RNA sequencing for characterization of living organisms

김상현 단국대학교 대학원 2024 국내박사

RNA 분자는 생명체의 필수적인 요소로 간주되고 있으며, 특정 조건 하에 서 단일 세포 내의 RNA의 특성을 이해하는 것이 많은 연구들의 궁극적인 목표로 자리잡고 있다. 이러한 RNA를 분석하는 다양한 방법들은 분석의 효 율성과 가격을 낮추고자 끊임없이 발전하고 있다. 이 중에서 RNA 염기서열 분석법은 Illumina 회사의 분석 방법을 기반으로 1세대 분석법인 Sanger 염기 서열 분석법을 거쳐 발전한 분석법이며, 작물 또는 간암과 같은 다양한 조직 과 세포에서 전사체의 차이 및 암의 이질성, 바이오마커 탐색, 그리고 약재 내성을 연구하는 분야에 많이 사용되고 있다. 본 연구에서는 RNA 염기서열 분석법, 정량적 실시간 증폭 분석법 그리고 생명정보학 분석법을 사용하여 두 가지 다른 종류의 조직의 전사체를 탐사하고, 이들의 발현 패턴과 관련된 기능을 비교하였다. RNA 염기서열 분석법을 활용한 작물의 연구에서 비슷한 발현 패턴을 보이는 70% 이상의 유전자를 유전자변형 작물과 일반 작물의 비교에서 확인하였으며, 이들과 관련된 기능이 광합성과 ABC 운송자와 주로 연관되어 있다는 것을 확인하였다. 한편, 벼 작물은 섭취를 통한 에너지원으로써 많이 이용되고 있기 때문에 많은 벼 작물 연구에서 내포된 항영양인자 를 연구하는 것이 중요하게 간주되고 있다. 이러한 이유로, 20개의 항영양인 자와 관련된 유전자를 선별하여 이들의 발현 패턴을 실시간 증폭 분석법으 로 확인하였고, 일반 벼 작물과 대비하여 약간의 차이를 보이지만 유전자변 형 작물이 유전적으로 안전한 것을 확인하였다. RNA 염기서열 분석법과 생 명정보학 분석법을 이용한 간암 연구에서는 암 조직과 낮은 수준의 면역 침투력을 보이는 조직에서 세포 독성 T 세포와 면역 관문과 연관된 유전자들 의 발현이 낮아짐을 보이며 억제된 면역 반응을 확인하였다. 이러한 이유로, 간암 환자와 면역 치료 간의 관계를 확인하고자 본 시료 내에서 유전자의 발현 패턴을 조사하였다. 이 중에서 IMPDH2 유전자가 암 조직과 면역 침투 수준이 낮은 조직에서 유의하게 증가한 발현 패턴을 보이며 선별되었고, 이 를 단백질 수준과 TCGA-LIHC 데이터베이스를 통해서 추가로 검증을 하였다. IMPDH2는 유전자의 발현과 M1 대식세포와 CD8 T 세포를 포함한 항암 면역 반응 간에 음의 상관관계를 보였고, 연구를 통해 IMPDH2가 항암 면역 반응을 감소시킴으로써 암을 발전시킬 수 있는 것을 확인하였다. 결과적으로, 본 연구에서는 다양한 전사체 분석법을 활용함으로써 두 가지 서로 다른 시료 의 유전자 발현 패턴과 관련된 기능을 연구하고, 유전자변형 작물의 유전적 안전성을 평가하였으며, 간암에서 암 치료에 활용할 수 있는 가능성 있는 유전자를 제시하였다. Since RNA molecules are considered as essence of life for all living cells, understanding of the identity and abundance in one cell under a specific condition is ultimate goal of much research. Various methodological technologies for transcriptome analysis targeting diverse types of RNAs are continuously developed to lead the higher efficiency and lower cost of sequencing. Bulk RNA sequencing (RNA-seq) is one of the illumine-based sequencing method investigated through first-generation sequencing method called Sanger sequencing and has been widely used in various type of tissues or cells, such as crops and human cancer, for profiling the difference of transcriptomes and the cancer biomarkers, heterogeneity, and drug resistance. In this study, I performed transcriptomic analysis by using RNA-seq, quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR), and bioinformatic analysis to profile the transcripts inside two different types of samples, and to compare expression patterns and enriched functions. In analysis of crop plants by using RNA-seq, almost 70% of similar gene expression patterns were found between transgenic and non-transgenic rice, and enriched functions of DEGs were mainly associated with photosynthesis or ABC transporter. Meanwhile, rice is widely used as energy sources, thus, screening of anti-nutrients is important in rice research. In this reason, I performed gene expression study of twenty anti-nutrients associated genes by using qPCR and showed genetical safety of anti-nutrients in transgenic rice with a few differences. In analysis of liver cancer by using RNA-seq and bioinformatic analysis, suppressive immune response along with reduced expression of cytotoxic T cell and immune checkpoint response associated genes were found in tumors and low-level immune infiltration groups. To study the relationship between immunotherapy and HCC patients, I investigated reported immunotherapy-related genes and confirmed gene expression patterns in the samples. Inosine monophosphate dehydrogenase 2 (IMPDH2) was significantly selected showing increased expressions in tumors and low-level groups, and it further validated in protein levels and TCGA-LIHC database. IMPDH2 was showed the negative correlation between gene expression and anti-tumor immune response including M1 macrophage and CD8 T cells. In this reason, IMPDH2 could promote tumor progression by reducing anti-tumor immune response. In conclusion, by using various transcriptome analysis, I profiled gene expression patterns and enriched functions in rice and liver samples, assessed genetical safety of transgenic rice, and provided a potential therapeutic target gene in liver cancer.

Analysis of Coupling Between Poly(A) Tail Length and Translation Activity Using Long-read Sequencing

Ari Hong 서울대학교 대학원 2022 국내석사

다양한 생물학적 맥락에서 대부분의 표현형의 결정은 궁극적으로 단백질의 발현량에 의해 결정된다. 하지만 단백질의 정량화는 접근성과 해석의 어려움에 의해 양적 연구에 쉽게 고려되지 않고, 보다 간단한 정보로 이루어진 리보핵산(RNA)의 정량화를 통해 이루어진다. 하지만 RNA의 생산 및 분해 조절에 의지하는 양적생물학연구는 RNA에 의한 번역 효율을 고려하지 못한다는 점에서 그 문제가 있다. 이러한 RNA에 의한 번역 효율을 연구하기 위한 실험방법에는 폴리리보솜 구획법이 있다. 이는 사이클로헥시미드(CHX)를 처리하여 리보솜을 고정한 RNA를 당 구배에 올리고 원심 분리를 통해 RNA에 붙은 리보솜의 수대로 분획하는 실험방법이다. 기존의 연구는 리보소체의 개수에 따라 분획된 RNA의 분포를 역전사증폭이나 염기서열분석에 사용함으로서 RNA 특성과 번역활성간의 조절을 알아보았으며, 이러한 RNA와 리보솜의 관계를 통칭하여 번역체로 명명하였다. 특히 차세대 서열 분석으로부터의 염기서열분석기술의 개발은 번역체에 대한 고해상도의 분석이 가능하도록 하였다. 한편 이러한 고해상도의 분석이 가능케 하기 위해, 차세대 서열 분석을 이용한 RNA 서열분석에서 RNA는 파편화와 증폭을 거친다. 이러한 전략은 깊이가 깊은 정보를 제공하지만, 선택적 스플라이싱이나 전사 후 변형과 같은 RNA 분자 고유의 성질을 잃는다. 3세대 서열 분석 방법 중 하나인 나노포어 서열 분석은 긴 RNA 분자를 직접 분석하는 것을 가능하게 하였다. 이러한 나노포어 서열 분석과 폴리리보소체 탐색을 병합하면, RNA가 가진 여러 특성과 번역 활성에 대해 연관 분석할 수 있을 것이다. 리보솜 밀도에 의해 분획된 RNA 표본들을 나노포어 서열 분석하려면 실험과 분석 두 측면에서 최적화가 필요하다(2.2). 이 장엔 부유세포주를 이용하여세포 용해물을 추출하고 폴리리보솜 분획을 하는 방법이 자세히 서술되어있다. 또한 서열 분석 결과의 최적화된 분석 순서를 제시하였다 (2.3). 2.4장에선 리보솜 밀도에 따른 번역체의 일반적인 특성을 조사하는 방법들을 개발하였으며, 2.5장에선 다양한 번역체를 구성하는 각각의 RNA 분자를 살펴보았 다. 3세대 시퀀싱은 DNA및 RNA에 대한 단일 분자적 시야를 제공하며 새로운 지평을 열었다. 이 논문에서는 이를 이용하여 번역체를 분석하는 방법의 개념을 제시하였으며, 기존 방식에서 보였던 결과가 재현됨을 확인하였다. 다양한 생물학적 맥락에서 이 방법의 적용은 번역 조절에 대한 새로운 발견의 기회를 더욱 늘릴 수 있을 것으로 기대된다. In diverse biological context, most of phenotype is ultimately determined by expression of proteins. But quantification of protein is unusually considered because of its difficulties in accessibility and interpretation, RNAs made up of simpler information is investigated vicariously. However, those high-throughput studies depending on processing and decay of RNA cannot consider translation efficiency of those RNAs. Polysome profiling is a method to study translation activity of mRNAs. Once each polysome fractions are collected, the translation activity of each mRNA is analyzed using various methods such as RT-PCR or deep-sequencing. Studies have been conducted to know correlation between the characteristics of RNA obtained as a result of polysome profiling and translation activity using various experimental methods. Nowadays, development of gene expression profiling technique enables high-throughput methods in translatome. Established RNA sequencing with illumina sequencer use fragmentation and amplification to ensure enough depth with high quality. However, this strategy causes loss of information such as alternative splicing or post transcriptional modification. On the other hand, nanopore sequencing, one of the third generation sequencing platform, allows direct long RNA sequencing. Coupling nanopore sequencing with polysome profiling, it will be possible to correlate the several features of RNAs that could only grasp each trend with existing RNA sequencing. For preparing a library of fractionated samples, some optimizations are needed in both experiment and analysis. I’ll introduce optimized experiment methods in detail first (Section 2.2). In this part, There are contents about preparation of cell lysate using floating cell line and detailed polysome fractionation method. I also optimized analyze pipeline for those data (Section 2.3). I describe an array of novel analytic methods to investigate general features of transcripts according to ribosomal density (Section 2.4). After that, I look up respective molecular proper making up mass of diverse transcripts. Long read sequencing experiments open a new prospect in the biology field providing single molecular view and lead to unexpected observation. In this thesis, I introduce a concept of profiling translatome in single molecule level. I confirmed reproducibility of this procedure and discovered diverse phenomenon. Further application of this method on various biological systems will provide an abundant opportunity for the discovery of unexpected translation regulations.

Transcriptomic characteristics of cancer-driver-gene expression and cellular state-wise change in glioblastoma tumorspheres

윤선진 Graduate School, Yonsei University 2021 국내박사

서론: 전사체 분석은 의학적 샘플의 전체적인 모습을 동시에 분석하게 하는 방법론이다. 이 방법론은 단백질을 코딩하는 유전자와 비암호화 유전자까지 분석을 할 수 있게 발달하였다. 최근에는 단일세포 수준의 분석이 가능하여 기존에는 하나의 세포로 여겨졌던 세포명 내에서 다양한 세포의 상태가 나타나는 것이 연구되고 있다. 이러한 다중 세포상태는 기존 세포실험에서 항암약물 등의 효과를 세포생존도 등을 통해 해석하는 방식에 영향을 끼치게 된다. 특히 약물을 세포에 처리할 때, 약한 세포등은 단일세포전사체 분석 과정에서 제외될 가능성이 있으며, 약물에 의해 죽은 세포는 단일세포전사체 라이브러리 준비과정에서 미세유체 채널을 막히게 하여 분석에 어려움을 줄 수 있다. 그렇기에 암세포에서 약물 반응을 다중세포상태를 고려하여 보는 방법은 중요하다. 본 연구에서는 생물정보학 기법을 재구성하여 다중세포상태를 고려하여 세포상태 변화를 계산할 수 있는 방법을 개발하였고 이를 뇌암에 적용하였다. 특히 뇌에 가장 흔하게 발생하는 교모세포종 (GBM)를 연구하려고 한다. 특히 교모세포종 세포는 다양한 연구기관에서 만든 세포가 있는데, 기존 연구에 의하면 세포배양 방법에 따라 세포가 달라 질 수 있다고 알려져 있다. 특히 뇌암세포는 뇌혈관장벽에 의해 혈액에서 분리되어 있다고 알려져 있는데, 기존 암세포배양 방법들은 소태아혈청을 중요하게 사용한다. 특히 제넨텍이나 브로드 연구소의 세포들도 소태아혈청을 이용하여 배양한 세포의 전사체데이터를 공개하고 있는데, 배양법은 뇌종양세포가 기존 미세환경의 특성을 벗어나게 하고, 줄기세포 능력을 잃고 분화된 세포로 변화하게 한다고 하여 세포 배양에 대한 상호간의 연계성을 명확히 알지 못한다. 본 연구는 세브란스병원에서 확립한 교모세포종 종양구 세포 (TS)에 대해서 전사체적 비교 연구를 하여, 다른 기관에서 만든 뇌종양세포와 다른점이 있는지 확인하고, 본 기관에서 확립한 세포를 검증한다. 또한 앞서 개발한 다중세포상태에서의 세포의 변화를 보는 역필터링 방법을 통해서 교모세포종 종양구가 각종 변화물질에 의해 변화하는 양상을 다중세포상태를 고려하여 볼 수 있는지 연구한다. 재료 및 방법: 텔로머라아제 역전사효소 촉진유전자 상의 변이 (TERT)와 종양단백질 P53 (TP53) 변이는 교모세포종의 암발생에 매우 중요한 초기 유전자로 연구되고 있다. 또한 이 두 유전자는 암세포에서 고발현이 나타나서 교모세포종의 마커로 활용될 수 있다. 이 두 유전자의 공발현은 TCGA, GTEx, 브로드연구소의 CCLE, 제넨텍의 암세포 데이터베이스 그리고 세브란스병원 GBM 조직 및 조직기원 종양구 (특히 아이소시트르산 탈수소효소 정상형 GBM)의 데이터베이스를 비교 분석하였다. 세브란스병원 GBM TS는 CCLE의 종양세포가 함께 같은 데이터전처리를 거쳐서 분석이 되었다. 이 두가지 세포 그룹의 차이가 있는 것에 의문을 갖고, GBM TS를 검증하였다. 발현 유전자 기준으로 하나의 교모세포종 종양구를 선택하여 단일세포전사체 분석과 유전자 복제수 변이 분석 등을 진행하였다. 결과: TCGA와 GTEx데이터를 통해서 GBM을 포함한 종양 조직과 일반 정상조직에서 TERT와 TP53의 공발현의 양의 상관관계를 확인할 수 있었다. 세브란스 원발 GBM 조직과 GBM TS에서도 TERT와 TP53의 통계적으로 유의미한 양의 상관관계를 확인할 수 있었다. 그러나 CCLE와 제넨텍의 중추신경계종양세포등을 포함한 대부분의 세포에서 이러한 두 유전자의 상관관계가 확인되지 않았다. 세브란스 GBM TS는 CCLE의 중추신경계종양세포들과의 비교를 통해 대사적으로 다르며 유전자 별 비교를 통해 볼 때에도 차이가 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 차이에 착안하여, GBM TS를 종양 조직과의 비교를 통해 검증작업을 진행하였다. GBM TS에서는 조직에서 나타나는 유전자의 발현패턴이 나타나고 있었으며, 해당 유전자는 다음과 같다 (MGMT, IDH1, EGFR, PTEN 그리고PTPRZ1). GBM 조직과 TS의 각각 정확히 일치하는 샘플 간의 비교를 통해서도 다양한 유전자의 발현패턴을 확인하였다. 또한 유전자 변이의 경우 특히 TP53유전자의 변이 패턴이 조직과 GBM TS에서 상당부분 일치하는 것을 확인할 수 있었다. 여러 GBM TS중에서 EGFR, TP53, MKI67 그리고PTPRZ1를 고발현하는 하나의 샘플을 확인하여 단일세포전사체분석을 진행하였다. 크게 3가지의 세포 상태가 확인되었고, 첫째 상태 또는 클러스터는 신경줄기세포의 유전자발현특징, 두번째 클러스터는 VIM과 GAPDH의 고발현 확인, 세번째 클러스터에서는 TERT와 TP53의 고발현이 확인되었다. 이 세가지 클러스터에 종양외의 다른 세포는 존재하지 않는 것이 유전자 발현 및 염색체 7번의 획득과 염색체 10번의 결실을 통해서 확인할 수 있었다. 결론: GBM TS는 GBM 조직의 전사체적 특성을 따른다. GBM TS의 원발조직과의 비교로 GBM TS는 원발조직의 특성을 반영하는 것을 유전자 발현 및 변이 패턴을 통해 알 수 있었다. 단일세포 전사체 분석에서 거의 동일한 유전체의 복제수 변이양상에도 서로 다른 유전자 발현패턴이 나타남을 확인할 수 있었다. 단일세포 유전자세트를 이용하여 세포상태별 약물반응을 볼 수 있다. Background: Transcriptome analysis enabled simultaneous snapshot evaluation of mRNA level of the prepared samples. The analysis method evolved to include protein-coding genes and non-coding genes. Furthermore, single-cell-RNA-sequencing revealed multiple cellular states or clusters in a previously established cancer cell line. As the traditional cell experiment assume a cell line is composed of identical cells, the identification of different cellular states would impact the conventional cell viability interpretations. Single-cell-RNA-sequencing on the drug-treated cells may resolve the cellular state issue. However, the technique may add bias, as the vulnerable cell group may disappear in the downstream analysis, or the dead cell may block the microfluidic channels with failure for preparation of library. Thus, a new analytic method that can account for the heterogeneity of cellular states may show cellular state-specific change or cell viability. I developed a simple protocol and applied it to brain tumor research. Glioblastoma (GBM) is the most common brain tumor, and there are independent cell cohorts by the research groups. However, there has been debate over the reliability of the established cells by the identity and by the culture methods. Brain tumor cells are located within the brain and protected from the serum by the blood-brain barrier. As the cell culture medium usually contains fetal bovine serum (FBS), such a condition was regarded as not an intrinsic niche environment for brain tumor cellular models. Tumor cell exposure to FBS was reported to induce fibrotic changes or induce differentiation from stem cell-like status of brain tumor cells. In addition to the Severance GBM cellular model RNA-sequencing database, Genentech and Broad institute applied different culture methods to develop and maintain glioma cells. They publicized RNA-sequencing data of these cells. Here, this dissertation aims to validate the RNA-sequencing data of the spheroid tumor cells of GBM (GBM TSs) that are cultured in the FBS-free culture medium in comparison with FBS-exposed GBM-derived cells as well as the third-party RNA-sequencing databases of glioma cells. I hypothesized that if the cellular model is reliable, the cell model may recapitulate the gene expression patterns and mutation patterns of original tumor tissue. Based on the validation and applying the gene sets from single-cell-RNA-sequencing, the perturbagen (FBS or drugs) effect was calculated from the bulk RNA-sequencing. Methods: Mutations of the promoter of telomerase reverse transcriptase (TERT) and tumor protein P53 (TP53) are widely found in the glioblastoma lineages and regarded as the initial driver of GBM. As these genes are selectively overexpressed in the tumor cells, co-expression of these two genes may screen the reliability of the established GBM cellular models. Co-expression pattern of TERT and TP53 was used as a first pilot test and assessed in the Cancer Genome Atlas (TCGA), Genotype-Tissue Expression (GTEx), Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE), Cancer cell RNA-sequencing database of Genentech, and Severance GBM tissues and tumor-derived tumorspheres (TSs) database. RNA-sequencing data of Severance GBM TSs are compared with CCLE tumor cells. Based on the difference between the two groups of cells, GBM TSs were analyzed and compared with the GBM tissues with gene expression patterns and gene mutation profiles. One single GBM TS sample was selected for the single-cell RNA-sequencing, and multiple cellular states were examined with the single-cell level GBM tissue data. Results: TCGA and GTEx data showed that several tissue entities and tumors, including GBM, show a statistically significant positive correlation between TERT and TP53. Severance GBM tissues and GBM TSs revealed a significant correlation between TERT and TP53. Unlike the Severance GBM TSs, the RNA-sequencing data of most of the tumor cells and central nervous system (CNS) origin tumor cells of CCLE and Genentech were not showing the correlation between the two genes. Severance GBM TSs were compared with the CCLE CNS tumor cells that are processed from the acquired raw data files with exactly the same computational protocols. Metabolic signatures and gene-wise comparison showed differences between the two groups of cells: and it necessitated the validation of GBM TSs with the GBM tissues. GBM TSs, when compared with control human astrocytes, recapitulated the GBM-cortex expression patterns of cancer-driver-genes (IDH1, EGFR, PTEN, and PTPRZ1) and MGMT. Matching samples of GBM tissue and GBM TSs were compared with the gene expression patterns. The mutation profile of TP53 was shared between the GBM original tissues and the matching-tissue-derived GBM TSs. A GBM-derived TS showed at least three different cellular states with common copy number variation signatures (chromosomal 7 gain and 10 loss). The cluster 0 was dominated by cycling cell signatures (UBE2S, HMGB2, CENPF). The cluster 1, the downstream of cluster 0 with RNA velocity analysis, expressed VIM and GAPDH as the dominant genes. The cluster 2 was expressing a relatively high level of GBM-related long-noncoding RNAs (MALAT1, MEG3, NEAT1) and mitochondrial genes. In the post-drug treatment transcriptome analysis, these types of cell clusters are deconvoluted and showed cluster-specific responses differing by treatment. Conclusions: GBM TSs resemble transcriptomic signatures of GBM tissues. Matching samples of tissues and TS revealed GBM TS as a reliable cellular model of GBM tumor cells. Single-cell RNA-sequencing revealed multiple cell clusters with similar chromosomal copy number variations. These multiple cell cluster can be applied to the identification of cellular state-wise responses to a perturbation, such as a drug treatment.

Studies on miRNA expression profiles and immunomodulatory effects of chicken exosomes in immune system

홍여진 중앙대학교 대학원 2022 국내박사

엑소좀은 세포에서 분비되는 작은 크기 (30-150 nm)의 소포로서 세포간의 신호전달에 중요한 역할을 한다. 엑소좀은 모세포로부터 단백질, 지방, 핵산 등을 이동시켜 수용세포로 전달함으로서 수용세포의 다양한 생물학적기작을 조절한다. 첫 번째 장에서는 그람 음성 세균의 lipopolysaccharide에 의해 활성화된 닭 대식세포 (HD11)로부터 얻은 엑소좀의 다양한 면역조절작용을 확인하였다. LPS-activated 엑소좀을 HD11에 처리하였을 때, IL-1β, IFN-γ, IFN-α, IL-4, CCL4, CCL17, CCL19 과 같은 다양한 사이토카인과 케모카인의 발현이 조절되었다. 또한 LPS-activated 엑소좀이 MyD88/NF-κB signaling pathway를 유도한다는 결과를 얻을 수 있었다. 두 번째장에서는 polyinosinic-polycytidylic acid (poly[I:C])로 활성화된 닭 대식세포 (HD11)로부터 얻은 엑소좀의 다양한 면역조절작용을 확인하였다. Poly(I:C)는 viral dsRNA로서 대식세포의 toll-like receptor 3에 의해 인지된다. Poly(I:C)-activated 엑소좀을 닭 대식세포와 T 세포 (CU91)에 처리한 결과, type Ⅰ interferons, pro-inflammatory cytokines, anti-inflammatory cytokines, chemokines 등의 발현이 조절되었으며, TAK1와 NF-κB1가 인산화 됨에 따라 NF-κB signaling pathway 유도 되었다. 세 번째장에서는 LPS와 poly(I:C)로 활성화된 닭 대식세포 (HD11)으로부터 얻은 엑소좀을 small RNA sequencing하여 miRNA 발현을 분석하였다. LPS-stimulated exosomes (LPS-EXO)과 unstimulated exosomes (CTRL-EXO)을 비교한 결과 36개의 differentially expressed miRNAs (DE miRNAs)가 확인되었으며, poly(I:C)-stimulated exosomes (POLY-EXO)과 CTRL-EXO를 비교한 결과 42개의 DE miRNAs가 확인되었다. LPS-EXO와 POLY-EXO를 비교한 결과 45개의 DE miRNAs가 확인되었다. miRDB와 TargetScan을 이용하여 target gene prediction을 한 뒤, Gene ontology 분석을 한 결과, 대부분의 target gene은 MAPK과 Wnt signaling pathway와 연관된것으로 나타났다. 또한, sequencing validation을 위해 gga-miR-142-3p, gga-miR-19a-3p, gga-miR-21-3p, gga-miR-301a-3p, gga-miR-338-3p, gga-miR-3523의 발현을 qRT-PCR 한 결과, sequencing 결과와 일치하는 것으로 나타났다. 따라서, 본 연구를 통해 LPS와 poly(I:C), 즉 박테리아와 바이러스 감염에 의해 대식세포로부터 방출되는 엑소좀의 miRNA 발현과 target gene의 면역조절기작에 대해 알 수 있었다. 네 번째장에서는 고병원성조류독감 바이러스 H5N1에 감염된 닭 (Ri chicken)으로부터 엑소좀을 추출하여 small RNA sequencing을 통해 exosomal miRNA 의 발현을 분석하였다. Mx와 BF2 유전자를 genotyping 하여 베트남 닭 Ri chicken을 저항성 (Mx/A; BF2/B21)과 감수성 (Mx/G; BF2/B13) 으로 나누었다. 고병원성조류독감바이러스 H5N1을 감염시킨 뒤, 3일 뒤 혈액으로부터 엑소좀을 추출하여 small RNA sequencing을 진행하였다. 감염되지 않은 저항성 닭으로부터 얻은 엑소좀과 감염된 저항성 닭의 엑소좀의 miRNA 발현을 비교한 결과, 총 20개의 differentially expression miRNAs (DE miRNAs)가 나타났다. 20개의 DE miRNAs에 대한 target gene을 Gene ontology분석한 결과, 다양한 면역관련 유전자들을 확인할 수 있었으며, MAPK signaling pathway와 관련된 유전자들을 확인할 수 있었다. qRT-PCR을 통하여 miRNA expression을 확인한 결과, sequencing 결과와 일치하는 것을 보였으며, 저항성 닭이 감수성 닭보다 miRNA expression level이 높은 것을 확인할 수 있었다. 본 연구를 통해, 고병원성조류독감 바이러스 H5N1의 감염에 대한 저항성 닭의 exosomal miRNA 발현을 알 수 있었으며, 이를 조류독감 바이러스에 대한 저항성 마커로 사용할 수 있는 가능성을 확인할 수 있었다. 다섯 번째장에서는 고병원성조류독감바이러스 H5N1에 감염된 닭으로부터 추출한 엑소좀이 면역세포에서 어떻게 면역조절작용을 하는지 확인하였다. White Leghorn을 고병원성조류독감바이러스 H5N1으로 감염시킨 뒤 4일 후, 혈액으로부터 엑소좀을 추출하여 닭 대식세포 (HD11), 섬유아세포 (DF-1), T 세포 (CU91), B 세포 (RP9)에 처리한 뒤, cytokine expression을 확인한 결과, type I interferon인 IFN-α와 IFN-β, type Ⅱ interferon인 IFN-γ의 발현이 증가하였으며, 더불어 IL-1β, IL-8의 발현 또한 H5N1감염 닭의 엑소좀에 의해 증가하였다. 또한, MAPK signaling pathway가 자극되었으며, 조류독감바이러스 단백질인 nucleoprotein (NP)과 non-structural protein 1 (NS1)이 엑소좀을 통해 세포로 전달되는 것이 확인되었다. 따라서, 본 연구를 통해 고병원성조류독감바이러스 H5N1 감염 닭으로부터 추출한 엑소좀이 면역관련 세포들의 pro-inflammatory cytokine의 발현을 증가시키고 MAPK signaling pathway를 유도하는 것을 알 수 있었다. 또한, 조류독감바이러스 단백질인 NP와 NS1이 엑소좀을 통해 면역관련 세포로 전달되는 것을 확인할 수 있었다. 이에 따라 엑소좀이 조류독감바이러스 백신으로 사용될 수 있는 가능성을 확인할 수 있었다. Exosomes are small membrane-extracellular vesicles produced from multivesicular bodies and play a role in cell-to-cell signaling. Exosomes from immune cells can regulate immune responses of recipient cells by releasing their contents. In the immune system, macrophages recognize lipopolysaccharides (LPSs) of gram-negative bacteria by toll-like receptor 4 (TLR4) and intracellular pathways, such as NF-κB pathway, are activated, inducing proinflammatory cytokine expression. However, no studies have investigated the functions of exosomes in chicken macrophages. In the first chapter, the purpose of this study was to demonstrate the immunoregulatory functions of LPS-activated exosomes in chicken immune systems. Therefore, chicken macrophages cells (HD11) were activated with LPS, and exosomes were purified. The LPS-activated exosomes enhanced the gene expression of cytokines and chemokines, including IL-1β, IFN-γ, IFN-α, IL-4, CCL4, CCL17, and CCL19, in naive chicken macrophages. Furthermore, LPS-activated exosomes induced the MyD88/NF-κB signaling pathway. Therefore, as an immune response against gram-negative bacterial infection, LPS-activated chicken macrophages can release exosomes that are delivered to inactivated macrophages by regulating the expression of immune-related genes and the MyD88/NF-κB signaling pathway. In the future, LPS-stimulated exosomes may be utilized as an immune stimulator. Macrophages also recognize viral dsRNA via Toll-like receptor 3 (TLR3), thereby inducing the activation of transcription factors such as interferon regulatory factor 3 (IRF3) and nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-κB). In second chapter, we aimed to identify the immunomodulatory functions of exosomes derived from chicken macrophages (HD11) stimulated with polyinosinic-polycytidylic acid (poly[I:C]); exosomes were then delivered into HD11 cells and CU91 chicken T cells. Exosomes purified from poly(I:C)-activated macrophages stimulated the expression of type Ⅰ interferons, pro-inflammatory cytokines, anti-inflammatory cytokines, and chemokines in HD11 and CU91 cells. Moreover, poly(I:C)-stimulated exosomes induced the NF-κB signaling pathway by phosphorylating TAK1 and NF-κB1. Therefore, we suggest that after the activation of TLR3 ligands following infection with dsRNA virus, chicken macrophages regulate the immune response of naive macrophages and T cells through the NF-κB signaling pathway. Furthermore, poly(I:C)-activated exosomes can be potentially utilized as immunostimulators. In third chapter, profiles of exosomal miRNAs from LPS and poly(I:C)-stimulated chicken macrophage cell line (HD11) were analyzed by small RNA sequencing to identify the composition of exosomal miRNAs and their regulatory mechanisms against bacterial and viral infections. Exosomes were purified after stimulation with LPS (1 μg/mL) and poly(I:C) (50 μg/mL) for 24 h. Then, exosomal RNA were analyzed for small RNA sequencing using the HiSeq 2500 System. Thirty six differentially expressed miRNAs (DE miRNAs) were obtained by comparing LPS-stimulated exosomes (LPS-EXO) and unstimulated exosomes (CTRL-EXO), 42 DE miRNAs in poly(I:C)-stimulated exosomes (POLY-EXO) and CTRL-EXO, and 45 DE miRNAs in LPS-EXO and POLY-EXO. Target genes of DE miRNAs were predicted using miRDB and TargetScan. KEGG pathway analysis showed that most of the target genes were related to mitogen-activated protein kinase and Wnt signaling pathways. Moreover, results of qRT-PCR for miRNAs (gga-miR-142-3p, gga-miR-19a-3p, gga-miR-21-3p, gga-miR-301a-3p, gga-miR-338-3p, and gga-miR-3523) were consistent with the sequencing results. This study will provide knowledge about immuno-regulatory mechanisms of exosomal miRNAs derived from macrophages against pathological insults such as bacterial and viral infections. In fourth chapter, Ri chickens were divided into resistant (Mx/A; BF2/B21) and susceptible (Mx/G; BF2/B13) trait by genotyping of Mx and BF2 genes. Then, Ri chickens were infected with H5N1, a highly pathogenic avian influenza virus (HPAIV). Exosomes were purified from blood serum of resistant chickens for small RNA sequencing. Sequencing data were analyzed using FastQCv0.11.7, Cutadapt 1.16, miRBase v21, non-coding RNA database, RNAcentral 10.0, and miRDeep2. Differentially expressed miRNAs were determined using statistical methods, including fold-change, exactTest using edgeR, and hierarchical clustering. Target genes were predicted using miRDB. Gene ontology analysis was performed using gProfiler. Twenty miRNAs showed significantly different expression patterns between resistant control and infected chickens. Nine miRNAs were up-regulated and 11 miRNAs were down-regulated in the infected chickens compared with that in the control chickens. In target gene analysis, various immune-related genes, such as cytokines, chemokines, and signalling molecules, were detected. In particular, mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway molecules were highly controlled by differentially expressed miRNAs. The result of qRT-PCR for miRNAs was identical with sequencing data and miRNA expression level was higher in resistant than susceptible chickens. This study will help to better understand the host immune response, particularly exosomal miRNA expression against HPAIV H5N1 and could help to determine biomarkers for disease resistance. In fifth chapter, we demonstrated immunomodulatory effects of exosomes from HPAIV H5N1-infected White Leghorn chickens on chicken macrophages, fibroblasts, T cell, and B cell lines. The expression of type I interferons (IFN-α and -β) were highly upregulated in immune-related cell lines after treatment with exosomes derived from H5N1-infected chickens. Levels of pro-inflammatory cytokines, such as IFN-γ, IL-1β, and IL-8, were also elevated by the exosomes. The mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway was stimulated in immune-related cells by such exosomes via phosphorylation of extracellular regulated kinases 1/2 and p38 signaling molecules. Furthermore, the H5N1 viral proteins, nucleoprotein (NP) and non-structural protein (NS1), were packaged in exosomes and successfully transferred to non-infected immune-related cells. Therefore, exosomes from H5N1-infected chickens induced pro-inflammatory cytokine expression and stimulated the MAPK signaling pathway by delivering key viral proteins. These findings would aid better understanding of the mechanism underlying the modulation of antiviral immune responses of host immune-related cells by viral-protein-carrying exosomes and support their further application as a novel exosome-based H5N1 AIV vaccine platform.

Application of RNA sequencing data to biomedical research : profiling of microbiome and gene expression change inferred by chromatin structure change in cisplatin resistance

신동진 서울대학교 대학원 2024 국내박사

최근 유전체연구는 NGS 기술의 발달로 인하여 비약적으로 발전하여 기초과학 영역에서부터 첨단 의학에 이르기 까지 거의 모든 생물학 분야에서 활용되며 매년 엄청난 양의 데이터가 생성되고 있다. 이에 따라 수많은 분석법들이 개발되고 있으며, 기존에 생성된 데이터를 새롭게 분석하는 등 유전체 데이터의 생성 못지않게 분석의 영역도 다채롭게 발달해 왔다. 뿐만 아니라 여러가지 유전체 데이터를 통합 하여 이른바 멀티오믹스 연구를 통하여 DNA 에서 단백질에 이르는 흐름에 맞추어 생물학적 메커니즘을 정확하게 분석 하는 것이 중요한 연구 과제로 떠오르고 있다. . 이에 본 연구에서는 두 종류의 유전체 데이터를 활용하여 최신 인간 참조 유전체를 이용하는 새로운 분석방법과 파이프라인을 소개하고자 한다. 기존에 생성되었던 전사체 데이터에서 새로운 의의를 찾고, 기 생성된 전사체 데이터와 새롭게 생성된 크로마틴 구조 데이터를 결합하여 유전자 발현의 후성유전학적 매커니즘을 찾아내고자 하였다. 첫번째로, NGS 시대의 도래 이 후 가장 활발하게 분석되었던 전사체 데이터의 인간 참조 게놈에 매핑되지 않는 리드에 주목하였다. 이는 대부분의 분석에서 시퀀싱 에러로 취급되어, 버려지는 데이터 이지만 다른 정보를 담고 있는 영역이기도 하다. 그 중 가장 대표적인 것이 샘플에 감염된 박테리아와 바이러스에 대한 정보이다. 대부분 무시되는 정보이지만 어떤 생체조직의 전사체 데이터 인가에 따라 그 중요도와 신뢰도는 충분히 향상될 수 있다. 이에 우리는 감염에 취약한 폐조직에 생기는 질환인 COPD(Chronic Obstructive Pulmonary Disease) 환자의 병변 조직과 정상 조직을 비교하여 매핑되지 않는 리드에서 어떤 차이가 나는지 조사하였고, 새로운 분석 파이프라인을 수립하여 최종적으로 정상조직에 비하여 COPD 조직에 많이 존재하는 박테리아를 찾아낼 수 있었다. 두번째 연구는 Hi-C(High throughput chromatin conformation capture) 시퀀싱 데이터를 활용하여 약물 저항성과 크로마틴 구조 변화와의 관련성을 알아보고자 하였다. 난소암 세포주를 이용하여 시스플라틴에 저항성을 가지는 세포주에서 유전자 발현 변화를 유발할 수 있는 크로마틴 구조와 상관관계를 살펴 봤으며, 이를 통하여 전체 크로모좀 차원에서의 A/B compartment의 변화가 발현량의 변화가 높은 유전자에 집중되어 있고 원거리의 inter-chromosomal 구조의 변화가 국지적인 TAD와 loop의 변화를 야기하여 변화한 TAD 영역에 속해있는 유전자들의 발현이 변화 할 수 있음을 살펴보았다. 이번연구에서 밝히고자 하였던 것은 두가지 이다. 첫번째, 기 생성되 데이터에서 새로운 의미를 찾아낼 수 있는 분석 파이프라인을 개발하는 것이었는데, RNA-seq 데이터는 이제까지 유전자의 발현량을 살펴보는 목적이외에 활용가치를 증명하기 어려웠다. 하지만 RNA-seq 데이터에 있는 예측하기 힘든 read들을 bacterial read로서 찾아내고 이를 증명함으로서 버려지는 수많은 unmapped read들을 다시금 살펴볼 수 있는 계기가 되도록 하였다. 두번째로, 서로 다른 두 종류의 데이터에서 연관성을 찾아 유기적으로 변화하고 반응하는 생명 정보의 흐름을 찾아내는 것이었다. Hi-C 데이터는 전체 지놈에 걸쳐 크로마틴 구조를 살펴볼 수 있다는 점에서 매우 특별한 데이터이다. 하지만 이러한 구조변화가 결국 야기하는 결과는 유전자의 발현량일 것이다. 즉 결과적으로 일어난 유전자 발현이라는 일련의 사건을 파헤치기 위하여 크로마틴의 구조변화에서 근거를 찾아내야 하는 것이다. 따라서 이러한 변화를 종합적으로 규명하기 위해서는 다양한 데이터의 통합이 필요하며 그 중 RNA-seq 데이터와 Hi-C 데이터를 사용하여 유전자 발현에 영향을 줄 수 있는 구조적 변화를 찾아냈다는 점에서 의미가 있었다. 데이터의 생성뿐만 아니라 분석이 더욱 중요해지고 있는 시점에서 다양한 유전체 데이터 사이의 연관성과 새로운 정보를 찾는 일은 매우 중요할 것이다. 현존하는 수많은 데이터들은 서로간의 상관관계가 있는 데이터들이다. 예를 들어 DNA의 구조 및 단일염기등의 변화는 유전자 발현에 직접적으로 혹은 간접적으로 영향을 주기도 한다. 또한 DNA의 구조변화를 야기하는 원인에는 histone modification, DNA 메틸화 등 다양한 후성유전학적 변화가 포함된다. 이러한 모든 변화 양상을 종합적으로 검토하고 유전자 발현량의 살펴보는 것이 최신 유전체 연구의 트렌드이다. 따라서 본 연구는 RNA-seq 데이터를 다양한 측면에서 분석함으로써 RNA-seq의 새로운 용도를 검증하였고, 크로마틴 구조변화를 근거로 다양한 유전자의 발현 변화를 살펴봤다는 점에서 큰 의의가 있다. 이러한 연구는 특히 암 연구와 기타 다른 질병의 연구에서 더욱 활발하게 이루어져야 하며 새로운 약물 타겟을 찾기 위하여 과발현, 혹은 하향 조절된 유전자의 명확한 기전을 이해하는 것이 중요함을 알 수 있게 해주었다. Recent advancements in genome research have been accelerated by the development of Next-Generation Sequencing (NGS) technologies, which are now utilized across nearly all biological fields, from basic science to advanced medicine, generating vast amounts of data annually. Consequently, numerous analytical methods have been developed, and the realm of data analysis has evolved to be as diverse as the data generation itself. Moreover, integrating various genomic data through so-called multi-omics research to precisely analyze biological mechanisms from DNA to proteins has emerged as a significant research challenge. In this study, I introduce a novel analytical method and pipeline utilizing the latest human reference genome and two types of genomic data. I aim to find new significance in previously generated transcriptome data and combine it with newly generated chromatin structure data to uncover the epigenetic mechanisms of gene expression. First, I focused on reads that do not map to the human reference genome from transcriptome data, which has been most actively analyzed since the advent of the NGS era. These reads are often discarded as sequencing errors in most analyses, but they may contain other valuable information, such as data on bacteria and viruses infecting the sample. Although this information is typically ignored, its importance and reliability can be enhanced depending on the type of biological tissue analyzed. I compared biopsy tissues from patients with Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) to normal tissues, focusing on unmapped reads, and established a new analytical pipeline. This allowed me to identify bacteria more prevalent in COPD tissues compared to normal tissues. The second study explored the relationship between drug resistance and chromatin structure changes using Hi-C (High-throughput chromatin conformation capture) sequencing data. By analyzing ovarian cancer cell lines resistant to cisplatin, I examined the correlation between chromatin structure changes and gene expression changes. I found that changes in A/B compartments at the whole-chromosome level were concentrated in genes with high expression changes, and inter-chromosomal structural changes caused local changes in TADs (topologically associating domains) and loops, affecting gene expression within the altered TAD regions. This research had two main objectives: First, to develop an analytical pipeline to find new significance in previously generated data. RNA-seq data, traditionally used to observe gene expression levels, was utilized to identify bacterial reads from unexpected reads, providing a new perspective on numerous discarded unmapped reads. Second, to identify organic changes and responses in biological information by finding correlations between different types of data. Hi-C data is unique in that it allows observation of chromatin structure across the entire genome. However, the ultimate consequence of these structural changes is gene expression changes. Thus, to uncover the series of events resulting in gene expression changes, evidence must be found in chromatin structural changes. Integrating various data types, I identified structural changes affecting gene expression using RNA-seq and Hi-C data. At a time when analysis is becoming as crucial as data generation, finding new information and correlations between different genomic data is essential. Numerous existing data sets are interrelated; for example, changes in DNA structure and single nucleotides can directly or indirectly affect gene expression. Epigenetic changes, such as histone modifications and DNA methylation, that cause structural changes in DNA are also important. Reviewing all these changes comprehensively and examining gene expression levels is a trend in modern genomic research. Thus, this study validated new uses for RNA-seq data through multi-faceted analysis and examined gene expression changes based on chromatin structural changes, highlighting its significance. This approach should be actively pursued in cancer research and other disease studies to find new drug targets and understand the mechanisms of overexpressed or downregulated genes.

Exploring dynamic transcriptome variation in thyroid cancer and aged kidneys through single-cell RNA sequencing

김경대 광주과학기술원 대학원 2025 국내박사

Single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) has revolutionized transcriptomic research by enabling the detailed examination of gene expression at the individual cell level, thereby overcoming the limitations of bulk RNA sequencing. This high-resolution approach enhances our understanding of cellular diversity, dynamic responses, and intricate heterogeneity across various biological contexts, including disease progression and immune modulation. scRNA-seq is particularly useful for studying complex tissues, such as the kidney, brain, and tumor microenvironments, as it elucidates previously elusive cell-cell interactions and responses. Despite its advantages, significant gaps remain in understanding the mechanisms underlying diseases, leading to limitations in treatment options across various diseases, including cancer. In particular, the dedifferentiation process in cancer, associated with poor prognosis and high recurrence rates, is poorly understood. Additionally, the detection of low abundance transcripts, such as long noncoding RNAs (lncRNAs), poses challenges for current RNA sequencing methodologies. To address these challenges, this study employed scRNA-seq to investigate the dedifferentiation process in thyroid cancer and its associated tumor microenvironment. By integrating scRNA-seq with whole exome sequencing, I identified copy number amplification of CREB3L1 as closely associated with dedifferentiation. Furthermore, I demonstrated that elevated expression levels of CREB3L1 were linked to decreased survival rates. I also introduced a novel targeted single-cell RNA sequencing approach designed to identify rare transcripts, including lncRNAs, leading to the discovery of tissue- and age-specific lncRNAs. I explored the functional roles of these lncRNAs by constructing gene regulatory networks and observed dynamic expression changes during aging, particularly in glomerular cells. Collectively, my findings provided insights into the heterogeneity and molecular evolution of thyroid cancer, highlighting the potential driver role of CREB3L1 in its dedifferentiation process. Additionally, I illuminated the comprehensive landscape of lncRNA expression and function, offering a valuable resource for future analyses. This work aims to deepen our understanding of critical biological mechanisms across various diseases and tissues, leveraging single-cell transcriptomic analysis to reveal molecular changes and cellular dynamics.

Cellular function analysis by non-negative matrix factorization of single-cell RNA-sequencing data

강지선 Graduate School, Yonsei University 2024 국내석사

The single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) method broadened the scope of biological research by introducing higher resolution of gene expression at the single-cell level. Previous studies in the field of cancer biology have focused on the interaction within the tumor microenvironment (TME). The intertumoral and intratumoral cancer heterogeneity is also an important aspect in cancer studies. I discovered the need to investigate the biological characteristics of cancer cells as well as TME and decided to conduct studies in hepatocellular carcinoma (HCC) which shows high mortality rate in population of South Korea. Various studies have been conducted concerning the features of HCC in bulk RNA-seq level, enabling molecular classification of the cancer. However, due to the resolution of the technology, it is difficult to classify the features of cancer cell itself. Meanwhile, non-negative matrix factorization (NMF) analysis is widely used in pan-cancer level to find the common features of cancer cells within different cancer types due to its ability to create functional modules that are biologically significant. In addition, the differentially expressed genes (DEGs) has the limitation of representation of global features of the cancer cells due to the intertumoral heterogeneity. Therefore, I decided to use NMF in analysis of HCC cancer cells to find intrinsic features that lacked information and define cancer cells in single-cell level by constructing programs and finding important genes. The single-nucleus RNA-seq data was then used for confirming the programs found. The gene expression programs enabled the classification of cancer cells into proliferation class and differentiation class, which are subtypes of HCC previously reported in bulk RNA-seq level. 기존의 간암 연구가 종양 미세 환경에 중점을 두어 진행되었던 점을 고려하여 암세포의 내재적인 특징을 분석하고, 기존에 제시된 간암 분류 방식에 대응시키고자 하였다. 암세포의 종양 이질성의 특성상 차등 발현 유전자를 통해 암세포의 전반적 특성을 분석할 수 없는 것을 고려하여 비음수 행렬 분해를 통한 단일 세포 전사체 분석을 활용하였다. 해당하는 프로그램들이 높게 발현하고 있는 유전자를 통해 각각의 프로그램의 생물학적 기능을 판별하고, 암세포의 연결 구조 분석을 통해 암세포의 분화에 따른 프로그램 발현에 어떠한 차이가 있는지 확인하였다. 이후 스코어링 방식을 통해 단일핵 전사체 데이터에 해당 프로그램의 발현 정도를 적용하였다. 단일핵 전사체 데이터에서 프로그램의 발현이 나타나는 것을 확인하여 찾은 프로그램이 환자의 이질성과 무관하게 나타남을 알 수 있었다. 또한, 기존 연구에서 밝혀진 간암의 유전자 발현 프로그램 가운데 간의 대사 작용과 관련이 있는 프로그램을 더욱 세분화하였다. 세분화한 프로그램 가운데 정상 조직과 공유하지 않는 프로그램을 특정할 수 있었다. 세포간 상호 작용 분석을 통해 특정 프로그램을 높게 발현히는 세포군과 종양 미세 환경이 어떠한 상호 작용을 하고 있는지 확인하였다.

Transcriptome-wide analysis of poly(A) tail and RNA-protein interaction

장혜식 서울대학교 대학원 2014 국내박사

RNAs store and transfer information among constituents of the cell. From their biogenesis to processing, transport, translation, catalysis, and decay, many cellular factors are involved to achieve tight regulation. Following the development of high-throughput DNA sequencing, it has become an essential tool to scrutinize RNA molecules in the cell in unprecedented scale and depth. This thesis concerns methodological advances in two aspects of RNA regulation. First, I develop a novel method to survey global status of polyadenylation that takes a fundamentally different approach from the existing techniques. Despite its importance in gene regulation, global investigation of the 3′ extremity of mRNA has not been feasible due to technical challenges associated with homopolymeric sequences and relative paucity of mRNA. The new technique, named as TAIL-seq, allows measuring poly(A) tail length at the genomic scale for the first time. I also discover widespread uridylation and guanylation at the downstream of poly(A) tail. The U-tails are generally attached to short poly(A) tails (<25 nt) while the G-tails are found mainly on longer poly(A) tails (>40 nt), implicating their generic roles in mRNA stability control. Furthermore, TAIL-seq identifies, with a single nucleotide resolution, numerous nucleolytic events involved in microRNA processing and mRNA cleavage. TAIL-seq will enable exploration of unforeseen diversity of RNA processing and modification. Secondly, I describe an array of new analytic methods to crosslinking, immunoprecipitation, and sequencing (CLIP-seq) to enhance its utility in the investigation of RNA-protein interactions. CLIP-seq arose as one of the standard techniques to retrieve transcriptome-wide information of RNA-protein interactions in last few years. However, generalized analysis techniques and tools have been missing unlike the other RNA-seq applications. In this study, I generalize analytic workflow for binding site identification by developing new methods. I also provide an open source toolchain that covers most of the common analyses performed for CLIP-seq. In addition, I present ecliptic, a fully automated pipeline, and it will speed up the research of RNA-protein interactions and make more information accessible to researchers. High-throughput experiments are expanding biology by providing unbiased view and leading to unexpected observations. In this thesis, I introduce two types of development for global investigation of poly(A) tails and single nucleotide resolution survey of RNA-protein interactions. By applying these methods, I discover several phenomena at the 3′ end of RNAs and the binding interfaces between RNA and RBPs. Further development and improvement will offer an ample opportunity for the discovery of unforeseen regulatory pathways. 리보핵산(RNA)은 정보를 저장하고 세포 구성 물질 간에 정보를 전달하는 매개 물질이다. RNA의 생성부터 처리, 운반, 단백질 번역, 촉매 작용, 분해까지 세포 안의 많은 구성요소들이 정해진 생리적 현상을 일으키기 위해 RNA을 정확히 조절한다. 대용량 디옥시리보핵산(DNA) 서열분석 기술의 개발에 따라, RNA 조절 분야의 연구자들은 빠르게 이 기술을 받아들여 기존에 없었던 정밀도로 세포 안의 RNA를 관찰하기 시작했다. 이제 해당 분야의 획기적 발견들은 대부분 대용량 서열분석에 강하게 의존하고 있다. PIWI-상호작용 RNA, 단백질을 만들지 않는 긴 RNA (lincRNA), lincRNA의 주요 작용 메커니즘, 기존 경로와 다른 마이크로RNA의 신생성 과정, RNA 접합 조절 등이 모두 대용량 서열분석을 이용한 새로운 발견이다. 이 논문에서 나는 두 가지 종류의 RNA 조절을 연구하는데 사용될 기술을 새롭게 개발하고 그를 응용한다. 첫 번째로, 세포 전체의 아데닐산중합반응 상태를 조사할 수 있는 새로운 방법을 개발했다. 전령RNA의 3′ 말단은 유전자 발현 조절에서 아주 중요하지만, 단독중합체는 서열을 해독하기 매우 어렵기 때문에 전사체 수준에서 분석할 수 없었다. TAIL-seq이라고 명명된 기술을 개발하여, 폴리아데닐산 꼬리 길이를 유전체 전체에서 최초로 잴 수 있었다. 또한, 나는 폴리아데닐산 꼬리 뒷 부분에 유리딘화와 구아닌화가 광범위하게 일어난다는 사실을 발견하였다. 유리딘 꼬리는 보통 25 nt 미만의 짧은 폴리아데닐산 꼬리 뒤에서 관찰되었고, 구아닌 꼬리는 40 nt 이상의 긴 폴리아데닐산 꼬리 뒤에서 주로 발견되었다. 이는 유리딘과 구아닌 꼬리가 전령RNA의 안정성 조절에 관련이 있을 수 있음을 시사한다. 그리고, TAIL-seq 분석 결과 마이크로RNA와 전령RNA의 가공과 분해에 관련된 많은 종류의 핵산 분해 현상이 단일 염기 단위 해상도로 관찰되었다. 따라서, TAIL-seq을 이용하여 RNA 가공과 수식에 관련된 예측하지 못한 현상들을 살펴볼 수 있을 것이다. 두 번째로 나는 자외선 교차결합, 면역침강 후 서열분석법(CLIP-seq)을 개선함으로써 RNA와 단백질의 상호작용을 분석하는데 유용하게 사용할 수 있는 방법들을 개발하였다. CLIP-seq은 RNA와 단백질 상호작용 정보를 전사체 범위로 연구하는 데 있어 필수적인 도구 중의 하나로 떠올랐다. 그러나, 아직 다른 RNA 서열분석법들과 달리 일반화된 방법론과 도구가 정립되지 않았다. 이 연구를 통해 새로 개발된 통계적, 시각적 분석 방법들은 예전에 쉽게 관찰할 수 없었던 새로운 정보를 드러낼 수 있을 것이다. 추가로, 새로이 개발된 CLIP 분석 도구 모음인 ecliptic은 RNA와 단백질 상호작용 연구를 더 빠르게 할 것이며 연구자들이 더 많은 정보에 접근하기 쉽도록 만들 것이다. 이 논문에서는 폴리아데닐산 꼬리의 전체적인 연구와 RNA 단백질 간 상호작용의 특정성에 대한 단일 염기 단위 해상도 조사법에 대해 기술적인 개선을 이루었다. 이로써, RNA의 3′ 말단과 RNA와 RNA 결합 단백질 사이의 인터페이스에 대한 여러 현상들을 발견했다. 대용량 실험 기법들은 편향되지 않은 시각을 제공하고 기존 방법으로 알기 어려웠던 현상을 관찰할 수 있게하여 생물학의 범위를 확장시키고 있다. 기존 기술들의 유연한 변용을 통해서 새로운 발견의 기회가 더욱 늘어날 것으로 보인다.

Genetic analysis of hereditary gingival fibromatosis using whole exome and RNA sequencing

김유리 Graduate School, Yonsei University 2016 국내박사

Efflux Pump Gene Expression Study Using RNA-Seq in Multidrug-Resistant Mycobacterium tuberculosis

이재준 경희대학교 대학원 2020 국내박사

Background: Drug resistance in Mycobacterium tuberculosis is a major global health problem. In fact, multidrug resistance (MDR) tuberculosis decreases treatment success rate and increases mortality rate. It is thus important to understand how drug resistance mechanisms work. However, still much of the resistance mechanisms in second-line anti-tuberculosis drugs used for MDR tuberculosis treatment remains unknown. Whereas MDR efflux pumps can explain many drug resistances and therefore be considered as potential therapeutic targets research on the efflux pump of M. tuberculosis is still rare. As such, this study investigated differences in the expression levels of efflux pump genes according to kanamycin and ofloxacin exposed in M. tuberculosis with/without associated mutations using RNA-seq. Materials and Methods: A total of four MDR strains were selected; two kanamycin resistance strains (M114; rrs wild-type and M125; A1401G mutant type) and two ofloxacin resistance strains (X39; gyrA wild-type and M137; codon 94 GAC (asp) →GGC (gly) mutant type). H37Rv was prepared as a control. All four MDR strains had no eis and no gyrB mutations. Each strain was inoculated at 7H9 broth with 0%, 25%, and 50% drug concentrations of MIC and RNA was extracted. RNA sequencing was performed using Illumina HiSeq 4000 (Illumina). The differentially expressed genes that showed two or more fold expression changes were taken and visualized using the KEGG pathway and hierarchical clustering with heat map. The top 12 genes with high volume value were selected and analyzed using volume plot. For comparison with previous studies, total 66 efflux pump genes were selected through literature review, and the expression level of these genes in this study were analyzed. Results: In kanamycin resistance strains, the number of differentially expressed genes (total: 2,692) in M114 was higher than that of M125 (total: 63). The largest fold changed genes which related to efflux pump mechanism in M114 under MIC25 and MIC50 kanamycin exposure was Rv3219 (whiB1). In ofloxacin resistance strains, the X39 (total: 193) expressed more genes than M137 (total: 83). The largest fold changed genes in X39 under MIC25 and MIC50 ofloxacin exposure were Rv2846c (efpA). In M125 and M137, the efflux pump related genes were not ranked in the top 12 genes. Notably, the regulator gene whiB7 also showed a large positive fold change by kanamycin exposure. Of the 66 selected efflux pump genes, 8 genes showed significant expression changes in this study. Among them, in comparison to the expression fold change with H37Rv under the kanamycin exposure condition, the greatest positive fold change was observed in Rv1258c. Conclusions: RNA-seq can be used for efflux pump research with comprehensive data to discover new efflux pump genes and regulatory genes that may contribute to drug resistance. The large changes in the expression of efflux pump genes and regulatory genes by drug exposure seen in this study may be a helpful finding to identify new resistance mechanisms. To better understand efflux pump related drug resistance mechanisms, further research on a larger group of drug-resistant M. tuberculosis would be necessary. 배경: Mycobacterium tuberculosis의 약물 내성은 세계 보건의 주요 문제이다. 다제내성결핵/광범위내성결핵균은 치료 성공률을 낮추고 사망률을 증가시키기 때문에 약물내성 기전을 이해하는 것이 중요하다. 그러나 여전히 다제내성결핵/광범위내성결핵균에 사용되는 2차 항결핵제 내성 기전의 적지 않은 부분은 밝혀져 있지 않다. 유출펌프는 많은 약물 내성을 설명할 수 있는 기전이며 잠재적인 치료 표적이 돌 수 있다. 그러나 결핵균에서 유출펌프에 대한 이해는 현재도 매우 부족하다. 이 연구에서는 다제내성 M. tuberculosis에서 kanamycin과 ofloxacin exposure하에 대표적 내성 관련 돌연변이 유무에 따른 유출펌프 유전자의 발현수준의 차이를 RNA-seq을 이용하여 결핵균의 2차약제 내성을 설명할 수 있는지 알아보았다. 대상과 방법: 단일 콜로니 단리 후 kanamycin 내성 표현형 보이면서rrs A1401G 돌연변이가 있는 균(M125)과 없는 균(M114), ofloxacin 내성 표현형을 보이면서 gyrA codon 94 GAC (asp)→GGC (gly) 돌연변이가 있는 균(M137)과 없는 균(X39), 대조 군으로 H37Rv를 준비하였다. 네 내성 균주 모두 eis와 gyrB 돌연변이는 없었다. 각 균주를 kanamycin 과 ofloxacin 각각MIC의 0%, 25%, 50%농도의 7H9 broth 에 접종하여 RNA를 추출 하였다. RNA sequencing은 Illumina HiSeq 4000을 이용하였다. 이 실험에서2배 이상 차등발현된 유전자를 KEGG pathway 와 hierarchical clustering를 이용하여 시각화 하였고, volume plot분석에서 상위 12개 유전자를 선정하여 분석하였다. 선행 연구들과 비교를 위하여 약제 저항을 유발할 가능성이 있는 유출펌프 유전자 71개를 문헌 고찰을 통하여 선별하였고, 이들 유전자가 이 연구에서 발현된 수준을 분석하였다. 결과: Kanamycin카나마이신 내성 균주 중, M114에서 차등발현 된 유전자(총: 2692)의 수는 M125(총: 63) 보다 더 많았다. Ofloxacin 내성 균주 중, X39(총: 193개)는 M137(총: 83) 보다 더 많은 유전자를 발현하였다. Kanamycin과 ofloxacin exposure 조건에서 유출펌프 기전과 관련되어 가장 높은 발현 변화를 보인 유전자는 각각, M114에서 Rv3219(whiB1), X39에서 Rv2846c 이었다. M125 및 M137에서는 상위 12개 유전자 중에 유출펌프와 관련된 유전자는 확인되지 않았다. 문헌고찰을 통해 선정된 약물 내성 연관 유출펌프 71개 유전자 중에서 8개의 유전자가 이 실험에서도 의미있는 결과를 보였으며, H37Rv의 발현 정도와 비교한 결과, kanamycin exposure 조건에서 Rc1258c가 가장 높은 발현 증가를 보였다. 결론: RNA-Seq 은 약제 내성에 기여하는 새로운 유출펌프 유전자를 연구하는데 효과적일 수 있다. 이 연구에서 이루어진 약제 exposure 조건에서 높은 발현 변화를 보인 유출펌프 유전자들은 새로운 약제 내성 기전을 밝히는데 도움이 될 것이다. 더 많은 다제내성 결핵, 광범위 약제 내성 결핵 그룹을 이용한 추가 연구는 유출펌프 관련 약물 내성 기전을 이해하는 데 기여할 것이다.