Serum Amyloid A (1-12) 섬유화 평가 및 Serum Amyloid A 섬유질과 금 나노 입자와의 상호작용

전희재 서울대학교 대학원 2019 국내석사

아밀로이드증은 비정상적인 단백질 응집체인 아밀로이드가 각종 장기에 축적되어 염증을 일으키거나 심각한 질병 및 기능장애를 일으키는 증상을 일컫는다. 대표적인 아밀로이드증에는 amyloid-β 의 응집으로 발생되는 알츠하이머 병, α-synuclein 의 응집으로 생기는 파킨슨병 등이 있다. 아밀로이드증은 크게 1차성 아밀로이드증과 2차성 아밀로이드증으로 나뉜다. 알츠하이머나 파킨슨병 같이 비정상적인 면역 글로블린의 생산으로 인한 아밀로이드의 축적을 1차성 아밀로이드증이라 하고, 염증 반응에 의한 염증성 단백질 생성 증가로 인한 아밀로이드 축적을 2차성 아밀로이드증이라고 한다. Serum amyloid A 는 2차성 아밀로이드증의 일종으로, 특히 류마티스 질환과 관련된 아밀로이드로 알려져 있다. 아밀로이드증의 발병이 점점 증가함에 따라 이러한 질병에 대한 연구가 진행되고 있다. 알츠하이머병, 파킨슨병과 달리 연구가 많이 진행 되지 않은 2차성 아밀로이드증 중 특히 Serum Amyloid A fibrils 의 형성 메커니즘에 대한 연구가 요구되는 실정이다. 이에 본 연구에서는 Amyloid fibrils 의 형성 메커니즘 관찰 및 2차적 구조적 변화를 확인하였다. 더 나아가 이러한 Amyloid fibrils 을 간단하고 혁신적인 방법으로 진단 할 수 있는 진단법 개발의 필요성을 충족하기 위하여 금 나노 입자를 이용한 진단 방법을 연구 및 개발하고자 하였다. 금 나노 입자는 단백질의 친수성 부분과 친유성 부분에 모두 잘 붙는 성질을 가지고 있고, 또한 thiol 기가 있는 아미노산을 가지는 단백질 표면에 dative bonding 을 통해 잘 결합 할 수 있다. 이러한 특성을 이용하여 Amyloid fibrils 표면에 금 나노 입자가 잘 결합하여 상호작용 할 것이라 판단하였고, detection tool 로써 활용가치가 있을 것으로 기대되었기에 연구를 진행하였다. 15 nm, 50 nm 지름을 가지는 구형 형태, 그리고 막대모양 형태의 서로 다른 세 가지 형태의 금 나노 입자를 이용하였다. 이 세 가지 다른 종류의 금 나노 입자는 사이즈에 따른 detection 정도의 차이, 모양에 따른 detection 차이를 동시에 확인하기 위해 사용되었다. Serum Amyloid A fibrils 형성 메커니즘과 단백질의 2차 구조 확인은 AFM, CD Spectroscopy, ThT Assay 를 통해 분석하였다. 형성된 Amyloid fibrils 과 세 가지 다른 종류의 금 나노 입자의 결합 여부는 TEM 으로 확인하였고, UV-Visble spectroscopy 를 이용하여 Amyloid fibrils 에 결합하여 상호작용한 금 나노 입자에 생긴 변화를 확인 하였다. 단백질이 금 나노 입자와 상호작용을 하면 입자 표면의 고유한 전자 분포에 변화가 생기는데, 이러한 현상을 Surface Plasmon Resonance (SPR) shift effect 라고 하며, 이 SPR Shift를 UV-Visble Spectroscopy 를 통해서 확인하였다. 이런 연구를 통해 질병 메커니즘에 대한 이해를 높였고, 적용분야를 확장시켰으며, 향후 진행될 후속 연구에 도움이 될 것이다. 또한, 이러한 고유하고 특이적인 변화의 모니터링을 통해, 금 나노 입자를 새로운 detection tool 로써 이용한 간단하고 혁신적인 진단 방법의 개발 가능성을 제시하였다. Amyloidosis refers to a condition in which amyloid, an abnormal protein aggregate, accumulates in various organs, causing inflammation or causing serious disease and dysfunction. Representative amyloidosis includes Alzheimer's disease caused by aggregation of amyloid-β and Parkinson's disease caused by aggregation of α-synuclein. Amyloidosis is divided into primary amyloidosis and secondary amyloidosis. Amyloid accumulation caused by abnormal immunoglobulin production such as Alzheimer's or Parkinson's disease is referred to as primary amyloidosis and amyloid accumulation due to increased inflammatory protein production by inflammatory reaction is referred to as secondary amyloidosis. Serum amyloid A is a type of secondary amyloidosis, especially amyloid associated with rheumatic diseases. As the incidence of amyloidosis increases, research is underway on these diseases. In particular, the mechanism of formation of Serum Amyloid A fibrils in secondary amyloidosis, which has not been investigated unlike Alzheimer's disease and Parkinson's disease, is required. In this study, we observed the mechanism of formation of amyloid fibrils and the secondary structural changes. Furthermore, to meet the need for the development of a diagnostic method that can diagnose these amyloid fibrils in a simple and innovative way, we have studied and developed a diagnostic method using gold nanoparticles. Gold nanoparticles can bind well to both the hydrophilic and lipophilic part of the protein and also to the surface of the protein with the thiol group. Using these properties, we determined that the gold nanoparticles would interact well on the surface of the amyloid fibrils, and they were expected to be useful as a detection tool. Three types of gold nanoparticles were used: a spherical shape with a diameter of 15 nm and a diameter of 50 nm, and a bar shape. These three different types of gold nanoparticles were used to simultaneously identify differences in detection by size and detection by shape. Serum Amyloid A fibrils formation mechanism and protein secondary structure were analyzed by AFM, CD Spectroscopy and ThT Assay. The binding of the formed amyloid fibrils to three different types of gold nanoparticles was confirmed by TEM and UV-Visible spectroscopy was used to identify changes in the gold nanoparticles interacting with the amyloid fibrils. When the protein interacts with the gold nanoparticles, unique electrons distribution on the surface of the particle were changed. This phenomenon is called the surface plasmon resonance (SPR) shift effect. The SPR shift was confirmed by UV-Visble spectroscopy. These studies have improved understanding of disease mechanisms, expanded the application area, and will be useful for further research in the future. In addition, through the monitoring of these unique and specific changes, the possibility of developing a simple and innovative diagnostic method using gold nanoparticles as a new detection tool is proposed.

Serum amyloid A1 involves amyloid plaque aggregation and aggravates memory deficits in amyloid beta abundant condition : 아밀로이드 베타가 풍부한 환경에서 Serum amyloid A1이 아밀로이드 플라크 형성과 기억력 저하에 미치는 영향

장소영 경북대학교 대학원 2017 국내석사

Alzheimer’s disease is one of the that characterized by cognitive impairment, progressive neurodegeneration and amyloid-β (Aβ) lesion. In progress of disease, inflammation known is to plays important role in neuronal death. Previous study on Serum amyloid A 1(SAA1) shows liver derived SAA1 accumulated in the brain by passed through the brain blood barrier (BBB) without damaging it. Since triggered SAA1 execrate the immune response in other disease, double transgenic mouse was generated with APP-c105 mice and SAA1-overexpression mice to examine the function of SAA1 in Aβ accumulated condition. Comparison between APP and double mice elucidate that SAA1 exacerbate amyloid aggregation and inflammation in Aβ abundant condition in brain. Followed behavior test also support the preceding result that double transgenic mice shows declined memory compared to APP mouse that only designed to express the Aβ 1-42.

자궁 수축 억제의 실패로 인한 조기 분만의 예측 인자로서 Serum Amyloid A 측정의 유용성

김영한 연세대학교 대학원 2002 국내석사

Usefulness of maternal serum amyloid A as a predictor of tocolytic failure in preterm deliveryObjective: This study is directed to determine whether the concentrations of serum amyloid A(SAA) in maternal serum could be used to predict a tocolytic failure in preterm delivery, by comparing with other factors associated with inflammation./Method: A total of 100 pregnant women from September, 2000 to August, 2001 received continuous prenatal care and underwent delivery in our hospital was enrolled in the study. Gestational age was ranged between 20 and 37 weeks. Subjects were divided into four groups (group I, no preterm labor and no premature rupture of membranes〔n=38〕; group II, premature rupture of membranes and no preterm labor〔n=12〕; group III, preterm labor and no premature rupture of membranes 〔n=34〕; Group IV, preterm labor and premature rupture of membranes〔n=16〕). The levels of SAA, CRP, ESR, and WBC count were measured in maternal serum./Results: SAA levles, CRP levels, and WBC count in patients with tocolytic failure were significantly higher than those in patients without tocolytic failure. SAA and CRP appeared to be significant factors by logistic regression analysis. From the ROC curve analysis of maternal SAA for the prediction of tocoltic failure, we set 6mg/l as a cut-off value in this study. Sensitivity, specificity, positive predictive value, and negative predictive value were 76%, 72%, 47.5%, and 90%, respectively. As for CRP, 0.59mg/dL was set as a cut-off value, and sensitivity, specificity, positive predictive value, and negative predictive value were 72%, 81.3%, 56.3%, and 89.7%, respectively. When cut-off values for both SAA and CRP were applied, sensitivity, specificity, positive predictive value, and negative predictive value were 60%, 92%, 71.4%, and 87.3%, /Conclusion: Serum amyloid A, one of the acute phase proteins, have not been previously studied in obstetrical field. This study showed that the measurement of mater 목적: 산모의 혈청 내에서 급성상 단백질인 serum amyloid A(SAA) 농도를 측정하여 자궁 수축 억제의 실패로 인한 조기 분만의 예측 인자로서의 유용성을 평가하고, 염증 반응과 관련된 여러 인자들과의 비교를 통해 그 유용성을 확립하고자 하였다. 재료 및 방법: 2000년 9월부터 2001년 8월까지 1년간 연세대학교 의과대학 부속 신촌 세브란스 병원에서 정기적인 산전 진찰과 분만이 가능하였던 총 100예의 산모를 대상으로 하였다. 조기 양막 파수와 조기 진통이 모두 없었던 군을 대조군(I 군, n=38)으로, 조기 양막 파수만 있고 조기 진통이 없었던 군(II 군, n=12), 조기 양막 파수는 없고 조기 진통만 있었던 군(III 군, n=34), 조기 진통과 조기 양막 파수가 모두 있었던 군(IV 군, n=16)을 실험군으로 나누어 검체를 수집하였다. 얻어진 산모의 혈청에서 SAA 농도, CRP 농도, ESR, 백혈구 수를 측정하였다. 결과: 자궁 수축 억제의 실패로 인한 조기 분만이 이루어졌던 군이 그렇지 않았던 군에 비해 SAA 농도, CRP 농도, 백혈구 수가 통계학적으로 유의하게 높았다. 로지스틱 회귀 분석을 통해 SAA와 CRP가 유의한 인자로 나타났다. ROC 도표에 의하여 SAA 농도의 임계를 6mg/L로 정하였을 때, 6mg/L 이상의 농도가 자궁 수축 억제의 실패로 인한 조기 분만을 예측함에 있어 민감도 76%, 특이도 72%, 양성 예측률 47.5%, 음성 예측률 90%로 나타났다. 마찬가지로 CRP 농도의 임계치를 0.59mg/dL로 정하였을 때, 민감도는 72%, 특이도 81.3%, 양성 예측률 56.3%, 음성 예측률 89.7%로 나타났다. SAA 농도와 CRP 농도의 임계치를 모두 적용한 경우 민감도는 60%, 특이도 92%, 양성 예측률 71.4%, 음성 예측률 87.3%이었다. 결론: 급성상 단백질인 SAA는 아직까지 산과 영역에

The Roles of Serum Amyloid A-1 and Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1 in Asthma Pathogenesis

CAO THI BICH TRA 아주대학교 2023 국내박사

Background: Neutrophilia (sputum neutrophils  65%) in the sputum and its mediators are attributed to neutrophilic airway inflammation that is associated with poor steroid responsiveness and severe asthma (SA). Although many researchers have investigated its underlying mechanisms, potential biomarkers and therapeutics, it has not been completely understood. Serum amyloid A (SAA) was proposed as a biomarker for neutrophilic asthma (NA) and was associated with impaired lung function. SAA1, a primary precursor of SAA, was involved in lipid metabolism, bacterial clearance and inflammatory regulations; nevertheless, its clinical significance and function in NA have not been studied. Furthermore, the presence of eosinophilia in the blood/sputum of severe asthmatic patients (type 2 SA) contributed to recurrent asthma exacerbations and low lung function even on maintenance medication including inhaled corticosteroids (ICS) and long-acting beta-agonist (LABA). In addition, tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP1) is a member of the TIMP family and play the role of a major inhibitor of metalloproteinase-9 (MMP9) in extracellular tissues. The pathogenic mechanism of TIMP1 on airway inflammation and remodeling remained uncertain, but accumulating evidence has shown that TIMP1 and MMP9 co-work in airways to upregulate tissue remodeling. Objective: This thesis sought to investigate: 1) clinical relevance of serum SAA1 according to asthma phenotype (NA vs non-NA); 2) SAA1 production from airway epithelial cells (AECs) upon external/internal stimuli; 3) the effect of SAA1 on the activation of neutrophils/macrophages; 4) SAA1 expression in different asthma mouse models; 5) clinical relevance of serum TIMP1 level according to SA phenotype (type 2 SA vs non-type 2 SA); 6) TIMP1 production from AECs upon various stimuli; 7) the effect of TIMP1 on the activation of eosinophils/macrophages; and 8) the effects of TIMP1 and anti-TIMP1 antibody on airway inflammation and remodeling in vivo. Methods: In the first study, 122 adult asthmatics (78 patients with NA and 44 those with non-NA) and 60 healthy controls (HCs) were enrolled to measure serum SAA1 levels. The production of SAA1 from AECs and its effects on neutrophils and macrophages were investigated. In the second study, we enrolled 250 adult asthmatics (54 patients with SA and 196 those with non-SA) and 140 HCs to measure serum TIMP1 levels. The release of TIMP1 from AECs and its effects on the activations of eosinophils and macrophages were evaluated. Results: Serum SAA1 levels were significantly higher in asthmatic patients than in HCs (P = 0.014); among asthmatics, patients with NA showed significantly higher SAA1 levels than those with non-NA (P < 0.001). In vitro investigations showed that poly I-C stimulation markedly enhanced the production of SAA1 from AECs, which was further augmented by neutrophils; SAA1 could induce the production of IL6, IL8 and S100 calcium-binding protein A9 from AECs. Additionally, SAA1 activated peripheral neutrophils and monocyte-derived macrophages from asthmatics to induce the neutrophil extracellular trap (NET) formation and pro-inflammatory cytokine production. In ovalbumin (OVA)-induced allergic asthma mice, poly I-C stimulation significantly increased SAA1, IL17A, interferon-gamma and IL33 levels in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF). The highest levels of SAA1 were noted in the BALF and sera of the NA mouse model, followed by the mixed granulocytic asthma model. Especially, SAA1 induced IL17 and retinoic acid receptor-related orphan receptor gamma t expressions from activated CD4+ T lymphocytes in OVA-induced allergic asthma mice. In the second study, significantly higher levels of serum TIMP1 were noted in asthmatics than in HCs, in the SA group than in the non-SA group and in the type 2 SA group than in the non-type 2 SA group (P < 0.01 for all). A negative correlation between serum TIMP1 and FEV1% values (r = –0.400, P = 0.003) was noted in the SA group. In vitro investigations demonstrated that TIMP1 was released from AECs in response to poly I-C, IL13, eosinophil extracellular traps (EET) and in coculture with eosinophils. TIMP1-stimulated mice showed eosinophilic airway inflammation, which was not completely suppressed by steroid treatment. In vitro and in vivo functional investigations showed that TIMP1 directly activated eosinophils and macrophages, and induced the release of EET and macrophages polarization toward M2 subset, which was suppressed by anti-TIMP1 antibody. Conclusions: These findings suggest that SAA1 may cause neutrophilic airway inflammation in adult asthmatic patients by activating neutrophils to form NET, macrophages to polarize toward the M1 subset, and CD4+ T cells to polarize toward T helper (Th) 2/Th17 predominant cells, resulting in steroid resistance. We propose SAA1 as the potential biomarker for the prediction of NA phenotype. In patients with SA, TIMP1 may contribute to the upregulation of eosinophilic airway inflammation and remodeling via migrating eosinophil into the airways and subsequently activating eosinophils to release EET, which further activate group 2 innate lymphoid cells. In the chronic allergic asthma mouse model, blocking TIMP1 with neutralizing antibodies reduced airway hyperresponsiveness, eosinophilic airway inflammation and remodeling. Taken together, modulating TIMP1 and EET production may be a potential treatment strategy for type 2 SA. 배경: 천식은 가역성 기도 폐쇄를 특징으로 하는 만성 기도 염증성 질환이다. 이 중 5%-10%를 차지하는 중증 천식(SA)은 지속적인 기도 염증을 나타내며, ICS를 포함한 약물 치료에도 폐기능이 감소한다. Serum amyloid A (SAA)은 호중구성 천식(NA, 가래 호중구 수 65%)의 바이오마커 중 하나로 1초간 강제 호기량 감소 (FEV1%) 감소와 관련성이 보고되었다. 반면, tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP1)은 TIMP 계열이며, 세포외 조직에서 주로 matrix metalloproteinases-9 (MMP9)의 억제제로 알려져 있고, 최근 TIMP1와 MMP9는 상호 작용을 통하여 기도 개형을 증가시킨다. SAA1과 TIMP1는 주로 기도 상피 세포 (AECs)에서 다양한 자극에 의해 분비되며, SA의 중증도에 영향을 미친다. 목적: 본 연구는 (1) 천식 표현형(NA vs non-NA)에 따른 혈청 SAA1의 임상적 유용성, (2) 외부/내부 자극에 의한AEC로부터 SAA1 생성, (3) 호중구/대식세포의 활성화에 대한 SAA1의 효과, (4) 천식 마우스 모델에서 SAA1의 효과, (5) SA 표현형(2형 대 비 2형)에 따른 임상적 매개변수와 관련한 혈청 TIMP1의 임상적 유의성, (6) 다양한 자극에 의한 AECs의 TIMP1 생성, (7) 호산구/대식세포의 활성에 의한 TIMP1의 효과, (8) TIMP1 및 항 TIMP1 항체가 생체 내 기도 염증/개형에 미치는 영향, 총 8가지를 확인하고자 하였다. 재료 및 방법: 첫번째 연구에서는, 122명의 천식 환자와 60명의 건강한 대조군(HCs)에서 혈청 SAA1를 측정하였다. 그리고 AECs에서 SAA1의 생산과 대식세포 및 호중구에 미치는 영향을 시험관 내 및 천식 마우스 모델에서 관찰하였다. 두 번째 연구에서는, 성인 천식 환자 250명(SA군, 54명; non-SA군, 196명)과 140명의 HCs 에서 혈청 TIMP1치를 측정하였다. 호산구 및 대식세포의 활성화에 대한 TIMP1의 효과와 AECs로부터 다양한 외부 자극에 따른 TIMP1의 방출 정도를 시험관내 및 생체내에서 평가하였다. 결과: 혈청 SAA1 수치는 천식 환자에서 HCs보다 유의하게 높았고(P = 0.014), 천식 환자들 중 호중구성 천식 환자군이 비 호산구성 천식군보다 유의하게 높았다 (P < 0.001). Poly I-C 처리 후 AECs에서 SAA1 생산이 현저하게 증가하였으며, 이는 호중구 처리 후 더욱 증가되었다. SAA1 처리 후, AECs에서 IL6, IL8 및 S100 칼슘 결합 단백질 A9 유리가 증가하였다. 또한, SAA1은 호중구에서 천식 환자의 말초 혈액에서 호중구 및 대식세포를 활성화하고, 호중구 세포외 트랩 형성 및 염증성 사이토카인 생산을 증가시켰다. 알부민으로 유발한 천식 마우스에서 poly I-C 자극은 기관지 폐포 세척액(BALF)에서 SAA1 수치과 IL17A/인터페론-감마/IL33 수치을 유의하게 증가시켰다. NA 마우스 모델의 BALF와 혈청에서 가장 높은 수치의 SAA1과 호중구 증가증이 나타났고, 혼합 과립구성 천식 마우스 모델이 그 뒤를 이었다. 특히, SAA1은 천식 마우스의 활성화된 CD4+ T 림프구로부터 RORt 발현을 유도하였다. 두 번째 연구에서, 혈청 TIMP1 수치는 천식 환자에서 HCs에 비해 유의하게 높았으며, 천식 환자중에서, non-SA군보다 SA군에서, 비2형군보다 2형 SA군에서 유의하게 높았다(각 P <0.01). SA 환자군에서 혈청 TIMP1과 FEV1 % 값 사이의 음의 상관관계(r = -0.400, P = 0.003)가 관찰되었다. 시험관 내 연구결과로 TIMP1는 AECs에서 다양한 외부 자극인 poly I-C, IL13, 호산구 세포외 트랩(EET) 및 호산구와 공동 배양 후 방출되었다. 동물 모델에서는 TIMP1 자극 후 호산구성 기도 염증이 관찰되었으며, 이는 스테로이드 치료로 완전히 억제되지 않았다. 또한, TIMP1은 호산구와 대식세포를 직접 활성화하고, EET와 대식세포의 방출을 유도하여, 항-TIMP1 항체 치료후 M2로의 분극화가 억제되었다. 결론: 이러한 결과는 SAA1이 NET 형성, M1 방향 대식세포 활성화 및 T 헬퍼(Th)2/Th17 우세 세포와 함께 호중구를 활성화 및 호중구 기도 염증을 유발하여, NA 또는 MA의 표현형에 기여한다. TIMP1은 SA 환자에서 호산구성 기도 염증을 강화하며, 혈청 TIMP1은 2형 SA에 대한 잠재적인 바이오마커 및/또는 치료 표적이 될 수 있다.

Investigation on potential roles of necroptosis effectors and Serum amyloid A3 in the mouse uterine epithelial cells

손수진 건국대학교 대학원 2024 국내석사

Investigation on potential roles of necroptosis effectors and Serum amyloid A3 in the mouse uterine epithelial cells Son, Sujin Department of Veterinary Medicine Graduate School of Konkuk University Necroptosis is a form of programmed cell death that is characterized as a regulate d cellular self-destruction mechanism. Once activated by certain external stimuli such as Tumor necrosis factor alpha (TNFα), the process is mediated by sequential actions of Receptor- interacting protein 1 (RIPK1), Receptor-interacting protein 3 (RIPK3), and Mixed lineage kinase domain-like protein (MLKL). Our laboratory previously reported that the cellular integrity of the uterine epithelial cells (UECs) depends on the presence of Tumor susceptibility gene 101 (Tsg101) in mice. One of the roles of TSG101 is known as a counteraction against necroptos is. Thus, I examined if UECs express necroptos is effectors and respond to certain stimuli in the mouse uterus. First, I examined the expression of Ripk1, Ripk3, and Mlkl in UECs and stromal cells (USCs) in mice by RT-PCR and Western blotting. UECs were stimulated with a mixture of TNFα (T), Smac mimetic LCL-161 (S), and zVAD-FMK (Z), a widely used combination to induce necroptosis. Cells were pre-stained with SYTOX Green® and observed under a live imaging apparatus to monitor changes in cell permeability. Peri- implantation uteri from pregnant mice on days 1, 4, and 8 were collected to examine physiological changes related to necroptosis. To examine steroid hormonal regulation of necroptosis-associated factors, uteri were collected from ovariectomized (OVX) mice injected with steroid hormones. I first confirmed that Ripk1, Ripk3, and Mlkl are expressed in UECs. The expression of Ripk1 and Ripk3 were upregulated in uteri from estrogen-injected OVX mice. TSZ- treated UECs showed increases in SYTOX Green staining by 24 h after TSZ treatment than DMSO-treated UECs. Immunofluorescence staining of pMLKL localized in TSZ- treated UECs at 1 h, suggesting activation of necroptotic machinery. UECs with or without TSZ treatment at 1 h were subjected to RNA sequencing analysis. In TSZ- treated UECs, several inflammation-associated genes were identified as differentially regulated genes (DEGs), Serum amyloid A3 (SAA3) is an acute-phase inflammatory protein that increases during inflammatory response in several tissues. I found that Saa3 is upregulated in necroptosis-induced UECs. TSZ-treated UECs have higher Saa3 mRNA levels than T, S, or Z-treated UECs. TSZ-treated L929 cells, the mouse fibroblast cell line which is used as a necroptosis-positive cell line, exhibited an increase in Saa3 expression. Additionally, inducing necroptotic cell death in Ripk3 knockout UECs resulted in fewer cell deaths compared to Ripk3+/- UECs. Notably, TSZ-treated Ripk3-/- UECs showed lower Saa3 expression levels compared to the control group. In conclusion, this study shows that the necroptosis machinery is present in the mouse uterus and UECs and the increased Saa3 expression by TSZ treatment implies its potential role as a necroptosis-target gene. Keywords: Mouse, Uterus, Uterine epithelial cells (UECs), Necroptosis, Serum amyloid A3 (SAA3) 세포 괴사(Necroptosis)는 조절된 세포 자체 파괴 메커니즘을 특징으로 한다. 특정 외부 자극, 예를 들어 종양 괴사 인자 알파 (TNFα)에 의해 활성화되면 이 과정은 수용체 상호작용 단백질 카이네이즈 1 (RIPK1), 수용체 상호작용 단백질 카이네이즈 3 (RIPK3), 그리고 혼합 계통 카이네이즈 도메인과 유사한 단백질 (MLKL)의 연속적인 작용에 의해 매개된다. 우리 연구실은 이전에 마우스의 자궁 상피 세포 (UECs)의 세포 무결성이 Tumor susceptibility gene 101 (Tsg101)의 존재에 의존한다고 보고한 논문이 있다. TSG101 의 역할 중 하나는 세포 괴사에 대항하는 것으로 알려져 있다. 따라서 나는 마우스 자궁에서 자궁 상피세포가 세포 괴사인자들을 발현하고 특정 자극에 어떻게 반응하는지 조사했다. 먼저 RIPK1, RIPK3 및 MLKL 이 자궁 상피세포에서 발현되는 것을 확인했다. 난소절제술 (OVX) 된 estrogen 이 주입된 자궁에서는 RIPK1 과 RIPK3의 발현이 증가하였다. 세포 괴사를 유발하는 것으로 잘 알려진 TSZ 결합체 (TNFα (T), Smac mimetic LCL-161 (S), and zVAD-FMK (Z))로 처리된 자궁 상피세포는 TSZ 처리 후 24 시간 동안 DMSO 처리된 자궁 상피세포보다 SYTOX Green 염색이 증가되었다. pMLKL 의 면역 형광 염색은 TSZ 처리 1 시간 후에 UECs 에 반응되어 나타났으며, 이는 세포 괴사 기작의 활성화를 시사했다. 1 시간 후의 TSZ 를 처리한 자궁 상피세포는 RNA seq 분석을 진행하였으며 TSZ 처리된 자궁 상피세포에서 여러 염증 관련 유전자가 차등 조절된 유전자로 식별되었다. 그 중, Serum amyloid A3 (SAA3)는 여러 조직에서 염증 반응 중에 증가하는 급성 상피 염증 단백질이며, Saa3 는 세포 괴사가 유도된 자궁 상피세포에서 발현량이 증가되는 것을 확인하였다. TSZ 처리된 자궁 상피세포는 각각 T, S, 또는 Z 처리된 자궁 상피세포보다 더 높은 Saa3 mRNA level 을 보였다. 세포 괴사 positive cell line 으로 사용된 마우스 섬유아 세포주인 L929 cells 에서도 TSZ 를 처리한 그룹에서 Saa3 발현이 증가되었다. 또한 Ripk3-/- 자궁 상피세포에서 세포 괴사를 유도하였더니 Ripk3+/- 자궁 상피세포에 비해 더 적은 세포 사멸이 나타났으며 이중, TSZ 처리된 Ripk3- /- 자궁 상피세포는 대조군에 비해 낮은 Saa3 발현 수준을 보였다. 요약하자면, 마우스 자궁 및 자궁 상피세포에 세포 괴사 기작이 존재하며, TSZ 처리에 의한 Saa3 발현 증가는 세포 괴사 타겟 유전자 로서의 잠재적인 역할을 시사한다는 것을 보여준다

강직성 척추염 환자에서 혈청 amyloid A의 질병활성도 지표로써의 유용성

정상윤 연세대학교 대학원 2003 국내석사

강직성 척추염(ankylosing spondylitis, AS)은 주로 척추 및 천장장골 관절등의 구간 관절을 침범하는 만성 전신성 염증 질환이다. 건이나 인대등의 골 부착부에 생기는 염증반응이 주요한 병리학적인 과정이며, 이는 관절과 그 외 조직의 섬유화와 이차적인 골성변화를 유도하여 침범된 관절의 강직을 일으킴으로써 관절의 변형과 운동장애를 초래하게 된다. 그 외 말초 관절염이나 전방 포도막염, 대동맥염, 폐 섬유화등의 관절 외 병변을 수반한다. 따라서, 적절한 질병 활성도의 평가가 중요시되고 있으며 그 지표를 찾는 노력이 있어왔다. 혈청 amyloid A(serum amyloid A, SAA)는 주요한 급성기 반응 단백으로 류마티스 관절염과 같은 염증성 질환에서 높은 농도로 증가한다. 그러나, 강직성 척추염에 있어서는 그 농도의 증가나 질병 활성도와의 관계에 대해 잘 알려져 있지 않다. 본 연구에서는 강직성 척추염환자와 정상 대조군간에 SAA의 농도를 비교하고 현재 임상에서 쓰이고 있는 질병 활성도 지표와의 연관성을 알아봄으로써 SAA가 질병 활성도 평가에 객관적이며 유용한 지표로 쓰일 수 있는지에 대하여 알아보고자 하였다. 강직성 척추염으로 진단받은 38명의 환자와 정상 대조군에서 N Latex SAA시약을 이용한 면역혼탁계측방법을 통해 SAA를 측정하여 비교하였으며, 질병 활성도 지표로써의 유용성에 대해 알아보기 위하여 기존의 질병 활성도를 평가하는 임상적 지표들과 비교 분석하였다. 질병의 활성도에 대한 임상적 지표로는 배쓰 강직성 척추염 질병 활성도 지표(BASDAI)를 이용하였고, 검사실 지표로 적혈구 침강 속도(ESR), C-반응 단백(CRP)을 측정하였다. 그 외 SAA와 콜레스테롤사이의 연관성을 알아보기 위하여 총 콜레스테롤, 고밀도 지단백 콜레스테롤, 저밀도 지단백 콜레스테롤, 중성지방을 측정하였다. 1. 강직성 척추염 환자군의 SAA농도가 대조군에 비해 유의하게 높았다. 2. 환자군의 SAA농도는 BASDAI와 유의한 상관관계를 보였다. 3. 환자군의 SAA농도는 ESR과 유의한 상관관계를 보였고, ESR이 정상범위이며 SAA의 증가를 보인 환자는 15명(40%)이었다. 4. 환자군의 SAA농도는 CRP와 유의한 상관관계를 보였고, CRP가 정상범위이며 SAA의 증가를 보인 환자는 9명(23%)이었다. 5. 환자군에서 SAA와 콜레스테롤간의 연관성에 대해 분석한 결과 유의한 상관관계를 보이지 않았다. 이상의 결과로 볼 때, 강직성 척추염 환자에서 SAA의 농도가 정상인에 비하여 유의하게 높이 올라감을 확인할 수 있었다. 또한, SAA는 기존의 BASDAI, ESR, CRP와 유의한 양의 상관관계를 보임으로써 객관적인 질병 활성도 지표로써 유용하게 쓰일 수 있을 것이며 앞으로 치료 반응 및 치료 약물의 선택에 큰 도움을 줄 수 있을 것으로 생각한다. Ankylosing spondylitis (AS) is a chronic inflammatory disease of the axial skeleton with variable involvement of peripheral joints and extraarticular manifestations such as enthesopathy, anterior uveitis, aortitis, fibrocystic pulmonary disease. Biological markers of inflammation are useful for the diagnosis and monitoring of inflammatory rheumatic disease such as rheumatoid arthritis and AS. Particularly, C-reactive protein (CRP) and serum amyloid A (SAA) is well recognized biological markers of inflammation and the level of these two proteins increases rapidly after the acute phase response is initiated. Furthermore, SAA may influence the function of high density lipoprotein(HDL) in relation to cholesterol metabolism. In AS, the acute phase proteins SAA has not been as studied as in rheumatoid arthritis. This study was designed to confirm the elevation of SAA in AS through the comparison of healthy control group, and to assess their relationship with disease activity and cholesterol metabolism. Seventy eight-paired sera from 38 AS patients and 38 healthy control were obtained to measure SAA levels. SAA levels were determined by the method of immunonephelometry. Disease activity of each AS patient was assessed by Bath ankylosing spondylitis disease activity index (BASDAI). To determine the correlation of labolatory parameters, erythrocyte sedimentation rate (ESR), CRP and lipid profile such as total cholesterol, HDL cholesterol, low density lipoprotein(LDL) cholresterol, triglyceride were measured at the same point with SAA measurement. 1. The mean SAA level of AS patients was higher than that of normal healthy controls significantly. 2. There was significant correlation between SAA level and BASDAI, and between SAA level and laboratory activity indices (ESR, CRP). 3. But, there was no significant correlation between SAA level and Lipid profile (total cholesterol, HDL cholesterol, LDL cholresterol, triglyceride). To the present results, we found that SAA levels were elevated in AS patients than healthy controls, and the high SAA levels in patients with AS have been found to correlate well with BASDAI and laboratory activity indices (ESR, CRP). These findings imply that SAA can be a very good indicator of disease activity in AS patients. In addition, SAA will be useful for the evaluation of treatment response and selection of drug administration. In this study, we could not identify the correlation of SAA levels and lipid profile. Future prospective studies about the relationship of SAA and cholesterol metabolism will be necessary.

The role of hepatic Serum amyloid A1 for Il-17 mediated immune response in transgenic mice : 간에서 과발현된 Serum amyloid A1로 인해 증가한 IL-17을 매개로 하는 염증반응

최민지 경북대학교 대학원 2020 국내박사

Serum amyloid A1(SAA1)은 간에서 과 발현되는 acute phase protein중 하나로서 염증반응을 시작하고 유지시키는데 중요한 역할을 하며 다양한 염증성 질환의 심각도와 이 단백질의 증가가 상관관계가 있다고 밝혀져 있다. 분비된 SAA1은 TLR2를 포함한 여러 receptor와 결합함으로서 TNF-α, IL-6, IL-17 등 다양한 염증 사이토카인을 증가시킨다고 알려져 있다. 이번 연구에서는 SAA1이 간에서 과발현된 형질전환마우스를 이용한 실험을 수행하였다. 첫 번째 연구로서 7주령 된 마우스에서 IL-17이 증가해있음을 확인했고 이 IL-17의 경우 Th17세포가 아닌 선천적 면역세포인 γδT cell에서 증가함을 확인했다. 이 세포는 표면에서 SAA1의 receptor인 TLR2를 발현하므로 이와 결합하여 IL-17을 분비하는 메커니즘을 확인하고자 하였다. TLR2의 저해제인 CU-CPT22를 마우스에 주입했을 때 TLR2의 하위에 NF-kB 시그널이 감소함을 확인하였으며 IL-17을 분비시키는 STAT3 시그널 또한 감소함을 확인했다. 이와 함께 IL-17의 발현이 감소함을 확인했다. FACS를 통해 IL-17과 STAT3 시그널이 γδT 세포 상에서 감소함을 확인함으로서 SAA1은 TLR2를 통해 γδT의 IL-17발현을 감소시킴을 확인했다. in vitro에서 마우스의 γδT 세포를 분리하여 recombinant SAA1과 recombinant IL-23을 함께 처리하였을 때 IL-17이 증가하고 이는 CU-CPT22에 의해 감소하는 것을 확인하였다. 따라서 최종적으로 SAA1은 TLR2를 통해 IL-23과 함께 IL-17의 발현을 증가시킴을 확인했다. 이번 연구를 SAA1이 IL-17을 발현하는 γδT 세포를 증가시킴으로서 다양한 염증성 질환의 악화를 유도할 수 있는 가능성을 제시하였다. 한편, γδT 세포 뿐 아니라 다양한 선천적 염증 세포에서 IL-17을 분비한다고 알려지고 있기 때문에 두 번째 연구에서는 TG에서 다른 염증세포에서도 IL-17이 분비되는지 알아봤다. 그 결과 TG에서 neutrophil의 수가 유의적으로 증가할 뿐 아니라 이 세포에서 IL-17의 분비 또한 증가하는 것을 확인했다. IL-17은 건선을 포함한 다양한 염증성 질환을 악화시키는 주요한 인자라고 알려진 바 있다. SAA1이 과발현된 TG에서 피부의 홍반과 함께 각질이 일어날 뿐 아니라 조직학적인 분석을 통해 피부세포의 과증식, 표피층에 neutrophil이 침투함으로서 건선이 일어나고 있음을 확인했다. 이와 함께 IL-17, SAA1, ki-67이 피부세포에서 발현이 증가하며 γδT세포가 진피층에 침투함을 통해 SAA1 TG에서 IL-17을 중심으로 하여 건선의 표현형이 나타난다는 것을 증명할 수 있었다. 만성적인 건선환자들에게서 IL-17의 증가와 함께 뼈의 손실이 일어나는 것이 알려진 바 있다. 따라서 만성적인 SAA1의 증가에 의해 건선성 관절염이 일어나는지 알아보고자 뼈에서 osteoclast과 osteoblast의 활성과 연관된 유전자의 발현을 살펴보았다. 그 결과 osteoclast의 표지유전자 중 활성과 분화에 관련이 있는 CTSK와 RANKL의 발현이 유의적으로 증가한 것을 확인했다. 이와 함께 IL-17, IL-23의 발현 또한 증가하였으며 FACS를 통해 osteoclast의 활성과 관련된 있는 RANKL의 발현이 증가한 것을 확인했다. 또한 SAA1 TG 마우스의 골수에서 neutrophil, γδT 세포의 수가 증가해있음을 확인하였다. CT 촬영을 통해 골밀도를 측정하였을 때 TG 마우스에서 골밀도가 유의적으로 감소함을 확인함으로서 SAA1 TG에서 만성적인 염증반응으로 인한 osteoclast의 증가로 인해 골밀도의 감소를 확인하였다. 따라서 본 연구에서 SAA1의 과발현으로 인해 다양한 염증세포에서 증가하는 IL-17이 건선과 뼈의 손실을 유발한다는 것을 확인하였다.

Human serum amyloid P component에 의한 bacterial peptidoglycan 인식 기작 연구

안장현 부산대학교 2013 국내석사

Human serum amyloid P component (SAP) recognizing various pathogenic bacteria, fungi and yeast is known to activate the classical complement pathway through C1q. SAP is also reported to be an adhesive protein recognizing several different ligand molecules, such as several sugar components, amyloid fibrils, chromatin and DNAs. Since these molecules are structurally so diverse, I assumed that human SAP might not have the same affinity to these suggested several ligand molecules. To understand molecular interaction between human SAP and pathogenic bacteria in immunity and microbiology, it is essential to determine the exact bacterial ligand structure of human SAP. Here, I found the fact that human SAP specifically binds to wall teichoic acid (WTA)-deficient Staphylococcus aureus ΔtagO mutant cells. To address this observation, when I examined the binding ability between human SAP and purified various S. aureus cell wall components and diverse peptidoglycan (PGN) depleted several cell wall component, it was revealed that human SAP recognizes the PGN of S. aureus. Furthermore, SAP recognized lysine (Lys)-type PGN of Gram-positive bacteria and diaminopimelic acid (DAP)-type PGN of Gram-negative bacteria via recognition of monomer-unit of PGN. But this SAP-PGN binding was specifically inhibited by the presence of S. aureus WTA. Additionally, to reveal the biological functions of PGN-recognizing human SAP, I examined complement activation and phagocytosis induction abilities using S. aureus cells. It was reported that human SAP activates C1q-mediated classical complement system and interacts with Fcγ-receptor of human immune cells during phagocytes. In my experiments, however, SAP doesn’t induce the activation of C1q-mediated classical complement onto S. aureus cells. However, when S. aureus cells treated with human SAP are incubated with human peripheral polymorphonuclear leukocytes (PMNs), engulfed numbers of S. aureus ΔtagO mutant cells by PMNs are increased about 10 times compared to the wild-type S. aureus cells. Taken together, I demonstrate that human SAP recognizes bacterial PGN and binds to WTA-depleted S. aureus cells. Also, SAP induces phagocytosis as one of host innate immune response toward WTA-deficient S. aureus cells, suggesting that human SAP may functions evolutionally as ancient human pattern recognition protein. Human serum amyloid P component (SAP)는 다양한 병원성 세균과 곰팡이, 효모를 인식하여 선천적 면역 반응을 유도하는 혈액단백질로, C1q단백질과의 결합을 통해 보체계의 고전경로를 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 또한 human SAP는 다양한 리간드 분자를 인식하는 단백질로 알려져 있다. 이 분자들은 구조적으로 다양하며 차이가 많기 때문에, 병원성 세균과 SAP의 상호작용을 이해하기 위해서는 SAP에 의해 인식되는 세균의 실제 리간드 구조를 결정하는 것이 필요하다. 본 연구자는 human SAP가 그람 양성균의 세포벽 성분인 wall teichoic acid (WTA)의 생합성에 필요한 tagO유전자가 결여된 Staphylococcus aureus의 ΔtagO균주에 특이적으로 결합하는 것을 처음 발견하였고, S. aureus의 여러 가지 세포벽 성분을 제거한 다양한 peptidoglycan (PGN)과의 결합 실험을 수행한 결과 SAP가 PGN을 인식한다는 것을 확인하였다. SAP는 WTA가 제거되거나 혹은 WTA 생합성이 결여되어 PGN이 외부에 노출이 된 조건에서 세균의 PGN을 인식하여 S. aureus에 결합할 것으로 추정된다. SAP는 그람 양성균의 lysine (Lys)-type PGN과 그람 음성균의 diaminopimelic acid (DAP)-type PGN을 모두 인식하여 결합하였으며, surface plasmon resonance (SPR)분석을 통해 SAP가 PGN의 단위인 N-acetylglucosamine (GlcNAc)과 N-acetylmuramic acid (MurNAc) 단당체를 인식하여 결합한다는 것을 확인하였다. PGN을 인식하여 S. aureus에 결합한 SAP의 면역학적 기능을 확인하기 위해 보체 활성을 분석한 결과 SAP는 보체를 활성화시키지 않았으며, 특히 SAP가 특이적으로 결합하는 ΔtagO균주의 경우 오히려 SAP에 의해 보체 활성이 억제되었다. SAP는 보체 활성화 외에 식균 세포 표면의 Fcγ수용체와도 상호작용 하는 것으로 알려져 있다. WTA의 생합성이 결여된 S. aureus에 SAP를 처리하였을 때, 식균 세포인 polymorphonuclear leukocytes (PMNs)와 반응하여 식균 작용이 10배 가량 증가되었으며, 야생형의 S. aureus의 경우 SAP를 처리하여도 식균 작용이 증가되지 않았다. 이 결과를 통해 S. aureus에 결합한 SAP는 PGN을 인식하며 식균작용을 유도한다는 것을 밝혔다. SAP는 선천적 면역 반응을 유도하는 분자로서, 세균의 당 성분을 인식하는 것으로 알려져 있지만, 현재까지 SAP가 인식하는 리간드는 명확히 밝혀지지 않았으며, SAP의 기능 또한 명확히 밝혀지지 않았다. 본인은 SAP가 PGN을 인식한다는 사실을 명확히 밝혀냈으며, WTA의 생합성이 결여되거나 제거된 조건에서 외부에 노출된 PGN을 인식하여 SAP가 세균에 결합함을 증명하였다. 세균에 결합한 SAP는 PMNs의 식균 작용을 유도하여 세균을 제거하는 역할을 하기 때문에 SAP에 의한 선천적 면역 반응은 숙주 방어 체계의 중요한 한 부분 이라고 할 수 있다.

염증성 질환이 있는 야생 조류에서 혈청 아밀로이드 A의 진단 지표로써의 평가

임해린 전북대학교 일반대학원 2022 국내박사

Wild birds are exposed to direct killing by human activities, as well as indirect threats from humans, ranging from environmental pollution, habitat destruction, and climate change. This study aimed to identify the most damaging problems for free-ranging birds and the trends in their injuries and diseases, by analyzing the records of birds rescued from the Jeonbuk Wildlife Center in South Korea. Medical data, including species, date and region of rescue, cause of admission, diagnoses, husbandry and treatment records, and outcomes, were collected from January 2019 to February 2021. A total of 1,464 birds belonging to 106 species were included. The two most frequent causes of admission were healthy orphans and window collisions. The number of admissions due to anthropogenic causes was 43.6%; however, it reached 80% when the considering factors were estimated to be caused by humans. A total of 71% of the diagnoses were associated with trauma, which was much higher than 51% of the causes expected to be traumatic. Inflammatory diseases were found in 82% of the examined birds, regardless of the cause of admission. A total of 82% of the diagnoses were inflammatory diseases, which was also much higher than the 57% expected rescue due to inflammation. This was because the nature of wild animals that hide illness and the inflammatory state was difficult to detect sensitively by general physical examination. To assess the exact condition of the patient, serum amyloid A (SAA), the main acute-phase protein in birds, was evaluated. Due to the lack of reports on the stability of evaluation of avian SAA samples, changes according to the storage period and repeated freezing-thawing cycles were observed. Seven plasma samples from two species, and six plasma samples from three species stored at -20°C were used for storage period and freezing cycles, respectively. An anti-chicken SAA ELISA kit (Eaglebio, Amherst, NH, USA) was used for measurement. For statistical analysis, the Kruskal-Wallis test and Spearman’s correlation coefficient were applied using SPSS V27 (IBM SPSS, Armonk, NY, USA). Statistical significance was set at P < 0.05. The daily SAA concentrations measured for 30 days did not show a statistically significant difference. Freezing and thawing were repeated five times in total, and a significant negative relationship was confirmed as the number of times increased (r = -0.8857, p <0.05). Although no specific number of cycles showed a statistically significant decrease, a decrease greater than 10%, the CV value of the ELISA kit, was observed in 4 samples out of 6 at the 4th cycle. One to three freeze-thaw cycles were not expected to result in any critical reduction; however, it was recommended to avoid repeating as much as possible. The application of serum amyloid A (SAA) to diagnose inflammation in birds has been studied; however, information on the extent of disease-related increase in the large number of wild birds is not yet available. In this study, the value of SAA as a diagnostic marker was evaluated based on disease severity. A total of 291 samples from 139 birds of six avian species were analyzed. All samples were divided into four groups (severe inflammation, moderate inflammation, mild problem, clinically healthy) based on clinical and/or histopathological examinations and evaluated by group. SAA was measured using an anti-chicken SAA ELISA kit, and leukocyte counts, albumin concentrations, and albumin/globulin ratios were compared. The difference among groups was evaluated using the Kruskal-Wallis test followed by a post-hoc test using the Dunn’s multiple comparisons with SPSS V27. Statistical significance was set at P < 0.05. The mean concentration and standard deviation (ng/ml) of SAA in each group were 94.66 ± 75.16, 39.05 ± 33.78, 12.76 ± 10.56, and 5.96 ± 8.07 respectively. There was a significant difference in mean levels between groups (H (3)=193.713, p <0.001), and the results were the same when analyzed by each species. The more severe the classification level according to disease, the higher SAA level and WBC counts, and the lower albumin and A/G ratio. All four indices showed significant difference of mean between groups (p < 0.001). The SAA showed drastic changes reflecting the treatment response or preceding the onset of clinical symptoms when it was measured periodically, confirming that SAA in wild birds can be used to detect asymptomatic disease or to evaluate positive responses to treatment. Along with white blood cells, albumin, and the A/G ratio, SAA is thought to be helpful in accurately identifying current health status. Since the study was conducted on clinical patients who were rescued from the wildlife center, the frequency of inflammation due to trauma was high, and a long-term evaluation in many birds was difficult to perform. We hope that this will be carried out in future studies. 야생 조류는 환경오염, 서식지 파괴, 기후변화 등 인간의 간접적인 위협 외에도 인간 활동에 의한 직접적인 죽음에 노출되어 있다. 본 연구는 한국의 전북야생동물센터에서 구조된 조류의 기록을 분석하여, 자유롭게 서식하는 야생 조류에게 가장 피해를 주는 문제와 부상 및 질병의 경향을 파악하기 위해 수행되었다. 2019년 1월부터 2021년 2월까지 종, 구조 날짜와 위치, 입원 원인, 진단, 사육 및 치료 기록, 그리고 치료 결과를 포함하는 의료 기록을 수집하였다. 이 분석에는 106종 1,464마리의 새가 포함되었다. 가장 빈도 높은 두 개의 구조 원인은 건강한 미아와 유리창 충돌이었다. 인간에 의한 구조 원인은 43.6%로 집계되었으나, 인간에 의한 부상이나 구조로 추정되는 경우까지 고려하면 80%에 달했다. 진단의 71%는 외상과 관련이 있었고, 이는 외상으로 간주되는 구조 원인의 비율인 51%보다 매우 높은 것이었다. 구조 원인에 관계없이, 염증성 질환은 검사를 수행한 조류의 82%에서 발견되었으며, 이는 또한 염증으로 인한 구조 원인에 해당한 57%보다 훨씬 높았다. 이 것은 질병과 염증 상태를 숨기는 야생동물의 특성과, 기본적인 신체검사로는 민감하게 건강 상태를 감지하기 어려웠기 때문이다. 환자의 정확한 상태를 파악하기 위해 조류의 주요 급성기 단백질인 혈청 아밀로이드 A(SAA)를 평가하였다. 그에 앞서 조류 SAA 시료의 안정성을 평가한 보고가 부족하여, 보관 기간 및 반복되는 동결-해동 횟수에 따른 변화를 관찰하였다. 보관 기간 및 해동 횟수 평가에는 -20 °C에서 보관된 2종의 혈장 샘플 7개와, 3종의 혈장 샘플 6개가 각각 사용되었다. 측정에는 닭 전용 SAA ELISA 키트 (Eaglebio, Amherst, 뉴햄프셔 주, 미국)을 사용하였다. 통계적 분석은 SPSS V27(IBM SPSS, Armonk, 뉴욕 주, 미국)을 이용하여 수행하였고, Kruskal-Wallis 검정과 Spearman의 상관계수를 적용하였다. 0.05 미만의 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 설정하였다. 30일 동안 매일 측정한 SAA 농도는 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다. 동결-해동은 총 5회 반복하였으며, 횟수가 증가할수록 유의한 음의 관계가 확인되었다(r = -0.8857, p <0.05). 통계적으로 유의하게 농도가 감소하는 횟수는 없었으나, 6개의 시료 중 4개에서 네 번째부터 ELISA 키트의 CV값인 10% 이상 농도가 감소하는 것이 관찰되었다. 1~3회의 동결-해동 주기는 심각한 감소를 초래할 것으로 예상되지 않지만, 가능한 한 반복하지 않는 것이 추천된다. 조류에서 염증을 진단하기 위한 혈청 아밀로이드 A(SAA)의 적용은 연구되어왔지만, 아직 다수의 야생 조류에서 질병과 관련되어 증가하는 정도에 대한 정보는 없다. 본 연구에서는 염증성 질병의 중증도에 따라 진단 마커로서 SAA의 가치를 평가하였다. 조류 여섯 종(황조롱이, 집비둘기, 솔부엉이, 수리부엉이, 말똥가리, 참매)에 해당하는 139마리로부터 채집된 총 291개의 시료가 분석되었다. 모든 시료를 임상적인 검사 및/또는 조직병리학적 검사를 기반으로 4개 그룹(중증 염증, 중등도 염증, 경증 문제, 임상적 건강)으로 나누고 그룹별로 평가하였다. SAA는 닭 전용 SAA ELISA 키트로 측정하였고, 백혈구 수, 알부민 농도, 알부민/글로불린 비율과도 비교되었다. 그룹 간의 통계적 차이는 SPSS V27를 이용하여 Kruskal-Wallis 검정으로 평가하였고, 두 그룹 간의 사후 검정에는 Dunn’s 검정이 적용되었다. 0.05 미만의 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 설정하였다. 각 그룹에서 SAA의 평균 농도와 표준편차(ng/ml)는 각각 94.66 ± 75.16, 39.05 ± 33.78, 12.76 ± 10.56, 5.96 ± 8.07이었다. 전 그룹간에 통계적으로 유의한 평균의 차이가 있었고(H (3) = 193.713, p <0.001), 각 종 별로 분석한 결과도 동일하였다. 염증성 질병과 심각도에 따른 분류 수준이 높을수록 SAA 농도와 WBC 수치가 증가하였고, 알부민과 A/G 비율이 감소하였다. 네 가지 염증 지표 모두 그룹 간에 유의한 평균 차이를 보였다(p < 0.001). 한 개체에서 주기적으로 SAA를 측정했을 때, 치료에 대한 반응을 반영하거나 임상 증상보다 앞서는 급격한 변화가 관찰되었다. 이 것으로 야생 조류에서 SAA가 무증상 상태의 질병을 진단하거나 치료에 대한 반응을 민감하게 평가하는데 사용할 수 있음을 확인하였다. 백혈구, 알부민 및 A/G 비율과 함께 SAA는 현재 건강 상태를 정확하게 식별하는 데 도움이 될 것으로 여겨진다. 이번 연구를 통해 야생동물 치료 분야의 전문가들이 미래의 조류 환자에게 더 정확한 진단과 효과적인 치료를 제공하는 데에 도움이 되길 희망한다.

Measurement of Human Serum Amyloid A-1 Protein Concentrations using Half-strip Lateral Flow Immunoassay : Half-strip Lateral Flow Immunoassay를 사용한 인간 혈청 아밀로이드 A-1 단백질 농도 측정

이수영 경북대학교 대학원 2021 국내석사

본 논문에서는 폐암 바이오마커로서 가능성을 가진 hSAA1 단백질을 대표적인 point-of-care (POC) 장치 중 하나인 lateral flow immunoassay (LFIA) 플랫폼을 적용한 비색법 기반의 half-strip으로 검출해보았다. 556 nm의 최대 흡수 파장을 가지는 항체 14F8이 컨쥬게이션된 Ag@Au core-shell을 LFIA half-strip 라벨로 적용했을 때, 별도의 리더기 없이 육안로 2 μM 농도의 hSAA1을 검출할 수 있었다. 본 연구 결과를 토대로 민감도를 증대하는 추가 연구를 진행한다면 현재 폐암 조기 진단의 한계를 극복할 수 있는 임상에 활용 가능한 비색법 기반의 LFIA 바이오 센서를 개발할 수 있을 것으로 기대된다. In this thesis, the human serum amyloid A-1 (hSAA1) protein, which has potential as a biomarker for lung cancer diagnosis, was detected with a colorimetric method based half-strip using the lateral flow immunoassay (LFIA) platform, one of the representative point-of-care (POC) devices. When Ag@Au core-shell conjugated with anti-hSAA1 14F8 having a maximum absorption wavelength of 556 nm was applied as an LFIA half-strip label, hSAA1 at a concentration of 2 μM could be detected visually without a separate reader device. If further studies to increase sensitivity are conducted based on the results of this study, it is expected that a colorimetric method-based LFIA biosensor that can be used clinically and also can overcome the limitations of early lung cancer diagnosis can be developed.