Breast cancer growth inhibition of hwanggeumchal sorghum (Sorghum bicolor Moench) extracts

박진희 건국대학교 대학원 2011 국내석사

본 연구의 목적은 황금찰 수수 추출물 (HSE)이 인간 유방암 세포주 (MDA-MB 231) 및 xenografts 된 마우스 종양에서 유방암 성장을 억제하는지를 조사하는 것이다. Signal transducer and activator of transcription 5 (STAT5b)/insulin-like growth factor-1 (IGF-1R) 및 STAT3/vascular endothelial growth factor (VEGF) pathway는 혈관신생 (angiogenesis)을 통한유방암 증식에 중요한 역할을 하는 것으로 최근에 보고되었다. STAT5b/IGF-1R pathway는 인간의 유방암 세포의 성장, 분화 및 생존을 조절하고 있다. 그리고 STAT3는 암의 발달과 유방암 등 각종 malignancies의 촉진에 관여하는 종양 전사 인자이다. 종양의 진행에 VEGF가 angiogenesis, 즉 새로운 모세 혈관을 형성하는 과정의 절대 조절자로 작용한다. 또한 최근 항 유방암 효과에 대한 황금찰수수 (HSE)의 연구도 없었다. 이에 우리는 강력한 인간 유방암 세포와 이를 xenografts한 마우스모델의 종양에서 HSE가 STAT5b/IGF-1R pathway와 종양내의 angiogenesis 발현의 억제 여부에 대하여 연구를 수행하였다. HSE를 처리한 인간 유방암 세포주 (MDA-MB 231)로부터 MTT assay를 통해 HSE 농도에 따른 세포독성을 실험하였으며, STAT5b/IGF-1R pathway와 STAT3/VEGF pathway를 통한 angiogenesis 발현에 대한 실험을 Western blot, RT-PCR, EMSA, Luciferase assay 등으로 수행하였다. 그리고 사람의 유방암세포 (MDA-MB 231)를 이식한 xenograft 마우스 모델을 이용하여 유방종양 성장의 억제를 확인하기 위하여 in vivo 실험으로 종양 size 측정, 조직의 H&E staining, Immunohistochemistry 및 조직 내 protein에 대한 Western blot 등을 수행하였다. HSE는 실질적으로 MDA-MB 231세포의 생존력을 농도 의존적으로 감소시켰고 이를 통하여 우리는 IC50값을 확인하였다. 세포와 이종이식 마우스 모델의 종양에서 STAT5b/IGF-1R와 STAT3/VEGF signal pathway의 관련 단백질 수준을 억제/감소시켰으며 농도, 시간에 의존적으로 signal pathway의 발현이 억제됨을 확인하였다. 또한 VEGF-R2, Cyclin D1, janus-activated kinase 2 (JAK2), estrogen receptor α (ERα) 및 Breast tumor kinase (Brk)가 HSE에 의해 감소되었다. 하지만 종양 억제유전자들(tumour suppress genes)인 p53 단백질 수준은 변함이 없었고 BRCA1의 발현은 오히려 증가하였다. VEGF와 IGF-1R의 mRNA 발현 또한 HSE에 의해 억제되었으며, 이는 STAT5b와 IGF-1R promoter의 DNA-binding 활성도에서도 같은 결과를 보였다. HSE가 처리된 세포 안에서의 STAT5b/IGF-1R 유전자 간 그리고 STAT3/VEGF 유전자 간의 상호작용 (interaction) 역시 현저하게 억제되었다. 궁극적으로, xenograft 마우스 모델의 종양의 성장이 HSE에 의해 효과적으로 상당히 억제됨을 확인하였고 HSE가 처리된 마우스의 종양은 처리하지 않은 대조군의 마우스와 대조적으로 종양의 necrosis가 활발히 이루어졌다. 면역 형광염색을 통해 종양의 조직에서도 인산화 된 STAT5, IGF-1R 및 STAT3 단백질 그리고 VEGF, VEGF-R2 및 hypoxia inducible factors (HIF-1α) 단백질의 발현량이 감소함을 확인하였다. STAT5b, IGF-1R, STAT3, VEGF, VEGF-R2, Cyclin D1, JAK2, ERα, Brk 및 HIF-1α 등과 같이 유방암 생성 및 증식에 기여하는 인자들은 HSE에 의해 모두 억제 되었고, 암 억제 단백질인 p53과 BRCA1 등에는 영향을 받지 않거나 오히려 발현량이 증가하였다. 따라서 황금찰 수수는 잠재적으로 항 유방암에 대한 효과적인 후보 chemopreventive 또는 치료 물질로써의 가능성과 방향을 제시할 수 있을 것이다. The objective of this study was to investigate antiproliferative activity and cytotoxicity potential of Hwanggeumchal sorghum extracts (Sorghum bicolor Moench, HSE) on human breast cancer cell line (MDA-MB 231) in vitro and Human Breast Cancer Xenografts in vivo. Recently these are reports that signal transducer and activator of transcription 5b (STAT5b)/insulin-like growth factor-1 receptor (IGF-1R) pathway and angiogenesis are to play an important role in breast cancer. Human breast cancer cells are regulated proliferation, differentiation, and survival by STAT5b/IGF-1R. In addition, STAT3 is an oncogenic transcription factor involved in development and furtherance of various malignancies including breast cancer. Furthermore, the vascular endothelial growth factor (VEGF) in tumour progression acts as a absolute regulator of angiogenesis in the process of forming new capillaries. Recently, There are no reports on the effect of HSE for anti-breast cancer. Hereupon, we have studied whether HSE suppresses tumour with regard to the expression of STAT5b/IGF-1R pathway and angiogenesis. We have studied cytotoxicity of HSE concentration test according to the MTT assay from MDA-MB 231 cells, and tested on the expression of STAT5b/IGF-1R pathway and angiogenesis by Western blot, RT-PCR, EMSA and Luciferase assay. In addition, we have studied suppression of tumour growth according to the measurement of tumour size, histomorphological assessment staining and Immunohistochemistry of the xenograft model tissues, Western blot for the tissue protein. HSE substantially decreased the viability of MDA-MB 231 cells in a dose-dependent manner and we confirmed the IC50. HSE inhibited/decreased STAT5b, IGF-1R, STAT3 and VEGF signal pathway in protein levels. HSE suppressed STAT5b/IGF-1R and STAT3/VEGF signal pathway in concentration/time dependent manners in MDA-MB 231 cells and Xenograft tumours in nude mice. In addition, STAT3, VEGF, VEGF-R2, Cyclin D1, janus-activated kinase 2 (JAK2), estrogen receptor α (ERα) and Breast tumor kinase (Brk) were suppressed by HSE. However, helpful signal pathway for anti-cancer that the p53, BRCA1 (tumour suppress gene) protein levels did not change or overexpress. Expression of VEGF and IGF-1R mRNA levels were suppressed by HSE. The STAT5b DNA-binding activities to IGF-1R promoter (STAT5 to the IGF-1R site) and activation of STAT5b/IGF-1R and STAT3/VEGF promoter were markedly suppressed in HSE-treated cells. Ultimately, we confirmed that HSE effectively suppressed the growth of xenograft tumour volume in the xenograft models and the tumour tissues of the xenograft models treated by HSE markedly increased tumour necrosis compared to untreated in tissue levels. By immunofluorescence, we were able to confirm that STAT5b, IGF-1R, STAT3 and VEGF reduced in tumours in mice treated with HSE in a dose dependent manner. And the expression of p-STAT5b, p-IGF-1Rβ and p-STAT3 were suppressed in the tumour tissues. The critical factors such as STAT5b and IGF-1R, STAT3, VEGF, VEGF-R2, Cyclin D1, JAK2, ERα, Brk and hypoxia inducible factors 1α (HIF-1α) causing breast cancer were suppressed by HSE. Thus, our results indicate that HSE may be potentially effective chemopreventive or therapeutic agent for breast cancer.

The healing effect of platelet-rich plasma on xenograft in peri-implant bone defects in rabbits

Wang Peng Department of Dentistry, Graduate School of Inha U 2016 국내박사

목적 : PRP (platelet-rich plasma) 와 같은 치유인자와 결합된 생체 재료는 잠재적인 가치를 가진다. Bovine-derived xenograft는 osseointegration 능력이 있는 생체친화적인 골전도성 골이식재로 인식되어 왔다. 많은 구강악안면 수술에서 PRP는 치유를 촉진시키는 가치있는 부가 재료로 부각되었다. 하지만 PRP의 재생능력과 골이식에서 사용했을 때의 실질적인 이득에 대하여는 논란이 되어왔다. 본 논문의 목적은 임플란트 주위 골결손의 치유에 PRP와 xenograft를 함께 사용했을 때의 영향을 평가하기 위한 것이다. 재료 및 방법 : 12마리의 토끼에 임플란트 식립하고 동시에 골이식을 시행하였다. 술 전에 실험할 각 토끼의 혈액을 채취하여 PRP를 준비하였다. 각 토끼의 좌측 및 우측 경골(tibia)에 원통형 골결손부(지름 7 mm, 깊이 3 mm)를 만들고, 총 24개의 티타늄 임플란트(지름 3 mm, 길이 8.5 mm)를 식립하였다. 따라서 임플란트 상부의 표면과 주변골 사이에 평균4 mm의 간극이 형성되었다. 대조군은 xenograft만 사용하여 간극에 골이식하였고, 실험군은 xenograft 와 PRP를 함께 사용하였다. 1주, 2주, 3주, 4주, 5주 및 6주의 치유기간에 과량의 KCl을 이용하여 토끼를 희생켰다. 한번에 2마리의 토끼를 희생시켜 임플란트와 주변골 시료를 얻었고, 조직학적인 분석을 시행하였다. 결과 : 대조군에서 최근에 형성된 골과 더 나은 골치유가 관찰되었다. 조직형태측정 분석 결과, 대조군의 평균 골-임플란트 접촉비율이 실험군보다 통계적으로 유의한 차이로 높게 나타났다. (25.23% vs. 8.16%; P < 0.05, independent-simple t-test, ANOVA). 결론 : 임플란트 주위 골결손의 치료에 있어서 bovine-derived xenograft에 PRP를 첨가하는 것은 임플란트 주위골의 치유를 지연시킬 수 있다. Objectives: The association of biomaterial combined with repair factor like platelet-rich plasma (PRP) has prospective values. Bovine-derived xenograft has been identified as an osteoconductive and biocompatible grafting material that provides osseointegration ability. PRP has become a valuable adjunctive agent to promote healing in a lot of dental and oral surgery procedures. However, there are controversies with respect to the regenerative capacity of PRP and the real benefits of its use in bone grafts. The purpose of this study was to assess the influence of PRP combined with xenograft for the repair of peri-implant bone defects. Materials and Methods: Twelve rabbits were used in this study, and the experimental surgery and implant installation were performed simultaneously. Autologous PRP was prepared before the surgical procedure. An intrabony defect (7.0 mm in diameter and 3.0 mm deep) was created in the tibia of each rabbit; then 24 titanium dental implants (3.0 mm in diameter and 8.5 mm long) were inserted into these osteotomy sites. Thus, a standardized gap (4.0 mm) was established between the surrounding bony walls and the implant surface. The gaps were treated with either xenograft alone (control group) or xenograft combined with PRP (experimental group). After healing for 1, 2, 3, 4, 5 and 6 weeks, the rabbits were sacrificed with an overdose of KCl solution. Two rabbits were killed at each time, and the samples including dental implants and surrounding bone were collected and processed for histological analysis. Results: More newly formed bone and a better bone healing process were observed in control group. The histomorphometric analysis revealed that the mean percentage of bone-to-implant contact in the control group was significantly higher than the experimental group (25.23% vs. 8.16%; P < 0.05, independent-simple t-test, ANOVA). Conclusion: The results indicate that the addition of PRP to bovine-derived xenograft in the repair of bone defects around the implant, PRP may delay peri-implant bone healing.

Effect of Adipose-Derived Stem Cells on Immune Modulation and Graft Survival in Human Skin Xenotransplantation Models

전성미 서울대학교 대학원 2023 국내박사

Background: Adipose-derived stem cells (ADSCs) exert immunomodulatory effects in the treatment of transplant rejection. This study aimed to evaluate the effects of ADSCs on the survival of human skin xenograft onto rodents and to investigate the mechanisms underlying the immunomodulatory effect of ADSCs. Methods: To evaluate the effect of ADSCs on graft survival and compare the administration methods (intravenous versus subcutaneous injection), C57BL/6 mice were used as recipients of full-thickness human skin xenotransplantation. To compare single versus triple injections of ADSCs and analyze the mechanism of immune response, 2 x 2 cm2-sized human skin xenografts were transplanted onto the backs of Sprague-Dawley rats. The host rodents were administrated with autologous ADSCs suspended in phosphate-buffered saline (PBS). The rats were euthanized 7, 10, and 14 days after transplantation to assess the mechanism underlying the immunomodulatory effects of ADSCs on human skin xenografts. Results: Subcutaneous injection of ADSCs appeared to be superior to intravenous injection in a human-to-mouse skin xenotransplantation model. Triple injections of ADSCs considerably delayed cell-mediated xenograft rejection compared with the control (PBS) and single-injection groups in a human-to-rat skin xenograft model. The vascularization and collagen type 1 to 3 ratios in the ADSC group were significantly higher than those in the control group. In addition, intragraft infiltration of CD3-, CD4-, CD8-, and CD68-positive cells was reduced. Furthermore, the expression levels of proinflammatory cytokine interferon-gamma (IFN-γ) were decreased and immunosuppressive prostaglandin E synthase (PGES) was increased in the xenograft and lymph node samples. Conclusion: This study presented that triple subcutaneous injections of ADSCs was effective improving skin xenograft survival by suppressing cell-mediated xenograft rejection compared with the control and single-injection groups. The immunomodulatory effects of ADSCs were associated with the downregulation of IFN-γ and upregulation of PGES in skin xenografts and lymph nodes. 배경: 지방유래 줄기세포 (Adipose-derived stem cell, ADSC)는 동종 피부 이식 모델에서 면역 조절 효과를 보이는 것으로 알려져 있다. 이 연구는 인간 피부 이종 이식 모델에서 ADSC의 면역조절 효과를 검증하고, 그 작용 기전을 분석하는 것을 목표로 한다. 방법: C57BL/6 마우스 등에 전층 인간 피부를 이식한 후 ADSC를 정맥주사와 국소 피하 주사로 투여하였으며, 각각의 투여 방법이 이식편 생존에 미치는 영향을 비교 분석하였다. 보다 상세한 면역 기전을 파악하기 위해 Sprague-Dawley rat (SD 랫드) 등에 인간 피부 이종 이식 실험을 시행하였다. ADSC (1×106 cells/ml)를 수술 직후 단일로 투여하거나 수술 후 0일, 3일, 그리고 5일에 각각 3회 투여하여, 투여 빈도가 이식편 생존 및 면역 조절 효과에 미치는 영향을 비교 분석하였다. 이식 후 7일, 10일, 그리고 14일에 피부 이식편, 액와 림프절, 혈청을 수집하여 면역 세포의 침투 정도, proinflammatory cytokine인 interferon-γ (IFN-γ), 그리고 ADSC가 분비하는 anti-inflammatory factor인 prostaglandin E2 synthase (PGES)의 발현을 분석하였다. 결과: 인간-마우스 이종 피부 이식 모델에서는 ADSC를 국소 피하 주사로 투여하는 것이 정맥주사보다 이식편 생존을 더욱 향상시켰다. 인간-랫드 이종 피부 이식 모델에서는 ADSC를 3회 투여하는 것이 수술 직후 단일 투여보다 세포 매개 이종 이식 거부 반응을 4일 정도 지연시켰다. ADSC를 3회 투여하였을 때 이식 거부 반응이 감소하였으며, 이는 이식편의 표피 기저층에서 세포 분열이 증가하고, 미세혈관 생성 밀도가 더욱 증가한 결과로 나타났다. 이식편 내의 CD3, CD4, CD8, CD68+ 면역 세포(T 세포, 대식세포) 침투는 감소하였고, 피부 이식편과 주변 액와 림프절에서는 IFN-γ 발현이 줄어들고, PGES 발현이 증가한 것을 확인했다. 결론: 이 연구를 통해 인간 피부 이종 이식 모델에서 ADSC가 세포 매개 이식 거부 반응을 저해하며, 이로 인해 이식편 생존이 증가하는 것을 확인하였다. 이 결과는 피부 이식편과 주변 림프절에서 IFN-γ 발현의 감소와 PGES 발현의 증가와 관련이 있음을 시사한다.

Bee Venom Inhibits Prostate Cancer Growth in LNCaP Xenografts via Apoptosis

양창열 경원대학교 일반대학원 2010 국내박사

연구목적: 이 연구는 봉약침의 봉독이 NF-κB 활성억제와 안드로겐 수용체 조절 단백질 및 세포자멸사 조절 단백질의 발현을 통하여 세포자멸사를 유도하고, 전립선 암세포를 이식한 쥐에서의 세포자멸사 유도 효과를 확인함으로써, 봉약침의 봉독이 생체 내에서도 세포자멸사를 유도하여 전립선암에 효과를 나타냄을 확인하고자 하였다. 실험방법: 세포자멸사의 관찰에는 DAPI, TUNEL staining assay를 시행하였으며, 세포자멸사 조절 단백질의 변동 관찰에는 western blot analysis를 시행하였고, 세포자멸사와 연관된 NF-κB의 활성 변화를 관찰하기 위해 EMSA를 시행하였다. 결 과: 1. DAPI, TUNEL staining assay 결과 봉독 및 melittin을 처리한 LNCaP 세포 모두에서 세포자멸사 유도율이 유의한 증가를 나타내었다. 2. LNCaP 세포에 봉독이나 melittin을 처리한 결과, 안드로겐 수용체 조절 단백질 중 p-Akt, COX-2, calpain은 봉독과 melittin 모두에서 유의한 감소를 나타내었고, Akt는 melittin에서 유의한 감소를 나타냈으며, 봉독에서 증가하는 경향을 보였고, MMP-9은 증가하였다. 3. 생체 내에서의 봉독의 항암효과를 확인하기 위해 전립선암세포가 이식된 쥐에 봉독을 처리한 후 암세포의 부피와 무게, 쥐의 체중을 측정한 결과, 봉독을 처리한 군에서 암세포 부피비율 및 무게는 감소하였고, 쥐의 체중은 증가하였다. 4. 전립선암세포가 이식된 쥐에 봉독을 처리한 결과, NF-κB 활성에서 유의한 감소를 나타내었다. 5. 전립선암세포가 이식된 쥐에 봉독을 처리한 결과, 세포자멸사 조절 단백질 중 Bax/Bcl-2, p53, caspase-3, caspase-9, calpain은 유의한 증가를, COX-2는 유의한 감소를 나타냈으며, MMP-9는 증가를 나타내었다. 결 론: 이상의 결과는 봉독이 시험관 내에서 뿐만 아니라 생체 내에서도 NF-κB의 활성을 억제하고 안드로겐 수용체 조절 단백질 및 세포자멸사 조절 단백질의 조절을 통하여 인간 전립선암 세포주인 LNCaP의 세포자멸사를 유도함으로써 전립선암 세포 증식억제 효과 및 호르몬 비의존적인 전립선암으로의 전이를 지연시키는 경향이 있을 것으로 사료되고, 봉독이 전립선암의 예방과 치료에 효과적으로 활용될 수 있을 것으로 기대된다. This study is to confirm that bee venom inhibits growth of prostate cancer through induction of apoptosis via inactivation of NF-κB and control of androgen receptor regulatory proteins and apoptosis regulatory pro- or anti-apoptotic proteins. Also, induction of apoptosis in prostate cancer xenograft-bearing nude mice was investigated to demonstrate bee venom or melittin is effective on prostate cancer through induction of apoptosis. Apoptosis was evaluated by DAPI staining and TUNEL staining assay. Western blot analysis was performed to assess expression of apoptosis regulatory protein, and EMSA was used to evaluate activity of NF-κB. DAPI, TUNEL staining assay showed that apoptosis was significantly induced in LNCaP cell by bee venom or melittin. COX-2, calpain and p-Akt were signigicantly down-regulated by bee venom or melittin in LNCaP cell. Akt was down-regulated by melittin, but up-regulated by bee venom. MMP-9 was increased by melittin and bee venom. To confirm anti-cancer effect of bee venom or melittin in vivo, prostate cancer xenograft-bearing nude mice treated by bee venom or cisplatin was studied. Tumor volume ratio and tumor weight were decreased, while body weight was increased in group of treated by bee venom. The effect of bee venom on apoptosis regulatory proteins and NF-κB was studied compared with cisplatin group in prostate cancer xenograft-bearing nude mice. NF-κB inactivated by bee venom and cisplatin in prostate cancer xenograft-bearing nude mice. Bax/Bcl-2, p53, caspase-3, caspase-9 and calpain activated significantly, on the other hand, COX-2 showed significant inactivation. MMP-9 was activated. Key finding of this study is the identification of anticancer efficacy of bee venom on human androgen sensitive prostate carcinoma LNCaP xenografts in vivo as well as on the cells in vitro via inhibition of NF-κB activity and induction of apoptosis by controling androgen receptor regulatory proteins and apoptosis regulatory proteins. bee venom could be a useful therapeutic agent for prolonging androgen dependant state of prostate cancer, consequently inhibiting its growth and keeping it treatable.

Guggulsterone induces apoptosis in colon cancer cells and inhibits tumor growth in murine colorectal cancer xenografts

안민지 Graduate School, Yonsei University 2010 국내석사

The plant sterol guggulsterone has recently been shown to have anti-inflammatory properties and anti-tumorigenic potential in certain cancer cell types. In this study, I investigated the anti-tumorigenic effects of guggulsterone and elucidated its molecular mechanisms in HT-29 human colon cancer cells and murine xenografts. In the present study, I determined whether guggulsterone induces apoptosis in HT-29 colon cancer cells in vitro, and the mechanism by which it does so. Furthermore, we carried out in vivo studies to examine the effect of guggulsterone in a colon cancer HT-29 xenograft model. Guggulsterone significantly suppressed cell viability and increased apoptosis in HT-29 cells in a dose-dependent manner by activating caspase-3 and caspase-8. Furthermore, guggulsterone decreased cIAP-1, cIAP-2, and Bcl-2 levels and increased the levels of truncated Bid, Fas, p-JNK, and p-c-Jun. The size of HT-29 xenograft tumors in guggulsterone-treated mice was significantly smaller than of the size of tumors in control mice. Immunohistochemical staining showed that Bcl-2 expression in tumor xenografts was inhibited by guggulsterone treatment. The present study indicates that guggulsterone induces apoptosis in HT-29 human colon cancer cells and inhibits the growth of HT-29 xenograft tumors in vivo, suggesting a potential therapeutic use for this compound in the treatment of colorectal cancer.

구강편평상피 암세포와 이종종양 모델에서의 화학요법과 배아줄기세포 유래 조혈모세포, 혈관내피세포의 단백체 분석 및 기능 연구

이라함 전북대학교 일반대학원 2016 국내박사

Recently, biphenolic components derived from the Magnolia family have been studied for anti-cancer, anti-stress, and anti-inflammatory pharmacological effects. However, the pharmacological mechanism of action of 4-O-methylhonokiol (MH) is not clear in oral cancer. The aim of this study was to investigate the role of MH in apoptosis and its molecular mechanism in oral squamous cell carcinoma (OSCC) cell lines, HN22 and HSC4, as well as tumor xenografts. Here, we demonstrated that MH decreased cell growth and induced apoptosis in HN22 and HSC4 cells through the regulation of specificity protein 1 (Sp1). Moreover, MH treatment effectively inhibited tumor growth and Sp1 levels in BALB/c nude mice bearing HN22 cell xenografts. These results indicated that MH inhibited cell growth, colony formation and also induced apoptosis via Sp1 suppression in OSCC cells and xenograft tumors. Thus MH is a potent anti-cancer drug candidate for oral cancer. In the second subject that OVOL2, a C2H2 zinc finger protein, is a novel binding protein of ER71 which is a critical transcription factor for blood and vessel development. OVOL2 directly interacted with ER71, but not with ETS1 or ETS2, in the nucleus. ER71-mediated activation of Flk1 promoter was further enhanced by OVOL2, although OVOL2 alone failed to activate it. Consistently, co-expression of ER71 and OVOL2 in differentiating embryonic stem cells (ESCs) led to a significant augmentation of FLK1-expressing (FLK1+) cells, endothelial and hematopoietic cells. Such cooperative effects were impaired by the shRNA-mediated inhibition of Ovol2. Collectively, we conclude that ER71 directly interacts with OVOL2 and that such interaction is critical for FLK1+ cell generation and its differentiation into downstream cell lineages. 최근 목련종 유래의 바이페놀 성분을 갖는 메틸호노키올의 항암, 항 스트레스 그리고 항 염증성에 대한 약물 효과는 연구 되었지만, 구강암에 있어서 메틸호노키올의 약학적인 메커니즘은 아직 명확하게 밝혀지지 않았다. 이 연구의 목적은 인간 구강편평상피 암세포인 HN22와 HSC4 뿐만아니라 이종종양에서의 분자학적 메커니즘과 세포사멸에 관여하는 메틸호노키올의 역할에 대한 연구이며, 여러 가지 실험방법을 이용함으로써, Sp1의 조절을 통해 HN22와 HSC4 세포의 성장을 늦추고 세포사멸을 유도하는 메틸호노키올에 대해 증명하였다. 또한 메틸호노키올을 처리했을 때 효과적으로 HN22 세포의 이종종양과 관련된 BALB/c 누드 마우스에서 Sp1의 수준과, 종양 성장이 억제되었다. 이러한 결과를 통해 메틸호노키올은 이종종양과 인간 구강 편평상피 암세포에서 Sp1 억제를 통한 세포사멸 유도와 세포성장 및 암세포 군집형성을 억제한다는 것을 시사했다. 두 번째 연구에서는 ER71의 신종 결합 단백질인 C2H2 징크핑거 단백질 OVOL2는 혈액과 혈관의 발생을 위해 중요한 전사인자 임을 보고한다. OVOL2는 직접적으로 ER71과 상호작용하지만 세포 내 핵에서는 ETS1 또는 ETS2와는 결합하지 않는다. OVOL2 단독으로는 Flk1 프로모터를 활성화시키지 못하지만, ER71을 통한 Flk1 프로모터의 활성화 조절이 가능하며, ER71은 OVOL2를 통해 Flk1 프로모터 활성화를 더욱 향상 시킨다. 결론적으로, ER71과 OVOL2는 상호작용 하고 있으며, 이러한 상호작용은 FLK1+ 세포 발생과, 이 후 세포 계통별 분화에 중요한 것으로 나타났다.

담도암 환자로부터 암세포주와 이종이식의 수립

강지훈 울산대학교 대학원 2020 국내박사

Background Biliary tract cancers (BTC) are rare and show dismal prognosis with limited treatment options. To improve our understanding of these heterogeneous group of tumors, and develop effective therapeutic agents, suitable preclinical models reflecting diverse tumor characteristics are needed. We aimed to establish and characterize new BTC cell lines and PDX models using malignant ascites from five patients with BTC. Method A total of 5 BTC cell lines and 3 PDX models derived from malignant ascites of 5 BTC patients, designated as AMCBTC-01, -02, -03, -04, and -05 were established. To characterize those models histogenetically and confirm whether characteristics of the primary tumor were maintained, targeted exome sequencing and histopathological comparison between primary tissue and xenograft tumors were performed. Mutation profiles of patient-derived BTC cell lines were also compared with those of commercially available BTC cell lines. Results From malignant ascites of 5 BTC patients, 5 BTC cell lines (100% success rate) and 3 PDXs (60% success rate) were established, respectively. The 5 BTC cell lines grew as a spindle to pleomorphic shapes and monolayers. The morphological characteristics of 3 primary xenograft tumors were compared with those of matched primary tumors and they displayed similar morphology. Target exome sequencing was available for 3 primary tumors (AMCBTC-01, -02, and -04), 3 BTC cell lines (AMCBTC-01, -02, and -03), and 14 PDX tumors from 3 BTC patients (AMCBTC-03, -04, and -05). The mutated genes observed in samples (models and/or primary tumor tissue) from more than one patient were TP53 (n=2), KRAS (n=2), and STK11 (n=2). Other mutated genes found in samples from 1 of 5 BTC patients were BRCA2, NF1, NOTCH 1, NOTCH3, ARAF, AXIN1, FGFR1, FGFR4, JAK1, JAK3, PIK3CD, LRP1B, and DDR1. Overall, the pattern of commonly mutated genes in AMCBTC cell lines was different from that in commercially available BTC cell lines. Interestingly, loss of heterozygosity in particular genes with regard to tumor suppression or apoptosis commonly occurred in PDXs, unlike primary tumor tissue or BTC cell lines. Conclusions We established the patient-derived cancer cell line and xenograft models from BTC patients with a higher success rate. These models accompanied by different genetic characteristics from commercially available models will be useful for a better understanding of BTC biology. 배경 담도암은 타암종에 비하여 드물게 발생하며 치료의 옵션이 제한되어 있어 예후가 불량한 질병으로 알려져 있다. 균일하지 않은 특성을 보이는 종양들로 이루어진 담도암에 대한 깊이 있는 이해의 향상과 효과적 치료제를 개발하기 위해서는 다양한 종양의 특성을 반영하는 적절한 전임상 모델이 필요하다. 이 연구에서는 복막전이가 동반되어 악성 복수가 있는 5명의 담도암 환자의 복수를 이용하여 새로운 담도암 세포주와 이종이식 모델을 확립하고 이들을 특성화 하고자 한다. 방법 AMCBTC-01, -02, -03, -04, 및 -05로 명명된 총 5명의 담도암 환자들의 악성 복수를 이용하여 총 5종류의 담도암 세포주 및 3종류의 이종이식모델이 확립되었다. 이 모델을 조직학적으로 특성화하고 원발 종양 조직의 특성이 유지되는지를 확인하기 위하여 원발 종양 조직 및 이종이식 종양 사이의 타겟 패널 시퀀싱을 통한 유전자 변이 분석과 조직 병리학적 비교분석을 시행하였다. 또한 타겟 패널 시퀀싱을 통해 환자 유래 담도암 세포주와 시판되어 사용되는 담도암 세포주 사이의 돌연변이 프로파일을 비교하였다. 결과 5 명의 담도암 환자의 악성 복수를 이용하여 총 5종류의 담도암 세포주 (100 % 성공률) 및 3 종류의 이종이식 모델 (60 % 성공률)이 각각 확립되었다. 5 종류의 담도암 세포주는 방추 모양에서 다형태성의 모양을 보였으며 단층으로 성장하였다. 일차적으로 확립된 3 종류의 이종 이식편 종양의 형태학적 특성을 각 각의 원발 종양과 비교하였으며 이들은 서로 유사한 형태를 보였다. 환자 3며의 원발 종양 (AMCBTC-01, -02 및 -04), 3 종류의 담도암 세포주 (AMCBTC-01, -02 및 -03), 3명의 담도암 환자에서 유래된 총 14개의 이종이식모델을 이용하여 (AMCBTC- 03, -04 및 -05) 타겟 패널 시퀀싱 검사가 이루어졌다. 둘 이상의 환자로부터 유래한 모델 (담도암 세포주 혹은 이종이식 모델) 또는 원발 종양 조직에서 관찰된 변이된 유전자는 TP53 (n = 2), KRAS (n = 2) 및 STK11 (n = 2)이었다. 담도암 환자 5 명 중 1 명의 모델 혹은 원발 종양 조직에서만 발견된 변이된 유전자는 BRCA2, NF1, NOTCH 1, NOTCH3, ARAF, AXIN1, FGFR1, FGFR4, JAK1, JAK3, PIK3CD, LRP1B 및 DDR1이었다. 전반적으로, 본 연구에서 확립된 담도암 세포주들의 유전자 변이 패턴은 시판되어 사용되는 담도암 세포주들의 패턴과 큰 차이를 보였다. 특징적으로 본 연구에서 확립된 이종이식 모델에서의 종양조직은 유전자 변이 분석시 원발 종양 조직 혹은 확립된 담도암 세포주와 달리 종양 억제 또는 세포사멸과 관련된 특정 유전자의 이종 접합성의 소실이 많이 발생 하였다. 결론 본 연구에서는 기존의 연구들보다 높은 성공률의 담도암 환자 유래 담도암 세포주 및 이종이식 모델을 확립하였다. 시판되어 사용되는 담도암 세포주와 비교하여 다른 패턴의 유전학적 특성을 수반하는 확립된 담도암 세포주는 담도암의 생물학적 특성을 더욱 잘 이해할 수 있는 유용한 도구가 될 것이다.

Bioceramic과 고순도 bovine xenograft를 이용한 시험관에서의 골 형성

장재혁 영남대학교 2000 국내박사

Hyaluronic acid와 bovine derived xenograft의 사용이 백서 두개골 결손부 재생에 미치는 영향

김연욱 원광대학교 대학원 2003 국내석사

Genomic profile of metastatic breast cancer patient-derived xenografts established using biopsy sample

김선경 서울대학교 대학원 2021 국내박사

Background: Metastatic breast cancer is a complex and life-threatening disease, although it is hard to cure, patients can get survival benefit from sequential anti-cancer treatment. Patient-derived xenograft (PDX) model is suggested as a practical tool to predict the clinical outcome of cancer treatment as well as to screen novel drugs. This study aimed to establish PDX models in Korean patients and analyze their genomic profiles and the utility for translational research. Methods: Percutaneous core needle biopsy or punch biopsy samples were used for xenotransplantation. The tumor tissue which has grown in the mouse was used for genome analysis. Whole exome sequencing and transcriptome analysis were performed to assess the genomic and RNA expression profiles, respectively. Copy number variation (CNV) and mutational burden were analyzed and compared with other metastatic breast cancer genomic results. The medical records were reviewed to understand the clinico-pathologic characteristic of enrolled patients. Moreover, the antitumor effect of an ATR inhibitor was tested in the relevant PDX model. Results: Of the 151 cases enrolled in this study, 40 (26%) PDX models were established. Notably, the take rate of all subtype, including hormone receptor-positive (HR+) subtype, exceeded 20%. The PDX model had genomic fidelity and CNV that represented the pattern of its donor sample. The somatic mutations of TP53, PIK3CA, ESR1, and GATA3 were frequently found. ESR1 mutation, CCND1 amplification, and APOBEC signature were significant features in HR+ HER2− PDX model. Fulvestrant in combination with palbociclib showed partial response to the relevant patient’s tumor harboring ESR1 mutation and CCND1 amplification found in PDX model. AZD6738, an ATR inhibitor, presented delayed tumor growth in a relevant PDX model. Conclusions: PDX model is well established using core needle biopsy samples from primary and metastatic tissues. Genomic profiles of the samples reflected their original tissue characteristics and could be used for the interpretation of clinical outcomes. These findings can increase the utility of this model in translational research. 유방암은 여성에게 가장 흔한 암으로 조기에 발견될 경우 예후가 좋지만, 전이성 유방암의 경우 질병 자체가 복잡한 성격을 띠고 있으며, 환자의 생명을 위협하는 질병이다. 분자생물학적인 연구를 통하여 여러 표적 치료제들이 개발되면서 전이성 유방암 환자의 생존 기간이 연장되고 있으나, 저항성 기전으로 인하여 질병이 다시 악화하는 것을 경험하고 있고, 이러한 어려움을 극복하려는 다양한 시도가 진행되고 있다. 암 환자 유래 조직 이식 동물모델 (patient-derived xenograft: PDX) 은 표적 치료제를 포함하는 항암 치료에 대한 공여자의 임상 결과를 예측하는 모델로 활용될 수 있고, 해당 모델을 이용하여 새로운 항암제의 효능을 입증하기 위한 동물모델로써 활용할 수도 있다. 최근까지 유방암의 환자 유래 조직 이식 동물모델은 대부분 서양인의 원발성 유방암 조직을 이용하여 수립되었다. 따라서 본 연구에서는 한국인 전이성 유방암 환자의 PDX 모델을 확립하고, 수립된 동물모델의 종양 조직을 이용하여 PDX 모델의 유전자 특성을 확인하며, 해당 유전적 특성이 있는 동물모델에서 효과가 있는 표적 치료제의 적응증을 확인하여 임상시험에 활용하는 가능성을 알아보고자 한다. 전이성 유방암 환자에서 경피적 생검 조직을 채취하여 NSG 마우스에 이식하였고 마우스에서 증식한 종양 조직을 이용하여 유전체 분석을 시행하였다. 유전자 변이 및 RNA 발현 양상을 확인하기 위하여 차세대 염기서열 분석 기법을 이용하여 whole-exome sequencing과 transcriptome sequencing을 수행하였고 유전자 복제수 변이와 종양 돌연변이 부담을 분석하였다. 또한, 등록된 환자의 임상 기록을 검토하여 전이성 유방암 환자의 임상적 요인과 병리학적 요인을 정리하여 수립된 PDX 모델의 분자생물학적 특성 및 유전체 분석결과와 비교 분석하였다. 또한, PDX 모델을 이용하여 표적 치료제의 항종양 효과를 관찰하였다. 전체 130명 환자에서 획득한 151개의 종양 조직이 이종이식에 활용되었다. 전체 151건의 사례 중 40건의 PDX 모델이 수립되어 26.5 %에서 PDX가 수립되었다. PDX 수립 성공률을 호르몬 수용체와 HER2 성장인자 수용체 발현 정도에 따라 아형을 나누어 분석하였고, 각 아형에서의 성공률 또한 20%를 초과함을 확인하였다. 특히, 기존에 성공률이 낮았던 호르몬 수용체 양성 아형에서도 22%의 성공률을 보였다. 본 연구에서 수립된 PDX 모델은 공여자의 종양 조직과 동일한 조직학적 특성을 보였다. 또한, 유전자 변이 및 유전자 복제 변이의 정도도 PDX 모델과 공여자 조직간 유사한 패턴을 나타내었다. TP53, PIK3CA, ESR1 및 GATA3 유전자의 돌연변이가 PDX 표본에서 빈번하게 발생함을 확인하였다. 이러한 유전자의 변이는 공여자의 조직에서 확인된 것과 같이 PDX 모델에서도 확인하였으며, 유전자 변이 빈도가 PDX 모델에서 증가함을 확인하였다. 본 연구에서 수립된 PDX 모델 중, 호르몬 수용체 양성 아형의 경우 ESR1 유전자 변이와 CCND1 유전자 증폭이 흔히 관찰되었고, APOBEC signature가 CpG signature와 함께 보임을 확인하였다. ESR1 유전자의 변이와 CCND1 유전자 증폭의 특성을 동시에 지니는 동물모델의 공여자에서 에스트로겐 수용체 분해제인 fulvestrant과 CDK4/6 억제제인 palbociclib을 병용 투여하여 임상 반응을 확인하여 PDX 모델에서 분석한 유전체 정보를 환자의 치료에 활용할 수 있었다. 또한, ATR 유전자 변이가 있는 동물모델에서 ATR 억제제인 AZD6738을 투여하여 종양 성장 억제 효과가 있음을 확인하였다. 본 연구에서 전이성 유방암 환자의 종양 조직을 이용하여 효과적으로 PDX 모델을 수립하였다. 특히 본 연구에서는 호르몬 수용체 양성 아형에서도 22%의 높은 성공률도 PDX 모델이 수립되었다. PDX 모델의 유전체 특성은 공여자의 조직에서 보이는 유전체 특성을 잘 반영하고 있음을 확인하였고, 이러한 유전체 특성을 이용하여 임상에서 환자의 치료 전략 수립에 도움이 될 수 있음을 입증하였다. 이러한 결과를 통하여 PDX 모델의 수립이 중개 의학 연구에서 활용 가능성을 제시하였다.