Change of Steroid Receptor Number of and Bioactivity of Gonadotropins in the Follicular Fluid of Porcine Ovarian Atretic Follicles(II):Testosterone Receptor

윤용달,이창주,전은현,김문규,이준영,Yoon, Yong-Dal,Lee, Chang-Joo,Chun, Eun-Hyun,Kim, Moon-Kyoo,Lee, Joon-Yeong The Korean Society for Reproductive Medicine 1989 Clinical and Experimental Reproductive Medicine Vol.16 No.1

Estradiol (E)은 난소내 과립세포 (granulosa cell, GC)를 증가시키고 생식소 자극호르몬과 협동으로 배란을 유도한다. Androgen은 E의 작용과 반대의 작용을 나타내며 여포의 폐쇄요인으로 알려지고 있다. Testosterone(T)이 폐쇄여포의 여포액내 다량 존재하는 것이 알려짐에 따라 난소내에도 자가조절분비(autocrine)또는 paracrine regulation에 의해 작용을 나타낼 것으로 가정되어 난소내 여포가 폐쇄됨에 따라 그 수용체의 변화하는 양상을 조사하고져 하였다. 흰쥐의 과립세포의 세포질에는 $51.3{\pm}6.1$fmol/mg protein의 Estradiol 수용체(ER) ; $153.1{\pm}25.3$의 Testosterone수용체(TR) ; 또한 $35.1{\pm}8.1$의 Progesterone수용체(PR)가 존재하였다. 과립세포내 ER용 세포질내 E를 제거한 후에 정량이 가능하였고 또한 과립세포내에도 TR이 사람에서는 $23.4{\pm}7.2$ fmol/mg protein, 돼지는 $98.5{\pm}23.1$로 상당량 존재함을 관찰하였다. Dihydrotestosterone Enanthate(DHTE)를 100ug/흰쥐의 농도로 처리한 결과 난소내 TR의 농도는 변화가 없이 ER의 농도만 현저히 저하되고 쥐의 난소무게 역시 감소하는 것을 발견하였다. 위의 결과로 보아 난소내에도 스테로이드 호르몬은 autocrine(자가조절)방법으로 작용하며 An-drogen이 난소의 무게를 감소시키는 것은 ER의 수를 감소시켜 E의 작용이 억제되고 여포들이 폐쇄를 일으켜 그 증식이 저하된 때문으로 사료된다.

여포성숙의 대사에 관한 생화학적인 연구 II. 돼지 난소내 중여포액에 존재하는 단백질의 조성 및 동일여포액내 스테로이드 호르몬의 농도

윤용달,이창주,도병록,김종흡 한국통합생물학회 1990 동물학회지 Vol.33 No.1

포유류의 난소내 여포의 폐쇄기작을 알아보기 위하여 본 실험을 행하였다. 정상과 폐쇄를 형태적으로 판정한 돼지의 난소내 개개 중여포의 여표액내 스테로이드 호르몬과 단백질을 방사면역측정법과 SDS-전기영동으로 각각 분석하여 다음과 같은 결과를 얻었다. Progesterone은 여포성숙기의 여포액내 폐쇄여포에서 높은 농도를 나타내었고testosterone의 경우 황체기의 정상여포 및 여포성숙기의 폐쇄여포에서 높은 농도를 나타내었다. estradiol은 여포성숙기의 폐쇄여포에서 정상여포에 비해 현저히 낮았다. 여포액내 존재하는 단백질의 SDS-PAGE 결과, 혈청에 존재하지 않는 4종의 단백질을 확인하였다. 난소주기에 따라 112K, 141K의 단백질이 확인되었고, 폐쇄여포액내 특이하게 존재하는 23K, 24K의 단백질도 확인할 수 있었다. 이상의 결과로 보아 난소주기에 따라 여포액재에 존재하는 스테로이드 호르몬의 농도와 단백질의 조성이 서로 같지 않음을 알 수 있었으며 여포의 폐쇄기작에 있어서도 난소주기에 따라 분명한 차이가 있음을 알 수 있었다. 그러나 이들 폐쇄여포에 존재하는 단백질들의 생리적인 역할을 이해하기 위하여는 많은 연구가 수행되어야 한다고 사료된다. To study the follicular atretic mechanism in mammalian ovary, the medium-sized (3.0-6.0mm) follicles of porcine ovary were morphologically classified as nonnal and atretic. Steroid concentrations in the follicular fluid were analyzed by radioimmunoassay, and the proteins in that fluid were electrophoretically separated. Concentrations of progesterone in the atretic follicular fluid of follicular phases were higher than those of normal ones (p < 0.05). Concentrations of testosterone were high in normal luteal and atretic follicular-phases follicles. The concentrations of estradiol remained significanily lower in atretic follicular-phases follicles than normal. After sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis of follicular fluid proteins, four kinds of proteins (20K, 32K, 33K, 38K) were detected, and those proteins were not present in sera. According to the ovarian cycle, proteins of MW of 112K and 141K were identified. In atretic follicular fludies, MW of 23K and 24K were specifically detected. From the above results, we can conclude that, as ovarian cycle changes, steroid contents and protein composition in atretic follicular fluid are different from the normal developing follicular fluid. To further understand the physiologic roles of the proteins present in the atretic follicular fluids, these proteins need to be characterized and identified.

냉동절편을 이용한 돼지 자궁내 에스트로겐 수용체의 측정

윤용달,박철홍,이영근,Yoon, Yong-Dal,Park, Chor-Hong,Lee, Young-Keun 대한생식의학회 1989 Clinical and Experimental Reproductive Medicine Vol.16 No.2

The present study was designed to develop a new method for the determination of estrogen receptor in porcine uterus using frozen sections. Cryostat sections were incubated with $^3H$-estradiol($^3H$-$E_2$) in the presence or absence of diethylstilbestrol(DES) and the radioactivity of 3H-E2 bound to estrogen receptor(ER) was detected. The level of specific estrogen receptor was determined by Scatchard analysis. The highest ratio of specific binding against total binding was achieved in 3 sec. tions(5mm x 5mm) which was corresponded to lOO${\mu}$/ml protein concentration. Optimal binding was obtained during incubation with $^3H$-$E_2$ for 30 minutes at 23$^{\circ}C$ after treatment of sections with acetone for 20 seconds. Three time-washing of sections was proved to be appropriate for the removal of unbound 3H-E2. 200-fold molar excess of DES was substituted for the binding of $^3H$-$E_2$ to ER sufficiently(binding efficiency of 54.8%). ER was saturated with 4nM of $^3H$-$E_2$ and its dissociation constant was 0.1nM. ER assay using frozen sections(Histological radioreceptor assay, HRRA) was significantly correlated with radioreceptor assay for estradiol(RRA, 0.976 , p<O.05). The present method has been proved a simple and reliable method for the preparation of small tissue samples, particularly for the specialized part of tissue, and for researches on reproductive physiology and pathology.

호르몬측정법의 개발, 제3세대: 현황과 응용

윤용달 한국발생생물학회 2013 한국발생생물학회 학술발표대회 Vol.2013 No.8

면역측정법의 최초 단계(제 1세대)는 방사선 추적자(radiolabeled analyte marker)를 이용한 길항적 측정방법의 개발과 보급이었다. 제 2세대는 단가항체(monoclonal antibody, McAb)를 이용하고, 비방사성 표지자를 이용하여 비경쟁적 초감도의 측정방법이 면역진단 분야에 적용되는 단계였다. 제 3세대는 최소량화(miniatured), 칩을 이용하는(chip-based) microarray 방법을 응용하여, 한시료에서 여러 가지 생리활성물질, 즉 호르몬의 동태를 파악하는 초감도 다변량분석법(simultaneous ultrasensitive measurement)이 개발되고 보급되는 단계라 할 수 있다. 제 1세대의 방사면역측정법(radioimmunoassay, RIA)을 거쳐 제 2세대 비방사면역측정법(non-isotopic immunoassay methods, NIA)에서 장·단점이 모두 비교되고, 각각의 특수성을 가진 측정법이 정립되고, 유용성, 편이성, 경제성, 분석의 수월성 등등 여러 가지가 고려되어 시장에서의 우열이 정리되고, 생존경쟁의 결과가 평가되었다. 이미 제 3세대(Chip/microarray- based multianalysate ligand assays)가 매우 빠르게 개발되고 있어 새로운 전환기를 맞고 있다고 판단된다. 그러나 이들 역시 우수성이 알려지고는 있으나, 재평가되어야 할 것이다. 또한 이들 초감도 면역측정법들이 이용되어 변(Fecalogram), 뇨(Urinogram), 침(Salivagram) 등에서 호르몬과 유리활성호르몬의 기준치들이 설정, 제시되고 있다. 이러한 진행은 non-invasive한 방법을 정립시키고, 내분비학적 호르몬 변동과 행동, 심리적인 변동, 운동생리학, 수의내분비학, 야생동물의 가임성과 불임성 등을 연구하여 종의 보전을 모니터링하는 새로운 장들을 열어가고 있다고 사료된다.

Adrenal and Testicular Androgens in Serum of Men after Physical Endurance Training

윤용달,이창주,이준영 한국발생생물학회 2001 발생과 생식 Vol.5 No.1

최근 격심한 운동은 시상하부-뇌하수체-생식소 (HPG)축의 교란을 일으켜 여성과 남성의 생식기능에 장애를 유발하는 것으로 알려지고 있다. 격심한 운동을 하는 여성 운동선수의 경우는 과소월경, 무배란, 황체기 단축, 성성숙 지연등에 따른 생식호르몬의 변화가 유발된다. 남성 운동선수의 경우는 과도한 운동, 정신적 장애와 긴장, 군 훈련 등 격심한 운동으로 생식호르몬의 분비에 이상이 생긴다고 보고되고 있으나, 임상적인 증상은 미약한 것으로 보고되고 있다. 본 Recently many studies have reported that total and bioavailable androgens reduced in male and female athletes and that physical exercise reduces the body weight and increases the reproductive abnormalities such as oligomenorrhea, anovulation, inadequate luteal phase, and delayed puberty in women by the inhibition of the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis . In addition, high mileage endurance 겨nning, psychological stress, and military endurance training in men also reduce the secretion of reproductive hormones. To investigate the efffcts of physical endurance exercise on the secretion of reproductive hormones in men, androgenic hormones from adrenal glands and testis were measured in serum by the conventional radioimmunoassays after long-term (more than3 months), short-term (1 week), and acute (12 hours) physical exercises. Androgenic hormones from adrenal glands and testis such as total testosterone (TT), free testosterone (fT), dehydroepiandrosterone (DHEA), and androstenedione (A) decreased after thesestrenuous endurance trainings, whereas ACTH, cortisol, and dehydroepiandrosterone sulfetes (DHEAS) increased. Conadotropins (LH and FSH) were not idluenced by the physical exercises. Based upon the present results, we assume that the decrease in adrenal and testicular androgens by physical endurance exercises might be associated with the reproductive abnormalities in athletes by unknown factor(s) in addition to the HPG axis disturbance.

Ultrasensitive Enzymeimmunoassay for Testosterone in Human Saliva

윤용달,전은현,이창주,도병록,이준영 한국발생생물학회 2000 발생과 생식 Vol.4 No.1

남성 및 여성의 타액내 testosterone의 농도를 측정하기 위하여 초감도 효소면역측정법 (ultrasensitive enzymeim-munoassay; EIA)을 정립하고, 이 EIA를 이용하여 한국인 정상 여성 및 남성의 타액에서 testosterone의 정상농도를 얻고자 하였다. 정상 월경주기를 가진 여성 18명에서 아침 6~9시 사이에 타액을 채취하였고, 남성의 타액도 오전 (9~10시)중에 채취하였다. EIA의 표지물질로는 horseradi A few enzymeimmunoassay (EfA) for testosterone (T) have been reported but was not suitable for all biological samples. The present study was designed to develop a rapid, ultrasensitive EIA and to apply this technique for study the physiological changes of T in biological samples. Saliva samples were collected at 06:00~09:00 hour during one menstrual cycle from 18 normally menstruating women and on 09:00~10:00 hour from 20 normal men. The present study shows an established EIA for testosterone, using horseradish peroxidase (HRP), which was covalently bonded to testosterone-3-carboxymethyloxime (T-3-CMO). One batch of T-antisera was also covalently linked to microcrystalline cellulose particles by a mixed anhydride method in order to facilitate separation of bound and free steroids. The established EIA was validated in terms of sensitivity, accuracy, specificity, precisions etc., comparing with conventional radioimmunoassay. The sensitivity of the established EIA was less than 25 pg/tube. The correlation coefficients between the expected T-values and observed T-values measured by EIA or RIA were r=0.985 and r=0.941 respectively. The cross reactivity of antiserum in EIA was a little higher than that of RIA, especially by 5 -DHT. The intra- and inter-assay precisions of the present EIA were similar to those of RIA. The present study also demonstrates that the normal T-values in saliva of Korean male & female samples are 265.6515.80 pmol/l and 109.74 12.01 pmol/l, respectively. The present EIA seems to be established and suitable for use in the endocrinological studies. The advantages of this EIA system also might make the present T-EIA an ideal procedure for use in a routine assay of ordinary laboratory with a conventional spectrophotometer.

Concentrations of Bioavailable Testosterone and Dihydrotestosterone Determined by Luminescence Immunoassay in Serum

윤용달,이창주,전은현,이준영,Yoon, Yong-Dal,Lee, Chang-Joo,Chun, Eun-Hyun,Lee, Joon-Yeong The Korean Society for Reproductive Medicine 1988 Clinical and Experimental Reproductive Medicine Vol.15 No.2

혈액에서 생물학적 활성을 나타내는 (bioavailable) steroid hormone은 주로 비결합형(free form)과 알부민 결합형(albumin-bound form)으로 구성된다. 특히 Testosterone (T)과 5 alpha-Dihydrotestosterone (DHT)의 활성적 분획이 전체의 T, DHT 양에 비해 생리적 현상과 보다 잘 일치하는 것으로 알려지고 있다. 본 연구는 섬광면역측정법(Luminescence immunoassay, LIA)으로 혈청내 활성적 T 및 DHT의 농도의 측정에 이용하고져 하였다. 항체는 T- 또는 DHT-3-CMO-BSA를 항원으로 토끼에 면역주사하여 얻었다. 추적자는 T-3-CMO, DHT-3-CMO에 aminobutylethylisoluminol(ABEI)를 부착시켜 사용하였다. 항체중 IgG분획을 Protein-A-Sepharose CL-4B로 분리한 후 Immunobead(Bio-Rad)에 부착시켜 Solid-phase LIA를 실시하였다. 본 연구에서 LIA는 정확도(accuracy), 정밀도(precision), 감도(sensitivity), 교차반응도(specificity)등을 조사하고, 기존의 방사면역측정법(RIA)과 비교하여 만족할만한 결과를 얻었다. 혈청내 T및 DHT의 활성적 분획의 농도를 측정한 결과는 다음과 같았다. T의 경우는 남성에서 T의 전체량의 33% 이상으로 $7.1{\pm}1.5nmol/l$, 여성에서는 26% 이상으로 $0.28{\pm}0.05nmol/l$이었다. DHT의 활성적 분획은 남성의 경우 $601.7{\pm}85.8pmol/l$, 여성의경우 $52.4{\pm}19.9\;pmol/l$이었다. 이상의 결과를 보아 본 연구에서 이용된 LIA는 혈청내 활성적 농도를 측정하기에 충분하다고 사료된다. 또한 이 방법을 이용하여 여성의 Androgenicity 및 남성 정소기능등의 제어방법에 응용될 수 있을 것으로 판단된다.

The Hormonal Levels of the Short Luteal Phase in Korean Women(II);Change of Serum Prolactin

윤용달,이준영,Yoon, Yong-Dal,Lee, Joon-Yeong The Korean Society for Reproductive Medicine 1984 Clinical and Experimental Reproductive Medicine Vol.11 No.2

본 연구는 황체기 단축현상(Short luteal phase, SLP) 을 가진 한국여성의 월경주기내 Prolactin 호르몬의 농도변화를 정상월경주기 (Normal luteal phase, NLP)와 비교하고져 하였다. 한편, Circadian rhythm 내 PRL 농도의 변화를 비교하고 임신기간중 PRL의 농도변화를 방사면역측정법(RIA) 으로 조사하였다. SLP여성의 PRL 농도는 후기의 여포성숙기(Late follicular phase) 및 초기황체형성기(Early IuteaI phase) 정상에 비하여 현저히 낮았다. 정상 월경주기에서는 PRL/Progesterone(mU/1/mg/ml)의 비율이 후기 여포성숙기까지 증가한 후 LH Peak day 이후 감소하는데 반하여 SLP여성의 비율은 조기 여포성숙기부터 계속적인 감소현상을 보였다. 또한 취침전 (04:00시) PRL의 농도는 SLP여성에게는 현저히 낮았다. 임신주기중 PRL의 농도는 4개월째 1,077mU/l 에서부터 9개월째 4,462mU/l까지 점진적인 증가를 하였다. 위의 결과로 보아 황체기단축현상은 PRL의 분비이상이 하나의 주요요인이 될 수 있으며, 특히 PRL/Progesterone의 농도비율이 SLP의 판정에 한 지표가 될 수 있을 것으로 사료된다.

Effect of 19-Norandrostenedione on the Spermatogenesis in Rat Testis

윤용달,전은현,양현원,김종민,Yoon, Yong-Dal,Chun, Eun-Hyun,Yang, Hyun-Won,Kim, Jong-Min The Korean Society for Reproductive Medicine 1990 Clinical and Experimental Reproductive Medicine Vol.17 No.1

19-nortestosterone(NORA)와 19-norandrostenedione(NT)는 정소내 aromatization과정중 중간 대사물로 검출된다. 본 연구는 이들을 장기간 투여하여 정소 및 부속기관의 무게, 혈청내 testosterone(T)의 농도, 정자형성에 미치는 영향을 조사하였다. NORA, NT 및 TE를 $300/50{\mu}l$농도로 주당 3회씩 12주간 정소에 직접 주사(intratesticular injection, i.t.)하였다. 또한 GnRH antagonist(RS68439)를 처리하여 혈청내 생식소자극호르몬 (GTH)을 감소시킨후 위 호르몬들을 동일방법으로 처리하여 이들의 보상작용을 조사하였다. NORA는 정소무게를 감소시키지 않았으나 GnRH antagonist를 처리하여 감소된 정소무게를 현저하게 보상하였다(P<0.05). NORA, NT, TE는 모두 부속기관의 무게를 증가시켰으며, RS68439가 감소시킨 부속기관의 무게를 현저히 증가시켰다. 그러나 이들은 부정소(epididymis)에는 영향을 주지않았으며 RS68439처리군에서는 보상작용을 나타내었다. 이들의 처리로 혈청내 LH농도는 완전히 감소하였으나 FSH의 농도에는 영향을 나타내지 않았다. 그리고 혈청내 T의 농도를 증가시켰다. NORA는 정자형성과정중 7단계의 spermatid의 수를 현저히 감소시켰다. 위 결과로 보아 NORA는 GnRH antagonist로 FSH의 분비가 억제된 쥐의 FSH분비를 촉진하며, T의 농도를 증가시켜 정자형성과정을 억제하는 것으로 추론된다.

THE HORMONAL LEVELS OF THE SHORT LUTEAL PHASE IN KOREAN W0MEN (III);CHANGE OF STEROID GLUCURONIDES

윤용달,Yoon, Yong-Dal The Korean Society for Reproductive Medicine 1985 Clinical and Experimental Reproductive Medicine Vol.12 No.1

월경주기 중 황체기가 짧은 여성 즉 황체기 단축현상을 가진 한국여성(SLP) 의 특성을 조사하고 진단하는 방법을 개발하기 위하여 본 실험을 행하였다. 재료는 정상 월경주기를 가진 12명의 여성에서 26주기와 8명의 황체기 단축현상을 가진 여성에서 17주기를 선택하였다. 기상후 첫 오줌에서 steroid glucuronides의 농도를 측정하여 비교한 결과는 다음과 같았다. SLP 의 estrone -3 -glucuronide ($E_1G)의 농도는 초기 여포기와 황체기 동안 정상인에 비하여 현저히 낮았다. 또한 SLP 의 전 월경기 중 pregnanediol-$3{\alpha}$-glucuronide($P_2G$)의 농도 역시 유의성있게 낮았다. 그러나 $E_1G/P_2G$의 비율은 여포기가 황체기에 비하여 현저히 높았고, SLP 여성의 비율이 정상인 보다 각 월경주기 중 유의성있게 높았다. 위의 결과로 보아 $E_1G$, $P_2G$및 $E_1G/P_2G$의 농도차로 황체기 단축현상을 가진 여성을 진단 하고 또 치료시 난소의 기능조절에 이욜될 수 있을 것으로 사려된다.