실뱀 (Orientocoluber spinalis)의 분변 eDNA 내 먹이원 분석용 블로킹 프라이머 개발과 NGS와 클로닝 분석의 효율성 비교

민성훈 강원대학교 대학원 2023 국내석사

먹이원에 대한 연구는 한 종의 생태적 지위와 행동권, 행동 특이성을 알 수 있게 해준다. 먹이원 연구 중 분변을 이용한 분자적 분석방법은 연구대상에게 최소한의 스트레스를 주기 때문에 멸종위기종 같이 개체수가 많지 않은 종에게 쓰기 적합하다. 실뱀(Orientocoluber spinalis)은 국내외에 서식 중인 종이며, 특유의 빠른 움직임과 적은 개체수로 인해 연구사례가 많지 않다. 본 연구는 실뱀의 생존에 영향을 미치지 않는 비침습적 먹이원 분석 방법을 개발하기 위해 수행되었다. 이를 위해 범용 척추동물 프라이머를 이용한 PCR 시, 분변 내 실뱀 자신의 DNA 증폭은 막지만, 먹이원 DNA는 증폭시킬 수 있는 블로킹 프라이머를 개발하였다. 이어서, 해당 프라이머를 통해 증폭시킨 실뱀 분변 내 먹이원 DNA를 NGS와 클로닝 방법을 통해 염기서열을 얻고, 이를 바탕으로 분변 eDNA 내 먹이원 분석의 효율을 비교하였다. 연구 결과, 실뱀을 포함한 파충류 8종을 제외한 잠재적인 척추동물 먹이원들의 유전자를 검출할 수 있는 블로킹 프라이머를 개발하였다. 실뱀의 증폭된 분변 eDNA를 NGS로 분석하였을 때 실뱀 3개체에서 각각 1종의 먹이원(도마뱀, 작은땃쥐, 대륙유혈목이)이 검출된 반면, 동일한 시료의 클로닝 분석에서는 1종의 먹이원만 검출되었다. 이러한 결과를 통하여 NGS를 통한 분변 내 먹이원 식별이 클로닝보다 정확도와 비용적인 측면에서 효율적으로 보인다. Research on food sources allows us to know the ecological status, behavioral boundary, and behavioral specificity of a species. Orientocoluber spinalis is a species that lives both domestic and foreign. and there are not many research cases due to their unique fast movement and small number of individuals. This study attempted to study the diets of Orientocoluber spinalis and to develop a non-invasive analysis method that does not affect survival on the research subjects. To this end, a blocking primer was produced to prevent DNA amplification of host Orientocoluber spinalis. In addition, we tried to find out an efficient method by comparing and analyzing the prey sequences obtained through NGS and cloning. As a result of the study, I successfully developed Orientocoluber spinalis blocking primer. And then, in the three feces of a Orientocoluber spinalis, I identified 3 different preys (Tsushima smooth skink, Asian lesser white-toothed shrew, Japanese keelback) using the NGS analysis, but only 1 prey using the cloning analysis. This result suggests that prey identification in feces eDNA of reptiles is more sensitive with the NGS than with cloning analysis and that blocking primer can be used in the reptile diet study using feces eDNA.

동중국해 수산자원 분포와 현존량 추정에 관한 기초 연구

이정관 전남대학교%0A 일반대학원 2024 국내박사

본 연구는 동중국해 해역의 효율적인 수산자원관리와 지속적인 어획량 유지를 위하여 실시한 기초 연구의 일환으로, 전남대학교 실습선 새동백호(GT: 2,996 ton, HP: 3,500 kw)의 최첨단 조사 장비를 이용하여 이 해역의 해양 환경 특성과 수산 자원량 분포 조사를 실시하였다. 저층트롤 조사를 통해 어류의 종과 분포 정보를 파악하였고, 해수에서 eDNA 조사 방법을 이용하여 어종을 식별하고, 과학어군탐지기(Scientific fish finder, EK80, Simrad, Norway)를 이용한 조사 방법을 통해 계절별(월별)로 2022년 4월, 7월, 8월, 11월에 과학적 수산자원 조사를 실시하였다. 해양조사를 통해 수집한 자료를 이용하여 동중국해 해역의 수산자원 분포와 밀도를 파악하고, 본 연구를 통하여 조사해역에서 분포하고 있는 어종, 분포 위치, 분포 밀도 등 현존하는 수산 자원량의 평가 및 추정 기술을 발전시키고, 정도를 개선하고자 하였다. 수층별 수온·염분 측정기(Conductivity temperature depth with water sample, Sea bird SBE 911 Plus, Otronix, USA)를 이용한 해양 환경조사 결과, 해양 환경 변화에 따라 소해면적법을 이용한 저층트롤 조사에서 계절별(월별)로 어획된 출현종과 출현 밀도가 다르게 나타났다. 저층트롤을 이용한 수산자원 조사 결과, 동중국해 조사해역에서 계절별(월별)로 어획된 생물의 총 출현 종수는 어류 21종, 갑각류 6종, 두족류 6종, 극피동물류가 2종 출현하였다. 8월에 생물의 출현 종수는 22종으로 가장 많았고, 4월에는 생물의 출현 종수가 9종으로 가장 적었다. 분류군별 개체수는 갑각류가 전체의 50.4 %로 최우점하였고, 어류가 42.7 %, 두족류가 4.4 %, 극피동물류가 2.6 %의 분포를 나타내었다. 생체량은 어류가 전체의 52.4 %로 최우점하였고, 갑각류가 29.3 %, 극피동물류가 13.5 %, 두족류가 4.8 %의 분포를 나타내었다. 동중국해 조사해역에서 어획된 갑각류의 출현 개체수를 파악한 결과, 깨다시꽃게(Ovalipes punctatus)와 꽃게(Portunus trituberculatus)가 우점하였다. 두족류의 출현 개체수를 살펴보면, 반원니꼴뚜기(Loliolus japonica)와 살오징어(Todarodes pacificus), 매오징어(Watasenia scintillans)가 우점하였다. 어류의 출현 개체수를 파악한 결과, 전갱이(Trachurus japonicus)와 갈치(Trichiurus lepturus), 민어(Sciaenidae), 성대(Chelidonichthys spinosus) 순으로 우점하였다. 소해면적법을 이용한 계절별(월별) 총 단위 면적당 평균 개체수 밀도는 4월에 84.8 (inds./km2)로 가장 낮게 나타났고, 11월에 809.0 (inds./km2)로 가장 높게 나타났다. 계절별(월별) 총 단위 면적당 평균 생체량 밀도는 동일하게 4월에 7,516.7 (g/km2)로 가장 낮게 나타났고, 11월에 52,057.4 (g/km2)로 가장 높게 나타났다. 과학어군탐지기의 38 kHz와 120 kHz 주파수 차이를 이용하여 어류의 음향자료를 추출하고, 추출된 자료의 우점종에 대한 계절별(월별) 수산자원의 시․공간분포를 면적 산란계수(Nautical Area Scattering Coefficient, NASC, m2/nmi2)로 나타낸 결과, 7월에 65.80 m2/nmi2, 11월에 70.10 m2/nmi2로 높게 나타났으며, 4월에 6.63 m2/nmi2, 8월에 0.23 m2/nmi2로 상대적으로 낮게 나타났다. NASC 값을 이용하여 계절별(월별) 우점종의 음향 분포 밀도를 추정한 결과, 4월에 꽃게(P. trituberculatus)가 0.021 g/m2로 나타났고, 7월에 갈치(T. lepturus)가 0.007 g/m2, 고등어(Scomber japonicus) 0.451 g/m2, 전갱이(T. japonicus) 0.335 g/m2로 나타났다. 또한, 8월에 갈치(T. lepturus)가 0.001 g/m2, 고등어(S. japonicus) 0.255 g/m2, 전갱이(T. japonicus) 0.248 g/m2로 나타났으며, 11월에는 병어(Pampus argenteus)가 1.709 g/m2로 나타났다. eDNA를 이용한 메타바코팅 분석 기술로 어종을 식별한 결과, 계절별(월별) 우점종은 4월에 고등어(S. japonicus), 날개다랑어(Thunnus alalunga), 멸치(Engraulis japonicus), 쥐노래미(Hexagrammos otakii)로 나타났고, 7월에는 날개다랑어(T. alalunga), 멸치(E. japonicus)로 나타났다. 또한, 8월에는 다랑어(Thunnini), 멸치(E. japonicus)로 나타났으며, 11월에는 참다랑어(Thunnus orientalis), 날개다랑어(T. alalunga), 멸치(E. japonicus)로 나타났다. eDNA와 과학어군탐지기를 결합한 계절별(월별) 우점종의 평균 밀도는 4월에 고등어(S. japonicus) 0.043 g/m2, 날개다랑어(T. alalunga) 0.085 g/m2, 멸치(E. japonicus) 0.020 g/m2, 쥐노래미(H. otakii) 0.173 g/m2로 나타났다. 7월에는 날개다랑어(T. alalunga) 0.085 g/m2, 멸치(E. japonicus) 0.020 g/m2로 나타났고, 8월에는 다랑어(Thunnini) 0.085 g/m2, 멸치(E. japonicus) 0.020 g/m2로 나타났다. 또한, 11월에는 참다랑어(T. orientlis) 0.057 g/m2, 날개다랑어(T. alalunga) 0.057 g/m2, 멸치(E. japonicus) 0.013 g/m2로 나타났다. 저층트롤 어구를 이용한 어획 조사 결과, 계절별(월별)로 어획된 출현종과 밀도가 다르게 나타났고, 어획 자료를 기반으로 한 우점종의 음향 분포 밀도와 과학어군탐지기 및 eDNA를 결합한 밀도도 계절별(월별)로 다르게 나타났다. 또한, eDNA를 이용한 메타바코딩 분석 기술로 어종을 식별한 결과, 계절별(월별) 우점종이 상이하게 나타났다. 이것은 동중국해 해역에 있어서 해양의 물리화학적 요소, 해류, 서식종 등이 다양하게 변화함과 동시에, 수산 자원량 추정 방법 그리고 식별된 우점종이 상이함에 따라 분포 특성의 차이가 나타난 것으로 생각된다. 본 연구의 결과는 동중국해 해역에서 해양 환경 변화에 따른 어류의 출현종을 파악하는 기초 자료로 이용할 수 있고, 나아가 과학어군탐지기를 이용한 수산자원의 밀도 추정 기술, eDNA를 이용한 어류의 식별 기술 등과 함께, 과학어군탐지기를 이용한 음향 조사에서 물리적 제약에 의해 발생하는 저층 음향 불능 구간(해저 데드존, Bottom Dead Zone)에서 수산 자원량 추정을 저층트롤 어구의 소해면적법으로 추정하여 조사대상 해역의 수산 자원량 평가 기술을 개선하는 기초 연구로 활용될 것이라고 판단된다. 또한, 최근에 새로 도입된 최첨단 트롤 모니터링 시스템과 같은 최첨단 장비는 보다 정확한 자원량 추정을 가능하게 하여, 해양에서의 수산자원평가 기술의 발전과 더불어 추정한 수산 자원량 정도의 신뢰도가 개선될 것으로 판단된다. As part of the basic research conducted to efficiently manage fishery resources and maintain sustainable catch in the East China Sea, this study conducted a survey on the characteristics of the marine environment and the distribution of fishery resources in this area using state-of-the-art research equipment of T/S SAEDONGBAEK (GT: 2,996 tons, HP: 3,500 kw, Chonnam National University). Distributions of fish species were confirmed using bottom trawl and scientific fish finder (EK80, Simrad, Norway). Each species was identified using the eDNA method in seawater. We conducted seasonal (monthly) surveys (April, July, August, and November 2022) using these methods. Using the data collected through marine survey, we tried to understand the distribution and density of fishery resources in the East China Sea, develop technologies for evaluating and estimating existing fishery resources such as fish species, distribution location, and density in the survey area, and improve the degree. Results of the marine environment survey using a conductivity, temperature, depth profile with water sampler (CTD, Sea bird SBE 911 Plus, Otronix, USA) showed different occurrence densities compared to those of the seasonal (monthly) caught species in the bottom-trawl survey using the swept area method. The total number of fish species caught seasonally (monthly) in the East China Sea was 21 teleosteis, 6 crustaceans, 6 cephalopods, and 2 echinoderms. In August, the number of species occurred the most with 22 species, and in April, the number of species occurred the least, with 9 species. As for individuals by taxon, crustacean ranked first with 50.4 % of the total, followed by teleostei with 42.7 %, cephalopods with 4.4 %, and echinodermata with 2.6 %. As for biomass by taxon, teleostei ranked first with 52.4 % of the total, followed by crustacean with 29.3 %, echinodermata with 13.5 %, and cephalopods with 4.8 %. Furthermore, as a result of occurrence individuals of crustaceans caught in the survey area, Ovalipes punctatus and Portunus trituberculatus dominated. As a result of the occurrence individuals of cephalopods, Loliolus japonica, Todarodes pacificus, and Watasenia scintillans dominated. And as a result of the occurrence individuals of teleosteis, the dominant position was in the order of Trachurus japonicus, Trichiurus lepturus, Sciaenidae, and Chelidonichthys spinosus. The average density of individuals per seasonal (monthly) total unit area using the swept area method was the lowest at 84.8 (inds./km2) in April, and the highest at 809.0 (inds./km2) in November. The average density of biomass per seasonal (monthly) total unit area was similarly the lowest at 7,516.7 (g/km2) in April, and the highest at 52,057.4 (g/km2) in November. Using the 38 kHz and 120 kHz frequency differences of the scientific fish finder, the sound data of teleostei was extracted, and the spatiotemporal distribution of seasonal (monthly) aquatic resources for the dominant species of the extracted data was calculated as the nautical area scattering coefficient (NASC, m2/nmi2). The NASC results were high at 65.80 m2/nmi2 in July and 70.10 m2/nmi2 in November, while relatively low at 6.63 m2/nmi2 in April and 0.23 m2/nmi2 in August. Also, as a result of estimating the sound distribution of seasonal (monthly) density of dominant species using NASC, P. trituberculatus was found to be 0.021 g/m2 in April, T. lepturus was found to be 0.007 g/m2, Scomber japonicus was 0.451 g/m2, and T. japonicus was 0.335 g/m2 in July. In August, T. lepturus was found to be 0.001 g/m2, S. japonicus was 0.255 g/m2, T. japonicus was 0.248 g/m2, and Pampus argenteus was found to be 1.709 g/m2 in November. According to the identification of fish species using eDNA, the seasonal (monthly) dominant species were S. japonicus, Thunnus alalunga, Engraulis japonicus, Hexagrammos otakii in April, and T. alalunga and E. japonicus in July, Thunnini and E. japonicus in August, and Thunnus orientalis, T. alalunga and E. japonicus in November. The average density of seasonal (monthly) dominant species combined with eDNA and scientific fish finder was 0.043 g/m2 for S. japonicus, 0.085 g/m2 for T. alunga, 0.020 g/m2 for E. japonicus, and 0.173 g/m2 for H. otakii. In July, the average density of the species was 0.085 g/m2 for T. alunga, 0.085 g/m2 for E. japonicus, and 0.020 g/m2 for Thunnini, and 0.020 g/m2 for E. japonicus in August. In addition, in November, the average density of T. alunga was 0.057 g/m2 for T. alunga, and 0.013 g/m2 for E. japonicus. As a result of the catch survey using bottom-trawl gear, the seasonal (monthly) occurrence of species and caught density were different, and the sound distribution density of dominant species using catch data, as well as the density combining scientific fish finder and eDNA method, were also different by season (month). Additionally, fish species identification using metabarcoding analysis technology using eDNA revealed that seasonal (monthly) dominant species differed. This is thought to be due to various changes in the physicochemical factors, currents, and habitat of species in the ocean in the East China Sea, as well as differences in the method of estimating fishery resources and the identified dominant species. The results of this study can be used as basic data to identify the fish species occurring in the East China Sea due to changes in the marine environment, and furthermore, together with the technology to estimate and identify the density of fishery resources using scientific fish finder and eDNA. Also, it is believed that it will be used as a basic study to improve the assessment technology of fishery resources in the study area of the bottom dead zone caused by physical constraints in the acoustic survey using scientific fish finder. And cutting-edge equipment, such as the recently introduced state-of-the-art trawl monitoring system, is expected to improve the reliability of the estimated amount of fishery resources along with the development of fishery resource evaluation technology in the ocean.

(The)Awakening에 있어서 Edna Pontellier의 성격과 비극

최숙자 충남대학교 1985 국내석사

The Awakening is the novel the author intended to name " A Solitary Soul." As the title suggests Edna awakens to much deeper needs of her lonely soul. She departs from a realization of her being. She first pursues arts in search of her identity, she then seeks her sexual appetite risking her marriage, and at the end she is even willing to forsake everythings, including her children, for her complete freedom and self-realization, She does not seem to be born to be a "mother-woman." In fact, she does not seem to live in reality but in the world of herimagination. From a very early age, she has often fallen in love with her romantic imagination. Robert awakens such adolescent dream in her, but he is too innocent and reluctant to satisfy her dream and leaves her. On the other hand Arobin, who seduces her, is substitude for Robert. Arobin arouses Edna's sensual desires, which she in turn uses to seduce Robert. But Robert is too conscientious to be trapped by her sensual appeal. Being left desolate she longs for the sea, the symbol of solitude, seduction and death. Her solitary swim far out into the emptiness of the Gulf means an infantile regressive act. She commits suicide when she finds that there is no mo re hope in her life, She can not give herself to anyone, Truly she is a victim of her own imagination which resulted from her own character and the environment to which she reacts violently. It seems, therefore, hasty to define this novel merely as a frustrated love story. Self-discovery seems more appropriate theme for the novel.

Kate Chopin의 The Awakening에 나타난 Edna의 자아추구에 관한 연구

이향숙 건국대학교 교육대학원 2001 국내석사

The Awakening was published by Kate Chopin in 1899. The main character, Edna, was raised strictly in a Protestant family. After marriage with Leonce, she lived in the Creole society. Creole society had double standards. When they speak, they pretend to be liberal, but, in real life, they are very conservative. At the age of 28, she started to recognize her self-identity. Edna was just another mother-woman with two children. Society permitted Edna only to be a wife of a husband and mother of two boys. One summer vacation, she fell in love with a Creole bachelor, Robert. She wanted to be herself. Finally, however, she denied herself as belonging to her husband. Edna loved Robert as the only love in her life. Robert was the only one she wanted to be with. Because Robert was also a Creole, he could not help believing that Edna belonged to Leonce, not to herself. But self-fulfillment was impossible for her. Of course, there were many characters with varied lives around her. But among them, Edna couldn't find a proper model for herself. She also realized that the society to which she belonged was forcing her to be only a mother-woman. However, she didn't want to satisfy that unfair social expectation. But she was not strong enough to claim a new self-identity. She had no choice but to choose death. At the end of the 19th century, this story was not acceptable in main stream society. In America, during that period, the idea of self-identification for women was far below the surface. At that time Napoleonic Law made up marriage rules. Most of the people in that period did not think a woman could identify herself as a human being. Chopin's philosophy was far beyond the norms of the times. The Awakening was prohibited in libraries. Her life as a writer declined after this piece. Chopin could not be accepted in that society. She was regarded as a dirty writer who dealt with the unhealthy sex life of women. Her work was far beyond general social awareness. It had to be buried more than 50 years. In 1953, French critic, Cryille Arnavon looked at this work again. A number of reviews were done on the work after that, even though the work had been devalued because of a lack of understanding. Now, it is regarded as a great book. Now, it is taught in universities as a classic. Edna did not want to surrender to the regulations that serve only as bondage for women. In a sense, the problem with self-identification is one of the most important topics for all of us. Still, there are problems for women, especially for married women. We have to find reasonable solutions to overcome the conflicts between the social demands for women and their existence as human beings. Actually, women liberation is in the same context of human liberalization. Self-identification was not only Edna's personal problem, but it can also be regarded as a problem for all human beings alive today. All of us have to do our best to try to find out the best solution for the problems of men and women.

경기도 하천의 항생제 내성 유전자의 정량적 및 유전적 분석 : 분리된 Aeromonas spp.의 Tetracycline 내성 유전자 중심으로

조기택 국립부경대학교 대학원 2024 국내박사

한반도 하구의 어류군집 특성과 eDNA를 활용한 어류 모니터링 연구

박상현 목포대학교 일반대학원 2023 국내박사

본 연구는 2016년부터 2018년까지 328개 하구에서 어류상 및 물리·화학적 특성을 연구하였으며, 하구 수생태계 최초전수조사 결과를 적용하여, 개선된 메트릭지수를 제공하였다. 또한 2022년에 경상남도 21개 습지 지역에서 문헌연구와 환경유전자 결과를 비교하여, 각 조사 방법별 특성 연구 및 현재의 하구 수생태계 현황 조사 및 건강성 평가에 적용된 KEFAI의 멀티메트릭에 보조도구의 적용 가능성을 파악하였다. 한반도 하구에서 52과 150종의 어류가 확인되어 하천보다 높은 다양성을 보였다. 잉어과 어류가 42.8%로 우점하였으며, 우점종(Dominant Species)은 황어(RA, 12.5%), 아우점종(Subdominant Species)은 숭어(RA, 9.5%)로 나타났다. 멸종위기야생생물(Endangered Species)은 가시고기와 한둑중개 2종이 확인되었으며, 모두 동해역에서 확인되었다. 고유종은 21종, 외래종 5종, 회유성어종 8종, 기수성어종 41종, 해산어 39종, 1차담수어는 62종으로 나타났다. 특히, 회유성어종은 자원으로서의 가치가 높은 종으로 구성되어 있으며, 서해역은 뱀장어, 남해역은 은어, 뱀장어, 동해역은 황어, 은어, 빙어, 연어가 주로 확인되었다. 하구의 연결성을 차단하는 횡구조물의 적극적인 수문 운용을 통해 회유성 어종의 소상 및 관리가 필요하다. SIMPER 분석 결과 하구는 해역별, 하구유형별 군집의 차이를 보였으며, 한반도 하구의 대표어종은 숭어, 붕어, 민물검정망둑으로 확인되었다. 서해역은 1차담수어인 살치와 붕어, 남해역은 기수성어종인 숭어와 가숭어, 동해역은 회유성어종인 황어와 기수성어종인 숭어로 확인되었으며, 열린하구에서는 숭어, 민물검정망둑, 닫힌하구에서는 붕어, 숭어로 확인되었다. 물리·화학적 특성에서 동해역은 열린하구의 특성을 보였으며, 서해역은 닫힌하구의 특성을 보였다. 닫힌하구로 대표되는 서해역은 탁도, COD, TN, TP 등 오염항목으로 대표되는 항목이 열린하구와 통계적 차이를 보였으며, 어류상에 큰 영향을 끼치는 것으로 나타났다. 반대로 열린하구로 대표되는 동해역은 DO, 전기전도도, 염도가 높으며, 서해역과 반대되는 특성을 보였다. CCA 결과에서도 해역별, 하구유형별 차이는 뚜렷하게 나타났으며, 어류군집 또한 SIMPER 결과와 합치되는 결과가 도출되었다. 한반도 하구의 KEFAI 평균은 50.52(C등급)으로 나타났으며, 해역별로 서해역 41.84점(C등급), 남해역 52.71점(C등급), 동해역 55.48점(C등급)으로, 서해역에서 동해역으로 갈수록 KEFAI가 높게 나타났다. 서해역에서 동해역으로 갈수록 열린하구의 비율이 높아지며, 하구의 연결성이 확보되어 다양한 종의 출현에 의한 결과로 확인되었다. KEFAI는 해역별, 하구유형별로 차이를 보였으며, 특성 또한 다르게 나타났다. 하구의 메트릭은 8개 항목으로, 해역별로 M8 항목을 제외한 모든 항목에서 통계적 차이(P < 0.05)를 보였고, 열린하구와 닫힌하구는 M1, M2 항목을 제외한 6개 메트릭 항목에서 통계적 차이를 보였다(P < 0.05). PCA 결과에서 서해역은 닫힌하구의 빈도가 높아, 닫힌하구의 특성을 공유하며, 높은 다양도 및 종수, 낮은 기수성어종수, 높은 내성종개체수 비율이 확인되었다. 남해역은 열린하구의 빈도가 높고, 열린하구의 특성을 공유하며, 낮은 다양도, 적은 종수, 높은 저서성어종의 개체수 비율이 확인되었다. 동해역은 열린하구의 빈도가 가장 높고, 열린하구의 특성을 띠며, 높은 다양도, 많은 종수, 낮은 내성종개체수 비율 및 낮은 저서종어종의 개체수 비율이 확인되었다. 국내에서 참조하구와 훼손하구에 관한 연구는 진행되지 않았으나, 참조하천과 훼손하천에 준하는 기준을 적용한 결과, 8개의 메트릭에서 모두 통계적 차이가 발생하였다(P < 0.05). 참조하구는 남해역, 열린하구의 특성을 띠며, 훼손하구는 서해역, 닫힌하구의 특성을 갖는다. 메트릭 항목은 2008년부터 현재까지 지속적으로 개정됐으나, 최초전수조사 결과를 반영하지 못하고 있다. 본 연구 결과에서 각각의 메트릭 항목을 분석한 결과 M1, M2, M3, M6, M7 항목은 일부 조정이 필요한 것으로 판단된다. 개선된 메트릭지수를 이용해 KEFAI를 산출한 결과, 건강성이 상승하는 것으로 나타났으며, 현재의 하구 건강성 평가체계는 KEFAI가 저평가된 것으로 판단된다. 본 연구는 2016년부터 3년 단위로 조사한 최초전수조사 결과를 바탕으로 분석하였다. 2008년 전후로 건강성 평가의 개념 정립 및 조사가 수행되었으며, 다년간의 연구로 많은 데이터가 누적되었다. 하지만 하구 수생태계 조사 및 건강성 평가 사업의 특성상 모니터링을 중점으로 하고 있다. 현재까지 다수의 논문과 분석 방법이 적용되었으나 일부 하구를 중심으로 연구가 진행되었으며 어류를 중심의 총괄적인 분석은 이루어지지 않았다. 따라서 본 연구에서 대한민국의 하구에 서식하는 어류의 군집구조, 하구의 물리·화학적 특성, 하구의 형태 등을 분석하였다. 또한, 기존의 멀티 메트릭을 검증하여 개선 방향을 제시하였다. 하구 수생태계 조사 및 건강성 평가는 다양한 분류군을 종합적으로 평가하지만, 본 연구는 어류를 중심으로 분석하였기 때문에 추후 다른 분류군과의 총체적인 분석이 필요하다. 이를 통해 하구수생태의 특성을 명확하게 파악하여 하구의 관리, 정책, 연구, 활용 등의 기준 정보로 제시할 수 있을 것으로 판단된다. 환경유전자 연구 결과에서 문헌연구 결과 66종, 환경유전자 결과 59종의 어류가 확인되었으며, 공통 출현종은 29종으로 나타났다. 기존의 전통적인 어류 연구방법을 통해서는 충분한 어류상을 확인할 수 없음을 확인하였다. 우점종은 문헌조사에서 민물검정망둑, 블루길, 피라미가 하구, 호소, 하천습지에서 우점하는 것으로 나타났으나, 환경유전자 연구에서는 모두 기벨리오붕어가 우점하는 것으로 나타났다. 본 연구에서 사용한 Primer는 국내 어류를 대상으로 개발된 Primer가 아니기 때문에 국내종을 정확히 판단하기에는 어려울 것으로 판단된다. 기벨리오붕어와 유사종인 붕어, 떡붕어 등은 완벽하게 구분할 수 없을 것으로 판단되며, 기벨리오붕어의 높은 OTUs는 기존의 붕어와 떡붕어의 유전자도 중복적으로 산출된 결과로 판단된다. 기벨리오붕어 외에도, 붕어교잡종(Carassius auratus x Megalobrama amblycephala pentaploid hybrid), 미꾸리교잡종(Misgurnus anguillicaudatus x Misgurnus bipartitus) 등 기존에 확인되지 않던 종들이 출현하여, 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단된다. 알파종다양성과 베타종다양성은 일부 항목에서 차이를 보였다(P < 0.05). 각각 8개의 메트릭으로 구성된 FAI, KEFAI 메트릭에서 각각 3개, 4개 항목은 종수에 영향을 받는다. 따라서 명확한 평가를 위해 환경유전자 조사 결과를 보조도구로 사용하면 정확한 지표 및 결과를 생산할 수 있을 것으로 판단된다. 현재 국내의 환경유전자 연구는 초기단계이며, 국내 어종을 정확히 구분할 수 있는 universal primer의 부재 등 다양한 문제점을 내포하고 있다. 본 연구에서도 붕어와 그 유사종의 구분에 대한 문제점을 확인하였다. 향후 어류조사에서 보편적인 방법으로 활용하기 위해서는 다양한 환경에서의 비교조사를 통한 검증이 필요하다. 따라서 국내 어종에 맞는 Primer의 개발, 습지별 보편적인 연구방법의 정착, OTUs의 개체수준에서의 활용 연구 및 검증이 필요하며, 이를 통해 보편적인 조사 방법으로 활용하고, 신뢰 있는 결과를 도출할 수 있을 것으로 판단된다. 1. 서 설(General Introduction) 한반도의 하구 연구는 2000년대 초반까지 국가적인 관심이 크게 나타나는 대형하구와 일부 소형하구 등 단일 하구를 중심으로 이루어졌다(Lim et al., 2020). 과거의 국내에서 이루어진 하구 연구는 대부분 수질 관련 현황 조사가 주로 실시되었으며, 이외에 유동, 퇴적모델에 관한 연구가 일부 수행되었다. 대형하구와 달리 중·소규모의 하구 연구는 적었으며, 국내 하구에 대한 이해가 부족했다. 세계적으로 생태 및 환경에 관한 관심이 증대되면서, 국내에서도 이에 맞춰 목표를 설정하여, 집중적인 관리를 수행하였다. 환경부에서는 물환경관리 목표를 “이화학적 수질”에서 “수생태계 건강성”으로 개념을 확대하고 2008년부터 하천 및 하구의 수생태계 현황 조사 및 건강성 평가를 하고 있다(Won et al., 2022). 2008년 전후로 부착돌말류, 저서성대형무척추동물, 어류를 이용한 건강성 평가 방법이 국내 상황에 맞춰 개발되었으며, 지속적인 개정을 통해 완성도를 높였다. 하구 수생태계 현황 조사 및 건강성 평가는 2017년부터 “물환경보전법” 제9조의 3(수생태계 현황 조사 및 건강성 평가), 동법 시행규칙 제 24조의 2(수생태계 현황 조사), 제24조의 3(수생태계 건강성 평가)에 따라 진행되고 있다. 하구 수생태계 현황 조사 및 건강성 평가는 자연환경보전법 제 30조의 규정에 따른 자연환경조사 및 습지보전법 제4조의 규정에 따른 습지조사와 함께 법정조사에 속한다. 하구 수생태계 현황 조사 및 건강성 평가는 기존의 법정조사보다 늦게 시작되었으나, 과학적인 평가 방법을 도입하여 조사 대상지를 등급화하여 평가하고 있다. 표준화된 조사지침을 개발하여, 모든 연구원들이 동일한 방법으로, 안정적이고 신뢰성 높은 조사가 가능하게 되었으며, 최근 정도관리의 중요성이 높아지면서 더욱더 높은 신뢰도의 데이터를 양산하고 있다. 하구는 하천의 끝단에 위치하며, 담수와 해수가 섞이고, 반폐쇄해의 특성을 갖는 지역이다(Pritchard, 1967). 하구는 담수와 해수가 혼합되며, 조석의 영향으로 인해 다양한 환경조건을 갖춰 생물의 구성이 다양하다(van Westen and Scheele, 1996; Goudie, 2004). 하구는 육상기원의 퇴적물 및 오염물질이 분해되고, 다양한 생물의 주요 서식지 및 산란지로서의 가치가 매우 높다(Costanza et al., 1997). 어류에 있어 하구는 다양한 어종이 공존하는 서식지이며, 하천과 바다를 잇는 회유성어종의 이동 통로이다(Potter et al., 1986). 하구의 다양한 수심과 높은 탁도는 어류의 생존율을 높이며, 다양한 산란장 및 서식처를 제공한다(McLusky and McCrory 1989). 한반도는 삼면이 바다와 접하며, 3개의 해역이 각각 다른 특성을 띠어 다양성을 더욱 증대시킨다. 3개의 해역은 각기 다른 지형적 특성으로 인해 하구의 어류군집이 다르게 형성된다. 또한 고생물지리학 측면에서 민물고기류의 지리적 구분은 서한아지역(West Korea subdistrict), 남한아지역(South Korea subdistrict), 동북한아지역(Eastnorth Korea subdistrict)으로 구분되며(Kim and Park, 2002) 해역별 하구의 어류군집에서 차이를 발생시킨다. 횡구조물 유무(Park et al., 2022), 물리·화학적 특성(Eick and Thiel 2014; Pease 1999; Han and An 2013; Harrison and Whitfield 2006; Meador and Goldstein 2003; Nicolas et al., 2010; Park et al., 2022), 하상기질(Morrow and Fischenich 2000; Pihl et al., 2002; Pusey and Arthington 2003; Hossain et al., 2012) 등은 모두 어류군집에 영향을 끼치며 개체군의 생존, 성장, 번식, 분포에 영향을 끼치기 때문에 모니터링을 기반으로 지속적으로 관리해야 한다. 미국 및 유럽 등 선진국에서는 수자원의 총체성을 반영하는 수생태계 건강성 회복을 물관리의 최상 목표로 설정하고 1990년대 초반부터 수질에 대한 생물학적 평가체계를 도입하여 활용하고 있다. “하구 수생태계 현황 조사 및 건강성 평가(MOE/NIER, 2008~2022)”는 국내 전체 하구(대규모하구, 도서 지역, 하구호 제외)를 대상으로 동시에 조사를 수행하는 대규모 국가 프로젝트이다. 이를 통해 도출된 결과는 한반도 하구의 어류군집의 현황과 특성을 이해하고, 하구의 보전 및 복원을 위한 자료로 사용된다. 하구별 3년 주기로 연 2회 평가를 통해 KEFAI를 산출하여, 하구의 건강성을 파악한다. KEFAI는 현재까지 8회에 걸쳐서 정교화를 추진하여, 2016년부터 현재 형태의 메트릭 평가 방법을 사용하고 있다. 하지만 현재 사용되는 멀티 메트릭은 3년 주기로 연 2회씩 조사된 최초전수조사 결과를 반영하지 못하고 있다. 또한, 현재의 연구체계에서는 표본조사(sample survey)시 발생하는 문제점을 내포하고 있다. 일반적인 생태계 조사에서 표본조사는 과거부터 현재까지 널리 사용한 방법이다. 하지만 표본조사는 표본크기, 채집위치, 채집방법, 측정방법에 따라 결과값이 다르며, 이외에 조사강도, 비용, 인원 등의 문제가 발생한다(Kim et al., 2020a; Portt et al., 2006). 따라서 환경유전자 조사 방법은 이와 같은 표본조사의 문제점을 보완하는 방법으로 사용할 수 있다. 환경유전자(environmental DNA, eDNA)는 다양한 환경 시료에서 추출된 DNA를 총칭하며, 모든 유기물로부터 데이터를 수집한다(Taberlet et al., 2012, Thomsen and Willerslev, 2015). 환경유전자는 미생물의 다양성에 관한 연구를 중심으로 연구되었으며, 2000년대부터 다른 분야에서 활용하기 시작하였다. 최근 차세대 염기서열분석(next-generation sequencers, NGS)의 발달로 생물다양성 연구 및 희귀종 탐색의 방법론으로 사용하고 있다(Kwak et al., 2021a). 특히 수환경에 서식하는 생물에 대한 유전정보를 비교적 간편하게 획득하고 분석할 수 있어, 수생물을 대상으로 다양한 연구들이 수행되고 있다(Sassoubre et al., 2016; Shaw et al., 2016; Evans et al., 2017). 환경유전자를 활용한 수생생물 조사는 수체 내 잔존 유전자를 분석하기 때문에 포획없이 생물의 존재 여부를 확인할 수 있다(Kim et al., 2020a). 이와 같은 특성으로 인해 기존의 현장조사 방법의 단점을 보완할 수 있다. 전통적인 모니터링 방법은 직접적인 포획방식으로 정량적인 결과를 산출할 수 있고, 서식 어종을 직접 확인할 수 있으며, 질병 및 기형 등의 유무를 파악할 수 있다. 반면, 어구 특성으로 인해 채집종의 편향성(gear selectivity)이 발생하며, 다양성 및 특정종의 개체군의 크기가 저평가될 수 있다(Bonar et al., 2009; Kim et al., 2020b). 물리적으로 채집이 어려운 환경에 주로 서식하는 종이거나, 개체수가 매우 적은 멸종위기종의 경우 직접적인 채집을 위해서는 많은 시간과 인력이 필요하며, 채집되지 않는 경우 해당 지역의 생물상이 저평가되는 결과를 발생시킨다. 국내에서 환경유전자 연구는 법정조사에 속하지 않기 때문에 그 지원과 연구는 현재 매우 부족한 상황이다. 따라서, 본 연구는 가장 최근에 이루어진 2016~2018년의 한반도 하구의 어류조사 결과를 활용하여 한반도 하구의 어류군집 현황과 특성에 대한 종합적인 분석 자료와 함께, 해역별, 하구유형별, 수계별, 하구규모별 어류군집의 특성 및 주요종의 서식 환경 및 분포에 대한 정보를 제공하였다. 어류군집을 물리·화학적 특성을 비교하고, 어류군집과의 상관관계를 도출하였으며, 정준상관분석(CCA)을 통해 물리·화학 항목과 어류군집의 상관성을 도출하였다. 또한 KEFAI 평가를 통해 한반도 하구의 현황을 제시하였으며, 메트릭 분석을 통해 최초전수조사 결과를 반영한 신규 메트릭 평가안을 제시하였다. 환경유전자 연구를 통해 경남권역에서 하천, 습지, 하구 등 다양한 환경에 적용하여, 어종의 다양성을 확인하고, 국내 내수면에서의 환경유전자 연구방법의 적용 가능성을 파악하였다. 또한, 하구 수생태계 현황 조사 및 건강성 평가 방법에 적용되는 멀티메트릭을 환경유전자 조사 방법을 통해 보정 및 적용 가능성에 대해 검토하였다. This study investigated the fish assemblages and physical and chemical characteristics in 328 estuaries sites from 2016 to 2018. The study utilized KEFAI's multi-metric index, providing an improved metric system based on the initial comprehensive survey results. In 2022, a comparison was made between literature research and environmental genetic results in 21 wetland areas in Gyeongsangnam-do, to assess the characteristics of each survey method and explore the applicability of supplementary tools in KEFAI's multi-metric index for current estuaries ecosystem status surveys and health assessments. Over the course of three years, the Korean Peninsula's estuaries revealed a higher diversity of fish species, with 52 families and 150 species identified. The dominant family was the Cyprinidae, accounting for 42.8% of the species, with the T. hakonensis(RA, 12.5%) as the dominant species and the M. cephalus(RA, 9.5%) as the subdominant species. Two endangered species, the P. sinensis and C. hangiongensis, were found, both in waters closer to the rivers in the East Sea. There were 21 endemic species, 5 exotic species, 8 anadromours species, 41 brackish species, 39 marine fish species, and 62 primary freshwater fish species recorded. In particular, the anadromours species consisted of valuable resources. The management of A. japonica should be prioritized in the West Sea, P. altivelis and A. japonica should be focused on in the South Sea, and T. hakonensis, O. keta, P. altivelis, and H. nipponensis should be managed intensively in the East Sea. It is necessary to address the decline and management of anadromours species through active water management of transverse structures that block estuaries connectivity. The SIMPER analysis revealed differences in cluster composition among estuaries based on the sea area and estuary type. The representative species for estuaries on the Korean Peninsula were M. cephalus, C. auratus, and T. brevispinis. In the West Sea region, the representative species were H. leucisculus and C. auratus, while in the South Sea region, they were M. cephalus and C. haematocheilus. In the East Sea region, the representative species T. hakonensis and M. cephalus. Open estuaries showed a prevalence of M. cephalus and T. brevispinis, while closed estuaries showed a prevalence of T. hakonensis and M. cephalus. In terms of physical and chemical characteristics, the East Sea exhibited the characteristics of an open estuary, while the West Sea displayed the characteristics of a closed estuary. The West Sea, representing a closed estuary, showed statistical differences from the East Sea in terms of pollution indicators such as turbidity, chemical oxygen demand (COD), total nitrogen (TN), and total phosphorus (TP). These indicators were found to have a significant impact on fish populations. In contrast, the East Sea, representing an open estuary, exhibited high levels of dissolved oxygen (DO), electrical conductivity, and salinity, showing characteristics opposite to those of the West Sea. The Canonical Correspondence Analysis (CCA) results also clearly demonstrated differences between the sea areas and estuary types, and the fish communities corresponded to the results obtained from the SIMPER analysis. The average KEFAI score for estuaries on the Korean Peninsula was 50.52(grade C), with variations observed among marine regions. The West Sea region scored 41.84(grade C), the South Sea region scored 52.71(grade C), and the East Sea region scored 55.48(grade C), indicating higher KEFAI scores as we move from the West Sea to the East Sea. This trend can be attributed to the higher proportion of open estuaries and improved connectivity, which results in the presence of a greater variety of species. KEFAI showed differences and distinct characteristics among marine regions and estuary types. The metric system for estuaries consisted of eight components, and statistically significant differences(P < 0.05) were observed for all components except M8 across sea area. Open and closed estuaries showed statistically significant differences (P < 0.05) in six metric components, excluding M1 and M2. PCA results indicated that the West Sea region exhibited characteristics of closed estuaries, with high diversity and species richness, low benthic fish species richness, and a high ratio of tolerant species. The South Sea region exhibited characteristics of open estuaries, with lower diversity, fewer species, and a higher ratio of benthic fish species. The East Sea region showed high diversity, a larger number of species, a lower ratio of tolerant species, and a lower ratio of benthic species. While there have been no specific studies on reference and impaired estuaries in Korea, applying criteria similar to reference and impaired rivers revealed statistically significant differences in all eight metrics(P < 0.05). Reference estuaries showed characteristics similar to the South Sea region and open estuaries, while impaired estuaries showed characteristics similar to the West Sea region and closed estuaries. Although the metric system has been continuously revised since 2008, it does not currently reflect the initial comprehensive survey results. The analysis of the initial comprehensive survey data in this study suggests that adjustments are needed for metrics M1, M2, M3, M6, and M7. Using the improved metric index to calculate KEFAI scores resulted in an increase in estuary health, indicating that the current estuary health assessment system underestimates the health status based on KEFAI. This study analyzed the results of the initial comprehensive survey conducted every three years since 2016. The concept and investigation were established around 2008, and extensive data has been accumulated over the years. However, due to the “survey and assessment estuary ecosystem health” evaluation projects, the focus has primarily been on monitoring. Numerous papers and analysis methods have been applied to date, but research has been conducted primarily on specific estuaries, and a comprehensive analysis of fish species has not been carried out. Therefore, this study aimed to analyze the overall community structure of fish species inhabiting estuaries in South Korea, as well as the physical and chemical characteristics and morphology of estuaries. Additionally, the study validated the existing multi-metric approach and suggested areas for improvement. This research focused on fish species and aimed to comprehensively evaluate the estuaries ecosystem and health assessment, considering various taxonomic groups. Therefore, future studies should conduct holistic analyses involving other taxonomic groups to gain a clear understanding of estuaries characteristics. This will provide valuable information for estuary management, policies, research, and utilization. According to the literature review, a total of 66 fish species were identified, while the environmental DNA analysis revealed 59 species. Among them, 29 species were found to be common to both methods. It was confirmed that traditional fish research methods alone were insufficient to adequately assess the fish assemblage. The dominant species identified through literature research were T. brevispinis, L. macrochirus, and Z. platypus in the estuaries, lakes, and river wetlands. However, the environmental DNA analysis indicated that all these habitats were dominated by C. gibelio. The primers used in this study were not specifically developed for domestic species, making it difficult to accurately identify local species. It is believed that it would be challenging to distinguish C. gibelio from similar species such as C. auratus and C. cuvieri, as their genetic material may have been detected redundantly within the high OTUs of C. gibelio. In addition to C. gibelio, previously unreported species such as the hybrid of C. auratus and M. amblycephala and the hybrid of M. anguillicaudatus and M. bipartitus were also found, indicating the need for further research. Alpha and beta diversity showed differences in some metrics (P < 0.05). Three out of the eight metrics in the FAI and four out of the eight metrics in the KEFAI were found to be influenced by species richness. Therefore, it is suggested that the results of environmental DNA analysis can be used as a supplementary tool to produce accurate indicators and results. Currently, environmental DNA research in South Korea is in its early stages and faces various issues, including the absence of universal primers for accurately distinguishing domestic species. In order to utilize it as a universal method in future fish surveys, it is necessary to validate it through comparative studies in various environments. Therefore, the development of primers specific to domestic fish species, the establishment of universally applicable research methods for different wetland types, research and validation of OTUs at the individual level are needed. Through these efforts, it is anticipated that the method can be used as a universal approach, leading to reliable results.

Genomic understanding and molecular detection of the saxitoxin biosynthesis in the marine dinoflagellate Alexandrium

KIM HANSOL 상명대학교 일반대학원 2024 국내박사

와편모조류는 담수 및 해수에 출현하는 단세포성 미세조류로, 넓은 범주의 수생태계 환경에 출현하여 높은 생태적 적응성과 생물 다양성을 보인다. 그러나, 해양 와편모조류 Alexandrium 속을 비롯한 일부 종은 유해 조류 대발생을 형성하고 마비성 패류독소를 생산한다. 삭시톡신과 마비성 패류독소 식중독의 원인이 되는 천연독소로 담수 남조류 및 해양 와편모조류가 생산하는 것으로 알려져 있다. 삭시톡신의 생합성에 관여하는 유전자(sxt)는 독성 담수 남조류에서 처음으로 규명되었는데, 와편모조류는 이들의 독특한 유전적 특성으로 인해 sxt 유전자에 대해서는 비교적 잘 연구되지 않았다. 따라서 본 연구에서는 남해 진해만에서 현장 조사를 통해 마비성 패류독소 식중독의 원인이 되는 독성 와편모조류를 식별하고, 이들의 유전적 정보를 유전체 및 전사체 수준에서 조사하고자 한다. 또한, 마비성 패류독소 식중독 원인종의 조기 검출 및 관리를 위한 sxt 유전자 기반 분자 탐침을 개발하고자 한다. 주요 연구 결과는 아래와 같다. 첫 번째로, 본 연구에서 최근 남해안 독성 식물플랑크톤 군집구조의 계절별 변화 양상을 파악하였으며, 분석은 2017년부터 2022년까지 진해만의 월별 시료를 대상으로 하였다. 식물플랑크톤 세포 밀도는 5.0×102 cells/L에서 7.9×105 cells/L까지 넓은 범주로 조사되었으며, 49종의 규조류, 27종의 와편모조류 및 1종의 대롱편모조식물로 구성되었다. 총 9종의 유해종(1종 규조류 및 8종 와편모조류)이 식별되었고, 여기에는 봄철 및 겨울철의 마비성 패류독소 식중독의 원인이 되는 Alexandrium catenella, A. pacificum 및 Gymnodinium catenatum을 포함한다. 또한, 해당 종들이 특정 환경 조건(수온, 영양소 등) 하에서 출현 및 증식함을 확인하였고, 환경 조건과 삭시톡신 생합성 사이의 관계를 분자적 측면에서 이해할 필요가 있었다. 두 번째로, 남해 연안에서 분리한 다양한 와편모조류는 대상으로 대규모 RNA 시퀀싱을 수행하여 전사체 라이브러리를 구축하였다. 이를 통해 삭시톡신 생합성에 참여하는 다수의 sxt 유전자를 발굴하였고, 이들의 염기 서열, 아미노산 서열 및 계통 구조를 다른 생물군(특히, 독성 남조류)의 것과 비교하였다. 그 중, sxtA, sxtG, sxtB는 독성 남조류 및 와편모조류에서 보존적으로 확인되었다. 또한, 독성 및 무독성 와편모조류의 전사체 비교 분석을 통해 이 세 유전자의 존재가 삭시톡신 합성에 필수적임을 확인하였다. Alexandrium에서 이 유전자들의 전사 수준은 종과 그 종의 독성에 따라 다르며, 삭시톡신 합성에 sxt 유전자의 전자 조절이 중요함을 의미한다. 이와 관련하여, A. catenella와 A. pacificum을 대상으로 sxt의 발현 패턴을 조사하여 환경 스트레스가 삭시톡신 합성에 미치는 영향을 이해하고자 하였다. 수온 및 질산염 공급의 변화는 세포 성장, 독력(삭시톡신 대사체 구성 및 농도) 및 sxt 발현 패턴을 유의적으로 변화시켰다. 공통적으로, 저온 스트레스 및 최적 성장 조건 (16℃)에서 독소 생산과 sxt 발현 수준이 크게 증가하였고, 이는 마비성 패류 독소에 의한 해산물 오염이 여름보다 봄에 더 높은 빈도로 발생하는 이유를 설명할 수 있다. 또한, 질산염 고갈은 세포의 독력을 감소시켰으며, 질산염 첨가 24시간 이후에 sxtA, sxtB 및 sxtI 유전자가 유의적으로 상향 조절되었다. 이는 Alexandrium이 환경 변화에 노출되면 단시간(24시간 내)에 유전자의 전사를 조절하여 환경에 적응하는 전략을 가짐을 의미한다. 더 나아가 수온 변화가 삭시톡신 생합성에 미치는 영향을 심층적으로 이해하기 위해 Alexandrium catenella Alex03에 저온 및 고온 스트레스 처리 후 시간 경과(12, 24, 48 및 72시간)에 따라 전사체 및 독소 프로파일을 조사하였다. KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 경로 분석 결과, 많은 유전자가 고온 스트레스 조건에서 하향 조절된 반면, 저온 스트레스 조건에서 상향 조절되었다. 수온 변화는 광합성 관련 유전자들의 유의미한 발현 변화를 유도하였으나, sxtB를 제외한 다른 sxt 발현 수준 및 패턴은 독소 함량 변화를 설명하기에 충분하지 않았다. 이는 sxt의 발현이 전사후 조절 및 번역 수준에서 조절되었음을 시사하며, 그 시스템을 이해하기 위한 추가 연구가 필요하다. 연구 결과는 독성 와편모조류가 계절 및 기후 변화에 대응하는 생태적 적응 및 생리·생태학적 메커니즘을 이해하는 기여한다. 마지막으로, 본 연구에서 규명한 sxt 합성 유전자를 이용하여, 독성 Alexandrium 현장 분자검출 기법을 개발하였다. 본 연구에서는 국내 대표적인 독성 Alexandrium catenella와 A. pacificum을 검출할 수 있는 sxtB 기반 TaqMan 탐침을 설계하였고, 진해만의 환경 eDNA를 확보하여 분거출 모니터링을 실시하였다. sxtB 탐침은 삭시톡신을 생산하는 A. catenella와 A. pacificum을 0.05 cell/mL 수준까지 검출하였다. sxtB 탐침 기반의 세포 밀도 추정치는 28S rDNA를 이용해 추정한 결과보다 현미경으로 계수한 세포 밀도 결과와 더 밀접한 상관성을 보여 결과에 신뢰성을 확인하였다. 높은 감도를 가진 해당 탐침은 국내 해안 양식장의 어패류가 마비성 패류독소에 오염되기 전, 조기에 경보하거나 관이 검사의 높은 감도는 조개류의 PST 오염을 조기에 경보하고 관리하는데 사용할 수 있는 잠재력을 시사한다. 또한, 지역적·계절적 적용 가능성을 확장하기 위해 다양한 독성 와편모조류를 대상으로 추가 검증이 필요하다. 결론적으로, 본 연구에서 진해만 현장 조사를 통해 최근 남해안의 PSP 원인종을 파악하였으며, 해당 독성 Alexandrium에 대한 게놈 수준의 전사체 유전자 정보를 방대하게 구축하였다. 이를 통해 Alexandrium의 마비성 패류독소, 독성 와편모조류의 삭시톡신 생합성 유전자 종류와 특성, 독소 유전자 획득 기원 및 환경요인에 따른 유전자 조절 메커니즘에 관한 측면을 명확하게 해석하였다. 또한, 신규 독소 생합성 유전자를 대상으로 유전자 검출 기법(sxtB TaqMan 탐침)을 개발하였으며, 낮은 농도에서 매우 정밀하게 반응하는 것을 확인하였다. 향후 본 연구 결과는 해양에서 Alexandrium의 마비성 패류독소의 분자생물학적 이해와 생명공학적 조기 검출을 통해 안전한 수산물 유통 및 해양생태계를 관리하는 데 활용될 것으로 기대된다. Dinoflagellates are unicellular microeukaryotes that are found in a wide range of environmental conditions, showing remarkable ecological adaptability and biodiversity. Beyond their ecological significance, several dinoflagellates, however, can form harmful algal blooms (HABs) and produce diverse toxins. Saxitoxins (STXs) are a major cause of paralytic shellfish poisoning (PSP) and are produced by certain marine dinoflagellates, especially the genus Alexandrium. Functional genes participating in STXs biosynthesis (sxt) were previously identified in toxic freshwater cyanobacteria, whereas they were poorly discovered in the toxic dinoflagellates due to their extraordinary genomic features. In the present study, I conducted environmental monitoring of phytoplankton at Jinhae Bay, and investigated recent seasonal changes in the toxic phytoplankton community in the southern coast of Korea. In addition, I constructed large-scale transcriptome sequence database from toxic Alexandrium isolated from Korean waters, and extensively studied STXs biosynthesis genes in terms of protein structure, evolutionary origin and functions for the genomic understanding and molecular detection of the saxitoxin biosynthesis in the marine dinoflagellate Alexandrium. The specific results are as follows. Firstly, I investigated recent seasonal changes in the phytoplankton community in the southern coasts of Korea, analyzing monthly samples collected in Jinhae Bay from 2017 to 2022. Phytoplankton cell concentrations ranged from 5.0×102 cells/L to 7.9×105 cells/L, consisting of 49 diatoms, 27 dinoflagellates and one Dictyochophyceae. Nine harmful species (one diatom and eight dinoflagellates) were identified, of which Alexandrium catenella, A. pacificum, and Gymnodinium catenatum produce STXs and can lead to PSP incident in spring. In addition, the species may proliferate under certain environmental conditions (temperature, nutrients, etc.); and thus, it is necessary to understand the relationship between environmental conditions and STX biosynthesis in molecular aspects. Secondly, mRNA sequencings were performed with toxic dinoflagellates isolated from the Korean coasts, and constructed large-scale transcriptome library. A number of sxt genes participating in STX biosynthesis were extensively identified, and their nucleotide, amino acid sequences, and phylogeny structures were compared with those from other taxa, especially toxic freshwater cyanobacteria. Among them, sxtA, sxtG, and sxtB were conserved among toxic cyanobacteria and dinoflagellates. Comparative transcriptome analysis of toxic and non-toxic dinoflagellates revealed that the presence of three genes is essential for STXs production. Additionally, transcriptional levels of the genes in Alexandrium were varied by the species and their toxicity, demonstrating the importance of sxt gene regulation for STX biosynthesis. In this regard, expressional patterns of sxt in response to environmental stress were assessed to understand their effects on STXs biosynthesis in A. catenella and A. pacificum. Changes in water temperature and nitrate availability significantly altered their growth, STXs contents, and sxt expression pattern. In common, cold stress and optimal condition (16℃) considerably increased the STX production and sxt expression level, which explains why seafood contamination was more frequent in the spring than in the summer. In addition, nitrate depletion decreased the toxins content, and sxtA, sxtB and sxtI genes were significantly induced after 24h of nitrate supplementation. To deeply understand the effects of temperature changes on STXs biosynthesis, the transcriptomic and toxins profiles of A. catenella Alex03 were examined over a time course (12, 24, 48, and 72 h) after cold and heat stress treatment. Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway analysis demonstrated that a number of genes were down-regulated under heat stress, whereas up-regulated under cold stress. Temperature changes induced differential expression of photosynthesis-related genes, while sxt expression levels were not significant to explain altered toxins content. These imply that transcriptional changes in sxt were regulated in post-transcriptional and translation levels, therefore, further research to understand their regulation is necessary. The results provide an understanding of the mechanisms of ecological adaptation and ecophysiological response in A. catenella under climate change. Finally, I developed a molecular detection method for toxic Alexandrium using the sxt synthetic gene identified in this study. TaqMan probes targeting STX biosynthesis gene sxtB were designed to detect toxic Alexandrium from environmental DNA (eDNA). As a result of molecular monitoring in Jinhae Bay, the probe reliably detected PST producing A. catenella and A. pacificum with a detection limit of 0.05 cells/mL. sxtB-based cell abundance estimates were more correlated with microscopy results than a qPCR assay targeting 28S rDNA. The high sensitivity of the assay suggests its potential to be used as an early warning system for PST contamination of shellfish. In addition, further verification is also required for a wide range of STX-producing dinoflagellates in order to confirm its seasonal applicability. Taken together, the present study has promoted a comprehensive understanding of the STX biosynthesis genes and regulatory mechanisms in toxic dinoflagellate Alexandrium. In addition, newly designed sxtB TaqMan probes are highly sensitive, and the probes are expected to be used to detect toxic Alexandrium cells for early warning and management of PSP occurrence in marine environments.

Environmental DNA Metabarcoding Analysis for Assessment of Fish Biodiversity in Han River, Korea, using Machine Learning Approaches

문민호 상명대학교 일반대학원 2023 국내석사

Fish play an important role in aquatic ecosystems and are sensitive indicators for rapid environmental changes. To assess fish biodiversity, environmental DNA (eDNA) collected from environmental samples can be analyzed using various markers; however, there is a limit to the studies comparing these primer efficacies. Additionally, sequences of the genus Rhinogobius were not assigned at the species level, making accurate eDNA analysis difficult. This study investigates an appropriate marker for fish species in Korea using eDNA metabarcoding conducted with the mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I (COI) gene and 12S ribosomal RNA (12S rRNA) gene to investigate fish biodiversity in Han River, Korea, during April, and June, 2022. Species that were detected using eDNA metabarcoding were compared with previous survey data to evaluate the validity of the eDNA metabarcoding analysis. For accurate taxonomic assignment of eDNA sequences of Rhinogobius from Han River to the species level, an XGBoost-based machine learning species classifier was constructed using the sequences obtained from the database. A total of 633 eDNA sequences were classified from 12S rRNA sequences. A total of 55 species of fish were identified, and the number of species and relative abundance differed according to the marker used. The alpha diversity of eDNA samples was higher when using 12S rRNA marker compared to COI marker. Similarly, there have been more species detected using 12S rRNA marker than with COI marker in previous investigations. The classifiers with the highest evaluation score using Pseudo k-tupler composition (PseKNC), with a classification accuracy 89.47 % (±2.63 %) was used for taxonomic assignment of Rhinogobius. All sequences of Rhinogobius were assigned at the species level. This is a preliminary study to evaluate a genetic marker of eDNA metabarcoding appropriate for fish of Han River, and to conduct accurate fish biodiversity analysis at species level. This study could provide basic data for assessing fish diversity in Han River. 어류 군집은 수생태계에서 중요한 역할을 수행하며, 급속한 환경 변화에 대응하기 위한 민감한 생물학적 지표이다. 어류의 생물다양성을 평가하기 위한 방법 중 하나로서 환경 시료에서 채취한 환경 DNA (environmental DNA, eDNA)를 다양한 마커를 이용하여 분석하는 연구가 이루어지고 있으나, 프라이머의 효율성을 비교한 연구는 부족한 실정이다. 또한 eDNA 메타바코딩 분석 과정 중 eDNA 서열을 알려진 분류군으로 할당하는 분류학적 할당은 중요한 과정 중 하나이나, Rhinogobius 속과 같은 특정 분류군의 경우 eDNA 서열이 종 수준으로 할당되지 않는 사례가 발생하여 분석을 어렵게 한다. 본 연구에서는 한강의 어종에 적합한 마커의 비교를 위해 미토콘드리아 cytochrome c oxidase subunit I (COI) 유전자와 12S ribosomal RNA (12S rRNA) 유전자 마커를 이용하여 환경 DNA (environmental DNA, eDNA) 메타바코딩을 수행하여 2022년 4월과 6월 한강의 어류 생물다양성을 평가하였다. 또한 eDNA 메타바코딩 분석의 유효성을 평가하기 위해 본 연구에서 eDNA 메타바코딩으로 식별된 종 목록과 이전 조사 데이터에 보고된 종 목록을 비교 분석하였다. 종 수준으로 분류되지 않은 한강 Rhinogobius 속의 염기서열을 종 수준에서 분류학적으로 할당하기 위해 데이터베이스에서 얻은 염기서열을 이용하여 XGBoost 기반 기계학습 어류 종 분류기를 구축하였다. eDNA 메타바코딩 분석 결과 총 7,015 및 633개의 대표 서열이 COI 및 12S rRNA 염기서열에서 각각 얻어졌다. 두 마커를 모두 이용하여 총 55종의 어류가 식별되었으며, 유전자 마커에 따라 검출된 종 수와 상대적 풍부도에 차이가 있었다. 알파다양성은 12S rRNA 마커를 이용한 경우 COI 마커를 이용한 경우보다 더 높았다. 이전 조사에서 기록된 종들에 대해 12S rRNA 마커를 이용한 경우 COI 마커보다 더 많은 종을 식별하였다. 12S rRNA 유전자를 이용하여 구축된 기계학습 분류기 중 가장 높은 평가점수를 받아 89.47 %의 정확도를 보인 Pseudo k-tupler composition (PseKNC)를 이용한 기계학습 분류기를 이용하여 eDNA 메타바코딩 분석에서 Rhinogobius의 염기서열을 할당하였으며, 모든 염기서열이 종 수준에서 할당되었다. 본 연구는 한강 어류에 적합한 eDNA 메타바코딩 유전자 마커를 비교하고, 종 수준에서 정확한 어류 생물다양성 분석을 위한 예비 연구로서 한강의 어류 생물다양성 평가를 위한 기초자료를 제공할 수 있다.

Environmental DNA (eDNA) sampling for detecting stream fish assemblages in comparison with traditional sampling methods

권소연 아주대학교 2023 국내석사

Recently, environmental DNA (eDNA) has been drawing attention as a powerful tool for detecting fish community structure. Since traditional capture-based methods are limited due to incomplete sampling efficiency, particularly when investigators cannot approach sampling sites, several studies have applied the eDNA method as a complementary tool. These previous studies also put an emphasis on fine-tuning methods for a specific ecosystem type to adopt the eDNA survey due to complicate relationships between eDNA and environmental factors. Thus, the aim of this study is to evaluate the eDNA method and suggest reasonable sampling methods that are highly likely to be applicable in stream fish sampling surveys. I compared the fish community structures observed with the eDNA and the traditional methods, and estimated the number of required sample replicates in the three study sites: Upstream; Midstream; and Downstream in Yeongpyeongcheon Stream, located in the Imjingang River Basin, a part of the Hangang River Basin in South Korea. I simultaneously conducted traditional fish sampling and eDNA sampling at 6 different sampling spots in each study site. Surveys were performed twice, in summer and autumn, to consider seasonal variations in fish assemblages. To clarify factors influencing the eDNA survey results, I conducted a permutational multivariate analysis of variance (PERMANOVA). The number of sample replicates needed was calculated via species accumulation curve fitted to the Michaelis-Menten equation. As a result, I could detect 22 and 33 species using traditional fish sampling and the eDNA method, respectively. Eighteen fish were detected from both methods, and the species undetected from the eDNA method were Rhinogobius brunneus, Hemibarbus labeo, Sarcocheilichthys variegatus, and Coreoperca herzi. From the PERMANOVA result, only site and seasonal factors were significant statistically among the factors including site, season, and mesohabitat types. When comparing the number of required sample replicates, eDNA sampling required less sampling efforts in autumn than traditional fish sampling. On the contrary, the number of sample replicates should be increased in summer, except for the Downstream site. In the Downstream site, eDNA sampling required less effort in both seasons. Six replicate samples per each study site covered an average of 80 percent of expected species in the region. Overall, the eDNA survey worked as a powerful tool for detecting fish fauna with less effort compared to traditional method. Sampling site and seasonal variation must be considered since the effect of these two variables were prominent. However, biological indices showed unrealistic values when calculated with the eDNA result. Further studies would be needed for applying eDNA read counts as a quantity data.

환경 DNA(environmental DNA)를 이용한 울릉도 식물상 연구

박근모 대전대학교 대학원 2023 국내석사

Environmental DNA (eDNA) is traces of DNA released by organisms into their environments and extracted without the isolation of target organisms. eDNA samples that contain intracellular and extracellular DNA have provided rich sources to detect biodiversity in the aquatic environment and permafrost regions. The recovery of plant biodiversity from soil samples, particularly in temperate regions, has not been studied. This study aimed to develop a method to understand the flora from the soil eDNA in the temperate zone and compare the metagenomic results with flora determined by morphology. Ulleungdo Island is an excellent model case to investigate plant biodiversity using soil eDNA because the volcanic island has been isolated in the East Sea since its origin and because the flora is well-studied. Fifty-four soil eDNA samples were collected in three locations in the Nari Basin representing different floristic composition and local environments from April to September in 2021 and 2022. A next-generation sequencing method (Mi-seq) was employed to identify molecular OTU using a two-marker system of the nuclear ITS2 region and chloroplast rbcL. Results of plant mOTU analysis showed that mOTUs of ITS2 were members of Magnoliophyta only and that those of rbcL belonged to various Embryophyta. The plant biodiversity of the three sites determined from eDNA is consistent with flora determined by morphology, indicating that the eDNA data successfully uncover the species composition of the sampled site. This study establishes plant diversity in soil eDNA in temperate regions for the first time. The methods developed in this study will be useful to study ancient deposits in the Nari Basin which will help understand the evolution of species and vegetation of the oceanic island.