혈관 생성 억제 제를 투여한 신생마우스 폐 조직에서 Retinoic acid의 세포자멸사의 억제

주선영 ( Sun Young Ju ),조경아 ( Kyoung Ah Cho ),유경하 ( Kyung Ha Ryu ),우소연 ( So Youn Woo ),박은애 ( Eun Ae Park ),조수진 ( Su Jin Cho ) 대한주산의학회 2008 Perinatology Vol.19 No.1

목적: Retinoic acid는 폐포 재생에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있어서 미숙아의 기관지폐이형성중의 예방에 사용되고 있다. 기관지폐이형성중의 병태생리는 미숙한 폐의 내피세포와 외피세포의 세포자멸사를 일으킴과 관련이 있다. 이에 본 연구에서 VEGFR2 억제가 신생 폐에서 세포자멸사를 증가시키는지, 또 retinoic acid의 투여가 본 폐 발달 억제 동물모형에서 세포자멸사를 억제하는지 알아보고자 하였다. 방법: VEGFR2 억제제인 SU1498을 생후3일된 마우스에 주사하고, 폐포발달이 이루어지는 그 후 10일간 retinoic acid나 위약을 주사하였다. 형태학적인 분석을 하였고, 세표자멸사를 비교분석하기 위해서 TUNEL 염색과 Annexin V을 표지자로 FACS출 시행하였다. 자멸사한 세포를 확인하기 위해서 동일초점 현미경으로 분석하였다. 결과: SU1498를 주사한 마우스에서 폐포면적과 평균폐포용적이 의미 있게 감소하였다. 세포자멸사도 약 3배 의미 있게 증가하였다. 자멸사한 세포는 내피세포와 상피세포에 분포하였다. Retinoic acid를 주사한 약 50%의 세포자멸사가 감소하였고, 형태학적으로 정상에 가까운 폐포 발달이 유지되었다. 결론: VEGFR2 억제를 하면 내피세포와 상피세포의 세포자멸사가 증가되면서 폐 발달이 저해되었다. 이어서 retinoic acid를 주사하면 세포자멸사가 억제되어 폐 발달유지에 도움이 되었다. 이러한 retinoic acid에 의한 세포자멸사의 억제가 기관지폐이형성증 예방에 기여할 것으로 추정된다. Background: Retinoic acid is known to play a role in alveolar regeneration and is used in the prevention of bronchopulmonary dysplasia (BPD) in premature infants. Many factors involved in the pathogenesis of BPD induce apoptosis of the endothelium and epithelium of the premature lung. We hypothesized that VEGFR2 inhibition would increase apoptosis in the newborn lung and retinoic acid would decrease apoptosis in our model of inhibited lung growth. Material and Methods: SU1498, a VEGFR2 inhibitor or vehicle was given to three-day-old mice. Subsequent retinoic acid or vehicle injection was given for ten days for the duration of alveolarization. Morphometric analyses were performed. Apoptosis was assessed with TUNEL staining and Annexin V staining. Co-localization of apoptotic cells with endothelial and epithelial cells was performed. Results: SUI498 injection reduced alveolar surface area and mean alveolar volume in newborn mice. Apoptosis was increased by three-fold in SU1498 injected mice. Apoptotic cells co-localized to endothelial and epithelial cells. Retinoic acid significantly reduced the degree of apoptosis by 50% in SU1498 injected mice and maintained lung development. Conclusion: VEGFR2 inhibition caused an arrest in lung development accompanied by an increase in apoptosis of endothelial and epithelial cells of the neonatal lung in mice. Subsequent retinoic acid treatment reduced apoptosis and we speculate that retinoic acid may preserve lung growth in bronchopulmonary dysplasia by inhibiting apoptosis in the neonatal lung.

돼지난소에서 난포폐쇄와 큰포식세포에 관한 형태학적 연구

김원식(Won-Sik Kim),한승로(Seung-Ro Han),김수일(Soo-Il Kim),박창식(Chang-Sik Park) 대한해부학회 2004 Anatomy & Cell Biology Vol.37 No.1

난포폐쇄가 과립층세포의 세포자멸사에 의해 이루어지고 이 과정에 큰포식세포가 직, 간접적으로 관여한다는 사실은 널리 알려져 있다. 그러나 난포내에서 일어나는 세포자멸사가 과립층의 어디에서부터 개시되고 어떻게 파급되는지, 세포자멸사 산물과 퇴화된 난모세포의 제거 방법 그리고 난포폐쇄의 완성은 어떻게 이루어지는가에 대해서는 아직 확실히 밝혀져 있지 않다. 이에 저자들은 가임기 돼지(Yorkshire-breed)를 실험동물로 난소내 난포의 광학현미경적 및 투과전자현미경적 관찰과 돼지 대식세포 단크론항체 4E9를 이용한 면역조직화학적 방법으로 본 연구를 실시하였다. 광학현미경적 관찰 결과, 난포폐쇄는 과립층세포의 세포자멸사로부터 개시되고 이어 난모세포의 퇴화와 난포막 속층 세포들의 세포자멸사가 일어나면서 난포폐쇄가 완성되는 것으로 보인다. 과립층세포의 세포자멸사는 핵농축으로부터 시작되고 과립층의 깊이에 관계없이 짧은 시간안에 모든 층으로 파급되고 최종적으로 난모세포의 투명대를 둘러싸고 있는 과립층세포의 세포자멸사로 이어지는 것으로 보인다. 투과전자현미경 관찰에서는 세포자멸사중에 있는 과립층세포들이 인접한 정상적인 과립층세포들과 큰포식세포들에 의해 포식되는 것을 확인할 수 있었고, 난포동내에 산재한 세포자멸사 소체들의 제거에도 큰포식세포들이 관여하고 있음을 알 수 있었다. 난포폐쇄와 큰포식세포와의 관계를 알아보기 위해 실시한 면역조직화학적 관찰에서는, 과립층세포의 세포자멸사 초기에는 큰포식세포가 과립층내에서만 발견되었으나, 세포자멸사의 진행과 함께 난포동과 난모세포를 둘러싸고 있는 투명대 주위에서 각각 순서대로 관찰되었고, 마지막으로 난포막 속층에서도 발견되어, 이들이 과립층세포들의 세포자멸사 소체들을 제거하는 것은 물론 최종적으로는 난포막 속층 세포들의 세포자멸사 소체들을 제거하여 난소 실질화에 관여하는 것으로 보인다. 이러한 본 연구의 결과는 난포폐쇄와 관련된 큰포식세포의 구조, 기능적 연구에 유용한 자료로 생각된다. Apoptosis of granulosa cells leads follicular atresia and macrophages have an important role during the apoptotic process. However, the propagation of apoptosis within the follicle, the ways of elimination of apoptotic bodies and degenerated oocyte, and the completion of follicular atresia are still controversial and unidentified clearly. Using adult porcine (Yorkshire-breed) ovary, in this morphological study, transmission electron microscopic observation and immunohistochemical study with pig macrophage monoclonal antibody 4E9 were performed. In light microscopy, the follicular atresia initiated with apoptosis of granulosa cells, followed by degeneration of oocyte and apoptosis of theca interna cells. Apoptosis occured in random fashion among the granulosa cells and propagated multidirectionally, and finally to the granulosa cells surrounding zona pellucida of degenerating oocyte. Pyknosis of granulosa cells was the first sign of apoptosis. In immunohistochemistry, macrophages were found only in the granulosa layer at the stage of beginning of apoptosis. With progression of apoptosis, they were proliferated greatly in number enough to eliminate all the apoptotic bodies, and found within the follicular antrum. In advanced stage of atresia, macrophages surrounded the zona pellucida of degenerating oocyte, and found also in the theca interna. In transmission electron microscopy, phagocytic granulosa cells maintained characteristic gap junctions with neighboring granulosa cells and contained several apoptotic bodies and lipid droplets within their cytoplasm. Macrophages kept many apoptotic bodies, vacuoles and autophagosomes in their cytoplasm. Apoptotic granulosa cells were ingested by intact granulosa cells and macrophages initially, but lately, all the apoptotic granulosa cells and degenerated oocyte were eliminated by macrophages. Ovarian follicular atresia completed with phagocytosis of apoptotic theca interna cells by macrophages, and the remnants of the atretic follicle became ovarian stroma. It is well known that macrophages may play an important role during follicular atresia, such as elimination of apoptotic granulosa cells, theca interna cells and degenerated oocytes, but, the valid action mechanisms of macrophages on the initiation of granulosa cell apoptosis and on the completion of atresia through the secretion of paracrine factors and autocrine factors still unclear.

Interleukin-3 박탈로 유도된 비만세포 세포자멸사의 Lipopolysaccharide에 의한 예방 기작

정승훈(Seung Hun Jeong),김태현(Tae Hyun Kim),김형민(Hyung Min Kim),Hirohiko Shibayama, 유영현(Young Hyun Yoo) 대한해부학회 2006 Anatomy & Cell Biology Vol.39 No.3

비만세포는 주로 외부 환경과의 경계지역에 분포되어 있으며 인체 내로 감염된 세균 세포벽의 구성성분이 비만세포를 자극하면 세균 감염에 대항하는 보호 작용도 한다. 비만세포는 말단 조직에서 다른 혈액세포에 비하여 매우 긴 수명을 가지고 있다. 본 연구는 lipopolysaccharide (LPS)가 inerleukin (IL)-3 박탈 유도성 비만세포의 세포자멸사에 미치는 영향을 구명하고자 수행되었다. BALB/c 생쥐의 넙다리뼈에서 분리해 낸 골수세포를 4주에서 6주간, IL-3가 첨가된 배지에서 배양하여 골수유래 비만세포(bone marrow derived mast cells; BMMCs)를 얻었다. 이 세포에서 IL-3를 박탈하여 세포자멸사를 유도하였으며, IL-3 박탈과 동시에 LPS를 처리하여 LPS의 효과를 조사하였다. 세포자멸사의 유도와 방지를 판단하기 위하여 DNA 전기영동, Western blotting, 면역형광염색, 레이저 공초점 현미경술, RTPCR을 실시하였다. IL-3 박탈 후 BMMC는 세포 생존율이 감소하고, 핵이 응축되었으며 다양한 세포자멸사관련 인자들이 세포소기관 사이에서 이동하였는데 LPS는 이런 현상을 방지하였다. IL-3 박탈은 BMMC에서 XIAP, 14-3-3, Bcl-2, Bcl-xL 등 항세포자멸사 인자들의 발현양을 감소시켰으나 LPS는 이들 인자들의 발현 수준을 IL-3가 박탈되지 않은 세포 수준으로 유지하였다. IL-3 박탈 후 Bim과 Bcl-2의 결합이 증가하였으나 LPS를 처리하면 Bim과 Bcl-2의 결합이 감소하는 것도 관찰하였다. 또한 싸이토카인에 의하여 유도되는 항세포자멸사 분자로 알려진 anamorsin이 유전자 수준에서 새로이 발현되는 것도 확인하였다. 본 실험결과 IL-3 박탈 후 비만세포에서 유도되는 세포자멸사는 LPS로 방지된다는 것을 확인하였으며 이 방지기작에는 항세포자멸사 인자들이 관여하는 것으로 해석한다. 또한 세균벽의 LPS가 비만세포의 세포자멸사를 막는 기작은 말단조직 내에서 비만세포의 수명을 길게 유지하는데 기여할 수 있다고 추측한다. Mast cells play a protective role in host defense against bacteria, and are found in high number at the host-environment interface. Stimulation of mast cells by bacterial cell wall components is essential for their protective effects against entero-bacterial infection. Mast cells have an extraordinarily long longevity in peripheral tissues compared to other types of blood cells. We undertook this study to reveal the mechanism underlying the prevention on IL-3 deprivation-induced apoptosis in mast cells by LPS. Bone marrow derived mast cells (BMMCs) were obtained from femurs of BALB/c mice and cultured under IL-3 stimulation for 4-6 weeks. At the same point when IL-3 was depleted, BMMCs were treated with LPS. To examine the effect of LPS, DNA electrophoresis, Western blotting, immunoflourescense staining, confocal microscopy, RT-PCR and immunoprecipitation were conducted. IL-3 deprivation reduced cellular viability and induced nuclear condensation and translocation of apoptosisassociated factors. However, LPS treatment prevented these IL-3 deprivation-induced apoptotic events. IL-3 deprivation downregulated representative antiapoptotic factors such as XIAP, 14-3-3, Bcl-2 and Bcl-xL. Expression level of these factors was maintained in BMMCs treated by LPS, which was similar to the level in the control cells. The Bim to Bcl-2 interaction was increased in IL-3 depleted cells, which was prevented by LPS treatment. It was also demonstrated that LPS induced the new expression of a cytokine-induced antiapoptotic factor anamorsin gene in BMMCs under IL-3 deprived condition. Taken together, LPS prevents IL-3 deprivation induced apoptosis in BMMCs via several antiapoptotic factors. This preventive mechanism of LPS on BMMCs apoptosis may contribute the long longevity of mast cells in the peripheral tissue.

Apoptotic Effect of co-treatment with HS-1200 and Cisplatin on SCC25 Human Tongue Squamous Cell Carcinoma Cell Line

김덕한,김인령,박봉수,안용우,정성희,Kim, Duk-Han,Kim, In-Ryoung,Park, Bong-Soo,Ahn, Yong-Woo,Jeong, Sung-Hee The Korean Academy of Orofacial Pain and Oral Medi 2013 Journal of Oral Medicine and Pain Vol.38 No.3

담즙산은 지방의 흡수와 콜레스테롤의 항상성을 조절하는 유전자의 전사에 관여하는 필수 콜레스테롤의 생성물이다. 담즙산 합성유도체인 HS-1200이 여러 가지 암세포에서 세포자멸사(apoptosis)를 유도한다는 것이 알려져 있다. 본 연구는 사람혀 편평세포암종세포(SCC25 cells)에서 담즙산 합성유도체인 HS-1200과 대표적인 항암제인 cisplatin의 병용처리 후 세포자멸사 증가효과가 있는지 알아보기 위해 수행하였다. HS-1200과 cisplatin의 병용처리가 단독처리에 비해서 효과적인 세포생존율 감소가 있는지 확인하기 위해서 MTT법을 시행하였고, 세포자멸사의 유도와 증가를 알기 위해서는 DNA 전기영동법, Hoechst 염색법, DNA hypoploidy법 을 사용하였다. 그리고 세포자멸사에 관계하는 단백질의 발현 변화와 세포내에서의 이동을 밝혀내기 위해서 Western blot 분석과 면역형광 염색법을 수행하였다. 더 나아가서 proteasome 활성도와 사립체막 전위 변화를 측정하였다. 본 연구에서는 HS-1200과 cisplatin을 병용처리한 SCC25 세포에서 핵의 농축, DNA분절, MMP와 proteasome 활성도의 감소, Bax의 증가와 Bcl-2의 감소, DNA양의 감소, cytochrome c의 세포질로의 유리, AIF와 DFF40(CAD)의 핵으로의 이동, caspase-9, caspase-7, caspase-3, PARP 그리고 DFF45(ICAD)의 활성화와 같은 다양한 세포자멸사 증거를 보였다. 반면에 상기 물질들에 단독처리 된 SCC25 세포에서는 세포자멸사 현상이 거의 없었다. 24시간 동안 $25{\mu}M$의 HS-1200, $4{\mu}g/ml$의 cisplatin 을 각기 단독처리 한 결과에서는 세포자멸사를 거의 유도하지 못했으나, 병용처리한 결과에는 아주 탁월하고 명확한 세포자멸사의 유도를 보였다. 그러므로 본 실험결과는 HS-1200과 cisplatin 의 병용요법이 사람구강편평세포암종 환자를 위해 새로운 치료전략으로서의 가능성을 보여준다고 생각한다. Bile acids are polar derivatives of cholesterol essential for the absorption of dietary lipids and regulate the transcription of genes that control cholesterol homeostasis. Recently it have been identified the synthetic chenodeoxycholic acid (CDCA) derivatives HS-1200 and cisplatin showed apoptisis-inducing activity on various cancer cells in vivo and in vitro. This study was undertaken to investigate the synergistic apoptotic effect of co-treatment with HS-1200 and cisplatin on human tongue squamous cell carcinoma cells (SCC25 cells). To investigate whether the co-treatment with HS-1200 and cisplatin compared to each single treatment efficiently reduces the viability of SCC25 cells, MTT assay was conducted. The induction and augmentation of apoptosis were confirmed by DNA electrophoresis, Hoechst staining and an analysis DNA hypoploidy. Westen blot analysis and immunofluorescent staining were also performed to evaluate the expression levels and the translocation of apoptosis-related proteins following this co-treatment. Furthermore, proteasome activity and mitochondrial membrane potential (MMP) change were also assayed. In this study, co-treatment with HS-1200 and cisplatin on SCC25 cells showed several lines of apoptotic manifestation such as nuclear condensations, DNA fragmentation, reduction of MMP and proteasome activity, the increase of Bax and the decrease of Bcl-2, decrease of DNA content, the release of cytochrome c into cytosol, translocation of AIF and DFF40 (CAD) onto nuclei, and activation of caspase-9, caspase-7, caspase-3, PARP and DFF45 (ICAD) whereas each single treated SCC25 cells did not show these patterns. Although the single treatment of $25{\mu}M$ HS-1200 and $4{\mu}g/ml$ cisplatin for 24 h did not induce apoptosis, the co-treatment of these reagents prominently induced apoptosis. Therefore our data provide the possibility that the combination therapy with HS-1200 and cisplatin could be considered as a novel therapeutic strategy for human squamous cell carcinoma.

돼지난소에서 난포폐쇄와 큰포식세포에 관한 형태학적 연구

김원식,한승로,김수일,박창식 충남대학교 형질전환복제돼지연구센터 2004 논문집 Vol. No.8

난포폐쇄가 과립층세포의 세포자멸사에 의해 이루어지고 이 과정에 큰포식세포가 직? 간접적으로 관여한다는 사실은 널리 알려져 있다. 그러나 난포내에서 일어나는 세포자멸사가 과립층의 어디에서부터 개시되고 어떻게 파급되는지, 세포자멸사 산물과 퇴화된 난모세포의 제거 방법 그리고 난포폐쇄의 완성은 어떻게 이루어지는가에 대해서는 아직 확실히 밝혀져 있지 않다. 이에 저자들은 가임기 돼지(Yorkshire-breed)를 실험동물로 난소내 난포의 광학현미경적 및 투과전자현미경적 관찰과 돼지 대식세포 단크곤항체 4E9를 이용한 변역조직화학적 방법으로 본 연구를 실시하였다. 광학현비경적관찰 결과, 난포폐쇄는 과립층세포의 세포자멸사로부터 개시되고 이어 난모세포의 퇴화와 난포막 속층 세포들의 세포자멸사가 일어나면서 난포폐쇄가 완성되는 것으로 보인다. 과립층세포의 세포자멸사는 핵농축으로부터 시작되고 과립층의 깊이에 관계없이 짧은 시간 안에 모든 층으로 파급되고 최종적으로 난모세포의 투명대를 둘러싸고 있는 과립층세포의 세포자멸사포 이어지는 것으로 보인다. 투과전자현미경 관찰에서는 세포자멸사중에 있는 과립층세포들이 인접한 정상적인 과립층세포들과 큰포식세포들에 의해 포식되는 것을 확인할 수 있었고, 난포동내에 산재한 세포자멸사 소체들의 제거에도 큰포식세포들이 관여하고 있음을 알 수 있었다. 난포폐쇄와 큰포식세포와의 관계를 알아보기 위해 실시한 면역조직화학적 관찰에서는, 과립층세포의 세포자멸사 초기에는 큰포식세포가 과립층내에서만 발견되었으나, 세포자멸사의 진행과 함께 난포동과 난모세포를 둘러싸고 있는 투명대 주위에서 각각 순서대로 관찰되었고 마지막으로 난포막 속층에서도 발견되어, 이들이 과립층세포들의 세포자멸사 소체들을 제거하는 것은 물론 최종적으로는 난포막 속층 세포들의 세포자멸사 소체들을 제거하여 난소 실질화에 관여하는 것으로 보인다. 이러한 본 연구의 결과는 난포폐쇄와 관련된 큰포식세포의 구조, 기능적 연구에 유용한 자료로 생각된다. Apoptosis of granulosa cells leads follicular atresia and macrophages have an important role during the apoptotic process. However, the propagation of apoptosis within the follicle, the ways of elimination of apoptotic bodies and degenerated oocyte, and the completion of follicular atresia are still controversial and unidentified clearly. Using adult porcine (Yorkshire-breed) ovary, in this morphological study, transmission electron microscopic observation and immunohistochemical study with pig macrophage monoclonal antibody 4E9 were performed. In light microscopy, the follicular atresia initiated with apoptosis of granulosa cells, followed by degeneration of oocyte and apoptosis of theca interna cells. Apoptosis occured in random fashion among the granulosa cells and propagated multidirectionally, and finally to the granulosa cells surrounding zona pellucida of degenerating oocyte. Pyknosis of granulosa cells was the first sign of apoptosis. In immunohistochemistry, macrophages were found only in the granulosa layer at the stage of beginning of apoptosis. With progression of apoptosis, they were proliferated greatly in number enough to eliminate all the apoptotic bodies, and found within the follicular antrum. In advanced stage of atresia, macrophages surrounded the zona pellucida of degenerating oocyte, and found also in the theca interna. In transmission electron microscopy, phagocytic granulosa cells maintained characteristic gap junctions with neighboring granulosa cells and contained several apoptotic bodies and lipid droplets within their cytoplasm. Macrophages kept many apoptotic bodies, vacuoles and autophagosomes in their cytoplasm. Apoptotic granulosa cells were ingested by intact granulosa cells and macrophages initially, but lately, all the apoptotic granulosa cells and degenerated oocyte were eliminated by macrophages. Ovarian follicular atresia completed with phagocytosis of apoptotic theca interna cells by macrophages, and the remnants of the atretic follicle became ovarian stroma. It is well known that macrophages may play an important role during follicular atresia, such as elimination of apoptotic granulosa cells, theca intema cells and degenerated oocytes, but, the valid action mechanisms of macrophages on the initiation of granulosa cell apoptosis and on the completion of atresia through the secretion of paracrine factors and autocrine factors still unclear.

Bee Venom Inhibits Prostate Cancer Growth in LNCaP Xenografts via Apoptosis

양창열,송호섭,Yang, Chang-Yeol,Song, Ho-Sueb KOREAN PHARMACOPUNCTURE INSTITUTE 2010 Journal of pharmacopuncture Vol.13 No.1

연구목적 : 이 연구는 봉약침의 봉독이 NF-${\kappa}B$ 활성억제와 안드로겐 수용체 조절 단백질 및 세포자멸사 조절 단백질의 발현을 통하여 세포자멸사를 유도하고, 전립선 암세포를 이식한 쥐에서의 세포자멸사 유도 효과를 확인함으로써, 봉약침의 봉독이 생체 내에서도 세포자멸사를 유도하여 전립선암에 효과를 나타냄을 확인하고자 하였다. 실험방법 : 세포자멸사의 관찰에는 DAPI, TUNEL staining assay를 시행하였으며, 세포자멸사 조절 단백질의 변동 관찰에는 western blot analysis를 시행하였고, 세포자멸사와 연관된 NF-${\kappa}B$의 활성 변화를 관찰하기 위해 EMSA를 시행하였다. 결과 : 1. DAPI, TUNEL staining assay 결과 봉독 및 melittin을 처리한 LNCaP 세포 모두에서 세포자멸사 유도율이 유의한 증가를 나타내었다. 2. LNCaP 세포에 봉독이나 melittin을 처리한 결과, 안드로겐 수용체 조절 단백질 중 p-Akt, COX-2, calpain은 봉독과 melittin 모두에서 유의한 감소를 나타내었고, Akt는 melittin에서 유의한 감소를 나타냈으며, 봉독에서 증가하는 경향을 보였고, MMP-9은 증가하였다. 3. 생체 내에서의 봉독의 항암효과를 확인하기 위해 전립선암세포가 이식된 쥐에 봉독을 처리한 후 암세포의 부피와 무게, 쥐의 체중을 측정한 결과, 봉독을 처리한 군에서 암 세포 부피비율 및 무게는 감소하였고, 쥐의 체중은 증가하였다. 4. 전립선암세포가 이식된 쥐에 봉독을 처리한 결과, NF-${\kappa}B$ 활성에서 유의한 감소를 나타내었다. 5. 전립선암세포가 이식된 쥐에 봉독을 처리한 결과, 세포자멸사 조절 단백질 중 Bax/Bcl-2, p53, caspase-3, caspase-9, calpain은 유의한 증가를, COX-2는 유의한 감소를 나타냈으며, MMP-9는 증가를 나타내었다. 결론 : 이상의 결과는 봉독이 시험관 내에서 뿐만 아니라 생체 내에서도 NF-${\kappa}B$의 활성을 억제하고 안드로겐 수용체 조절 단백질 및 세포자멸사 조절 단백질의 조절을 통하여 인간 전립선암 세포주인 LNCaP의 세포자멸사를 유도함으로써 전립선암 세포 증식억제 효과 및 호르몬 비의존적인 전립선암으로의 전이를 지연시키는 경향이 있을 것으로 사료되고, 봉독이 전립선암의 예방과 치료에 효과적으로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Effect of Snake Venom Toxin from Vipera Lebetina Turanica on Neuroblastoma SK-N-SH Cells

Sim Jae-young,Song Ho-sueb 대한침구의학회 2008 대한침구의학회지 Vol.25 No.3

목적 : 이 연구는 Vipera lebetina turanica의 蛇毒藥鍼液(Snake venom toxin, SVT)이 인간 신경아세포종의 암세포주인 SK-N-SH 세포에서 암세포성장의 억제 및 그 기전에 대하여 살펴보고자 하였다. 방법 : SVT를 처리한 후 SK-N-SH의 성장억제를 관찰하기 위해 CCK-8 assay와 LDH assay를 시행하였고, apoptosis 평가에는 세포형태의 관찰과 DAPI, TUNEL, Annexin V-PI double staining assay 및 cell detachment assay를 시행하였다. 세포자멸사 관련 세포기전을 보기 위하여 세포주기, 세포내 칼슘량, 세포내 활성산소량 및 미토콘드리아의 세포막전위 변화를 측정하였고, DNA fragmentation assay를 시행하였으며, 세포자멸사 조절 단백인 Bax, Bcl-2, caspase-3, -9의 발현 변화 관찰에는 western blot analysis를 시행하였다. 결과 : SK-N-SH 세포에 SVT를 처리한 후, 신경아세포종 세포의 성장, Apoptosis의 유발 및 기전의 영향을 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. SVT를 처리한 SK-N-SH 세포 관찰에서 세포독성은 농도의존적으로 증가하는 경향이 있는 반면 암세포성장의 유의한 억제는 20㎍/㎖ SVT에 의해서만 나타났다. 2. 세포자멸사 평가에서 SVT를 처리한 SK-N-SH 세포는 세포자멸사의 특징적 형태를 나타내었다. TUNEL assay에서는 세포자멸사 활성세포가 미약하게 나타난 반면 cell detachment assay와 Annexin V-PI double staining에서는 각각 세포박리와 세포자멸사 활성세포의 유의한 증가를 나타내었다. 3. 세포자멸사 관련 세포기전연구에서 SVT를 처리한 SK-N-SH 세포의 세포주기, 세포 내 칼슘양 및 DNA fragmentation에는 유의한 변화가 관찰되지 않은 반면 세포내 활성산소 양은 유의한 증가를 나타내었고, 그에 따른 미토콘드리아 세포막 전위의 유의한 변동이 관찰되었다. 4. SVT를 처리한 SK-N-SH는 세포자멸사 관련 단백 발현에서 Bax에 대해 유의한 증가를 나타내지 않았으나 caspase-3 및 caspase-9의 유의한 증가와 Bcl-2의 유의한 감소를 나타내었다. 결론 : 이상의 결과는 SVT가 세포 내 활성산소를 증가시킴으로써 미토콘드리아의 세포막전위에 변화를 일으켜 인간 신경아세포종 세포주인 SK-N-SH의 세포박리와 유관한 세포자멸사를 유발함으로써 증식억제 효과가 있음을 입증한 것이다.

인간 대장암 세포 SW48과 RKO의 세포자멸사에 있어 의존수용체 RET9과 RET51 Transfection의 역할

서현일,박동일 대한장연구학회 2013 Intestinal Research Vol.11 No.1

목적: 의존수용체는 리간드의 결합유무에 따라서 세포의 증식, 분화, 이동 또는 세포자멸사를 촉진시키는 수용체이다. 이번 연구는 인간 대장암 세포주에서 의존수용체와 그 리간드를 이용하여 세포자멸사를 조절할 수 있는지 알아보기 위해 시행하였다. 방법: 세 가지 인간 대장암 세포주에 의존수용체 RET9과 RET51을 각각 transfection시킨 후 세포자멸사를 측정하였다. 동시에 의존수용체를 transfection시킨 12시간 후 리간드인 GDNF를 100 ng/mL 농도로 투여한 군의 세포자멸사도 측정하였다. Empty vector는 pcDNA를 사용하였다. 또한 GDNF 농도에 따른 세포자멸사도 측정하였다. 결과: RET51을 transfection시켰을 경우 SW48 세포주는 empty vector인 pcDNA를 transfection시킨 군에 비해 ELISA 검사 시 1.7배, caspase검사 시 2.19배 세포자멸사가 증가하였다. RKO 세포주는 ELISA 검사시 3.55배, caspase 검사 시 2.06배 증가하였다. V400 세포주는 세포자멸사의 증가가 관찰되지 않았다. RET9은 모든 세포주에서 세포자멸사의 증가가 관찰되지 않았다. RET51 transfection 12시간 후 GDNF를 투여한 SW48 세포주에서는 ELISA 검사 시 0.75배, caspase 검사 시 0.88배 측정되었으며, RKO 세포주에서는 각각 2.18배, 0.89배 측정되었다. RKO 세포주에 RET51을 transfection시킨 후 GDNF의 농도를 각각 0, 25, 50, 100 ng/mL로 투여하였을 때, 투여한 GDNF의 농도가높을수록 세포자멸사가 감소하는 것이 관찰되었다. 결론: 인간 대장암 세포주에 인위적으로 의존수용체와 그 리간드를 조작함으로서 세포자멸사를 촉진시킬 수도, 억제시킬 수도 있다는 것을증명함으로서 새로운 대장암 치료법을 시도해 볼 수 있는 이론적 근거를 마련하였다. Background/Aims: Dependent receptor can transmit both positive signal: proliferation, differentiation or migration; and negative signal: apoptosis. It depends on the presence of its ligand. This study was performed to determine the effects of transfection of dependent receptors in human colon cancer cell lines. Methods: Two dependent receptors (rearranged during transfection [RET]9 and RET51) were transfected into three human colon cancer cell lines: SW48, RKO and V400. Then, half of them were treated with glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF). Using ELISA and caspase assay, apoptosis was measured. Dose-response relation between GDNF and apoptosis was also analyzed. A pcDNA was used as an empty vector. Results:After transfection of RET51, apoptosis was increased in SW48 (70% with ELISA and 119% with caspase assay) and RKO (255% with ELISA and 106% with caspase assay) cell lines when compared with the pcDNA group. V400 cell line did not show increased apoptosis. Transfection of RET9 did not induce apoptosis in all of the three human colon cancer cell lines. Treatment with GDNF 12 hours after transfection of RET51 decreased apoptosis in SW48 (66% with ELISA and 60% with caspase assay) and RKO (39% with ELISA and 57% with caspase assay) when compared with the cell lines transfected with RET51 only. Apoptosis was down-regulated with increasing concentration of GDNF in RKO cell line. Conclusions: This study showed that the apoptosis of human colon cancer cell line can be controlled by manipulating the dependent receptors and its ligands. We present the possibility of therapeutic method using dependent receptor in colon cancer. (Intest Res 2013;11:28-33)

Effect of Snake Venom Toxin from Vipera Lebetina Turanica on Neuroblastoma SK-N-MC Cells

Sim Jae-young,Song Ho-sueb 대한침구의학회 2008 대한침구의학회지 Vol.25 No.2

목적 : 이 연구는 Vipera lebetina turanica의 蛇毒藥鍼液(Snake venom toxin, SVT)이 인간 신경아세포종의 암세포주인 SK-N-MC 세포에서 암세포성장의 억제 및 그 기전에 대하여 살펴보고자 하였다. 방법 : SVT를 처리한 후 SK-N-MC의 성장억제를 관찰하기 위해 CCK-8 assay와 LDH assay를 시행하였고, apoptosis 평가에는 세포형태의 관찰과 DAPI, TUNEL, Annexin V-PI double staining assay 및 cell detachment assay를 시행하였다. 세포자멸사 관련 세포기전을 보기 위하여 세포주기, 세포내 칼슘량, 세포내 활성산소량 및 미토콘드리아의 세포막전위 변화를 측정하였고, DNA fragmentation assay를 시행하였으며, 세포자멸사 조절 단백인 Bax, Bcl-2, caspase-3, -9의 발현 변화 관찰에는 western blot analysis를 시행하였다. 결과 : SK-N-MC 세포에 SVT를 처리한 후, 신경아세포종 세포의 성장, Apoptosis의 유발 및 기전에 영향을 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. SVT를 처리한 SK-N-MC 세포 관찰에서 20㎍/㎖ SVT 처리가 암세포성장의 유의한 억제를 나타내었다. 세포독성 관찰에서 SVT처리는 처리하지 않은 것에 비하여 증가를 나타내었다. 2. 세포자멸사 평가에서 SVT를 처리한 SK-N-MC 세포는 세포자멸사의 특징적 형태를 나타내었다. TUNEL assay에서는 세포자멸사 활성세포가 미약하게 나타난 반면 cell detachment assay와 Annexin V-PI double staining에서는 각각 세포박리와 세포자멸사 활성세포의 유의한 증가를 나타내었다. 3. 세포자멸사 관련 세포기전연구에서 SVT를 처리한 SK-N-MC 세포의 세포주기, 세포내 칼슘량 및 DNA fragmentation에는 유의한 변화가 관찰되지 않은 반면 세포내 활성산소 양은 유의한 증가를 나타내었고, 그에 따른 미토콘드리아 세포막 전위의 유의한 변동이 관찰되었다. 4. SVT를 처리한 SK-N-MC는 세포자멸사 관련 단백 발현에서 caspase-9에 대해 유의한 증가를 나타내지 않았으나 Bax 및 caspase-3의 유의한 증가와 Bcl-2의 유의한 감소를 나타내었다. 결론 : 이상의 결과는 SVT가 세포내 활성산소를 증가시키므로 미토콘드리아의 세포막전위에 변화를 일으켜 인간 신경아세포종 세포주인 SK-N-MC의 세포박리와 유관한 세포자멸사를 유발하므로 증식억제 효과가 있음을 입증한 것이다.

Synthetic Chenodeoxycholic Acid Derivative HS-1200-induced Apoptosis of Human Melanoma Cells

Chul-Jung Baek(백철중),Ji-Hak Min(민지학),Seong-Hyeok Moon(문성혁),In-Ryoung Kim(김인령),Seung-Eun Lee(이승은),Duk-Han Kim(김덕한),Gyoo-Cheon Kim(김규천),Hyun-Ho Kwak(곽현호),Bong-Soo Park(박봉수) 대한체질인류학회 2007 대한체질인류학회지 Vol.20 No.4

담즙산과 합성담즙산유도체가 여러 종류의 암세포에 세포자멸사(apoptosis)를 유도하며, 항암효과가 있다고 알려져 있다. 또한 합성 chenodeoxycholic acid (CDCA) 유도체가 여러 가지 암세포에 유도한 세포자멸사 연구들이 보고되어 왔다. 하지만 아직까지 사람흑색종세포에 합성 CDCA 유도체가 유도한 세포자멸사 연구는 보고되지 않았다. 그래서 본 연구는 합성 CDCA 유도체인 HS-1199와 HS-1200이 사람흑색종세포(G361 세포)에 세포자멸사 효과와 세포자멸사 기작을 밝혀내기 위해서 수행되었다. 합성 CDCA에 처리된 G361 세포의 생존율을 확인하기 위해서 MTT 방법을 사용하였고, 세포자멸사 유도 검증은 DNA 전기영동법과 Hoechst 염색을 이용하였다. 세포자멸사에 관계하는 단백질의 발현 변화와 세포 내에서 이동을 밝혀내기 위해서 Western bot 분석과 면역형광염색법을 수행하였다. 더 나아가서 proteasome 활성도와 사립체막 전위 변화를 측정하였다. 합성 CDCA 유도체로 처리된 G361 세포에서 caspase-3, DFF, PARP의 파괴, caspase-3 (HS-1200 only), PARP, DFF의 분절화, DNA 조각남(HS-1200 only), 핵 응축, proteasome 활성화의 감소, 사립체막전위(MMP)의 감소, 그리고 cytochrome c와 AIF의 사립체에서 세포질로의 유리와 같은 다양한 세포자멸사의 증거를 보였다. 두 개의 합성 CDCA 유도체 중에서 HS-1200이 HS-1199보다 더욱 강한 세포자멸사 효과를 보였다. 본 연구는 CDCA 유도체인 HS-1200이 사람흑색종세포에서 proteasome, 사립체 그리고 caspase 경로을 통해서 세포자멸사를 유도하는 것을 증명하였다. 이러한 결과는 HS-1200이 사람흑색종의 새로운 치료적 전략으로 응용될 수 있다고 생각한다. Bile acids and their synthetic derivatives induced apoptosis in various kinds of cancer cells and anticancer effects. It has been reported that the synthetic chenodeoxycholic acid (CDCA) derivatives showed apoptosis-inducing activity on various cancer cells in vitro. It wasn’t discovered those materials have apoptosis-inducing effects on G361 human melanoma cells. The present study was done to examine the synthetic bile acid derivatives, HS-1199 and HS- 1200, induced apoptosis on G361 cells and such these apoptosis events. The viability of G361 cells was assessed by the MTT assay. Induction of apoptosis was confirmed by DNA electrophoresis and Hoechst staining. Westen blot analysis and immunofluorescent staining were performed to study the alterations in expression level and translocation of apoptosis-related proteins. Proteasome activity and mitochondrial membrane potential (MMP) change were also assayed. Tested G361 cells showed several lines of apoptotic manifestation such as activation of caspase-3, DFF and PARP, DNA degradation (HS-1200 only), nuclear condensation, inhibition of proteasome activity, reduction of mitochondrial membrane potential, and the release of cytochrome c and AIF to cytosol. Between two synthetic derivatives, HS-1200 showed stronger apoptosis-inducing effect than HS-1199 did. Taken collectively, we here demonstrated for the first time that synthetic CDCA dedrivatives induce apoptosis of human melanoma cells through the proteasome, mitochondria and caspase pathway. Therefore our data provide the possibility that HS-1200 could be considered as a novel therapeutic strategy for human melanoma cells from its powerful apoptosis-inducing activity.