신선편의식품의 미생물 오염 특성과 백년초 추출물에 의한 Staphylococcus aureus의 생육저해

서영호 경북대학교 대학원 2011 국내박사

본 연구에서는 2006년에서 2008년 사이에 서울지역에서 유통된 신선편의식품 345건을 대상으로 일반미생물과 식중독균 오염실태를 조사하였다. 그리고 신선편의식품에서 가장 빈번하게 검출되는 S. aureus에서 enterotoxigenic S. aureus을 분리하고 이의 독소형, 생물형 및 항생제 내성 등을 통해 유전형 특성을 알아보았다. 또한 S. aureus의 억제를 위해 안전성과 경제성을 갖춘 천연물질 중 백년초 추출물을 선택하여 항균효과를 조사하고, 세포내에서 항균활성과 nitric oxide 생성 억제능을 살펴보았다. 그리고 신선절단 사과와 상추에 S. aureus을 접종한 후 여기에 백년초 추출물을 처리하여 균 억제효과를 알아보고, 저장 중 peroxidase activity, 색도, 관능검사 등을 통해 품질변화를 살펴보고자 하였다. 신선편의식품 345건에서 중온균은 2.0-9.7 log CFU/g의 범위로 검출되었으며, 세균수가 6 log CFU/g 이상인 시료는 모두 273건 (79.1%)으로 나타났고, 가장 균수가 높은 시료군은 새싹채소였다. 호냉성균은 중온균과 유사하게 검출되었으며 범위는 1.7-9.2 log CFU/g로 나타났다. 총대장균 균수는 시료의 98.3%에서 1.0-8.8 log CFU/g 검출되었으며, 시료 중 새싹채소에서 가장 높게 검출되었으며, 평균함량은 7.3 log CFU/g 이었다. 대장균은 절단과일에서는 검출되지 않았으며, 혼합샐러드와 양파류 (파, 양파) 그리고 절단상추에서는 각각 4.7, 7.4, 3.3%가 검출되었다. Salmonella spp.는 5건 (혼합샐러드 1건, 새싹채소류 3건, 양파류 1건)이 검출되었으며, C. perfringens는 신선편의식품 345건 중 21건 (6.1%)에서 검출되었다. L. monocytogenes는 새싹채소에서 단 1건 검출되었으며, E. coli O157:H7과 Y. enterocolitica는 검출되지 않았다. 곰팡이 및 효모는 세균보다 검출범위가 매우 넓게 검출되었다. 신선편의식품 345건에서 S. aureus가 40건 (11.3%) 검출되었다. 이 중 독소를 가진 균주는 25건 (62.5%) 이었다. S. aureus 독소는 RPLA 방법과 PCR 방법에 의하여 독소를 확인하였다. 가장 많이 검출된 gene은 sea (n=23) 이었으며, 다음으로 sei (n=12), seg (n=12), seh (n=3) 순이었다. 가장 빈번하게 나타난 gene profile은 sea-sei-seg (n=9) 이었다. 그리고 gene seg 와 sei 는 모든 경우에 동시에 검출되었으며, 결과적으로 본 연구에서 가장 빈번하게 검출된 독소형이 sea gene 이며 이것은 seg, sei 와 자주 결합되어 나타난다는 것을 알 수 있었다. Enterotoxigenic S. aureus 25건 중 21건 (84.0%)이 human biotype으로 나타나 대부분 사람에게서 오염된 것을 알 수 있었다. 또한 24건 (96.0%)이 항생제 내성균이었으며, 2가지 이상의 다재 항생제 내성균은 14건 (56.0%)으로 나타났다. 25개의 균주 모두 amoxicillin/clavulanic acid, cefepime, cefotetan, ciprofloxaxin, clindamycin, refampin, vancomycin에는 내성을 보이지 않았다. 페니실린에 내성인 균주가 24건 (96.0%)으로 가장 많았으며, erythromycin에 32.0%, ampicillin에 16.0%가 내성을 보였다. 또한 두개의 균주(SA 11, SA 19)는 oxacillin에 내성을 나타내고 있어, MRSA (methicillin resistance staphylococcus aureus)가 신선편의식품에도 존재함을 확인할 수 있었다. Enterotoxigenic S. aureus은 멸균증류수에서 백년초 추출물에 의해 억제되는 경향을 보였다. 특히 50 mg/mL 이상의 추출물을 넣었을 때 1시간 이후부터 균이 의미 있게 감소하였으며, 8시간 이후에는 모든 균이 사멸되는 결과를 보였다. BHI 배지상에서도 대조군에 비해 50 mg/mL 추출물 처리구는 1일 후부터 균수가 2-3 log CFU/g 정도로 억제되는 경향을 볼 수 있었다. 그리고 21℃에서 저장한 시료에서 100 mg/mL 추출물 처리구는 3일 후부터 균이 완전히 사멸되었으며, 75 mg/mL 추출물 처리구에서는 5일 후부터 균이 사멸되어 백년초 추출물의 S. aureus 억제 효과를 확인할 수 있었다. 산처리 효과 비교실험에서는 동일한 농도에서 백년초 추출물 50 mg/mL 처리구는 산용액 처리구보다 유의적으로 세균 억제 효과가 더 큰 것으로 나타났다. 그리고 100 mg/mL 백년초 추출물 처리구에서도 1.20 log CFU/g 수준까지 균이 감소하여 산용액 처리구보다 세균 억제 효과가 월등히 높은 것으로 나타났다. 이것은 낮은 pH 뿐만 아니라 페놀화합물이나 플라보노이드 같은 다른 어떤 활성을 가진 인자가 존재한다는 것을 나타내고 있다. Raw 264.7 세포내에서 백년초 추출물 처리구가 8시간 이후에 대조구보다 유의적으로 세균이 억제되었으며, 농도가 높을수록 그 효과가 커짐을 알 수 있었다. 세포의 형태는 배양시간이 경과함에 따라 macrophage의 형태적 변화가 증가되었으며, 처리 후 8시간 후에 대조구의 형태적 변화가 5±2%인데 비하여 처리군의 형태적 변화는 60±5%에 이르렀다. Nitric oxide 양은 LPS로 활성화된 Raw 264.7 세포는 약 68 μM 정도의 NO를 생성하였으나, 백년초 추출물을 처리하였을 때 NO 생성이 현저히 억제됨을 알 수 있었다. 투과주사전자현미경 사진에서도 백년초 추출물을 처리한 후에는 세포벽이 파괴되고, 세포내 물질이 밖으로 용출되어, 백년초 추출물의 항균효과를 확인할 수 있었다. 신선절단 상추와 사과에 백년초 추출물을 처리한 후 4℃에 저장하면서 측정한 결과를 보면 50 mg/mL 처리구는 저장 2일째부터 유의적으로 균수가 억제된 것을 알 수 있으며, 100 mg/mL 처리구는 저장 4일째부터, 200 mg/mL 처리구는 저장 2일째부터 균이 완전히 사멸되었다. 21℃에서 저장시에도 유의적인 균 억제경향을 관찰할 수 있었으며, 100 mg/mL 처리구는 4일째부터 균이 완전히 사멸되었으며 200 mg/mL 처리구도 2일째부터 S. aureus 균이 전혀 검출되지 않았다. 전체적으로 저장 온도에 따른 차이는 크게 나지 않았고, 백년초 추출물의 농도에 따라 변화가 크게 일어났으며, 특히 50 mg/mL 이상 처리구에서 균 억제 효과가 유의적으로 나타난 것을 알 수 있었다. 또한 신선절단 상추보다는 사과에서 억제 효과가 더 큰 것으로 나타났다. Peroxidase activity 억제효과에서 백년초 추출물이 신선절단 상추의 peroxidase activity를 감소시켜 갈변억제 및 품질저하를 막는 효과를 가지는 것으로 나타났다. 그리고 신선절단 상추와 사과 저장 중에 중량 감소율은 저장 초기에 큰 폭으로 감소하였으며, 백년초 추출물 처리구와 대조구의 유의적인 차이는 없는 것으로 나타났다. 그리고 저장기간 중 색도의 변화를 보면 저장기간의 증가에 따라 L 값은 전반적으로 감소하는 경향을 나타내었으며, 특히 신선절단 사과에서 21℃에 저장한 대조구는 6일 이후에 매우 큰 폭으로 L 값이 감소하였으며, 백년초 추출물을 처리한 구는 상대적으로 감소폭이 적음을 확인할 수 있었다. 21℃에 저장한 신선절단 상추의 경우도 대조구는 4일째 저장부터 두드러지게 L 값이 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, 상대적으로 백년초 추출물 처리구는 L 값의 변화가 적어 갈변 저해 효과를 보이는 것으로 나타났다. 신선절단 사과의 a 값은 저장 초기에 모두 음의 값을 나타내었으나 무처리구 (21℃)의 경우 4일째부터 양의 값을 나타냄으로써 갈변이 일어나고 있으며 상대적으로 백년초 추출물 처리구는 갈변이 억제됨을 확인할 수 있었다. 관능검사결과 4℃에서 7일간, 21℃에서 3일간 저장한 신선절단 사과는 200 mg/mL 백년초 추출물 처리구가 색 항목에서 유의적으로 높은 점수를 받아 변색이 적게 일어났음을 알 수 있었으며, 신선도 항목에서도 100, 200 mg/mL 처리구가 다른 처리구에 비해 유의적으로 신선도가 높게 유지되고 있음을 알 수 있었다. 외관품질에서도 백년초 추출물 처리가 신선절단 사과의 외관품질을 잘 유지하는 것으로 나타났다. 신선절단 상추도 사과보다 유의적인 차이는 적었지만 백년초 추출물 처리구의 품질이 더 우수한 것으로 나타나 S. aureus의 증식억제 뿐만 아니라 신선편의식품의 품질향상에도 매우 유용한 천연 항균제로서 역할을 할 것으로 기대된다. A total of 345 samples of minimally processed vegetables were acquired at a department store, a local supermarket, and a restaurant in Seoul, Korea. Samples were tested for microorganism distributions and for the presence of pathogenic bacteria. The aerobic mesophilic counts ranged between 2.0 and 9.7 log CFU/g, with the highest count recorded from the sprouts. Counts of psychrotrophic microorganisms were as high as those of the mesophilic microorganisms. Total coliform populations between 1.0 and 8.8 log CFU/g were found in 98.3% of the samples. Microbiological counts for fresh-cut fruits were very low. Sprouts were highly contaminated with microorganisms and showed a high incidence of Escherichia coli and Clostridium perfringens. Salmonella species and Listeria monocytogenes were detected in 1.5% and 0.3% of samples, respectively. E. coli O157:H7 and Yersinia enterocolitica were not detected in any of the samples. Staphylococcus aureus has long been recognized as an important pathogen in food-borne disease in the world. Minimally processed vegetables and sprouts are often contaminated with enterotoxigenic strains of this bacterium. Of 345 examined samples, 40 samples (11.6%) were contaminated with S. aureus. A total of 25 enterotoxigenic S. aureus strains were biotyped ,and their resistance to antibiotics was examined. Most isolated strains produced Staphylococcal enterotoxin A (SEA) (n=23) followed by Staphylococcal enterotoxin I (SEI) and Staphylococcal enterotoxin G (SEG) and mainly belonged to the human biotype (88%). At least 96.0% of the analyzed strains showed antibiotic resistance properties, while 56% of the analyzed strains exhibited multiple antibiotic resistance to the antibiotics tested. Two of the analyzed strains were resistant to methicillin. Moreover, a strain which had multi- resistance to 6 antibiotics was found. The results indicate that enterotoxigenic, antibiotic-resistant strains of S. aureus are widely proliferated in minimally processed vegetables and sprouts. Antibacterial activities of Opuntia ficus-indica extract on S. aureus in vitro were investigated. Opuntia ficus-indica extract at various concentrations were prepared in distilled water (DW) or Brain Heart Infusion (BHI) broth. S. aureus were inoculated in each sample and incubated at 21 and 4℃ for 1, 4, 8, 24 hr (Distilled water) and 1, 3, 5 days (BHI broth). DW results showed that Opuntia ficus-indica extract 50 mg/mL treatment reduced S. aureus by 2~3 log CFU/g. BHI data indicated that the number of viable S. aureus was reduced significantly with increasing Opuntia ficus-indica extract and no S. aureus remained when cultured with 100 mg/mL for 3 days at 21 and 4℃. Opuntia ficus-indica extract make morphological change of Raw 264.7 cells, and there was significant decreased S. aureus. And further nitric oxide (NO) production was decreased within Raw 264.7 cells. Fresh-cut apples and lettuces were inoculated with S. aureus and imersed for 10 min with Opuntia ficus-indica extract. fresh-cut apples and lettuces were packaged and stored at 4, 21℃ for 10 days at 4, 21℃. Viable cell count was noticeably reduced by 2-4 log CFU/g after treated with 50 mg/mL Opuntia ficus-indica extract and no S. aureus remained when treated with 100-200 mg/mL at 2, 4 days. Also fresh-cut apples and lettuces treated with Opuntia ficus-indica extract presented peroxidase activity inhibition that, in the case of 100-200 mg/mL Opuntia ficus-indica extract, showed 20-50% peroxidase activity compared with controls. L value were decreased and a value was increased during storage of fresh-cut apples and lettuces. fresh-cut apples treated with 100-200 mg/mL Opuntia ficus-indica extract showed lower changes than control in L and a value. In sensory evaluation, the fresh-cut apples and lettuces treated with Opuntia ficus-indica extract showed higher score in color, freshness and visual quality than controls Therefore, the Opuntia ficus-indica extract showed their strong antimicrobial activity against enterotoxigenic S. aureus and these results suggest that Opuntia ficus-indica extract could be used as a natural food preservative.

식품 및 사람 손에서 분리된 Staphylococcus aureus의 독소유전자 분석 및 항생제 내성 분석

김혜란 중앙대학교 대학원 2008 국내석사

본 연구는 국내 식품 중 식중독 주원인균인 Staphylococcus aureus의 오염실태를 파악하고, 식품과 사람 손 분리주의 특성을 비교․연구하기 위하여 Staphyloco- ccal enterotoxin의 오염도와 toxin genotype, 항생제 내성균 오염실태 및 내성패턴, 동일 toxin type의 분리주로 PFGE 분석을 실시하였다. 최근 5년 간(2001~2006) 수집 된 817건의 식품 시료 중 145주 17.7%에서 S. aureus가 검출되었고, 이 중 가공된 식품 시료에서 539건 중 85주 15.8%, 비가공된 식품 시료의 경우 313건 중 60주 19.2%에서 S. aureus가 오염되어 있었다. PCR을 이용하여 S. aureus의 toxin genotype을 분석하였다. 식품 분리 31주 중 16주인 51.6%, 손 분리주 18주 중 8주인 44.4%에서 독소 유전자가 확인되었으며, 이 중 SEA형이 각각 82%, 87.5%로 가장 많이 나타났다. 식품 및 손 분리주는 penicillin과 ampicillin에 가장 높은 내성률을 나타내었고 전체적인 항생제 내성률은 손 분리주가 식품분리주 보다 약간 높게 나타났다. 식품 분리주에서는 MRSA가 없었으나 손 분리주에서는 1균주 발견되었다. 식품 및 손 분리주 중 가장 많이 나타난 내성패턴 유형은 penicillin과 ampicillin 두 종류에 내성으로 나타났다. 식품 분리주 및 손 분리주의 다제 내성균은 각각 3.2%, 27.8%가 발견되었다. 동일 SEA형을 지닌 식품과 사람손 분리주간의 PFGE유형이 모두 상이한 결과를 나타내어 유전적 유의성은 확인되지 않았다. 이러한 결과로 국내에는 식품 및 일반인 손에 주로 SEA형의 독소유전자가 오염되어 있었고, 손 분리주가 식품 분리주보다 더 높은 항생제 내성률을 지니고 있어 이는 앞으로 식품 제조 시 손에서 식품으로의 오염 방지 및 항생제 내성균 모니터링에 대한 연구에 활용 될 수 있을 것이다. The purposes of this study are to find out the pollution of Staphylococcus aureus, which is a germ that causes food poisoning, in the foods of Korea, to compare food isolates with hand isolates and to analyze their characteristics. In order to do so, analyzed to the pollution level of Staphylococcal enterotoxin, toxin genotype, pollution of resistant bacteria, resistance pattern, and Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) was analyzed for the isolates of the same toxin type. Among 817 food samples collected for the past five years (2001~2006), S. aureus was detected from 145 isolates (17.7%). S. aureus was polluted in 85 isolates (15.8%) out of 539 processed food samples as well as 60 isolates (19.2%) out of 313 non-processed food samples. The toxin genotype of S. aureus was analyzed by using PCR. Toxic genes were verified from 16 (51.6%) out of 31 food isolates as well as 8 (44.4%) out of 18 hand isolates. The SEA type accounted for 82% and 87.5% and was the most. The food and hand isolates had highest resistance rate for penicillin and ampicillin. The overall tolerate rate of antibiotics was slightly higher in the hand isolate than the food isolate. The food isolate did not have MRSA, but one MRSA was found from the hand isolate. As for the type of resistance pattern, resistance against both penicillin and ampicillin occurred most in the food and hand isolates. 3.2% and 27.8% of the multi-drug resistant bacteria were found from the food and hand isolates. The PFGE type of the food isolate were different from that of the human hand isolate. The two isolates had the same SEA type. Hereditary differences were not verified. Foods and Human hands are polluted with mainly SEA-type toxic genes in Korea. The antimicrobial resistance rate of the hand isolate was higher than that of the food isolate; thus, these results will be able to be used to prevent foods from being polluted by hands and to research the monitoring of resistant bacteria.

저출력레이저조사가 Staphylococcus aureus에 감염된 창상에 미치는 영향

이필연 檀國大學校 1996 국내박사

저수준레이저를 이용하여 창상이나 병소의 치유과정에 대한 효과를 조사하기위하여 많은 연구가 시행되었다. 연구에 의하면 갈륨비소 레이저광이 생체자극효과를 가진다고 하며, 저수준레이저를 조사하면 단백질과 핵산(DNA) 합성을 자극하여 치은섬유아세포의 증식을 촉진한다고 보고하였다. 외상병소나 근육병소의 치료에 사용된 레이저치료법에 관한 관심이 점증함에 따라 저수준레이저요법(LLLI)의 치유효과를 설명하기위하여 분자생물학적수준의 연구를 시행하기에 이르렀다. 보고에 의하면 Mutans Streptococcide는 LLLI를 사용시 증식이 촉진되며, 다른 세균에서도 유사한 증식효과가 나타날 것이라고 주장하였다. 그러므로 LLLI가 피부감염을 야기하는 가장 흔한 원인인 Staphylococcus aureus도 마찬가지로 증식이 촉진되는지를 조사해볼 필요가 있으며, 또한 감염과 같이 특정 병적 상태에서의 저수준레이저광의 효과는 아직까지 명확하게 밝혀져 있지 않았다. 그러므로 본 연구의 목적은 첫째, Staphylococcus aureus의 증식에 대한 저수준레이저광의 효과를 조사하는 실험이며, 둘째 Staphylococcus aureus로 감염된 피부창상에 대한 저수준레이저광의 효과를 판정하는데 있다. 34개의 Staphylococcus aureus 배양표본을 사용하여 48시간의 세포주기동안 조사기간과 조사시간, 그리고 레이저 펄스(laser pulse)형에 따라 3가지 실험을 시행하여 증식에 가장 효과적인 상태와 가장 비효과적인 상태의 갈륨비소 반도체 레이저펄스를 결정하였다. 이후 지름 약 6mm의 개방창상을 44마리 백서의 양측 대퇴부에 형성하여 모든 창상에 S. aureus를 감염시켰다. 모든 표본은 펄스형과 조사방법(중앙조사법과 주변조사법)에 따르는 실험을 하기 위하여 4가지로 분류하였다. 각 백서의 양측 창상중 하나는 1, 3, 5, 7일 마다 각 실험의 방법에 따라 레이저를 조사하고 실험동물의 다른 창상은 대조군으로서 사용하였다. 모든 창상의 면적은 실험 1, 3, 5, 7일째에 일정한 거리에서 사진촬영하여 면적계를 이용, 측정한 후 통계적인 의의를 조사하였다. 본 연구의 결과는 저수준레이저는 특정 조건하에서 S. aureus의 증식을 촉진하였다. 그러나 S. aureus에 감염된 창상을 저수준레이저로 조사시 치유가 촉진되었다. 중앙조사법과 주변조사법에 의한 창상치유효과는 통계적인 의의가 보이지 않았다. 따라서 결론적으로 S. aureus에 감염된 창상에 직접 또는 간접이든 pulse의 종류에 관계없이 조사하는 경우 치유효과가 나타나는 것은 정상주위 조직의 LLLI 자극효과가 염증의 확산을 억제한다고 말할 수 있다. Many studies, using low level laser, have been performed to investigate the influence of laser irradiation on the healing process of wounds or lesions. It is claimed the infrared GaAs laser has a biostimulative effect. It has been proposed that the low reactive level laser irradiation(LLLI) may stimulate protein and DNA synthesis to accelerate the proliferation of gingival fibroblasts. The increasing interest in laser therapy applied in the healing of post-traumatic lesions and myopathies has recently stimulated several experiments designed to investigate the molecular basis for explaining therapeutic effects of LLLI. It is suggested that Streptococcus mutans could be stimulated by LLLI, and similar modulation could potentially occur in the other bacteria exposed to LLLI. It is, therefore, necessary for us to study whether LLLI has also positive effects on the proliferation of Staphylococcus aureus known as a common cause of skin infections. In addition, some studies are required to investigate the influence of LLLI on the healing process of skin wounds infected with Staphylococcus aureus, because the effect of LLLI under pathologic abnormal conditions such as an infection is still unknown. This study includes two kinds of experiments: an experiment for the effect of LLLI on the proliferation of Staphylococcus aureus and experiment for the influence of LLLI on the healing process of skin wounds infected with Staphylococcus aureus. Thirty four samples of Staphylococcus aureus for 48 hours of cell cycle were used and 3 experiments were performed according to the irradiation time, the irradiation interval and the pulse type to investigate the most and least proliferative pulses of LLLI (GaAs semiconductor laser). Open wounds of about 6 mm in diameter are formed on both right and left gluteal regions of 50 rats and then Staphylococcus aureus were inoculated on all wounds. All animals divided into the 3 experimental groups to compare using Repeated measures ANOVA test: the peripherally irradiated wound and non irradiated wound, the centrally irradiated wound and peripherally irradiated wound, and the centrally irradiated wound with the most proliferative pulse and peripherally irradiated wound with the least proliferative pulse. Irradiations were performed and all wound areas were measured by photographing the wounds from a constant distance on the 1st, 3rd, 5th,and 7th day. LLLI increased the growth of S. aureus under specific condition using P13(6,000 Hz, 14 mW average output power, 4 hour interval, 2 min irradiation: 29.62 mJ/cm^2). Nontheless, when LLLI was irradiated in the infected wound, the healing of wound was accelerated. Comparing the healing effects of central and peripheral irradiations, there was no significant difference between the effects of two irradiations. It can be, therefore suggested that the biostimulation effect in the inferior tissue of wound should be more effective to control the wound than that in the lateral tissue of wound. It is beleived that central irradiation is more recommendable to treat the infected wound.

상추와 재배환경 유래 포도상구균 독소유전자와 항생제 감수성에 관한 연구

서승미 전북대학교 일반대학원 2021 국내석사

This study was undertaken to analyze microbiological characteristic of Staphylococcus spp. isolated from lettuce and cultivation environment and to confirm enterotoxin genes and antibiotic resistance of Staphylococcus aureus. 113 samples were collected from Ⅰ, Ⅱ and Ⅲ regions (8 lettuce farms) from Jeollabuk-do in February 2020 to October 2020. The total aerobic bacteria was in range of 4.1 to 6.6 log CFU/g for lettuce, 6.2 to 7.4 log CFU/g for soil, 5.4 to 8.5 log CFU/g for compost and 3.2 to 4.6 log CFU/100 mL for irrigation water. The coliforms of lettuce were detected in 22 of 37 samples, in range of 1.8 to 2.4 log CFU/g, soil were detected in 38 of 42 samples, in range of 2.5 to 3.8 log CFU/g and irrigation water were detected in 10 of 23 samples, in range of 1.8 to 2.1 log CFU/100 mL. S. aureus was in range of 2.0 to 3.1 log CFU/g for lettuce and 2.3 log CFU/100 mL for irrigation water. Fifty-seven of S. aureus isolated from lettuce and cultivation environment were investigated on the characteristics of enterotoxin including six toxin (sea, seb, sec, sed, see and tsst-1) genes. In case of enterotoxin production, 27 strains isolated from lettuce and irrigation water produced sea genes. Enterotoxin seb, sec, sed, see and tsst-1 were not detected in these isolates. The patterns of antibiotic resistance against 13 antibiotics were examined for 97 isolate of Staphylococcus spp. isolated from 113 samples. Of the 97 isolates of Staphylococcus spp., it consist of 57 S. aureus, 2 Staphylococcus lentus, 11 Staphylococcus sciuri, 13 Staphylococcus warneri and 14 Staphylococcus xylosus. Among 57 isolates of S. aureus, 40 isolates (70.2%) showed the resistance to at least one kind of antibiotics and 6 isolates (10.5%) showed the multi-drug resistance to 3 different types of antibiotics. As a result, this study provides important background information on the microbiological characteristic and antibiotics response of Staphylococcus spp. isolated from lettuce and cultivation environment.

임상검체에서 분리된 Staphylococcus aureus의Panton-Valentine Leukocidin 유전자에 관한 연구

권미애 부산가톨릭대학교 보건과학대학원 2007 국내석사

Staphylococcus aureus (S. aureus)는 병원 감염과 지역사회 감염을 일으키는 주요 원인균으로 Panton-Valentine leukocidin (PVL), coagulase, enterotoxin, toxic shock syndrome toxin-1 (TSST-1), exfoliatins 등의 많은 virulence factor를 생산하여 강한 병원성을 가진다. Panton-Valentine leukocidin (PVL)은 S. aureus가 생산하는 cytotoxin으로 백혈구 파괴와 조직괴사를 일으키는 매우 강력한 독소이다. 또한 주로 피부 및 연조직 감염과 관련이 있고 최근 치사율이 높은 괴사성 폐렴과의 연관성도 알려져 있으며 S. aureus에 의한 지역사회 감염 여부를 진단하는 주요 지표로 이용되고 있는 독소이다. 본 연구에서는 2005년 3월부터 8월까지 부산시내 종합병원으로부터 분리된 S. aureus 170균주에서 PVL 생성 유전자의 유무를 확인하였다. 그리고 PVL 양성 균주와 methicillin 내성균과의 상관성, coagulase serotype과 같은 역학적 지표들과의 연관성 여부에 관한 연구를 수행하였다. S. aureus 총 170균주 중 PVL 양성 균주는 26주(15.3%)로 확인되어 높은 양성률을 나타내었다. 검체별로는 전체 양성 검체 26건 중 ear discharge에서 13주(50%)가 검출되었다. 전체 170균주 중 methicillin-resistant S. aureus (MRSA)는 109균주이었고, methicillin-susceptible S. aureus (MSSA)는 61균주로 이들 균주간의 PVL 양성률은 각각 14.7%(16주/109주), 16.4%(10주/61주)로 나타나 MRSA와 MSSA 간의 유의한 차이는 없었다. PVL 양성 26균주에 대한 coagulase 혈청형 시험 결과는 coagulase serotype Ⅴ (9주, 34.6%)가 가장 많았으며, 다음으로 serotype Ⅱ (6주, 23.1%), serotype Ⅶ (5주, 19.2%), serotype Ⅳ (4주, 15.4%), serotype Ⅲ (1주, 3.8%) 순으로 나타났다. 본 연구의 결과에서 나타난 PVL양성 균주 중 coagulase serotype Ⅴ의 높은 검출은 새로운 유행 균주(epidemic strain)의 출현과 지역사회 감염 황색포도상 구균(community-associated S. aureus)의 가능성을 추정해 볼 수 있다. Staphylococcus aureus (S. aureus) is one of the most frequently isolated pathogens in hospital routine and community acquired infection. It produces numerous virulence factors, including the Panton-Valentine leukocidin (PVL), coagulase, enterotoxin, toxic shock syndrome toxin (TSST-1) and exfoliative toxins. S. aureus isolates carrying the genes that encode PVL have been responsible for recent outbreaks of severe invasive diseases in the world. PVL is a pore forming cytotoxin that targets human and rabbit mononuclear and polymorphonuclear cells. PVL positive strains are associated with severe necrotizing community-acquired pneumonia. To determine the frequency of PVL genes-positive S. aureus, 170 strains of S. aureus isolated from clinical sources in Busan, 2005 were analyzed by polymerase chain reaction amplification and also investigated the relationship between methicillin resistance of strains and coagulase serotype for epidemiological purpose. Twenty six (15.3%) of the 170 strains were PVL genes-positive and most were associated with ear infections (13/26, 50%). Among the 26 PVL genes-positive strains, 16 (14.7%) of the 109 methicillin-resistant S. aureus (MRSA) and 10 (16.4%) of the 61 methicillin-sensitive S. aureus (MSSA) carried the PVL genes. There was no significant difference of PVL genes carriage between the MRSA and MSSA strains. The most prevalent coagulase in PVL genes-positive strains was coagulase serotype Ⅴ (9/26, 34.6%) and followed by serotype Ⅱ (6/26, 23.1%), Ⅶ (5/26, 19.2%), Ⅳ (4/26, 15.4%), and serotype Ⅲ (1/26, 3.8%). These results suggest that high prevalence of the PVL genes carriage with coagulase serotype Ⅴ in S. aureus isolates from clinical sources may be a part that allowed community associated strains to emerge and cause a severe disease in humans.

Staphylococcus aureus에 대한 아로마 오일의 항균 효과 비교 연구

정영훈 建國大學校 産業大學院 2004 국내석사

본 논문은 Aroma Therapy의 주체인 Essential oil을 이용하여 Staphlococcus aureus(황색 포도상 구균) 미생물에 대한 Aroma Essential oil의 항균 효과를 조사하였다. 우리 주변에서 흔히 볼 수 있고 식중독을 비롯하여 여러 가지 감염증을 일으키는 병원균으로 S. aureus는 사람의 손, 호흡기, 물건에 의해 전파되며, 농양이나 종기를 유발하고, 림프나 혈관을 통해 다른 부위로 감염되는 세균의 일종이다. Essential oil은 최근 들어 치유적 가치가 인정되면서 Aromacology, Sclentiffic Aroma Therapy로 정통의학에서도 관심이 확대되고 있는 분야이기도 하다. 그들의 약리적 효능 중 고대로부터 가장 많이 활용되었던 항균 효과를 이용하여 S. aureus의 세균 증식 억제에 어느 정도 효력이 있는지 측정하였다. Aroma Essential oil(tea-tree, thyme, mdjoram, Rose등)을 설정하여 각 오일의 원액카 희석액을 S. aureus 배양시 Paper disc 법으로 항균 효과를 조사하였다. 실험 결과 원액을 가지고 실험 하였을 때와 희석액으로 실험하였을 때 11종의 오일에서 항균 효과가 나타났으며, 특히 Tea-tree, Rosemary, Marjoram, Thyme, Geranium은 매우 강력한 항균 효과를 보여 주었다. 또한 Thyme, Franckincense, Pine, Clary sage, Lavender 오일들은 오히려 50% 희석액에서 더 강한 살균력이 나타나는 의외의 반응을 보이기도 하였다. 그런가 하면 거의 살균력이 없는 것도 있었는데 Mandadarin, Jasmin, YlangYlang, Rose 오일은 원액과 희석액 도두에서 똑같이 저해능 없었으며, 주로 에스테르 계열의 달콤한 향기가 있는 오일들이였다. 대조군으로 실험한 3% Phenol과 항균 효과 비교시, Tea-tree는 약 4.5배, Marjoram 3.3배, Rosemary 3.2배, Lavender 2.9배의 항균 효과가 입증되었으며, 또한 항균성이 높은 Tea-tree, Rosemary, Marjoram, Thyme, Geranium오일들은 Phenol 외에 알코올(Alcohols), 테르펜(Terpenc), 옥사이드(Oxides) 계열의 성분들이 공통적으로 함유되어 있었다. 증발을(휘발성)과 항균력과의 관계는 휘발성이 낯은 것일수록 항균력이 낮았으며, 잘 휘발되는 성질의 것이 항균력도 높게 나왔다. In this thesis, the antibacterial effects of Aroma Essential oils against a microorganism, Staphylococcus aureus, were compared and experimented by using Essential oils, which are the subject of aroma therapy. S. aureus is a pathogen which gives rise to various infectious diseases such as food poisoning, which can often occur around us. It is conveyed by our hands, respiratory organ and things, causes abscess or furuncle and is infected to other parts through lymph ducts or blood vessels. As recently the therapeutic value of Essential oils are getting recognized, the interest in them is extended and developed to the medical areas, which are Aromacology and Scientific Aroma Therapy. The antibacterial effect, which has been one of the most useful pharmacological effects from the ancient times, was used to measure how much it could control the bacterial proliferation of S. aureus. As an experimental method, 16 kinds of Essential oil (tea-tree, thyme, majoram, rose and so on) were selected. After S. aureus was cultivated respectively in crude liquid and diluted Essential oil (50% solution), data were incubated with clear zone occurred in 24 hours on paper disc method. according to the result of the experiment, when each experiment was carried out with crude liquid and 50% diluent, 11 kinds of oil showed the antibacterial effect. Especially, tea-tree, rosemary, marjoram, thyme and geranium showed very strong antibacterial effects while thyme, franckincense, pine, clary sage and lavender oils showed the stronger sterilization ability in the 50% diluent. On the other hand, mandarin, jasmin, ylang ylang and rose oils seldom showed any sterilization ability, that is, they did not have an inhibition ability in both crude liquid and 50% diluent. They were usually esters and had sweet flavors. when the antibacterial effect of 3% phenol as a control group was compared, that of tea-tree showed about 4.5 times, marjoram 3.3 times, rosemary 3.2 times and lavender 2.9 times to it. Tea-tree, rosemary, marjoram, thyme and geranium oils which had high antibacterial effects included the components of alcohols, terpene, oxides in addition to phenol in common. In the relationship of the evaporation(volatility) rate and the antibacterial ability, oils with the lower volatility showed the lower antibacterial ability and oils with the better volatility showed the higher antibacterial ability. Taken together, the data presented in this thesis may provide the evidence that Aroma therapy can be used in the field of replacement therapy.

Development of a novel chimeric lysin(gCHAP-LysK) against Staphylococcus aureus

박진미 서울대학교 대학원 2019 국내석사

Staphylococcus aureus는 사람, 가축 및 가금의 다양한 감염증을 초래하며 다양한 항생제 내성을 갖는 다약제 내성균의 증가로 대체 항생제 개발이 활발히 이루어지고 있다. 이들 중 박테리오파지에 의해 생성되는 리신(lysin)은 세포벽을 구성하는 두꺼운 펩티도글리칸(peptidoglycan) 층의 화학 결합을 끊어주는 효소 활성으로 세포벽을 약화시켜 살균 효능을 나타낸다. 박테리오파지 리신은 역할에 따라 효소 활성 및 세포벽 결합 도메인으로 구성되어 있으며 효소 활성 도메인은 한 개 또는 두 개 효소 기능을 갖는 경우가 대부분이다. 각각의 효소 활성 및 세포벽 결합 부분은 모듈로 존재하여 개별 분리해도 고유의 활성을 보이므로 이들을 다양하게 조합하여 활성이 높고 살균 범위도 넓은 다양한 인공 리신이 개발되고 있다. 최근 활발한 게놈 연구를 통해 S.aureus의 게놈 상에 다양한 리신 유전자뿐만 아니라 세균 분열 시 작용하는 자가 리신(autolysin) 유전자도 알려져 있어 이들의 모듈을 조합하여 새로운 인공 리신을 개발할 수 있다. 본 연구에서는 S.aureus의 강력한 용균 파지인 ϕK 리신 유전자의 cysteine, histidine-dependent amidohydrolases/peptidase (CHAP) 또는 amidase (Ami) 모듈을 모든 S.aureus의 게놈 상에 존재하는 CHAP 또는 Ami 모듈로 치환함으로써 2개의 인공 리신을 작출하였다(gCHAP-LysK 및 gAmi-LysK). 대장균 S30 추출물을 기반으로 한 시험관전사/번역 (in vitro transcription/translation, IVTC/TL)과 집락 감소 효능 시험을 이용하여 인공 리신의 소 유방염 유래 S.aureus (PMB4)의 살균 활성을 평가한 결과 gCHAP-LysK의 살균 활성을 확인하였다. 또한 인공 리신을 대장균에서 발현하고 Ni-NTA chromatography로 정제하여 PMB4에 대한 살균 효능을 집락 감소 및 탁도 감소 효능시험으로 검사한 결과 살균 효능을 재확인 하였다. 따라서, 시험관전사/번역법은 대장균 발현 과정 없이 다양한 인공 리신의 살균 효능을 시험관에서 신속하게 동정하는데 사용될 수 있으며 새로운 인공 리신인 gCHAP-LysK는 소 유방염의 주요 원인인 S.aureus에 대한 항생제 후보 물질로서 유용 할 것으로 기대된다 The increasing prevalence of antibiotic-resistant isolates of Staphylococcus aureus has led to develop alternative antibiotics to treat these drug-resistant pathogens. As alternative antibiotics the lytic enzymes (lysins) produced by bacteriophages weaken the integrity of thick peptidoglycan layer in the cell wall and induce destruction of bacterial body. The bacteriophage lysins are composed of two modular domains that are catalytic domain and cell wall binding domain. To date various chimeric lysins with potent antibacterial efficacies have been generated by shuffling bacteriophage lysin modules from different origins. In the present study, two chimeric lysins were generated by exchanging peptidase or amidase module of ϕK lysin with that of genomic autolysin gene, SsaA homologe or atl, of S. aureus (gCHAP-LysK and gAmi-LysK). The antibacterial activity of chimeric lysins was screened by using Escherichia coli S30 extract-based in vitro transcription and translation (IVTC/TL) and colony reduction test. The result show that the CFU of the codop-LysK- and gAmi-LysK-treated PMB4 did not decrease, but the CFU of gCHAP-LysK show a steep decrease after 30 or 60 min of incubation. The gCHAP-LysK, which confirmed the antibacterial activity by screening, was expressed in E. coli and purified by Ni-NTA chromatography. Purified gCHAP-LysK also reduced turbidity to colony forming units and Staphylococcus aureus (PMB4, strains from bovine mastitis). Thus, the IVTC/TL method can be used for rapid identification of antibacterial activity of candidate chimeric lysins, and the novel chimeric lysin, gCHAP-LysK may be useful as a candidate antibiotics against bovine mastitis S. aureus.

Epidemiologische und molekulare untersuchungen zur biofilmbildung in Staphylococcus epidermidis und Staphylococcus aureus

조성학 Bayerischen Julius-Maximilians-Universitat 2003 해외박사

Staphylococcus aureus und Staphylococcus epidermidis gehoren zu den haufigsten Erregern nosokomialer Infektionen bei immunsupprimierten Patienten. Gleichzeitig bilden diese Bakterien einen wesentlichen Teil der gesunden Hautflora des Menschen. Bisher ist wenig daruber bekannt, ob es Unterschiede in der genetischen Ausstattung zwischen klinischen und kommensalen Isolaten gibt und welche Faktoren zur Etablierung von Staphylokokken im Hospitalmilieu beitragen. Die Ergebnisse der vodiegenden Arbeit zeigen, daß die Fahigkeit zur Biofilmbildung offensichtlich ein wesentliches Merkmal pathogener Staphylokokken ist. Die Expression dieses Virulenzfaktors ist dabei hochvariabel und hangt von der genetischen Ausstattung der Stamme mit dem fur die Biofilmbildung verantwortlichen ica-Operon, bestimmten Umweltfaktoren und dem Einfluß von Insertionssequenzen ab. In einer epidemiologische Untersuchung wurde gezeigt, daß in S. epidermidis das ica-Operon haufiger in klinischen als in kommensalen Stammen vorkommt. Der uberwiegende Teil dieser ica-positiven Stamme bildete phanotypisch einen Biofilm aus. Im Unterschied dazu enthielten alle untersuchten S. aureus-Stamme, unabhangig von ihrer Herkunft, das voHstandige ica-Gencluster, wobei jedoch keiner dieser Stamme unter Laborbedingungen einen Biofilm bildete. Durch subinhibitorischen Konzentrationen bestimmter Antibiotika bzw. durch Osmostress ließ sich die Biofilmbildung in 30 Prozent der S. aureus-Stamme induzieren. Ebenso konnte in ica-positiven S. epidermidis-Stammen die Biofilmbildung dirch diese Umweltfaktoren stimuliert werden. Die Studie ergab auch, daß es einen Zusammenhang zwischen der Biofilmbildung, der Antibiotikaresistenz und dem Vorkommen der Insertionssequenz IS256 gibt. So war IS256 signifikant haufig in klinischen S. epidermidis und S. aureus-Stammen nachweisbar, wahrend es keinen Unterschied im Auftreten von IS257 zwischen klinischen und saprophytaren Isolaten gab. Die IS256-positiven S. epidermidis-Stamme wiesen uberdurchschnittlich oft das ica-Qperon auf und waren gegen mindestens zwei Antibiotika gleichzeitig resistent. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß IS256 an der Phasenvariation der Biofilmbildung in vivo beteiligt ist. Bei einem klinischen S. epidermidis-Stamm, der yon einem Patienten mit einer Katheter-assoziierten Harnwegsinfektion isoliert wurde, wurde die Insertion des Elementes im icaC-Gen nachgewiesen, was in einem Biofilm-negativen Phanotyp resultierte. Subkultivierung der Insertionsmutante fuhrte nach wenigen Passagen zur Ausbildung eines Biofilms. Die Nukleotidsequenzierung ergab die vollstandige Exzision von IS256 aus dem icaC-Gen einschließlich der duplizierten Zielsequenz von sieben Basenpaaren. Diese Daten stimmen vollstandig mit den zuvor in einer in-vitro-Studie erhaltenenen Ergebnissen uberein und sie zeigen, daß IS256 die Expression des ica-Operons offensichtlich auch in vivo wahrend einer Infektion beeinflußt. Bei S. aureus konnte in dieser Arbeit ebenfalls eine Phasenvariation der Biofilmexpression nachgewiesen werden. Durch Mehrfachpassagen wurden aus ehemals Biofilm-negativen Einzelkolonien mehrere Biofilmproduzenten gewonnen, die auch wieder zum Biofilm-negativen Phanotyp revertieren konnten. Die DNA-Analyse mittels Pulsfeldgelelektrophorese zeigte, daß es in den varianten Stammen zu großeren DNA-Rearrangements gekommen war, die neben der variablen Biofilmbildung auch mit Unterschieden in der Expression des alternativen Transkriptionsfaktors SigmaB einhergingen. Die Nukleotidsequenzierung des sigB-Systems ergab in den Varianten mehrere Punktmutationen in den SigB-Regulatorgenen rsbU und rsbW. Dies legt nahe, daß der SigB-Genlokus einer starken genetischen Variabilitat unterliegt, die wiederum pleiotrope Effekte auf die Genexpression in S. aureus ausubt. Durch Northern-Blot-Analysen konnte allerdings gezeigt werden, daß die Biofilmbildung in den S. aureus-Varianten nicht mit der veranderten SigB-Expression in Zusammenhang steht. Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis belong to the most frequent causes of nosocomial infections in immunocompromised patients. These bacteria form an essential part of the healthy skin flora of human beings. Little is known, whether there are differences in the genetic equipment between clinical and commensal isolates and which factors contribute to the setup of staphylococci in the hospital environment. The results of the presented work show that the ability to form biofilms is an essential feature of pathogenic staphylococci. The expression of this virulence factor is highly variable and depends on the presence of the ica operon which is responsible for biofilm formation, specific environmental factors and the influence of insertion sequences. In an epidemiological investigation, it was shown that the ica operon in S. epidermidis is more often present in clinical strains than in commensal ones. The predominant part of these ica-positive strains formed phenotypically a biofilm. In contrast, all examined S. aureus contained, independent of their origin, the complete ica gene clusters, while, however, none of these strains formed a biofilm under laboratory conditions. Biofilm formation could be induced by subinhibitory concentrations of specific antibiotics or osmotic stress in 30 percent of the S. aureus strains. Also, biofilm formation could be stimulated in ica-positive S. epidermidis strains through these environmental factors. The study also revealed that there is an association between biofilm formation, antibiotic resistance and the occurrence of the insertion sequence IS256. Thus, IS256 was significantly more often detected in clinical S. epidermidis and S. aureus strains, while there was no difference in the occurrence of IS257 between clinical and saprophytic isolates. Most of the IS256-positive S. epidermidis strains carried the ica operon and were simultaneously resistant against at least two antibiotics. Furthermore, it was shown that IS256 is involved in phase variation of biofilm formation in vivo. In case of a clinical S. epidermidis strain that was isolated from a patient with a catheter-associated urinary tract infection, the insertion of the element in the icaC gene was detected resulting in a biofilm-negative phenotype. Subcultivation of the insertion mutant resulted in biofilm-forming variants after a few passages. Nucleotide sequencing indicated the complete excision of IS256 from the icaC gene including the duplicated target site sequence of seven base pairs. These data are in agreement with the results received in a recent in vitro study and show that IS256 has an influence on the ica-expression during an infection. In this study, phase variation of biofilm formation was also shown in S. aureus. After serial passages, several biofilm producers were derived from formerly hiofilm-negative single colonies which could also revert to the biofilm-negative phenotype again. DNA analysis by pulsed-field gel electrophoresis showed that in the variants large DNA-rearrangements took place. In addition to the variable biofilm production, differences in the expression of the alternative transcription factor SigmaB were observed in the variants. Nucleotide sequencing of the sigB system indicated several point mutations in the SigB regulatory genes rsbU and rsbW of the variants. This implies that the SigB gene locus is subject to a strong genetic variability that results, in turn, in pleiotropic effects on gene expression in S. aureus. However, Northern blot analysis revealed that the biofilm formation in the S. aureus variants are not associated with the varying SigB expression.

慶北 北部地域 動物 및 사람으로부터 分離된 Staphylococcus aureus 菌의 抗菌劑 耐性과 分子生物學的 特性

김신 安東大學校 大學院 2003 국내박사

This studies was conducted to investigate antimicrobial resistance and molecular biological characteristics of Staphylococcus aureus (S. aureus) from animals and S. aureus from human in a northern areas of Gyeongbuk province. The first study was conducted to investigate the antimicrobial resistance of S. aureus isolated from animals (bovine mastitic milk, chickens, Korean native cattle, Korean native goats, pigs, dog and mouse) in a northern areas of Gyeongbuk province. A total of 149 strains of S. aureus were isolated from bovine mastitic milk (80 strains), chickens (36 strains), Korean native cattle (17 strains), mouse (10 strains), Korean native goats (3 strians), pigs (2 strians), dog (1 strain). As a results of antimicrobial resistance test by using 14 antimicrobial agents, all isolates (17 strains) from Korean native cattle was resistant to penicillin and ampicillin, 88% to lincomycin, 76% to tetracycline. 58.8% of isolates from bovine mastitic milk were shown resistance to penicillin and ampicillin, 19% to gentamicin, 6% to tetracycline, respectively. Two methicillin resistant S. aureus (MRSA) were isolated from bovine mastitic milk and revealed the multi-drug resistance. 72% of isolates from chicken were shown resistance to tetracycline, 58% to penicillin and ampicillin, 42% to streptomycin, 31% to lincomycin, 25% to norfloxacin, 22% to gentamicin, in order. As a results of CVR test, most of S. aureus isolates (98.7%) from animals were SR types. As a results of REP-PCR, there were difference between S. aureus from animals and S. aureus from human in genetic level. In second study, 114 strains of S. aureus isolates were isolated from human clinical specimens. Antimicrobial resistance test and mec A gene PCR showed that 61.7% of the S. aureus isolated from human were MRSA. 71.9% of isolates showed resistance to tetracycline, 53.5% to ciprofloxacin, 68.4% to gentamicin. But all isolates showed no resistance to vancomycin. All MRSA isolates had more than 5 drug resistance patterns. But 9.1%(4/44) of MSSA showed more than 5 drug resistance patterns. The results of coagulase PCR-RFLP for MRSA isolates showed 5 types. Type A and type B were the major colonal strains which comprized of 70.4%(50 strains) and 15.5%(11 strains), respectively and other types were in small numbers. As a results of PFGE analysis for 30 strains of S. aureus (27 strains of MRSA fron human, 2 strains of MSSA from human, and 1 strain of MRSA from bovine mastitis), there was no relationship between one MRSA from bovine mastitis and 27 strains of MRSA from human. As a results of CVR test, 59.6% of isolates were SR type, 32.5% WR type, and 7.9% DR type. This result showed that there were difference in CVR test between S. aureus from animals and S. aureus from human. In third study, 40 strains of S. aureus were isolated bovine mastic milk at a dairy farm in Yeong-ju city, Gyeongbuk province. As a results of antimicrobial resistance test, the S. aureus revealed 55% of isolates were resistant to ampicillin and penicillin, 7.5% to gentamicin. But 45% of isolates were sensitive to all antimicrobial agents used. In case of enterotoxin production, 56.3% of isolates produced enterotoxin D. Two strains of enterotoxin D producers produced both enterotoxin B and D. As a results of enterotoxin multiplex PCR for 9 strains which had enterotoxin genes, the 9 strains also produced enterotoxin in vivo test using suckling mouse assay. According to isolation date, 15 representative strains were selected. As a results of PFGE analysis of the 15 representative strains, 14 strains were identical. Therefore I consider the identical strains of S. aureus have caused continuously bovine mastitis in this dairy farm. If autogenous vaccine can be made by the strains, it will work well for the prevention of bovine mastitis by S. aureus. As a general conclusion, difference between S. aureus from animals and S. aureus from human were as followed. In case of antimicrobial resistance, S. aureus from animals had about 60% resistance to penicillin. But S. aureus from human had 100% resistance to it. Among 114 strains of S. aureus from human, 74 strains (64.9%) showed more than 5 drug resistance. But among 149 strains of S. aureus from animals, only 5 strains (3.4%) showed more than 5 drug resistance. 61.7% of S. aureus from human were MRSA. But only 1.3% of S. aureus from animals were MRSA. As a results of PFGE analysis, There were no relationship between 27 strains of MRSA from human and 1 strain of MRSA from bovine mastitic milk. As a results of CVR test analysis, There were much difference between S. aureus from human and S. aureus from animals. As a results of REP-PCR, there were difference in genetic characteristics between S. aureus from human and S. aureus from animals.

젖소 乳房炎 由來 Staphylococcus aureus의 遺傳的과 特性과 藥劑 耐性에 관한 硏究

임숙경 전남대학교 대학원 2000 국내박사

유방염 원인균 중 Staphylococcus aureus는 중요한 전염성 균으로 한번 감염되면 치료가 어렵고 재발율이 높기 때문에 지속적으로 발생하여 목장에 경제적으로 막대한 손실을 주고 있다. 그러나 S. aureus가 다양한 병원성 인자를 분비하여 숙주세포에 저항하는 자체방어와 무분별한 항균제 사용으로 인한 내성균의 증가로 항균제의 치료 효과가 높지 않다. 유방염 발생시 항균제에만 의존하고 있는 국내 현실을 감안해 볼 때 유방염을 방제하기 위한 새로운 접근방법이 필요한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 S. aureus에 대한 유전형을 분석하여 지역, 목장별 분포도 및 특성을 조사하여 유방염 방제 전략을 세우는 기초자료로 활용하고자 한다. 또한 포도구균 식중독의 주요 원인인 enterotoxin의 생산능과 enterotoxin을 생산하는 균주들에 대한 형별분석을 실시하여 enterotoxin 생산에 관여하는 특정형에 대한 관리로 원유에 혼입되는것을 최소화하여 위생적인 우유를 생산하고자 하며, Z-lactamase 저해제를 이용한 Z-lactam계 항균제의 효능을 조사하여 유방염 치료에 활용하고자 하였다. 전국 5개 지역 26개 목장에서 분리한 S. aureus의 유전형은 polymerase chain reaction- restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP)으로 조사하였으며, enterotoxin 생산능은 reversed passive latex agglutination(RPLA) kit와 multiplex-polymerase chain reaction으로 검출하여 enterotoxin을 생산하는 균주들에 대해 coagulase serotyping, PCR-RFLP, pulsed field gel electrophoresis(PFGE)를 병용하여 분석하였다. 또한 Z-lactamase를 생산하는 균에 대해 sulbactam과 clavulanic acid를 이용하여 최소발육억제농도와 호중구내에 감염시킨 후 세균수 감소효과를 조사하였다. 먼저 PCR-RFLP를 수행한 결과 1개의 증폭산물을 얻을 수 있었으며 증폭산물을 Alu 1 제한효소로 처리한 결과 8개 유전형으로 나타났다. 이 중 A형이 가장 높은 분포율을 나타내었으며, G형과 B형 순으로 분포하고 있었으며 전체 균주의 61.4%가 위의 3개 유전형에 속하였다. 목장별 분포도에서는 모든 유전형이 3개 목장 이상에 분포하고 있으며, 그 중 A형과 G형은 26개 목장 중 10개 목장에, H형은 9개 목장에 분포하고 있었다. 그리고 국내 대부분의 목장이 2-3개의 유전형이 분포하고 있었으며 1개 목장은 4개 유전형이 동시에 분포하고 있었다. 지역별로는 경기 지역이 B형, 충청 지역이 A형과 G형, 그리고 전라 지역에는 G형이 주로 분포하고 있었다. 각 유전형별 약제 내성 양상을 비교해 본 결과 우세아형과 소수아형간 유의성있는 차이는 없었으나 각 유전형별 내성 양상이 다소 다르게 나타났으며, 체세포수에 있어서는 F형이 다른 유전형에 비하여 높게 나타났다(p<0.05). 본 실험에 사용한 166주 중 33주가 enterotoxin을 생산하였으며, 이 중 enterotoxin A(SEA)를 생산하는 균주가 29주, enterotoxin B(SEB)를 생산하는 균주가 3주, 그리고 enterotoxin C(SEC)는 1주가 생산되는 것으로 나타났으며, 3주는 multiplex-PCR 법에서는 검출되었지만 RPLA에서는 검출되지 않았다. Enterotoxin 생산 균주에 대해 coagulase serotyping을 실시한 결과, V.I형이 23주로 가장 높게 분포하고 있었으며, II형이 4주, A,형이 3주, 그리고 III형이 1주로 나타났다. PCR-RFLP 양상은 H형이 16균주로 가장 높게 분포하고 있었으며 B형, G형이 각각 6주, 5주씩 분포하고 있었다. 또한 PFGE 분석 결과 10개의 다양한 양상을 보였으며, SEA를 생산하는 균주 중 b형이 15주이며, SEB를 생산하는 3주 중 j형이 2주로 나타났다. 3가지 방법으로 분석한 결과 16가지의 다양한 양상을 나타내었으며 판별력 지수는 0.89로 나타났다. SEA를 생산하는 균주 중 V.I:H:b clone이 34.4%(10/29)를 차지하고 있었으며 SEB는 V.I:B:j clone이 3주 중 2주로 나타났다. Enterotoxin을 생산하지 않는 균주들의 체세포수는 생산하는 균주들보다 다소 높은 것으로 나타났으며(p<0.05), hemolysin 생산능에 있어서는 유의성 있는 차이는 인정되지 않았다. Z-lactamase 저해제를 이용한 Z-lactam계 항균제의 효능을 조사하기 위하여 먼저 Z-lactamase 생산능을 조사한 결과, 전체 균주 중 59.6%가 Z-lactamase을 생산하였다. Penicillin에 대한 최소발육억제농도가 12.5 □/□. 이상의 농도에서는 1주를 제외한 모든 균주가 이 효소를 생산하였으며, 지역별로는 경상도를 제외한 4개 지역에 Z-lactamase를 생산하는 균들이 50% 이상 분포하였다. Z-lactamase를 생산하는 균주들에 대해서 Z-lactamase 저해제를 이용한 Z-lactam계 항균제의 효능을 조사한 결과 ampicillin/sulbactam과 amoxicillin/clavulanic acid 처리군이 ampicillin, amoxicillin 단독 처리군에 비해 log₂base로 2-6배의 항균제 감소효과가 있었다. 호중구내에 감염된 S. aureus에 대한 항균능을 조사한 결과 1시간, 4시간 처리시에는 대조군 및 ampicillin이나 amoxicillin 단독으로 처리한 그룹과 유의성 있는 차이가 인정되지 않았으나, 18시간 이후에는 ampicillin/sulbactam, amoxicillin/clavulanic acid 처리군 공히 ampicillin, amoxicillin 단독 처리군보다 세균수가 낮게 조사되어, Z-lactamase 저해제와 Z-lactam계 항균제를 함께 사용 함으로써 호중구내의 S. aureus에 대해서도 효능이 인정되었다(p<0.05). 본 연구의 결과를 통해 국내 젖소 유방염 유래 S. aureus의 우세아형 및 enterotoxin 생산에 관여하는 clone에 대해서 유방염 방제 및 예방대책을 수립하여 유방염 피해를 줄이고, enterotoxin을 생산하는 균들이 원유에 혼입되는 것을 최소화함으로써 보다 안전하고 위생적인 우유 및 유제품을 생산할 수 있으며, Z-lactamase 저해제의 활용으로 효과적인 유방염 치료가 가능할 것으로 기대된다. Mastitis is the disease considered most responsible for the economic losses in dairy cattle. Although mastitis is caused by a variety of bacteria, Staphylococcus aureus is recognized worldwide as one of the most common pathogens. Enterotoxin-producing S. aureus is a common cause of staphylococcal food poisoning. Raw milk containing enterotoxigenic S. aureus may prove harmful to the health of consumers. Despite intense research and control programs, the prevalence of mastitis may remains high. A better understanding of the epidemiology of S. aureus mastitis may lead to a new approach for the control of the disease. This study was conducted to investigate polymorphisms of the coagulase gene and the relatedness of the enterotoxigenic S. aureus causing bovine mastitis in Korea. One hundred sixty-six strains of S. aureus were isolated from bovine mastitic milk of 26 dairy farms, the strains were characterized for restriction fragment length polymorphism(RFLP) of the coagulase gene. A variable region of the coagulase gene was amplified using polymerase chain reaction followed by Alu I restriction enzyme digestion. A total of 8 different RFLP patterns were observed. RFLP type A, B, and G accounted 37, 31, and 34 strains of the isolates. The 3 most common types accounted for 61.4% of the isolates. Coagulase genotypes differ among geographic locations, and only a few genotypes prevail in each location. Of the 166 strains, 33 strains produced enterotoxin A, B or C. Enterotoxin A was produced by 29 strains, while enterotoxin B and enterotoxin C were produced by 3 and 1 strains. Eleven out of twenty-six dairy farms harboured enterotoxigenic S. aureus strains. For an understanding of the epidemiology of enterotoxigenic S. aureus, coagulase serotype, RFLP of the coagulase gene and pulsed field gel electrophoresis(PFGE) by cutting endonuclease Sma I are used in this study. The 4 coagulase serotype, 7 RFLP types and 10 PFGE patterns were observed. The PFGE method proved useful for subclassifying S. aureus and differentiating strains of the same RFLP type. Of the 29 enterotoxin A-producing strains, 10 strains belong to V.I:H:b clone and 2 enterotoxin B Brains V.I:E:j clone. Enterotoxins producing S. aureus from bovine mastitis were genetically diverse but the common genotype was prevailed in Korea. Production of Z-lactamase by S. aureus is one of the major mechanism responsible for the development of Z-lactam antibiotic resistance. Of the 166 isolates, 99 strains were produced Z-lactamase. In recent years, potent Z-lactamase inhibitor such as clavulanic acid and sulbactam have become available for halting the action of common Z-lactamase. In this study, the effect of Z-lactam antibiotics and Z-lactamase inhibitor was examined. For the Z-lactamase producing S. aureus strains, sulbactam and clavulanic acid had poor antibacterial activity with MICs of > 128 □/□. and ampicillin/sulbactam and amoxicillin/clavulanic acid were lowered two to six fold(log₂base) than ampicillin, amoxicillin, respectively. S. aureus organisms survived within bovine polymorphonuclear neutrophil (PMN) cells. Some antibiotics failed to killed intracellular bacteria because they could not penetrate the cell membrane and bacteria reduced growth rates. In this study, intracellular S. aureus was obtained by the bacteria mixed with PMN. After 1, 4, and 18 hours' incubation at 37℃, the mean change in log_10 viable S. aureus concentrations were calculated. There were significantly fewer viable bacteria after 18 hours' incubation in the groups containing ampicillin/sulbactam, amoxicillin/clavulanic acid than in either ampicillin or amoxicillin but this was not found in 1 and 4 hours' treatment. Ampicillin/sulbactam and amoxicillin/clavulanic acid possesse beneficial properties which induced microbicidal activity in vitro and PMN cells against Z-lactamase producing strains of S. aureus. This study could provide valuable information regarding the epidemiology and we could have treated the mastitis by Z-lactam/ Z-lactamase inhibitors effectively.