습부식 방법으로 제조한 TiO2 나노선기반 말디톱 질량분석을 이용한 펩티드 분해반응 연구

김미라 연세대학교 대학원 2018 국내석사

본 연구에서는 TiO2 나노선을 고체 매트릭스로 이용하여 펩티드 시퀀싱을 말디톱 질량 분석법으로 구현하고자 하였다. 말디톱 질량 분석법은 시료의 이온화를 돕는 매트릭스를 시료와 혼합하여 분석장치의 타켓에 분주한 후 337 nm의 질소 레이저 복사선을 시료에 조사하면 시료가 매트릭스의 도움으로 쉽게 이온화 되면서 TOF 관에서 이온들의 질량 분석이 진행된다. 높은 감도를 가지고 있어서 펩토몰 범위까지 감지를 할 수 있고, 샘플 준비가 쉬워 단백질, 핵산과 같은 분자량이 큰 생화학 물질의 질량분석에는 효과적이다. 하지만 유기 매트릭스는 분자량 500 Da 이하의 저 분자 범위에서 레이저로 인해 생기는 파편들로 인해 저 분자들을 분석하기에는 사용하기 어렵다는 단점이 있다. 따라서 본 연구에서는 고체 매트릭스 중 광반응이 잘 일어나고 저 분자 범위에서 노이즈를 형성하지 않는 TiO2 나노선을 합성하여 고체 매트릭스로 사용하였다. TiO2는 brookite, anatase, rutile의 세 가지 상으로 존재하며 매우 안정한 물질로 산화력이 커서 광촉매로 많이 사용되고 있다. TiO2는 차원에 따라(0D, 1D, 2D) 나노입자, 나노선 그리고 나노 필름 형태로 존재한다. 이 중, 본 연구에서는 TiO2 나노선을 습부식 나노선 제조 방법으로 합성하였고 FE-SEM, Raman, HR-XRD, AFM 등으로 확인하였고, 방법은 다음과 같다. 알카리 처리, 물 처리, 침수처리를 통해 Ti 플레이트를 기판으로 TiO2 나노선을 3D 그물망 형태로 제조하였으며, 이를 말디톱 질량 분석에 고체 매트릭스로 사용하였다. 펩티드 시퀀싱 방법에는 기존에는 FDNB 방법, Edman degradation 분해법, 그리고 densyl chloride를 사용하였고, 현재는 Tandem mass spectrometry를 이용하는 추세이다. Tandem mass spectrometry는 시료가 혼합된 혼합물을 타겟에 분주하여 일차적으로 질량분석을 통해 원하는 시료만 선택하여 그 시료를 분해하여 시퀀싱 하는 방법이다. 분해된 펩티드의 파편은 분해 방법에 따라 a, b, c, x, y, z 형태로 표기하며 이를 통해 분해된 펩티드를 이용하여 펩티드 시퀀싱을 한다. 본 연구에서는 앞서 언급한 Tandem mass spectrometry의 펩티드 시퀀싱을 말디톱 질량 분석법에서 구현하고자 하였다. 앞서 합성한 TiO2 나노선을 고체 매트릭스로 이 나노선 위에 시료를 분주하여 UV 노광기로 30 s 레이저를 조사한 뒤 말디톱 질량 분석법으로 다양한 펩티드들의 분해 조각을 분석하여 펩티드 시퀀싱을 진행하였다. 또한, UV 레이저 조사 시간에 따른 영향을 알아보고자 UV 조사 시간을 다르게 하여 펩티드 분해 조각을 분석하였고, TiO2 나노선의 표면 거칠기에 따른 시료의 측정 감도 또한 연구하였다. 본 연구에서는 저 분자 범위에서 생체 분자를 보다 정확하게 검출하고자 습부식 나노선 제조 방법으로 TiO2 나노선을 제조하였다. 또한 기존에 FDNB 분해법, Edman degradation 분해법, densyl chloride 분해법 그리고 Tandem mass spectrometry를 통하여 진행되는 펩티드 시퀀싱을 합성된 TiO2 나노선을 고체 매트릭스로 이용하여 펩티스 시퀀싱을 진행 하였고, UV 조사 시간 및 TiO2 나노선의 표면 거칠기 등을 통하여 펩티드의 분해되는 정도를 정성적, 그리고 정량적으로 분석하였다. 이러한 연구를 토대로, TiO2 나노선 뿐만 아니라 광반응 효과가 뛰어난 물질을 고체 매트릭스로 사용하여 말디톱 질량 분석법을 이용한 펩티드 시퀀싱의 가능성을 보이고자 하였다. In this study, TiO2 nanowires synthesized from a Ti plate by wet corrosion process have been used as a solid matrix for laser desorption/ionisation time-of-flight (LDI-TOF) mass spectrometry (MS). TiO2 nanowires as a solid matrix is applied to sequencing the peptide using MALDI-TOF mass spectrometry. Matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) has been widely used for the analysis of macromolecules such as proteins and DNAs. For MALDI-TOF MS measurements, the sample is first mixed with a matrix, which is an organic compound with conjugated structures that can absorb energy in the UV range. When the sample mixed with the matrix is irradiated with a UV-laser, the matrix molecules undergo fragmentation as a result of the absorption of the energy. The matrix fragments then, ionise the samples in to [M+H]+, [M+2H]2+ and so on, where M represents the parent ion and H represents a proton. As the ionisation mechanism is very mild, the macromolecules can be ionised without fragmentation. For analysis using MALDI-TOF MS, the sample mixed with the matrix solution is dropped on a metal plate. The dried sample usually makes a non-homogeneous crystal and different amounts of the ions are produced based on the position of the laser radiation. Additionally, as the organic matrix compounds are fragmented upon irradiation, the mass peaks of the matrix molecules are non-reproducibly produced at low m/z ratios (<500). As a result, quantitative and the small molecule analyses are very difficult to achieve using MALDI-TOF MS for compounds with a molecular weight of less than 500 Da. For this reason, TiO2 nanowires synthesized by wet corrosion treatment of a Ti plate have been reported as a solid matrix for LDI MS. Usally, TiO2 exists in three crystal structures at atmospheric pressure: rutile, brookite, anatase. TiO2 nanomaterials are very stable substance and have been considered the most promising materials because of their strong absorption in the UV range. TiO2 exists in nanoparticle, nanowires and nanofilm patterns following dimensions. In this work, TiO2 nanowires were top-down synthesized on a solid matrix Ti plate for LDI-TOF mass spectrometry throught the wet corrosion process: (1) KOH treatment (TA), (2) water treatment (TAW) and (3) heat treatment (TAWH). By this process, 30 nm thick TiO2 nanowires with 3D network structures were synthesized. The crystal structure was characterized by XRD, Raman spectroscopy. The feasibility of the TiO2 nanowires in the anatase phase as a solid matric for LDI-TOF mass spectrometry was demonstrated using arginine as a model analytes. Traditional methods of peptide sequencing are FDNB method, Edman degradation, and using densyl chloride. Currently, many groups using Tandem mass spectrometry for peptide sequencing. Tandem mass spectrometry, also known as MS/MS, involves multiple steps of mass spectrometry selection, with some form of fragmentation occurring in between the stages. In a tandem mass spectrometer, ions are formed in the ion source and separated by mass-to-charge ratio in the first stage of mass spectrometry (MS1). Ions of a particular mass-to-charge ratio (precaursor ions) are selected and fragment ions (product ions) are created by collision-induced dissociation, ion-molecule reaction, photodissociation, or other process. The resulting ions are then separated and detected in a second stage of mass spectrometry (MS2). Interpretation of the MS/MS spectra is primarily based on analyzing sequence-specific fragment ions formed by cleavage of these bonds. The fragment ion type is identified by a letter, based on the type of backbone bond cleaved and which terminus the fragment contains; a, b, c, x, y, and z. In this study, TiO2 nanowires were applied to MALDI-TOF MS for peptide sequencing. Some peptides dispensed onto the TiO2 nanowires with up to 0.5 µl per sample spot and investigated UV laser to a TiO2 nanowires plate for 30 s. Then, a peptide converted into peptide fragment and analyzed these fragment using MALDI-TOF MS. Furthermore, studied depending on investigated UV laser time how to made peptide fragment, TiO2 nanowires surface roughness how sensitive to detect analytes. In this study, top-down synthesized TiO2 nanowires are presented as an ideal solid matrix to analyze small biomolecules at a m/z of less than 500. Then, TiO2 nanowires as a solid matrix were applied to MALDI-TOF MS for peptide sequencing. Furthermore, studied depending on investigated UV laser time how to made peptide fragment, TiO2 nanowires surface roughness how sensitive to detect analytes quantitatively. In this study, top-down synthesized TiO2 nanowires have been used as a solid matrix for LDI-TOF MS. Furthermore, TiO2 nanowires as a solid matrix is applied to sequencing the peptide using MALDI-TOF mass spectrometry.

Development for Monosaccharide-Biomarkers in Diabetes Mellitus by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry without Derivatization

강민정 과학기술연합대학원대학교 2017 국내석사

자연계에 널리 존재하는 단당류는 바이러스 감염, 면역 반응, 종양, 염증 등의 생물학적, 병리학적 과정에 중요한 역할을 하는 등 분자 세포 메커니즘에 관련되어 있을 뿐만 아니라 암, 심장 질환, 당뇨병, 비 알코올성 지방간 질환을 포함한 다양한 질환의 치료 및 진단 방법에도 사용되고 있다. 특히 혈청에 포함된 프룩토오스 (fructose)의 경우 현대인들에게 많이 발생하고 있는 type 1.5 diabetes에서 높게 측정된다고 보고되고 있다. 단당류는 물리·화학적 특성이 유사한 수많은 이성질체가 존재하기 때문에 분자량과 고유한 조각화 패턴으로 정성분석과 정량분석이 어렵다. 본 연구에서는 고성능 액체크로마토그래피-탠덤질량분석기를 이용하여 효율적인 단당류의 분석법을 개발하고자 한다. 체내에 존재하고 있는 8개의 단당류를 탈수소화 된 형태인 [M-H]- 를 선택하고, negative mode 및 multiple reaction monitoring (MRM) 방법을 사용하였다. 특정 아미노기로 구성된 Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) 컬럼으로 친수성인 단당류의 컬럼 내 머무름을 증가시켜 이성질체간의 분리를 용이하게 하였다. 이동상 조성, 유속, 컬럼 온도 등의 분리 요인을 비교하였으며 고감도 LC-MS/MS 이용하여 8개의 단당류를 분석하기 위한 최적화된 조건을 확보하였다. 이 방법은 다양한 화학 시약을 사용한 분석물의 환원 방법, 유도체화 방법, 컬럼 후 (post-column) 유도체화 방법 없이 보다 간이화 된 전처리 과정을 통해 체내에 존재하는 단당류 8종 (hexoses: D-glucose/ D-fructose/ D-mannose/ D-galactose; pentoses: D-ribose/ L-arabinose/ D-xylose; hexose deoxy sugar: L- fucose)에 대한 분석이 가능한 것으로 확인하였다. 본 연구 결과로부터 다양한 질병을 갖는 환자의 혈액, 침, 소변과 같은 체액 속 단당류를 모니터링 함으로써 쉽고 빠르게 질병 의 진단 및 진행 단계를 확인 할 수 있는 다양한 응용 할 수 있을 뿐만 아니라 혈청에 포함된 프룩토오스를 측정을 하므로 당뇨병 합병증인 케토시스 (ketosis)를 수반한 1.5 형 당뇨병의 진단 가능성을 제시한다. Monosaccharides in biological systems are the important components in many diverse areas including therapeutic development and disease diagnostics (e.g obesity, metabolic syndrome, cancer and diabetes). It is difficult biomolecules to quantify due to the largest numbers of existing forms, along with their chemical similarity and structural complexity. In particular, isomeric monosaccharides are not distinguished by their mass and fragmentation pattern. Thus, this study aims to develop an effective method of monosaccharides by using liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Eight monosaccharides were detected as deprotonated form [M-H]- using electrospray ionization in negative ion MRM mode. HILIC chromatography with amino groups in the stationary phase (HILICpak VG-50 4E) was used to increase retention of polar compounds, underivatized monosaccharides and to resolve stereoisomers of monosaccharides subunits. The mobile phase consisted of 0.1% (v/v) ammonium hydroxide in water and acetonitrile. We found the optimized condition to separate eight monosaccharides in liquid chromatography-tandem mass spectrometry by changing mobile phase composition, gradient mode, and column temperature. This method does not require reduction, derivatization, or post-column addition of various chemical reagents. Monosaccharides (hexose: D-glucose/ D-fructose/ D-mannose/ D-galactose; pentose: D-ribose/ L-arabinose/ D-xylose; hexose deoxy sugar: L-fucose) were effectively separated with simplified sample preparation. It provides clear chromatographic separation and mass spectrometric detection for eight simple sugars, simultaneously. In conclusion, liquid chromatography coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry was a powerful technique for the separation and quantitation of 8 monosaccharides. This method will be useful the monitoring eight monosaccharides in biological fluids such as blood, saliva, urine, and tissues with various human diseases and offering early diagnosis and treatment by determining staging - type 1.5 diabetes including diabetic ketoacidosis or ketosis as measurement of fructose concentrations in human serum.

Energy Dependent Tandem Mass Spectrometry Analysis for Structural Identification of Polycyclic Aromatic Hydrocarbon Compounds : 에너지에 따른 Tandem Mass Spectrometry를 이용한 Polycyclic Aromatic Hydrocarbons 의 구조 분석

하지현 경북대학교 대학원 2017 국내석사

Polycyclic Aromatic Hydrocarbon (PAH) compounds는 원유, 석탄 등으로 주위에 많이 존재하고 있는 화합물 중 하나이다. PAH 안에는 여러 isomer들을 포함, 많은 종류의 화합물들이 존재하며 몇몇 compound는 환경과 사람에게 상당한 오염물질로 작용한다. 이들을 구조 분석하는 것은 원유 공정 등과 같은 곳에서 매우 중요하게 생각하고 있다. 주로 많이 쓰이는 기기 중 하나는 Liquid Chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)이다. 하지만 이러한 PAH 화합물들을 분석한 논문들은 적으며 그조차도, resolution이 낮거나 몇 개의 compound, collision energy만 가해서 얻은 스펙트럼이 전부이다. 따라서 High resolution mass spectrometry를 이용하여 다양한 energy를 가해 PAH compound의 tandem mass spectra를 얻는다면 isomer를 포함하여 많은 화합물을 구별할 수 있을 것이라고 가정하였고 이 가정을 확인하기 위해 60여개의 PAH standard 화합물을 분석하여 스펙트럼을 얻었다. MS/MS spectra는 collisional energy와 구조에 따라 서로 다른 fragmentation pattern을 가지고 있었으며 이 데이터를 이용하여, aromatic ring에 붙은 side chain의 개수와 ring 사이의 alkyl chain의 길이에 따른 화합물, isomer 등을 포함하여 여러 PAH 화합물을 구별할 수 있었다. 또한 실제 sample인 Crude oil fraction에도 적용을 시켜 각각 가지는 core structure를 예측할 수 있었다.

LC-ESI-tandem mass spectrometry를 이용한 현호색 종에서의 Alkaloids 구조구명 : Structural Determination of Alkaloids in Corydalis Species by LC-ESI-Tandem Mass Spectrometry

정은경 경희대학교 약학대학원 2012 국내석사

This study was conducted for the structural determination of several alkaloids presented in Corydalis species (Corydalis decumbens, Corydalis ternata, and Corydalis yanhusuo) including protopine, aporphine, benzylisoquinoline, phthalide, tetrahydroprotoberberine, and protoberberine alkaloids. Several kinds of alkaloids were rapidly extracted from Corydalis species by sonication with 70% methanol and liquid-liquid extraction (LLE). These alkaloids in extract were successfully separated by a reversed-phase C18 column using gradient elution and identified by electrospray ionization (ESI)-tandem mass spectrometry (MS/MS). An LC-Fourier-transform ion cyclotron resonance (FT-ICR)-MS was also applied to obtain accurate mass measurements of unknown alkaloids. For the structural elucidation of several alkaloids extracted from Corydalis species, the authentic alkaloids were preferentially analyzed and their MS/MS spectra were interpreted to find diagnostic ions according to their structural characteristics. The aporphine alkaloids with methoxy groups on rigid ring structure produced characteristic ions such as [M+H]+, [M+H-OCH3]+ and [M+H-OCH3-CH3OH]+ in the ESI-MS/MS analysis. The MS/MS spectra of protoberberine alkaloids with quaternary amine showed the intense ions including [M]+, [M-CH3]+, and [M-CH3-CO]+ ions. For tetrahydroprotoberberine and protopine type alkaloids, characteristic ions resulted in the retro-Diels-Alder (RDA) fragmentations via fusion of B- and/or C-ring, producing abundant ions. Especially, the dehydrated ions of [M+H]+ ion for protopine type alkaloids were produced through iminolization during the ESI process. Based on the MS/MS spectral patterns and FT-ICR-MS data, a total 33 of alkaloids observed in Corydalis species were identified or tentatively identified and 10 of them were for the first time reported from C. species investigated in this study. Those results will be helpful for the identification of unknown alkaloids observed in plants and also for the understanding of plant metabolism. LC-ESI-tandem mass spectrometry를 이용한 현호색 종에서의 Alkaloids 구조구명 정 은 경 지도교수 홍 종 기 본 연구는 현호색(Corydalis(C.) tuber) 종 (C. decumbens, C. ternata, C. yanhusuo)에 있는 aporphine, tetrahydroprotoberberine, protoberberine, protopine, benzylisoquinoline 계열을 포함하는 여러 알칼로이드의 구조를 규명하기 위해 수행되었다. 이러한 알칼로이드의 효과적인 추출은 70% methanol의 초음파 추출 (sonication) 과 액-액 추출과정 (LLE) 을 거쳐 이루어졌다. 또한 알칼로이드는 역상에서의 C18 컬럼의 기울기 용리 조건을 통한 분리와 전자분무이온화 (ESI) - 탄뎀 질량분석 (MS/MS) 에 의한 구조확인이 동시에 분석되었다. 또한 미지의 알칼로이드의 정확한 분자량 정보를 얻기 위하여 푸리에-변환 이온 사이클론 트론 공명 질량분석 (FT-ICR MS) 을 적용하였다. 현호색 종에서의 알칼로이드 추출을 확실히 하기 위해서 인증된 표준품으로 우선적인 분석이 이루어지고 그들의 구조적인 특성에 따른 진단 이온들의 해석이 MS/MS 스펙트럼의 해석으로 진행되었다. 안정한 환 구조를 가지는 aporphine 알칼로이드의 구조는 특성이온으로써 [M+H]+, [M+H-•OCH3]+ 그리고 [M+H-•OCH3-CH3OH]+ 가 MS/MS 분석에서 나타났다. Protoberberine 알칼로이드인 quaternary alkaloids 의 스펙트럼은 [M]+, [M-•CH3]+, 그리고 [M-•CH3-CO]+ 의 형성을 나타내었다. Tetrahydroprotoberberine alkaloids 의 경우는 retro Diels-Alder (RDA) 반응에서 B 와 (또는) C-환 구조의 분해 현상으로 생성되는 특성이온을 통해 크게 두 개의 조각 이온을 생성한다. 특히 protopine 계열의 알칼로이드는 ESI 과정 중에 iminolization 반응을 통하여 tetrahydroprotoberberine 계열의 알칼로이드로 전환 될 수 있다. 이전의 보고되었던 알칼로이드의 HPLC 용리 패턴과 MS/MS 스펙트럼의 패턴을 기초로 하여 현호색 종에 있는 총 33종의 알칼로이드를 잠정적으로 확인하였으며 특히 본 연구에서는 그 중 11 종의 알칼로이드를 현호색 종에서 처음으로 확인할 수 있었다. 따라서 본 연구는 식물에서의 밝혀지지 않은 미지의 알칼로이드를 밝히고 그들의 구조를 확인하는데 큰 도움을 줄 것이다.

Structural Determination of Alkaloids in Corydalis Species by LC-ESI-Tandem Mass Spectrometry

정은경 경희대학교 대학원 2012 국내석사

This study was conducted for the structural determination of several alkaloids presented in Corydalis species (Corydalis decumbens, Corydalis ternata, and Corydalis yanhusuo) including protopine, aporphine, benzylisoquinoline, phthalide, tetrahydroprotoberberine, and protoberberine alkaloids. Several kinds of alkaloids were rapidly extracted from Corydalis species by sonication with 70% methanol and liquid-liquid extraction (LLE). These alkaloids in extract were successfully separated by a reversed-phase C18 column using gradient elution and identified by electrospray ionization (ESI)-tandem mass spectrometry (MS/MS). An LC-Fourier-transform ion cyclotron resonance (FT-ICR)-MS was also applied to obtain accurate mass measurements of unknown alkaloids. For the structural elucidation of several alkaloids extracted from Corydalis species, the authentic alkaloids were preferentially analyzed and their MS/MS spectra were interpreted to find diagnostic ions according to their structural characteristics. The aporphine alkaloids with methoxy groups on rigid ring structure produced characteristic ions such as [M+H]+, [M+H-OCH3]+ and [M+H-OCH3-CH3OH]+ in the ESI-MS/MS analysis. The MS/MS spectra of protoberberine alkaloids with quaternary amine showed the intense ions including [M]+, [M-CH3]+, and [M-CH3-CO]+ ions. For tetrahydroprotoberberine and protopine type alkaloids, characteristic ions resulted in the retro-Diels-Alder (RDA) fragmentations via fusion of B- and/or C-ring, producing abundant ions. Especially, the dehydrated ions of [M+H]+ ion for protopine type alkaloids were produced through iminolization during the ESI process. Based on the MS/MS spectral patterns and FT-ICR-MS data, a total 33 of alkaloids observed in Corydalis species were identified or tentatively identified and 10 of them were for the first time reported from C. species investigated in this study. Those results will be helpful for the identification of unknown alkaloids observed in plants and also for the understanding of plant metabolism. LC-ESI-tandem mass spectrometry를 이용한 현호색 종에서의 Alkaloids 구조구명 정 은 경 지도교수 홍 종 기 본 연구는 현호색(Corydalis(C.) tuber) 종 (C. decumbens, C. ternata, C. yanhusuo)에 있는 aporphine, tetrahydroprotoberberine, protoberberine, protopine, benzylisoquinoline 계열을 포함하는 여러 알칼로이드의 구조를 규명하기 위해 수행되었다. 이러한 알칼로이드의 효과적인 추출은 70% methanol의 초음파 추출 (sonication) 과 액-액 추출과정 (LLE) 을 거쳐 이루어졌다. 또한 알칼로이드는 역상에서의 C18 컬럼의 기울기 용리 조건을 통한 분리와 전자분무이온화 (ESI) - 탄뎀 질량분석 (MS/MS) 에 의한 구조확인이 동시에 분석되었다. 또한 미지의 알칼로이드의 정확한 분자량 정보를 얻기 위하여 푸리에-변환 이온 사이클론 트론 공명 질량분석 (FT-ICR MS) 을 적용하였다. 현호색 종에서의 알칼로이드 추출을 확실히 하기 위해서 인증된 표준품으로 우선적인 분석이 이루어지고 그들의 구조적인 특성에 따른 진단 이온들의 해석이 MS/MS 스펙트럼의 해석으로 진행되었다. 안정한 환 구조를 가지는 aporphine 알칼로이드의 구조는 특성이온으로써 [M+H]+, [M+H-&#8226;OCH3]+ 그리고 [M+H-&#8226;OCH3-CH3OH]+ 가 MS/MS 분석에서 나타났다. Protoberberine 알칼로이드인 quaternary alkaloids 의 스펙트럼은 [M]+, [M-&#8226;CH3]+, 그리고 [M-&#8226;CH3-CO]+ 의 형성을 나타내었다. Tetrahydroprotoberberine alkaloids 의 경우는 retro Diels-Alder (RDA) 반응에서 B 와 (또는) C-환 구조의 분해 현상으로 생성되는 특성이온을 통해 크게 두 개의 조각 이온을 생성한다. 특히 protopine 계열의 알칼로이드는 ESI 과정 중에 iminolization 반응을 통하여 tetrahydroprotoberberine 계열의 알칼로이드로 전환 될 수 있다. 이전의 보고되었던 알칼로이드의 HPLC 용리 패턴과 MS/MS 스펙트럼의 패턴을 기초로 하여 현호색 종에 있는 총 33종의 알칼로이드를 잠정적으로 확인하였으며 특히 본 연구에서는 그 중 11 종의 알칼로이드를 현호색 종에서 처음으로 확인할 수 있었다. 따라서 본 연구는 식물에서의 밝혀지지 않은 미지의 알칼로이드를 밝히고 그들의 구조를 확인하는데 큰 도움을 줄 것이다.

Development of doping control method for autologous blood transfusion by profiling analysis of phospholipids using liquid chromatography-tandem mass spectrometry in human red blood cells

우지혜 Graduate School, Korea University 2015 국내석사

Illegal doping drugs have been prohibited by World Anti-Doping Agency (WADA) for protecting the health of athletes, and WADA suggest the guidelines how to defense from dopings every year. Blood transfusion using the oxygen carrying capacity of red blood cells improves the sport performance of the athlete dramatically. Especially autologous blood transfusion method had been tried to use own blood which was previously collected and stored. Therefore autologous blood transfusion is hard to detect comparing to other doping methods or drugs, and still there are no strict WADA guidelines. Here we focused on the phenomena that red blood cells of cryogenic stored blood undergo the change in membrane phospholipids composition. Human Blood was collected from healthy donor and stored at low temperature of -70°C for 72 days and Membrane phospholipids were extracted through Bligh & Dyer method. Sellected six phospholipids (PC32:0, PC32:1, PC34:1, PC34:2, SM24:1, LysoPC18:0) were analyzed using liquid chromatography-tandem mass spectrometry and results showed significant change and subjected to further validation experiment in phospholipids between normal and cryopreserved blood is anticipated to present new guidelines for autologous blood transfusion. 적혈구의 산소 공급을 이용한 수혈 도핑은 운동경기의 정당성에 반(反) 할 뿐 아니라 선수의 건강까지 해할 수 있는 위험한 시도이다. 수혈 도핑은 타인의 혈액을 주입하는 타가수혈과 선수의 혈액을 저장 후 선수 자신에게 주입하는 자가 수혈이 있다. 기존의 수혈 검출 방법은 모든 선수에게 직접적으로 적용시키기 어렵거나, 자가수혈에는 적용 할 수 없는 등의 단점이 있었다. 이러한 기존의 단점들을 극복하여 자가 수혈도핑을 보다 간편히 검출 하고자 하는 연구는 세계 각 도핑 센터의 주요 연구 중 하나이다. 본 연구에서는 적혈구의 막 인지질 성분이 자가수혈 과정에서 변화 할 것으로 예상하고 그 변화를 측정하여 자가수혈 여부를 알 수 있는 방법을 고안하였다. 적혈구 막 인지질은 친수성 인산기와 소수성의 탄소 사슬이 이중충의 구조로 막을 형성한다. 인산기에 따라 스핑-고마이엘린, 포스포콜린, 포스포에탄올아민 등으로 나뉘어지며 인산기와 결합하는 탄소 사슬에 따라서 다양한 종류가 존재한다. 인지질 이중층은 적혈구 막에서 물질의 수송과 신호전달의 역할을 하며 적혈구의 형태를 유지한다. 수혈에 관한 여러 논문에서 저온에 저장될 때 인지질의 수치가 변화된 보고가 있으며, 이를 자가수혈 검출 방법에 도입하고자 하였다. 지원받은 혈액을 -70°C에서 72일간 저장한 후 Liquid Chromatography-tandem mass spectrometry로 분석하였다. Liquid Chromatography-tandem mass spectrometry의 활용은 이미 그 간편함과 정확성이 널리 알려져 있다. 인지질이 조각화될 때 공통적으로 나타나는 184 m/z을 product 값으로 정하여 SRM mode로 측정하였다. 실험을 위한 validation을 통해 인지질을 Liquid Chromatography-tandem mass spectrometry로 확인 할 수 있는 실험법을 정한 후 시료를 분석하였다. 이번 실험에서는 인지질 성분 중 6개의 인지질이 시도 되었으며, 분석된 적혈구의 인지질 중 SM 24:1의 큰 차이를 확인하였다. 대부분의 인지질이 변화함을 보였으며, 인지질의 구성의 개인차 보다 확연히 다른 양상의 수치를 나타낸다. 또한 식습관에 따른 적혈구 막 인지질의 구성을 연구한 결과보다도 판이하게 다른 양상을 보였다. 이와 같은 결과는 정상적인 환경이 아닌 자가수혈 시 필수적인 혈액의 저온저장 후 해동의 과정에서 나타나는 변화이며, 본 연구를 바탕으로 저온 저장된 혈액이 다시 체내에 주입되는 자가수혈 검출법으로 활용이 가능함을 나타낸다. 향 후 실험은 더욱 다양한 인지질의 시도와 생체 내에서의 실험, 저장 일수의 변화추이, 나아가 fatty acid의 변화 메커니즘의 연구가 추가적으로 수행 될 가치가 있으며 이를 바탕으로 보다 완전한(신빙성 있는) 자가수혈 검출법을 얻을 수 있을 것이라 예상된다.

Metabolic profiling of human urine after administration of imatinib response in healthy human using liquid chromatography-tandem mass spectrometry : 액체 크로마토그래피-질량분석기 기반 이매티닙 대사체 프로파일링

신용철 경북대학교 대학원 2017 국내석사

Imatinib is an anti-cancer drug that inhibits specific tyrosine kinases including BCR-ABL. Here, we investigated the effect of imatinib on endogenous metabolism through a metabolomic approach using liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). In this study, twenty healthy Korean male volunteers received 400 mg imatinib orally one time. For metabolic profiling, pre- and post-dose urine samples were collected continuously for 12 h before and after imatinib administration. All samples were analyzed by LC-MS full scan with XCMS software. After quantile normalization, multivariate statistical analysis was carried out using SIMCA-P+. Principal component analysis (PCA) and partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) plot revealed a clear separation between pre- and post-dose groups. From the PLS-DA, a total of 322 metabolites that played important roles in the separation were selected according to the variable importance projection (VIP) value ≥ 1.0. Eight endogenous metabolites were identified by using several metabolite databases. The identified endogenous metabolites were betaine, adenine, tyramine, thiamine, indole-3-acetic acid, epinephrine, sphingosine, and 7-dehydrocholesterol. Among them, betaine is known to be associated with mitochondrial activation and reduced glucose uptake. Taken together, this pharmacometabolomic approach would serve as a good tool for predicting endogenous imatinib response using the LC-MS/MS system. 이매티닙은 타이로신 키나아제인 BCR-ABL을 억제하는 항암제이다. 본 연구에서는 액체크로마토그래피-질량분석기를 이용한 대사체 프로파일링을 통해 이매티닙 투여 전∙후 내인성대사체 변화를 조사하였다. 20명의 건강한 한국인 남성 자원자는 이매티닙 400 밀리그램을 1회 복용하였다. 대사체 프로파일링을 위해, 이매티닙 복용 전과 후 각각 12 시간 채취한 축뇨를 사용하였다. 모든 시료들은 XCMS 소프트웨어와 액체크로마토그래피-질량분석기로 분석되었고, 표준화과정 후에 SIMCA-P+를 이용하여 다변량 통계분석을 수행하였다. 연구 결과, 주성분분석 및 부분최소자승판별분석에서 투여 전과 투여 후 그룹간이 명확하게 분리되었음을 확인하였다. 부분최소자승판별분석에서 그룹 간 분리에 중요한 역할을 하는 총 322개의 대사체 (VIP ≥ 1.0)를 선별하였다. 여러 대사체 데이터베이스를 사용하여 베테인, 아데닌, 티라민, 티아민, 인돌-3-아세트산, 에피네프린, 스핑고신 및 7- 디하이드로콜레스테롤의 8개 내인성 대사체들을 확인하였다. 액체크로마토그래피-질량분석기를 이용한 본 연구의 약물대사체학 접근 방식은 내인성 이매티닙 반응을 예측하는 좋은 도구로서의 역할을 할 것으로 예상된다.

Evaluation of Complexation and Transformation Products Between Alachlor and Transition Metals Studied by ESI Tandem Mass Spectrometry

박성군 Graduate school of Changwon National University 2004 국내박사

Alachlor (2-chloro-2',6'-diethyl-N-(methoxymethyl) acetanilide(IUPAC) is one of the chloroacetamide herbicide that is extensively used to prevent weed growth primarily on corn and soybean crops. This compound when applied to crops undergoes transformation under the influence of environment. The persistent agrochemicals often cause health hazards to non-target organisms including animals and man. The fate of alachlor applied in soil is governed by various processes, such as adsorption and transformation in addiction to the influence of a number of factors such as alachlor concentration, moisture, temperature, metal species and climate conditions. The goal of our experiments was to determine the effects of transition metals on alachlor dissociation, and metal complexation structure with alachlor by using ESI-Mass spectrometry. In this work, possible manganese complexes of alachlor and other transition metal complexes of alachlor were investigated for the influence of transition metals on decomposition of alachlor by using electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS). Under ESI conditions, the singly charged complex ions, such as [M+MnCl]^(+), [2M+MnCl]^(+), and polynuclear complexes, such as [2M+Mn_(2)Cl_(3)]^(+), [2M+Mn_(3)Cl_(5)]^(+), [3M+Mn_(2)Cl_(3)]^(+), [3M+Mn_(3)Cl_(5)]^(+) and doubly charged complex ions such as [3M+ Mn]^(2+), [4M+ Mn]^(2+)(M=alachlor), formed between alachlor and manganese chloride. Tandem mass spectrometric determination showed that the fragmentation patterns of the complexes are different from that of alachlor molecule indicating that the complexation with transition metal might cause different degradation pathway of alachlor in the environment. The signal intensities of complex ions between alachlor and manganese as well as other transition metals are significantly increased as compared to that of alachlor's, which can be useful to the enhanced determination of low level of alchlor in the environment.

Untargeted metabolic profiling of human urine prior to and following administration of glimepiride by liquid chromatography -tandem mass spectrometry : 액체 크로마토그래피 탠덤 질량분석기를 이용한 글리메피리드 복용 전, 후의 사람 뇨의 비표적 대사체 프로

도은영 경북대학교 대학원 2016 국내석사

Glimepiride, a third generation of sulphonylureas, is an antihyperglycemic agent which is widely used to treat type 2 diabetes mellitus. In this study, endogenous metabolic profiling of healthy human urine before and after glimepiride administration was investigated using liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Urine samples of thirteen healthy male volunteers were collected before and after 2 mg glimepiride administration. The chromatogram data acquired by LC-MS/MS analysis was processed to detect, align, and normalize peak by R program (version 2.9.0). The dataset with 804 peaks were imported to SIMCA (version 14) to carry out multivariate statistical analysis to obtain the statistically significant metabolites affected by glimepiride administration. Principal component analysis and orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) score plots showed a clear separation between pre- and post-dose groups. From the OPLS-DA model, a total of 288 metabolites that played important role in the separation were selected according to the variable importance projection value > 1.0. Employing several metabolite databases, eight endogenous metabolites were identified. The identified endogenous metabolites were 2'-deoxyuridine, L-glutamine, cytidine, trigonelline, urocanic acid, 5-hydroxyindoleacetic acid, 3, 4, 5-trimethoxycinnamic acid, and adenine. Taken together, these results will be useful for understanding the alteration in biochemical pathways affected by glimepiride. 글리메피리드는 제 3세대 설폰요소제이며, 제 2형 당뇨병의 치료에 널리 이용되는 혈당강하제이다. 본 연구는 복용 전, 후 사람 뇨 시료의 액체 크로마토그래피 탠덤 질량분석기를 이용한 비표적 대사체 프로파일링 분석을 통해 글리메피리드 복용으로 인해 변한 내인성 대사체를 확인하고자 한다. 뇨 시료는 2 밀리그램의 글리메피리드를 복용한 열 세명의 건강한 남성 자원자에게서 얻어졌다. 액체크로마토그래피 탠덤 질량분석기로 얻어진 크로마토그램 데이터는 피크의 검출, 조정, 표준화를 위해 R 프로그램 (버전 2.9.0)을 사용하여 분석하였다. 총 804개의 피크 데이터셋은 SIMCA (version 14)를 이용해 다변량 통계분석 과정을 거쳤으며, 이를 통해 글리메피리드 복용으로 영향을 받은 대사체를 분리했다. 주성분분석과 직교부분최소자승판별분석의 점수 그림에서 복용 전, 후 그룹이 분명하게 나뉘어지는 것을 확인하였다. 직교부분최소자승판별분석을 통해 Variable importance in the projection 값이 1을 초과하는 복용 전, 후의 분리에 중요한 역할을 하는 288개의 대사체를 선별하였다. 다양한 대사체 데이터베이스를 이용하여 최종적으로 8개의 내인성 대사체를 선별하였다. 확인된 8가지의 내인성 대사체는 2'-데옥시유리딘, L-글루타민, 사이티딘, 트리고넬린, 유로카닌산, 5-히드록시인돌아세트산, 3, 4, 5-트리메톡시신남산, 아데닌이다. 본 연구에서 글리메피리드 복용으로 인한 대사 변화가 프로파일링 되었고, 이 결과는 글리메피리드로 인해 영향을 받은 생화학적 대사경로의 변화를 이해하는데 유용할 것이다.

Simultaneous determination of statins in human urine by dilute-and-shoot-liquid chromatography-mass spectrometry

Jang, hae-jong Kangwon National University 2019 국내박사

An innovative, simple, and rapid assay method based on liquid chromatography combined with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) was developed and validated for the simultaneous determination of eight statin drugs in human urine. A simple sample clean-up procedure using the “dilute and shoot” (DAS) approach enabled a fast and reliable analysis. The influence of the dilution factor was investigated to ensure detectability and reduce the matrix effect. Chromatographic separation was performed on a Phenomenex Kinetex C18 column (2.6 µm, 50 × 3.0 mm i.d.) using an elution gradient of mobile phase A composed of 0.1% acetic acid, and mobile phase B composed of acetonitrile, at a flow rate of 0.35 mL/min. Quantitation was performed on a triple quadrupole mass spectrometer operated in multiple reaction monitoring (MRM) mode using positive ion electrospray. The total chromatographic run time was 15 min. The method was validated for selectivity, sensitivity, recovery, linearity, accuracy, precision, and stability. The present method was successfully applied to the analysis of Rosuvastatin in urine samples after oral administration to healthy human subjects. 사람 소변 내의 8가지 statin 계열 약물을 혁신적이고 간단하며 신속하게 분석할 수 있는 LC-MS/MS (liquid chromatography-tandem mass spectrometry)를 이용한 분석법을 개발하고, 검증하였다. “dilute and shoot” (DAS) 라는 방식으로 간단하게 시료를 처리하는 빠르고 신뢰할 수 있는 분석법입니다. 생체시료 효과를 감소시키고 검출할 수 있게 희석 인자를 연구하였다. Phenomenex Kinetex C18 column (50 × 3.0 mm i.d., 2.6 µm) 을 사용하였으며, 0.1% acetic acid (이동상 A)와 acetonitrile (이동상 B)를 0.35 mL/min 으로 흘리면서 이동상의 조성 변화를 주어 8가지 statin계열 약물의 크로마토그램을 분리하였다. API-3200 LC-MS/MS의 양이온 전기 분무법을 이용한 MRM (multiple reaction monitoring) 모드로 분석하여 정량하였다. 총 분석 시간은 15분 이었다. 선택성, 감도, 회수율, 직선성, 정확성, 정밀성 및 안정성을 통하여 분석법을 검증하였다. 본 연구에서 개발된 분석법을 건강한 사람에게 경구 투여 한 후 채취한 소변에서 Rosuvastatin 분석에 적용하였다.