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수출용 채소종자검사를 위한 탄저병균 특이검출 PCR 마커 개발
장시운 단국대학교 일반대학원 2015 국내석사
우리나라의 연간 종자수출은 빠르게 성장하고 있으며 수출국들은 재식 시 발병 및 전파의 가능성이 높은 탄저병균을 규제하고 있다. 진균에 의해 발생하는 식물의 탄저병은 Colletotricum spp.에 의해 발생한다. 이 병원균은 넒은 기주범위를 갖으며 기주식물의 잎, 줄기, 과실 등 작물지상부의 거의 모든 부위에서 궤양과 부패 등을 일으킨다. 우리나라의 수출종자에서 검역대상이 되는 탄저병균은 C. orbiculare, C. coccodes 그리고 C. circinans이다. 현재 수출종자의 검역은 배양검사로 이루어 지지만, 배양기간이 길며, 형태학적 동정 또한 대조 표본 및 도감 등을 이용하기 때문에 검사자간에 차이가 크다. 이러한 문제를 해소하기 위해서 본 연구는 신속하고 정확한 검사 방법을 개발하고자 Polymerase Chain Reaction (PCR) 기술을 이용한 검사법으로서 탄저병균인 C. orbiculare, C. coccodes 그리고 C. circinan에 대한 특이검출 마커를 제작하여 검정하였다. 본 연구를 위해서는 C. orbiculare, C. coccodes 그리고 C. circinans를 비롯하여 다른 Colletotrichum균 16종을 사용하였다. 특이검출 마커를 개발하기 위해서 종 간 서열차이가 많아서 진균의 동정에 널리 사용되는 translation elongation factor 1-α 유전자 (tef1-α)와 β-tubulin 유전자를 목표 유전자로 하여 분석을 시도하였다. 해당 3종의 탄저병균에 대한 이들 유전자는 PCR을 이용하여 증폭하였고 그 염기서열을 결정하였다. 결정한 염기서열은 다중염기서열 정렬을 통해 비교하여 C. orbiculare에서는 β-tubulin 유전자에서 orbiTu-F/orbiTu-R1, orbiTu-F/orbiTu-R2, orbiTu-F/orbiTu-R3 프라이머를, C. coccodes에서는 tef1-α 유전자에서 coccoTef-F/coccoTef-R, 그리고 C. circinans는 tef1-α 와 β-tubulin 유전자에서 cirTef-F/cirTef-R과 cirTu-F/cirTu-R 등 각각의 탄저병균 종에 특이적인 프라이머 세트를 제작하였다. 프라이머의 특이성 검정을 통해 모든 프라이머 세트는 해당 탄저병균에 특이적인 검출이 가능한 것을 확인하였다. 검출 감도 테스트 결과 C. orbiculare는 orbiTu-F/orbiTu-R3 프라이머 세트를 이용하여 일반 PCR 방법으로는 1 pg 수준에서, real-time PCR 방법으로는 1 pg 수준에서 검출이 가능하였다. C. coccodes는 coccoTef-F/coccoTef-R 프라이머세트를 이용하여 일반 PCR 방법으로는 10 ng 수준에서 real-time PCR 방법으로는 10 pg 수준에서 검출이 가능하였다. C. circinans 경우는 cirTef-F/cirTef-R 프라이머 세트를 이용하여 일반 PCR 방법으로는 100 pg 수준에서, real-time PCR 방법으로는 10 pg 수준에서 각각 높은 감도로 검출이 가능하였다. 또한 인공접종을 통해 해당 탄저병균을 감염시킨 종자에서 이들 진균의 검출을 시도한 결과 일반 PCR 방법과 real-time PCR 방법 모두 검출 가능함을 확인할 수 있었다. 본 연구에서 개발한 프라이머 세트들은 PCR 기술을 활용한 수출 종자 검역에 있어서 빠르고 정확하게 탄저병균 특이검출 마커로 이용될 수 있을 것으로 기대된다. Currently, the scale of exportable seeds is growing rapidly in Korea. Each exporting country imposes restraints on the import of anthracnose fungus infected seeds. Anthracnose diseases on plants are caused by fungi belonging to the genus Colletotrichum, which has broad host ranges. Symptoms of the fungal disease involve causes canker and rotting on leaves, stems, flowers, and fruits. C. orbiculare, C. coccodes and C. circinans are anthracnose fungal species regulated by plant quarantine in seed exportation. Currently, quarantine of exportable seed is based on the detection of fungal propagules or cultures. But this traditional method is not efficient and timely limited because the culturing period is long and morphological identification could be different between the examiners. The aim of present study was to develop better detection method for Colletotrichum spp. using polymerase chain reaction (PCR). To develop anthracnose fungi-specific PCR primers, nucleotide sequence information on translation elongation factor 1-α gene (tef1-α) and β-tubulin gene of the three fungal species were obtained through PCR and DNA sequencing. Primers were designed by the alignment of the obtained sequences and reference sequences from GenBank database. C. orbiculare specific PCR primers were designed as orbiTu-F/orbiTu-R1, orbiTu-F/orbiTu-R2, and orbiTu-F/orbiTu-R3, respectively, which target the β-tubulin gene sequence. C. coccodes specific PCR primers were designed as coccoTef-F/coccoTef-R which targets the tef1-α gene sequence. C. circinans specific PCR primers were designed as cirTef-F/cirTef-R and cirTu-F/cirTu-R which target the tef1-α and the β-tubulin gene sequences, respectively. Through PCR test of specificity, all the primer sets was confirmed to be capable of specific detection of each anthracnose fungal species. Regarding sensitivity of detection, C. orbiculare can be detected with the primer set orbiTu-F/orbiTu-R3 using a conventional PCR at the level of 1 pg and real-time PCR at 1 pg. C. coccodes can be detected with the primer set coccoTef-F/coccoTef-R using a conventional PCR at the level of 10 ng and real-time PCR at 10 pg. C. circinans can be detected with the primer set cirTef-F/cirTef-R using a conventional PCR at the level of 1 pg and real-time PCR at 10 pg. These primers also effectively detected the three anthracnose fungal species in the artificially inoculated vegetable seeds. These results suggest that the developed PCR primers could be applied for the inspection of anthracnose fungi in vegetable seeds for exports.
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