 연구에서 형태학적 변화를 일으키고 세포 외 기질 성분의 배설을 유도함으로써 줄기 세포의 연골 형성을 향상시킬 수 있는 인슐린 유사 성장 인자와 형질전환생장인자-베타의 효능을 제안했고, 따라서 줄기 세포를 활용한 연골 형성 전략은 (1) 세포 배양 방법, (2) 외인성 성장 인자의 첨가, (3) 성분 조성의 변화, (4) 지지체의 개발과 같은 방향으로 개발되었다. 이 논문에서는 (1) 중간엽 줄기 세포와 연골 세포를 이용한 공동 배양법, (2) 지방 세포 유래 줄기 세포를 이용한 임상 시험 및 결과, 그리고 (3) 중간엽 줄기세포를 이용한 연골 재생 전략을 요약하고 소개하고 있다. (1)에서는 줄기 세포 또는 연골 세포와 같은 단일 유형의 세포 집단을 환부에 투여한다고 해서 연골 결손의 완전한 회복이 보장되는 것은 아니다. 따라서 공동 배양 기술을 사용하는 조직 공학적 접근법은 생체 연골 조직에서의 복잡하고 역동적인 세포 상호 작용을 모방하고 있으며, 세포 표현형의 연골 형성으로의 변화를 촉진하기 위해 개발되었다. 따라서 이 주제는 최근에 개발 된 두 가지 주요 세포 집단 (중간엽 줄기 세포 두 종류와 연골 세포 등)을 이용한 공동 배양 시스템을 소개한다. 다른 한편, (2) 지방 세포 유래 줄기 세포는 손상된 연골 부위를 치료하기 위해 임상 분야에서 이용되어 왔다. 이 부분에서는 지방 세포 유래 줄기 세포를 이용하여 임상에 적용시켰다. 채점 시스템으로 평가 하여 임상 효능을 요약했다. 또한 줄기 세포의 분화를 촉진하기 위해 혈소판 풍부 혈장 및 지방조직 유래 세포기질 분획과 같은 추가 화합물을 지방 세포 유래 줄기 세포와 주사하여 임상 시스템에서의 현재 지방 세포 유래 줄기 세포 치료법이 개발되었다. 또한 송아지 혈청과 소 혈청을 사용하여 다른 접근 방식을 도입했다. (3)에서는 혈청에 따른 지방 세포 유래 줄기 세포의 연골 세포로의 분화 효과를 확인하기 위해, 송아지 혈청과 소 혈청을 처리하여 기존에 사용하고 있는 소 태아 혈청과 비교하였다. 소 태아 혈청은 세포 증식, 신진 대사 및 분화를 위한 배양 배지에서 가장 필수적인 보충 물이다. 그러나 제한적인 공급과 그에 따른 가격 상승으로 인해 일련의 연구가 소 태아 혈청을 대체 할 수 있는 대체 가능한 혈청의 생물학적 타당성을 연구했다. 줄기 세포 기반 세포 제품을 제조하는 데 대한 관심 증가와 함께 혈청 및 외인성 성장인자를 포함한 배양 배지의 조성을 최적화하는 것이 중요하다고 여겨지고 있어, 이 실험에서 인간 지방 세포 유래 줄기 세포의 증식 및 연골 분화 능력에 대한 송아지 혈청과 소 혈청의 효과가 평가되었으며, 특히 연골 보충 배양 조건에서 평가되었다. 연구 결과 (1) 연골 세포를 이용한 줄기 세포를 이용한 공 배양 방법이 단일 배양법에 비해 줄기 세포 분화에 효과적인 연골 형성이 될 수 있음, (2) 줄기 세포를 이용한 임상에서의 지방 세포 유래 줄기 세포 치료가 통증, (3) 송아지 혈청과 소 혈청은 소 태아 혈청과 비교하여 지방 세포 유래 줄기 세포의 증식에는 영향을 미쳤지만, 연골 세포로의 분화 분석한 결과에서는 기존의 혈청과 차이가 나지 않았다. 이러한 연구결과들은 다양한 연골재생치료제의 개발 방향에 많은 단서를 던져주고 있고, 따라서 지방 세포 유래 줄기 세포 혹은 골수유래 중간엽 줄기세포를 이용한 줄기 세포 치료가 향후에 효과적인 골관절염 치료가 될 수 있음을 시사한다.

Exogenous Delivery of Active Biomolecules For Enhanced Cellular Functionality

김영국 동국대학교 2021 국내석사

Immunomodulatory Engineering Strategies by Exogenous Delivery of Tumor Cell Lysates for Cancer Immunotherapy : Ex vivo Activation of Primary Dendritic Cells via Coacervate-mediated Exogenous Delivery of Tumor Cell Lysates

성지현 동국대학교 일반대학원 2023 국내석사

Tumor cell lysates (TCLs) are good immunogenic sources containing various tumor-associated antigens. Since whole necrotic TCLs can enhance the maturation of dendritic cells (DCs) and their antigen-presenting ability, especially with the aid of antigenic molecules, multiple engineering strategies for exogenous TCL delivery have been investigated as novel cancer immunotherapeutic solutions. TCL-mediated induction of DC maturation and subsequent immunological responses of multiple immune cellular players could be improved by utilizing various biomaterial-based carriers. Therefore, exogenous delivery of TCLs using biomaterial-mediated versatile delivery platforms and co-delivery strategies using a series of adjuvants could (1) facilitate ex vivo priming of multiple immune cells for the production of cell-based immunotherapeutics, and (2) augment in vivo antitumor immunity and cancer vaccination efficacy. To this end, (1) important engineering methodologies to prepare antigen-containing TCLs, (2) current therapeutic approaches using TCL-mediated DC activation, and (3) the significant sequential mechanism of DC-based signaling and stimulation in adaptive immunity are important parameters to develop effective immunomodulatory techniques via TCL-based activation. Hence, we developed coacervate-mediated exogenous TCL delivery for effective ex vivo DC priming and activation by using (1) squaric acid (SqA)-mediated oxidation of source tumor cells to obtain antigenic TCLs with increased immunogenic potential, and (2) coacervate (Coa) colloidal complex as exogenous TCL carriers. Elevated oxidation in SqA-treated source tumor cells increased their immunogenic potential, indicated by a high level of damage-associated molecular pattern (DMAP) molecules in TCLs that could sufficiently stimulate DCs. Moreover, to effectively deliver these exogenous immunomodulating TCLs to DCs, Coa (i.e., self-assembled colloidal micro-carriers fabricated by electrostatic interactions of cationic mPEGlyated poly (ethylene arginyl aspartate diglyceride) and anionic heparin) was utilized for the preservation of bioactivities and sustained release of cargo TCLs. Coa-mediated ex vivo delivery of SqA-treated TCLs (SqA−TCL) sufficiently promoted DC maturation through enhanced uptake of antigens into target DCs, increased expression of DC activation markers, facilitated secretion of pro-inflammatory cytokines from activated DCs, and improved MHC-I dependent cross presentation of a colorectal cancer specific antigen. Therefore, based on antigenic and adjuvant behaviors, our Coa-mediated exogenous delivery of SqA−TCL could be a facile and promising ex vivo DC priming strategy for further cell-based cancer immunotherapies. 암세포 용해물은 암 관련 항원으로, 수지상 세포의 성숙 및 항원 제시 능력을 향상시킬 수 있기 때문에 암세포 용해물의 외인성 전달을 위한 여러 전략들이 새로운 항암면역치료법으로 많이 연구되고 있다. 암 세포용해물에 의한 수지상 세포의 성숙 유도 그리고 적응 면역 시스템의 활성화은 생체재료를 매개로 한 다양한 전달체를 활용하여 개선시킬 수 있으며, 향상된 항암 면역 및 암 백신 효능을 목표로 한다. 이를 위해(1) 암세포용해물을 제조하기 위한 공학 방법론, (2) 암세포 용해물을 통한 수지상 세포 기반 현재의 치료 접근법, (3) 수지상 세포 기반의 신호 및 자극에 의한 순차적 적응 면역 시스템 메커니즘이 중요하며, 최근의 생 체 재료 기반 외인성 암세포 용해물 전달 플랫폼의 개발은 효과적인 암 백신 및 항암효과를 위한 다양한 치료적 접근이 될 수 있다. 따라서, 다양한 전달체 중 암세포 용해물을 효과적으로 전달할 수 있는 양전하성 합성 고분자인 mPEGylated poly (ethylene arginyl aspartate diglyceride) (PEAD)와 음전하를 나타내는 헤파린과의 상호 작용을 통해 형성된 PEAD/헤파린 복합체 (코아세르베이트)를 활용한 새로운 생체 외 수지상 세포 프라이밍 기술을 실험적으로 제한한다. 암 면역 치료에서 세포 치료제의 성공적인 개발을 위해서는 면역 세포에 대 한 효과적인 생체 외 프라이밍 기술이 종종 필요하다. 이를 위해 (1) 종 양 세포의 squaric acid (SqA) 매개 산화를 통해 높은 면역원성의 암세 포 용해물을 얻고, (2) 외인성 단백질 운반체로서 코아세르베이트 콜로 이드 복합체가 활용된다. SqA 처리된 종양 세포에 의한 증가된 산화는 암세포 용해물 내 DMAP 분자의 표시로, 효과적으로 수지상세포의 성숙을 유도할 수 있는 증가된 면역원성 잠재력을 초래했다. 이에 더불어, 외인성 면역조절 암 세포 용해물을 수지상세포에 효과적으로 전달하기 위해, 코아세르베이트 는 탑재 된 암세포 용해물의 지속 방출 거동을 보여주고, 암세포 용해물 의 생체 내 활성을 보존했다. 코아세르베이트 매개 SqA 처리된 암세포 용해물의 생체 외 전달은 (1) 표적 수지상 세포로의 항원 흡수 향상, (2) 수지상 세포 활성화 마커의 발현 증가, (3) 활성화된 수지상세포로부터 전염증성 사이토카인의 분비 촉진, 그리고 (4) 결장직장암 특이적 항원 의 향샹된 MHC-I 의존 교차 제시를 보여주었다. 항원 및 보조제 능력을 지닌 SqA 처리 된 암세포용해물의 코아세르베이트 매개 외인성 전 달은 면역 세포 기반 항암면역요법을 위한 효과적인 생체 외 DC 프라이 밍 전략으로서 유망한 응용이 될 수 있다. 종합적으로, 이 연구는 암세포 용해물의 효과적인 수지상세포로의 전달을 위한 외인성 전달체의 다양한 전략들을 제시하고 있으며, 코아세 르베이트를 활용한 SqA 처리 된 암세포 용해물은 항암 면역 치료를 위 한 잠재적인 생체 외 수지상 세포 프라이밍 기술이 될 수 있음을 시사한다.

Augmented Anticancer Efficacy of Natural Killer Cells via Surface-functionalized Quantum Dots using PD-1 Binding Peptides

Sehwan Jeong 동국대학교 일반대학원 2023 국내석사

As a currently spotlighted method for cancer treatment, cancer immunotherapy has made a lot of progress in recent years. Among tremendous cancer immunotherapy boosters available nowadays, drug delivery using nanoparticle is actively being studied. Toll-like receptor (TLR) agonists were specifically selected, because of their effective activation of innate and adaptive immune cells, such as dendritic cells (DCs), T cells, and macrophages. We classify and summarize the recently reported delivery strategies using (1) exogenous TLR agonists to maintain the biological and physiological signaling activities of cargo agonists, (2) usage of multiple TLR agonists for synergistic immune responses, and (3) co-delivery using the combination with other immunomodulators or stimulants. Peptide-nanoparticle conjugates have been investigated as an alternative to commercially available antibody products for immune checkpoint blockade (ICB) therapy due to (1) the small size of the peptide and its excellent modularity and (2) increased therapeutic effects resulting from multivalency when peptides conjugate to the nanoparticle surface. We developed surface-functionalized nanoparticles called quantum dots (QDs) using PD-1 binding peptides for efficient ICB therapy, particularly via the activation of an immune synapse between NK cells and target breast cancer cells. The peptide-functionalized QDs effectively enhanced the anticancer effect of NK cells by strongly associated with the corresponding surface receptors on NK cells, and successful imaging of NK cells using the fluorescence properties of the QDs. Consequently, peptide-functionalized QDs could be an ICB therapy-based immunotherapy strategy that used for cell imaging and tracking as well as improving the anticancer effect of NK cells. Overall, this study presents nanoparticle-based drug delivery strategies on represent of TLR agonist, and suggests strategies for activating NK cells and cell surface modification using enhanced ICB treatments through peptide-functionalized QDs. 암 치료를 위한 현재 주목받는 방법으로서, 암 면역 요법은 최근 몇 년 동안 많은 발전을 이뤘다. 오늘날 이용할 수 있는 다양한 암 면역 치료 촉진제 중 나노 입자를 이용한 약물 전달이 활발히 연구되고 있다. 나노입자를 사용한 면역세포의 활성화 전략 연구를 위해, 배경 연구로서 나노입자를 활용한 TLR(Toll-like receptor) 작용제의 전달 방안에 대한 리뷰가 진행되었다. 수지상 세포, T 세포 및 대식세포와 같은 선천 및 적응 면역 세포의 효과적인 활성화 때문에 TLR작용제가 사용될 수 있다. 우리는 (1) 화물 작용제의 생물학적 및 생리학적 신호 활성을 유지하기 위해 외인성 TLR 작용제를 사용하고, (2) 시너지 면역 반응을 위해 여러 TLR 작용제를 사용하고, (3) 다른 면역 조절제 또는 자극제와의 조합을 사용하여 공동 전달하는 최근 보고된 전달 전략을 분류하고 요약한다. 펩타이드-나노입자 결합물은 (1) 펩타이드의 작은 크기와 탁월한 모듈성 및 (2) 나노입자의 표면에 결합할 때의 다가성으로 인한 치료 효과의 증가로 인해 현재 면역 체크포인트 차단(Immune checkpoint blockade, ICB) 치료를 위해 상용화된 항체 제품의 대안으로 연구되고 있다. 우리는 특히 자연살해세포와 표적 유방암 세포 사이의 면역 시냅스 활성화를 통해 효율적인 ICB 치료를 위해 PD-1 결합 펩타이드를 사용하여 표면 기능화된 나노입자인 양자점을 개발했다. 펩타이드로 기능화된 양자점은 자연살해세포의 표면 수용체 PD-1과 효과적으로 강하게 연관되어 자연살해세포의 항암효과를 강화했으며, 양자점의 발광 효과를 활용한 자연살해세포의 이미징에 성공했다. 결과적으로, 펩타이드로 기능화된 양자점은 자연살해세포의 항암효과 향상 및 세포 이미징 과 트래킹에 활용될 수 있는 ICB치료법 기반 면역치료 방안이 될 수 있다. 전반적으로 본 연구는 TLR 작용제의 대표성에 대한 나노입자 기반 약물 전달 전략을 제시하고, 펩타이드 기능화 양자점을 통한 향상된 ICB 치료를 이용한 NK 세포 활성화 및 세포 표면 개질 전략을 제안한다.