벼에서의 세로토닌과 멜라토닌 생합성 기작에 관한 분자생물학적 특성분석

박상규 전남대학교 대학원 2012 국내박사

CHAPTER I Rice NADPH-cytochrome P450 Reductases differentially affect cytochromeP450-mediated serotonin and melatonin biosynthesis in rice Eukaryotic cell 내에는 약 450여 가지에 달하는 많은 종류의 membrane- bound cytochrome P450 monooxygenases (P450s)가 존재한다. NADPH- cytochrome P450 reductases는 P450에 전자를 제공하여 P450의 활성을 촉진한다. 다양한 plant P450의 E. coli에서의 발현을 통한 P450의 대사산물 생산 연구는 E. coli의 내재적 electron donation system과 plant P450과의 호환성이 미미한 관계로 그 한계를 지닌다. 본 연구에서는 벼의 NADPH- cytochrome P450 reductases(OsCPR)를 cloning 및 characterization하여, serotonin을 생산하는 벼의 P450인 tryptamine 5-hydroxylase (T5H)에 가장 적합한 OsCPR을 발굴하고자 하였으며 그 결과 OsCPR1, OsCPR2, OsCPR3의 세가지 유전자를 발굴하였다. 벼의 조직 별, 다양한 처리구 별로 이들의 mRNA 발현 양상을 조사한 결과 OsCPR1, OsCPR2는 비교적 상시 발현하는 양상으로 보이는 반면 OsCPR3는 이들에 비해 낮은 발현량을 나타냈다. 또한 세가지 OsCPR모두 drought, 제초제, 중금속 처리구에서 높은 발현유도 양상을 나타냈다. GFP fusion을 통한 OsCPR protein의 tobacco세포내에서의 localization을 확인한 결과 세가지 모두 endoplasmic reticulum으로 targeting되는것으로 확인되었다. N-terminal deletion된 OsCPR1 과 OsCPR2 protein을 정제하여 kinetic assay를 수행한 결과 Δ105OsCPR2 protein이 정제가 가장 용이하며 기질친화도 역시 높게 나타났다. 한편 OsCPR1,2,3와 T5H 의 호환성 확인 및 bacteria를 통한 serotonin 과다 생산을 모색하기 위한 접근으로 OsCPR과 N-terminal deleted Δ37T5H를 E. coli내에서 co-expression하여 serotonin생산량을 측정하였다. 그 결과 co-expression시 Δ37T5H만을 발현시킨 것에 비해 serotonin생산량이 OsCPR1,2,3 모두에서 증가하였으며 특히 OsCPR2의 경우 10배이상 증가하였다. 아울러 N-terminal deleted OsCPR2와 Δ37T5H의 co-expression의 경우 full length OsCPR보다는 낮으나 control에 비해 높은 serotonin 생산량을 나타냈다. 이러한 결과는 OsCPR2와 T5H가 가장 호환성이 높은 조합이라는 것을 나타내며 이들의 protein간 상호interaction은 N-terminal membrane spanning domain이 없어도 이루어진다는 것을 나타낸다. 그러나 N-terminal deletion에 비해 full length OsCPR 발현 시 가장 높은 T5H 활성도를 나타내므로 OsCPR의 N-terminal은 최상의 활성도를 위한 중요한 요소이다. 한편 GST pull-down, Ni-NTA pull down assay를 통하여 OsCPR과 T5H간의 protein- protein interaction을 확인하였으며 그 결과 OsCPR1,OsCPR2 모두 T5H와 직접적인 binding을 하는 것으로 나타났으며 OsCPR1에 비해 OsCPR2가 높은 binding affinity를 보이는 것을 확인하였다. 한편 12시간 light/12시간 dark cycle조건에서 배양된 3주된 벼의 TDC1, T5H, OsCPR 발현양상을 조사하여 light/dark cycle에 따른 serotonin 함량변화에 위 유전자들이 어떠한 양상으로 관여하는지를 확인하였다. TDC1과 T5H의 경우 light period에 미세하게 발현량이 증가하였으며 OsCPR1은 변화가 없었고, OsCPR3는 light에서의 미세한 증가 양상이, OsCPR2는 light에서의 두드러진 발현 증가양상이 나타났다. 이에 상응하여 light period에서 tryptamine, serotonin 과 melatonin이 증가하는 것을 확인하였다. 이를 통해 OsCPR2는 light/dark cycle에 따른 벼의 serotonin, melatonin 생합성 조절에 있어서 중요한 요소임을 알 수 있다. CHAPTER II Tryptamine 5-hydroxylase-deficient Sekiguchi rice induces synthesis of 5-hydroxytryptophan and N-acetyltryptamine but decreases melatonin biosynthesis during senescence process of detached leaves Serotonin 생합성 효소인 Tryptamine 5-hydroxylase (T5H) 유전자의 knock out mutant인 Sekiguch rice는 유도된 노화과정(senescence)에서 wild-type인 Asahi rice보다 많은 양의 tryptamine과 N-acetyltryptamine이 축적되었다. 한편 T5H activity가 부재함에도 불구하고 senescence시 Sekiguchi에서 소량의 serotonin이 검출되었다. 이것은 senescence에 의해 5-hydroxytrptophan 생합성이 유도되고 decarboxylation되어 serotonin으로 변환될 수 있기 때문이다. 따라서 Sekiguchi와 Asahi 모두 senescence 유도 후 6일 까지는 serotonin의 acetylated form인 N-acetylserotonin이 비슷한 수준으로 검출된다. 한편 Sekiguchi leaf에서는 이 시기에 다량의 N-acetyltryptamine이 축적되는데 이것은 벼의 arylalkylamine N-acetyltransferase (AANAT) enzyme에 의해 tryptamine이 acetylation되기 때문이다. senescence 유도 후 6일까지 비슷한 수준의 N-acetylserotonin이 축적되었음에도 Sekiguchi 에서는 Asahi에 비해 매우 낮은 수준의 melatonin이 검출되었다. 이는 Sekiguchi내의 증가된 N-acetyltry.ptamine이 melatonin생합성을 저해하기 때문이다. 이것은 senescence 기간 동안 0.1 mM N-acetyltryptamine의 외부처리 시 Asahi에서의 melatnin생합성이 완전히 저해된 것으로서 확인할 수 있다 CHAPTER III Cloning and characterizations of rice N-acetylserotonin methyltransferase isotypes 벼에서 Melatonin을 생합성하는 효소인 (Oryza sativa) N-acetylserotonin methyltransferase (osASMT),의 세가지 putative isotypes(osASMT11, osASMT13, osASMT15)에 대한 cloning및 characterization을 수행하였다. 아미노산 서열은 매우 높은 유사성을 나타냈으나 mRNA level 에서의 발현양상은 다소 차이를 보였다. osASMT15의 경우 벼의 leaf에서 높은 발현양상을 나타냈으며, osASMT13은 flower에서 두드러진 발현을 나타냈다. osASMT11과 osASMT15는 발현양상이 유사하게 연동되는 반면 osASMT13은 발현률 자체가 매우 낮았다. GFP fusion을 통한 osASMTs protein의 tobacco세포내에서의 localization을 확인한 결과 모두 microbody로 targeting되는것으로 추정된다. osASMT15는 기존에 cloning되어 bacterial expression을 통한 media assay로 activity가 확인된 바 있으나 정제를 통한 kinetic assay는 진행되지 않았다. 본 연구에서는 osASMT15의 bacterial expression을 통한 정제 및 kinetic assay를 통한 효소의 특성분석을 수행하였으며, 또한 세가지 osASMT 유전자들을 각각 과다발현 시킨 벼 형질전환체를 구축하여 분석하였다. osASMT11과 osASMT15 형질전환체 에서 증가된 melatonin 함량이 검출되었다. 정제된 GST-fused, GST-free osASMT15의 specific activity는 각각 6.6과 12.6 pmol/min/mg protein으로 확인되었으며 GST-free osASMT15는 864μm의 Km value를 나타냈다. 한편 동물의 ASMT와는 달리 osASMT15는 높은 기질농도에 의한 활성도의 저해가 나타나지 않았다. CHAPTER I Rice NADPH-cytochrome P450 Reductases differentially affect cytochromeP450-mediated serotonin and melatonin biosynthesis in rice NADPH-cytochrome P450 reductases (CPR; E.C.1.6.2.4) donate electrons to a large number of membrane-bound cytochrome P450 monooxygenases (P450s) that exist in eukaryotic cells. Production of P450-mediated metabolites in Escherichia coli has been limited due to the lack of bacterial electron donors compatible with various plant and mammalian P450s needing to be expressed. Here, we describe cloning and characterization of three rice (Oryza sativa) CPRs (OsCPRs) that are potential donors to plant P450s, including tryptamine 5-hydroxylase (T5H) in serotonin synthesis and cinnamate 4-hydroxylase (C4H) in phenylpropanoid synthesis. With 76% amino acid identity shared among these three OsCPRs, OsCPR1 and OsCPR2 transcripts are constitutively expressed in rice leaves, whereas OsCPR3 transcripts are expressed at a marginal level. Notably, all three OsCPR transcripts are induced to varying degrees by drought, herbicides and metal stress (CdCl2). Fusion of the OsCPR proteins with a GFP reporter indicated that all three are exclusively targeted to the endoplasmic reticulum in tobacco protoplasts. Co-expression of full-length OsCPR1, OsCPR2 and OsCPR3 with either T5H or C4H in E. coli indicated that the OsCPR2/T5H and OsCPR2/C4H constructs displayed the highest T5H and C4H catalytic activities, yielding levels of serotonin and 4-coumaric acid that were 10- and 14-fold higher than in control strains lacking CPR. Co-expression of different N-terminal deletion mutants indicated that the N-terminal residues of OsCPR2 were required for peak electron transfer activity to P450 even though deletion mutants with short N-terminal deletions were capable of functioning as an electron donor. GST-pulldown assay between T5H and OsCPRs deletion mutant protein shows that the T5H activity stimulated by OsCPR2 is due to direct protein-protein interaction with higher affinity than others despite the N-terminal deletions of both T5H and OsCPR. The expression level analysis of TDC1, T5H, OsCPRs of 3-week-old rice plant under 12hr-light/12hr-dark regime showed obvious enhancement of mRNA and protein of OsCPR2 and slight enhancement of TDC1, T5H at light time. According to the increased levels of related metabolites accumulations at light time, Light/Dark regulation of serotonin and melatonin biosynthesis is controlled mainly by OsCPR2. CHAPTER II Tryptamine 5-hydroxylase-deficient Sekiguchi rice induces synthesis of 5-hydroxytryptophan and N-acetyltryptamine but decreases melatonin biosynthesis during senescence process of detached leaves Melatonin biosynthesis was examined in Sekiguchi mutant rice lacking functional tryptamine 5-hydroxylase (T5H) activity, which is the terminal enzyme for serotonin biosynthesis in rice. During senescence process, the leaves of Sekiguchi mutant rice produced more tryptamine and N-acetyltryptamine compared to the wild-type Asahi leaves. Even though T5H activity is absent, Sekiguchi leaves produce low levels of serotonin derived from 5-hydroxytrptophan, which was found to be synthesized during senescence process. Accordingly, both rice cultivars exhibited similar levels of N-acetylserotonin until 6 d of senescence induction; however, only Asahi leaves continued to accumulate N-acetylserotonin after 6 d. In contrast, a large amount of N-acetyltryptamine accumulated in Sekiguchi leaves, indicating that tryptamine was efficiently utilized as substrate by the rice arylalkylamine N-acetyltransferase (AANAT) enzyme. An increase of N-acetyltryptamine in Sekiguchi had an inhibitory effect on synthesis of melatonin since little melatonin was produced in Sekiguchi leaves at 6 d of senescence induction, even in the presence of equivalent levels of N-acetylserotonin in both cultivars. The exogenous treatment of 0.1 mM N-acetyltryptamine during senescence process completely blocked melatonin synthesis. CHAPTER III Cloning and characterizations of rice N-acetylserotonin methyltransferase isotypes Rice (Oryza sativa) N-acetylserotonin methyltransferase (osASMT), the last enzyme in the synthesis of melatonin, was expressed in Escherichia coli and purified. We then characterized its enzyme kinetics, which is the first time this has been done in plants. Purified glutathione S-transferase (GST)-fused recombinant osASMT (GST-osASMT) and GST-free osASMT showed specific enzyme activities of 6.6 and 12.6 pmol/min/mg protein, respectively. When evaluated by the Lineweaver-Burk equation, GST-free osASMT exhibited a Kmof864μm. An in vitro enzyme assay of purified osASMT showed melatonin formation to be proportional to the enzyme and substrate concentrations, as well as time. Unlike animal ASMT, high substrate concentrations did not inhibit the activity of osASMT. Finally, melatonin biosynthesis in rice seedlings was affected by light intensity, with etiolated shoots grown in continuous darkness producing more melatonin than shoots grown in continuous light. The level of melatonin in relation to the light intensity closely paralleled the mRNA level of osASMT in the shoots, suggesting that endogenous melatonin is upregulated in darkness, as is the case in animals.

Melatonin protects liver against ischemia and reperfusion injury through inhibition of toll-like receptor signaling pathway

강정우 성균관대학교 일반대학원 2011 국내석사

This study was designed to investigate the immunomodulating effect of melatonin on toll-like receptor (TLR)-stimulated signal transduction. Rats were subjected to 60 min of ischemia followed by 1 or 5 hr of reperfusion. Melatonin (10 mg/kg) or the vehicle was administered intraperitoneally 15 min prior to ischemia and immediately before reperfusion. Melatonin treatment significantly reduced the level of serum alanine aminotransferase activity. Increased levels of TLR3 and TLR4 protein expression induced by ischemia/reperfusion (I/R) were attenuated by melatonin. Serum level of high-mobility group box 1 (HMGB1), a potent alarmin of the TLR system, increased significantly in the I/R group, and melatonin inhibited this release. Melatonin suppressed the increase of myeloid differentiation factor 88 (MyD88) protein expression, extracellular signal-regulated kinase (ERK) and c-Jun N-terminal kinase (JNK) phosphorylation and nuclear translocation of nuclear factor-κB (NF-κB) and phosphorylated c-Jun, a component of activator protein 1. The increased level of toll-receptor-associated activator of interferon (TRIF) expression, phosphorylation of interferon (IFN) regulatory factor 3 (IRF3) and serum IFN-β was attenuated by melatonin. Melatonin attenuated the levels of tumor necrosis factor (TNF)-α, interleukin (IL)-6 and inducible nitric oxide synthase (iNOS) protein and mRNA expression, while the level of heme oxygenase-1 (HO-1) was augmented. Our results suggest that melatonin ameliorates I/R-induced liver damage by modulation of TLR-mediated inflammatory responses. 허혈 및 재관류 손상은 조직의 저산소 손상 후에 혈류와 산소운반이 재개되면서 악화되는 병태생리의 과정으로 이러한 손상의 임상적 중요성은 고형장기 이식, 다발성 손상, 저혈성 쇼크 그리고 간절제 등의 과정에서 더욱 크게 인식되어지고 있다. 재관류 손상의 기전은 활성산소종(reactive oxygen species (ROS)), 염증성 싸이토카인 (inflammatory cytokine) 등에 의한 직접적 물리적인 손상에서 시작하여 이러한 손상에 의해 속발 되는 비특이적인 그리고 특이적인 면역반응에 의해 심화된다. 이러한 면역반응의 연결고리에 pathogen associated molecular pattern (PAMP) 혹은 damage associated molecular pattern (DAMP)을 인식하는 ligand인 Toll like receptor (TLR)가 있다. 또한 허혈 및 재관류시 HMGB1은 세포의 손상에 의해서 수동적으로 누출되며 이렇게 누출된 HMGB1이 TLR와 반응하고 TLR는 세포내 신호전달 물질인 MyD88에 의한 신호전달 과정을 거처 NF-κB를 활성화하여 염증성 싸이토카인 분비를 촉발한다. Melatonin은 송과선(松果腺)에서 생성•분비되는 호르몬으로 우수한 항산화 작용을 나타낼 뿐만 아니라 다양한 동물 모델을 이용한 허혈 및 재관류시 뇌 및 간장 등의 장기에 우수한 보호 효과를 나타내었다. 본 연구에서는 웅성 흰쥐의 생체 내 실험을 통해 간장 허혈 및 재관류로 유도된 간장 손상에 대한 melatonin의 보호 효과를 toll-like receptor 신호 기전을 중심으로 알아보고자 하였다. 간장 허혈 및 재관류는 60 분 간의 허혈과 1 시간 및 5 시간의 재관류를 시행하여 유도하였으며, 허혈 처치 15 분 전 및 재관류 직전에 melatonin (10 mg/kg)을 복강으로 투여하였다. 간장 허혈 및 재관류 후 간세포 손상의 지표인 혈청 내 ALT 활성은 현저히 증가하였으며, 이는 melatonin에 의해 현저히 억제되었다. 이러한 간보호 효과는 조직학적 검사를 통해서도 확인할 수 있었다. 허혈 및 재관류에 의한 TLR3 및 TLR4 단백질 발현의 증가는 melatonin에 의해 억제되었다. 또한 허혈 및 재관류에 의해 대표적인 DAMP인 HMGB1의 혈중 방출이 증가하였으며 melatonin은 이를 억제하였다. 또한 허혈 및 재관류 후 TLR system의 대표적인 adapter 분자인 MyD88의 단백질 발현의 중가는 melatonin에 의해 억제되었으며, mitogen activated protein kinases (MAPKs) 중 ERK 및 JNK의 활성화 또한 melatonin에 의해 억제되었다. 허혈 및 재관류 후 NF-κB/p65 및 p-c-Jun의 핵 내로의 이동이 증가하였으며 이러한 증가는 melatonin에 의해 감소되었다. 허혈 및 재관류로 인한 증가된 TRIF의 단백질 발현, IRF3 인산화 및 혈청 내 IFN-β은 melatonin에 의해 억제되었다. 또한 대표적 염증매개 인자인 혈청 내 TNF-α 및 IL-6, iNOS 및 HO-1의 단백질 발현량이 허혈 및 재관류 후 증가하였다. 혈청 내 TNF-α 및 IL-6, iNOS 단백질 발현량의 증가는 melatonin에 의해 억제되었으며 HO-1의 단백질 발현량은 melatonin에 의해 더욱 증가하였다. 유전자 발현의 경우 단백질 발현의 결과와 일치하는 경향을 나타내었다. 이 연구를 통해 간장 허혈 및 재관류시 melatonin과 TLR 시스템의 cross-talk를 알아보았으며, 전반적인 melatonin의 간보호 효과는 TLR3 및 TLR4의 과발현 억제, HMGB1 방출 억제 및 기타 염증 반응 억제를 통해 나타나는 것으로 여겨진다. 이를 바탕으로 간장 허혈 및 재관류시 melatonin의 TLR 신호 기전 억제에 의한 염증 조절 효과는 여러 장기의 허혈 및 재관류 손상의 치료 물질로 사용될 수 있을 것으로 사료된다.

Effect of melatonin on noise induced hearing loss in rats

정성도 단국대학교 대학원 2011 국내석사

연구 목적 소음은 청력을 감소시키는 원인중 하나이다. 소음성 난청(Noise induced hearing loss)의 원인은 아직 명확하게 밝혀져 있지 않다. 세포자가소멸(Apoptosis)은 많은 기전 중 하나이다. 이에 본 논문은 항세포자가소멸(Anti-apoptotic) 작용과 항산화(Antioxidant) 작용이 있는 멜라토닌(Melatonin)을 농도를 다르게 주입하여 청성뇌간반응검사(Auditory brainstem response) 및 웨스턴 블로팅(Western blotting), 전자현미경(Scanning electron microscopy)을 통하여 그 효과를 비교 관찰 하고자 하였다. 재료 및 방법 실험 동물로는 44마리의 정상 청력인 성인 쥐(Spraque-Dawley rat)를 무작위 분배하여 6개의 군으로 만들었다. C 군은 운반체(Vehicle)만 복강내 투여 할뿐 소음이나 멜라토닌에 노출 시키지 않았고 HM, LM 군은 소음에는 노출 시키지 않고 고농도(4mg/kg)와 저농도(0.4mg/kg)로 멜라토닌을 투여 하였다. NO 군은 소음에 노출 시키고 운반체만 투여하였다. NH, NL 군은 소음과 함께 멜라토닌을 고농도와 저농도로 같이 투여하였다. 소음은 Narrow band 16kHz의 주파수로 하루건너 하루, 6시간씩 2일 동안 주었으며, 멜라토닌은 운반체에 녹여 소음주기 전날부터 두 번째 소음 주기 직전까지 총 4회 복강내 주사하였다. 모든 소음노출 후 1일째, 7일째, 14일째, 21일째 청성뇌간반응검사를 시행하였으며 소음 노출되지 않은 군도 같은 시기에 검사하였다. 또한 소음노출 완료 4시간 후에 웨스턴 블로팅을 시행하였으며 21일째 청성뇌간반응검사가 끝난 후 전자현미경으로 와우의 외유모세포의 수를 비교하였다. 결과 소음에 노출되지 않은 3군은 서로 청력에 유의한 차이가 없었으며 소음에 노출된 군은 노출되지 않은 3군에 비하여 청력이 유의하게 낮았다. 소음이 노출된 3군 내에서는 멜라토닌을 투여한 NH, NL 군이 소음만 준 NO군에 비하여 청력이 유의하게 높았다. 하지만 NH, NL 두 군 사이의 유의한 차이는 보이지 않았다. 웨스턴 블로팅 검사 상 NO 군에서 Caspase 3 activation이 관찰 되었으며 NH, NL군에서는 관찰 되지 않았다. 전자 현미경 검사상 외유모세포의 개수가 소음노출 되지 않은 3군은 차이가 없었으나 소음에 노출된 3군은 노출되지 않은 군에 비하여 유의하게 개수가 적었다. 또한 멜라토닌을 투여한 군에 비하여 투여하지 않은 NO 군은 개수가 더 유의하게 적었으며 멜라토닌을 준 군내에서는 유의한 차이가 없었다. 결론 멜라토닌은 소음으로 인한 외유모세포의 세포자가소멸을 막아주어 소음에 의한 청력저하로부터 보호하는 효과가 있어 보이며, 본 실험에서 실시한 두 용량간의 차이는 보이지 않았다. Purpose Noise causes damage of the auditory system leading to hearing loss. The aim of this study was to investigate the role of cochlear damage caused by apoptosis occuring as a result of exposure to noise and to reveal the dose-dependent effects of melatonin on noise induced hearing loss. Materials and Methods Forty-four adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into six groups. All groups were two-time exposed to 6h of continuous narrow band noise(16kHz) at 120dB every other day, except group C, HM, LM. Group C was not exposed to noise and treated with vehicle. Group HM was not exposed to noise and treated with high dose melatonin(4mg/kg). Group LM was not exposed to noise and treated with low dose melatonin(0.4mg/kg). Group NO was exposed to noise and treated with vehicle. Group NH was exposed to noise and treated with high dose melatonin(4mg/kg). Group NL was exposed to noise and treated with low dose melatonin(0.4mg/kg). A melatonin were administered intraperitoneal 24h before exposure to noise, immediately before noise exposure and once a day until noise exposure was completed, total four times. The hearing levels were measured at each frequency of 4, 8, 12, 16 and 32 kHz by auditory brainstem response before the noise exposure and also after 1st,7th,14th and 21th day to observe the recovery of hearing thresholds. The caspase-3 activity was also examined performing Western blotting. And the subjects were sacrificed for histological observations of the hair cells using the scanning electron microscope. Results The result of this study showed that three noise exposed groups(NO, NH, NL) all suffered NIHL(Noise induced hearing loss) compared to the control, HM and LM group. Of the 3 noise exposed groups, the melatonin administered groups(HM, LM) showed significantly less hearing loss. However, there were no difference between the two groups(NH, NL). And noise induced the loss of outer hair cells, and this loss of hair cells was significantly attenuated by administration of melatonin. Melatonin reduced caspase-3 activation in the noise exposed cochleae. Conclusion Melatonin seems to prevent hearing loss by easing damage from noise induced hearing loss. Although melatonin is a potent antioxidant, no dose-dependent effects were found in this study.

신생쥐에서 유발시킨 저산소 허혈 뇌손상에 대한 melatonin과 저체온치료 병용요법의 효과

박재현 계명대학교 대학원 2014 국내박사

Melatonin is a naturally occurring hormone produced by the pineal gland. Melatonin has many pharmacological effects in different tissues or organs. Melatonin is especially known to have antioxidant and neuroprotective effects. Hypothermia is a therapeutic tool against hypoxia-ischemia (HI) of the brain. This study examines the effect of combined therapy using melatonin and hypothermia in neonatal rats with HI. Seven-day old rats were subjected to HI and randomized into four groups: vehicle, melatonin alone, vehicle and hypothermia, and melatonin and hypothermia. Melatonin (30 mg/kg) was intraperitoneally administered in two doses: immediately following HI, and 24 h later. Hypothermia consisted of whole-body cooling (3 hours, 27 ℃). Sham-treated animals not subjected to HI were also studied. P10, P14, and P35 rats were sacrificed for experiments. Vehicle-treated P10 rats increased in brain infarction compared to controls in TTC staining study. And also, P35 rats decreased in brain volume of injured hemisphere in H&E stain. Melatonin or hypothermia alone did not show any protective effect against HI. However, a combination of melatonin and hypothermia effectively reduced the brain injury. In addition, the results of in situ zymography, TUNEL assay and immunofluorescence studies showed that neuroprotective effects were achieved only with combined therapy. In conclusion, melatonin may contribute to synergistic effects to neuroprotection of hypothermia on brain damage after HI. Melatonin은 송과샘 호르몬으로 여러 조직에 있어 다양한 약리작용을 나타낸다. 특히, melatonin은 우수한 항산화제로 신경 보호작용이 알려져 있다. 저체온치료는 뇌손상 억제를 위해 임상에서 제한적으로 사용된다. 연구자는 melatonin과 저체온치료가 신생쥐에서 유발시킨 저산소 허혈에 대하여 뇌손상을 억제하는지 알아보고자 하였다. 이 연구에서 생후 7일된 Sprague-Dawely 종의 쥐를 사용하였다. 실험군은 vehicle군과 melatonin 단독투여군, vehicle 및 저체온치료 병합요법군, melatonin 및 저체온치료 병합요법군으로 나누었다. 정상 대조군은 저산소 허혈 뇌손상을 유발하지 않은 sham 수술군으로 하였다. Melatonin은 30 mg/kg 용량으로 복강 내 주사하였는데 저산소 허혈 손상 직후 및 24시간 경과 시점으로 구분해서 2차례 투여하였다. 저체온치료는 전신 냉각으로 27 ℃ 환경에서 3시간 시행하였다. 수술 후 3일(P10), 1주 경과(P14) 및 4주 시점(P35)에서 실험쥐를 희생시켜서 뇌조직 절편을 만든 후 저산소 허혈에 의한 뇌손상을 평가하였다. TTC 염색에서 vehicle 투여한 P10 실험쥐는 저산소 허혈로 인한 뇌경색이 대조군에 비해 현저하였다. 또한, H&E 염색에서 P35 실험쥐는 손상측 뇌위축이 현저하였다. Melatonin이나 저체온치료 단독으로는 뇌의 경색이나 위축을 유의하게 억제하지 못하였으나 melatonin 및 저체온요법의 병합치료는 뇌손상을 줄이는 효과가 있었다. In situ zymography 및 TUNEL 염색, 면역형광법을 이용해서 뇌손상을 평가한 결과, 신생쥐의 저산소 허혈 뇌손상에 대해서 병합요법만이 신경 보호효과를 나타내었다. 향후 뇌손상 억제의 기전적 배경에 대한 연구가 필요하나 melatonin과 저체온치료를 병합하는 임상적용의 가능성을 확인하였다.

Melatonin synergistically increases resveratrol-induced heme oxygenase-1 expression through the inhibition of ubiquitin-dependent proteasome pathway : A possible role in neuroprotection

김민경 건국대학교 대학원 2011 국내석사

Melatonin (MEL)은 송과선에서 분비되는 indoleamine 계열의 물질이다. 뿐만 아니라 식물에서도 자연적으로 합성되는데, 이중 하나인 resveratrol (RSV)은 많은 종류의 식물류에서 자연적으로 합성이 되며, 특히 적포도주의 주 성분으로서 신경보호작용과 항산화의 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 최근 연구된 바에 의하면, RSV은 알츠하이머 치매나 뇌졸중에서 신경세포의 사멸을 억제하는 것으로 알려져 있고, MEL이 첨가되면 알츠하이머 치매로 인한 인지 능력 손상이 회복이 되는 것으로 나타났다. HO-1(heme oxigenase-1)은 특정 조직에 항산화 효과를 줄 수 있는 산화 환원반응 조절 효소이다. 본 실험에서는 MEL과 RSV을 함께 처리했을 때, HO-1을 통한 신경 보호의 역할이 나타나는지를 in vitro상에서 관찰 하였다. RSV을 첨가한 군에서는 태아의 대뇌피질의 뇌세포와 별아교세포에서 첨가한 RSV의 농도에 따라 HO-1단백질의 발현량이 증가하는 것을 관찰 하였다. 반면에 MEL을 첨가한 군에서는 MEL의 농도에 따라 HO-1 단백질의 발현량에 큰 차이를 보이지 않았다. RSV과 MEL을 함께 첨가한 군에서는 HO-1 단백질의 발현이 RSV만 처리한 군에 비해 더욱 증가하였다. 그러나 HO-1 mRNA의 발현량은 RSV 처리에 의해서만 증가했을 뿐, MEL과 RSV+MEL 처리한 군에서는 모든 농도에서 비슷하게 나타나는 것을 확인 하였다. 태아의 대뇌피질의 뇌세포와 해마의 절편 배양에서 과산화수소로 인한 산화적 신경 독성에 대해서 MEL이나 RSV 하나만 처리 한 군에 비해 MEL과 RSV을 함께 처리한 군에서 현저히 감소한 것이 나타났다. HO-1 단백질의 발현을 HO-1 mRNA에 특이적인 shRNA를 이용하여 억제시켰을 때, MEL과 RSV의 처리에 의한 HO-1 단백질의 발현에 대한 증가 효과는 나타나지 않았고, 과산화수소에 의한 산화적 손상에 대한 신경 보호 효과를 억제하는 것으로 나타났다. proteosome의 억제제로 알려져 있는 MG132와 RSV을 함께 처리함으로써, MEL+RSV을 처리한 효과와 비슷하게 만들어 실험한 결과, MEL과 RSV을 함께 처리한 것과 같은 결과를 얻음으로서 MEL과 RSV에 의한 HO-1 단백질 발현의 증가는 HO-1의 ubiquitination을 억제함으로서 나타남을 확인하게 되었다. 이러한 결과는 MEL이 ubiquitin 의존적인 proteosome pathway를 억제함으로써 HO-1의 발현을 더욱 증가시킴으로 인해, 산화적 손상으로부터의 신경 보호 역할을 하는 RSV의 기능을 더욱 좋게 함을 알게 되었다. 본 실험에서 밝혀진 MEL과 RSV의 혼합처리에 의한 신경 보호 기능은 신경손상으로 인한 장애를 치료하는데 보다 효과적인 방법을 제시한 것이라 볼 수 있다. Melatonin is an indoleamine secreted by the pineal gland as well as a plant-derived product and resveratrol (RSV) is a naturally occurring polyphenol synthesized by a variety of plant species; both molecules act as a neuroprotector and antioxidant. Recent studies have demonstrated that RSV reduced the incidence of Alzheimer’s disease and stroke, while melatonin supplementation was found to reduce the progression of the cognitive impairment in AD. The HO-1 is an inducible and redox-regulated enzyme that provides tissue-specific antioxidant effects. We assessed whether the co-administration of melatonin and RSV shows synergistic effects in terms of their neuroprotective properties through HO-1. RSV significantly increased the expression levels of HO-1 protein in a concentration-dependent manner both in primary cortical neurons and astrocytes, while melatonin per se did not. Melatonin+RSV showed a synergistic increase in the expression levels of HO-1 protein but not the HO-1 mRNA level compared to either melatonin or RSV alone. Treatment of melatonin+RSV significantly attenuated the neurotoxicity induced by H2O2 in primary cortical neurons, and also in organotypic hippocampal slice culture. The blockade of HO-1 induction by shRNA attenuated HO-1 induction by melatonin+RSV and hindered the neuroprotective effects against oxidative stress induced by H2O2. The treatment of MG132+RSV mimicked the effects of melatonin+RSV, and melatonin+RSV inhibited ubiquitination of HO-1. These data suggest that melatonin potentiates the neuroprotective effect of RSV against oxidative injury, by enhancing HO-1 induction through inhibiting ubiquitination-dependent proteasome pathway, which may provide an effective means to treat neurodegenerative disorders.

Melatonin attenuates KA-induced learning impairment via activating melatonin MT₂receptor

Kim, Tae Woo 강원대학교 대학원 2009 국내석사

Accumulating evidences suggested that melatonin, a pineal hormone, possesses antioxidant, neuroprotective, and cognitive enhancing effects. Although previous reports indicated that increase in neuronal cell adhesion molecule (NCAM) expression is related to the cognitive enhancing effect of melatonin, it remains to be determined whether melatonin receptor is involved in melatonin-mediated cognitive enhancing effect. In order to extend our understanding, effect of melatonin on the kainic acid (KA)-induced learning impairment was examined in this study. Treatment with sub-convulsive dose of KA (0.04㎍/head, i.c.v.) did not show convulsive behavior or significant neuronal cell loss in the hippocampus of mice. However, this dose of KA induced significant memory impairment as evaluated by Morris water maze and passive avoidance task. Repeated treatment with melatonin (10 mg/kg, i.p.) significantly attenuated memory impairment induced by KA, and this cognitive enhancing effect of melatonin was significantly reversed by melatonin MT₂ receptor antagonist (4P-PDOT), but not by melatonin MT₁/MT₂ receptor antagonist (luzindole) or melatonin MT₃receptor antagonist (prazosin). Consistently, hippocampal melatonin MT₂ receptor protein expression was significantly reduced by KA injection, and treatment with melatonin significantly blocked KA-induced reduction in the MT₂ receptor expression. However, KA treatment did not affect melatonin MT₁ receptor expression. KA-induced memory impairments were concomitant with significant hippocampal cholinergic dysfunction (decreases in acetylcholine, choline acetyltransferase, and muscarinic M1 receptor expression) and increase in oxidative stress markers (lipid peroxidation, protein oxidation, and reactive oxygen species). In addition, hippocampal expressions of the glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), NCAM, polysialic acid-NCAM (PSA-NCAM), protein kinase C (PKC) βI and βII subunits, and phospho-calcium/calmodulin-dependent kinase II (CaMK II) were significantly decreased by KA treatment. Treatment with melatonin significantly attenuated these changes induced by KA, and melatonin-mediated attenuation was significantly reversed by melatonin MT₂ receptor antagonist (4P-PDOT). In summary, these results suggest that melatonin ameliorates KA-induced learning impairments via activating MT₂receptor. 송과선에서 분비되는 호르몬인 melatonin은 항산화, 신경보호, 인지기능향상 효과 등을 가지고 있다고 널리 알려져 있다. 비록 이전 연구에서 neural cell adhesion molecule (NCAM)의 발현의 증가가 melatonin의 인지기능 향상과 관계된다는 보고는 있지만, melatonin에 의한 인지기능 보호효과에 있어서 melatonin 수용체의 역할은 정해진 것이 없다. 좀 더 나은 이해를 위해, 본 연구에서는 kainic acid에 의해 유도되는 인지기능 손상에 대한 melatonin의 효과를 실험하였다. 경련을 일으키지 않는 용량의 KA (0.04㎍/head, i.c.v.)의 처리는 경련이나 해마부위에서의 유의적인 신경손상을 나타내지 않았다. 하지만 이 용량에서의 KA는 Morris water maze와 passive avoidance task에서 유의적인 기억력 손상을 일으켰다. 반복적인 melatonin (10 mg/kg, i.p.)의 처리는 KA에 의해 유도된 기억력 손상을 유의적으로 막아주었고, 이러한 melatonin의 인지기능 향상효과는 melatonin MT₂수용체 길항제 (4P-PDOT)에 의해 반전되었지만, melatonin MT₁수용체 길항제 (luzindole)이나 melatonin MT₃수용체 길항제 (prazosin)는 영향을 미치지 못했다. 해마의 MT₂수용체의 단백 발현은 KA에 의해 유의적으로 감소되었고, melatonin의 처리는 KA에 의한 MT₂수용체 발현의 감소를 유의적으로 막아주었다. 하지만 KA의 처리는 melatonin MT₁수용체의 발현에는 영향을 미치지 않았다. KA에 의해 유도된 기억력 손상은 유의적으로 해마의 choline성 신경손상 (acetylcholine, choline acetyltransferase, muscarinic MT₁ 수용체 발현 등의 감소)과 oxidative stress의 markers (지질과산화, 단백산화, 활성산소종)의 증가를 수반하였다. 게다가 해마의 glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), NCAM, polysialic acid-NCAM (PSA-NCAM), protein kinase C (PKC) βⅠ과 βⅡ, phosphor-calcium/calmodulin-dependent kinase Ⅱ (CaMK Ⅱ)의 발현들도 KA의 처리에 의해 감소되었다. Melatonin의 처리는 KA에 의한 이러한 변화를 유의적으로 막아주었고, melatonin MT₂수용체 길항제 (4P-PDOT)에 의해 반전되었다. 요약하자면, 이러한 결과들은 melatonin은 MT₂수용체를 활성화시킴으로써 KA에 의해 유도되는 인지기능 손상을 막아준다는 것을 알려준다.

Antimetastatic effect of melatonin via inhibition of TMPRSS4 mediated epithelial-mesenchymal transition in colorectal cancers

오범석 경희대학교 대학원 2017 국내박사

Melatonin은 항산화, 항암, 항염증 등의 효과가 있는 것으로 알려져 있으나, 항전이 억제 기전은 아직까지 불명하다. TMPRSS4는 세린 단백질 분해효소로, 암세포의 침윤, 전이, 이동에 관여하고, EMT에 중요한 매개체이며, 세포주기 진행을 통하여 세포성장에 관여한다, 이에 본 연구에서는 사람의 대장암세포를 중심으로 TMPRSS4 통한 상피간엽이행(EMT) 저해에서의 전이 억제기전이 연구되었다. Melatonin은 HCT15와 SW620 세포에서 세포독성을 하였으며, TMPRSS4의 발현이 높은 HCT15 세포에서 침윤, 부착, 이동을 억제하는 것을 확인 하였으며, TMPRSS4의 발현의 저해와 TMPRSS4에 의하여 유도되는 세포성장과 관련된 세포주기 단백질인 cyclin E, 단백질분해효소인 uPA, 전사인자 STAT3, 세포의 부착인자 FAK, EMT 단백질 Snail의 발현을 저하시켰으며, EMT 저해 단백질 E-cadherin, 세포주기 단백질 p27의 발현을 증가시켰다. TMPRSS4의 기능을 확인 하기 위하여 TMPRSS4의 발현이 낮은 SW620 세포에 형질감염하여 확인한 결과 TMPRSS4에 의하여 유도된 EMT와 세포성장과 관련된 세포주기 단백질을 유의하게 증가시켰으며, melatonin은 증가된 TMPRSS4, Snail, cyclin A, cyclin E, pro-uPA and p-FAK을 감소 시켰으며, E-cadherin and p27을 증가 시키는 것을 확인 할 수 있었다. 결과적으로, melatonin에 의한 전이억제는 TMPRSS4의 매개되어 EMT를 억제를 통해 일어남 알 수 있었다. Though Melatonin, an indoleamine (N-acetyl-5methoxytryptamine), produced especially at night in the pineal gland, was known to have anti-inflammatory, antioxidant and anticancer activity. However, the effect of melatonin on transmembrane protease serine 4 (TMPRSS4)-induced metastasis and epithelial–mesenchymal transition (EMT) is never reported until now, since TMPRSS4 is known an important mediator of metastasis and EMT in human epithelial cancer cells. Thus, in the present study, inhibitory mechanism of melatonin on metastasis and EMT was clarified mainly in human colorectal cancers such as HCT15 and SW620 cells in association with TMPRSS4 and TMPRSS4 related proteins. Here, TMPRSS4 was highly expressed in HCT15, but was weakly expressed in SW620 cells. Melatonin exerted weak cytotoxicity, decreased invasion, adhesion and migration, and attenuated the expression of TMPRSS4, cyclin E, pro- urokinase-type plasminogen activator (pro-uPA) , phospho-signal transducer and activator of transcription 3 (p-STAT3), phospho-focal adhesion kinase (p-FAK), Snail and increased the expression of E-cadherin, p27, pP38 and phospho-c-Jun N-terminal kinases (p-JNK) in HCT15 cells. To determine the critical role of TMPRSS4 in antitumor effect of melatonin in SW620 cells, transfection was conducted in SW620 cell with the cDNA of TMPRSS4 gene. Melatonin effectively suppressed TMPRSS4-induced the EMT, cell cycle progression, TMPRSS4 related proteins, invasion, migration, along with decreased expression of TMPRSS4, Snail, cyclin A, cyclin E, pro-uPA and p-FAK and increased expression of E-cadherin and p27 in TMPRSS4-overexpressing SW620 cells. Overall, these results suggest that melatonin suppresses TMPRSS4-induced metastasis and EMT in colon cancer cells by inhibiting the TMPRSS4.

Melatonin에 의한 신경세포 보호 효과 및 Akt 인산화 기전 규명을 위한 연구

공필재 강원대학교 일반대학원 2007 국내박사

Melatonin은 송과체에서 분비되는 신경호르몬으로 생리기능의 변화에 중요한 역할을 한다. 지금까지의 연구를 통해 melatonin은 여러 가지 신경독성물질로 유발되는 세포 사멸로부터 신경세포를 보호한다는 것이 밝혀졌다. 본 연구는 kainic acid (KA)에 의해 유도되는 신경흥분독성에 대한 melatonin의 보호기전을 쥐의 해마에서 규명하고자 하였다. 뇌실로 주입된 KA는 해마부위의 현저한 신경세포 사멸과 소교세포 활성화 그리고 소교세포 활성화에 따른 iNOS의 유도를 야기하였다. 조직병리학적 분석을 통해 KA 주입 1시간 전의 melatonin 투여가 KA로 유발되는 CA3 영역의 신경세포 사멸을 감소시킨다는 것을 확인하였다. 또한 OX-6 와 iNOS 항체의 면역반응성을 측정하여 Melatonin이 KA로 유발되는 소교세포 활성화와 그에 따라 발생하는 iNOS의 발현을 현저하게 억제하는 것을 확인하였다. PI3K의 하부 효력기인 Akt는 흥분독성 손상과 같은 병리적인 신경세포 사멸에 있어 신경세포의 생존을 위한 중요한 매개물이다. Melatonin에 의해 Akt가 활성화 될 수 있는지 규명하기 위해 melatonin을 처치한 후 24시간 까지 해마의 CA3 영역에서 Akt 인산화 정도를 관찰하였다. Melatonin 처치 2시간 후부터 신경세포의 Akt 인산화 증가가 관찰되었다. 또한 melatonin은 성상세포의 Akt와 전사조절인자인 CREB을 인산화 시켰고, 신경성장인자인 GDNF와 TGF-β의 발현도 증가시켰다. CREB이 인산화된 Akt의 기질임을 고려하면 Akt의 인산화에 따른 CREB의 인산화가 GDNF와 TGF-β의 발현을 증가시킬 수 있을 것으로 사료된다. 따라서 melatonin에 의한 성상세포의 Akt 인산화는 신경세포 보호의 중요한 기전 중 하나일 가능성이 있다. 이러한 성상세포의 Akt 인산화 기전을 규명하기 위하여 본 연구자는 PI3K의 특징적 억제제인 wortmannin과 melatonin 수용체의 비선택적 길항제인 luzindole을 melatonin 주입 전에 전처치 하였다. 그 결과 melatonin에 의해 유도되는 Akt의 인산화는 wortmannin에 의하여 완벽하게 억제되었고, luzindole에 의해서는 부분적으로 억제되었으며 GDNF와 TGF-β의 발현 또한 억제되었다. 본 연구자는 KA로 유발되는 신경흥분독성에 대한 melatonin의 신경보호 효과가 신경세포와 성상세포의 Akt 인산화, 그리고 소교세포 활성화의 억제를 통해서 이루어지는 것을 규명하였다. 따라서 본 논문은 간질, 발작, 외상성 뇌손상과 같은 흥분독성으로 인한 신경세포의 손상과 연관된 급성 뇌질환의 치료에 있어 melatonin이 사용 가능한 약물임을 제시하였다. Melatonin, the major secretory product of the pineal gland, has a variety of important physiological functions. It has been reported that melatonin protects neurons in culture from cell death induced by several neurotoxins. In the present study, the underlying protective mechanism of melatonin on kainic acid(KA)-induced excitotoxicity was examined in the hippocampus of mice. KA, administered intracerebroventricularly(i.c.v.), induced marked neuronal cell death with concurrent microglial activation and subsequent induction of inducible nitric oxide synthase(iNOS) in the hippocampus. Histopathological analysis demonstrated that melatonin(10 mg/kg), administered 1 hr prior to KA, attenuated KA-induced death of pyramidal neurons in the CA3 region. Melatonin obviously suppressed KA-induced microglial activation and consequent iNOS expression that were determined by increased immunoreactivities of microglial marker OX-6 and iNOS, respectively. Akt, a downstream effector of PI3K, is a critical mediator of neuronal survival in pathological neuronal cell death such as excitotoxic injury. In order to determine whether Akt is activated by melatonin treatment, the level of Akt phosphorylation was examined in CA3 region of hippocampus up to 24 hr after melatonin treatment. Increased phosphorylation of Akt in pyramidal neurons was observed as early as 2 hr after administration of melatonin. After melatonin administration, Akt and cAMP response element(CRE) binding protein(CREB) were also phosphorylated in astrocyte and the expression of glial cell line-derived neurotrophic factor(GDNF) and transforming growth factor-β(TGF-β), was increased. Considering that CREB is the substrate of p-Akt, and p-CREB can increase GDNF and TGF-β expression, astrocytic Akt phosphorylation by melatonin can be one of the important mechanisms of neuroprotection. To evaluate the pathway of astrocytic Akt phosphorylation activated by melatonin, I treated wortmannin, specific inhibitor of PI3K, and luzindole, a non-selective melatonin receptor antagonist, prior to the administration of melatonin. The results showed that wortmannin completely blocked the melatonin induced phosphorylation of Akt. In contrast, luzindole partially did it. Also GDNF and TGF-β expression by melatonin was inhibited by pretreatment of wortmannin or luzindole. The results of the present study demonstrate that melatonin exerts its neuroprotective action against KA-induced excitotoxicity both through the activation of neuronal and astrocytic Akt, and through the direct and indirect inhibition of microglial activation. Therefore, the present study suggests that melatonin is potentially useful in the treatment of acute brain pathologies associated with excitotoxic neuronal damage such as epilepsy, stroke, and traumatic brain injury.

Neuroprotective Effect of Melatonin in Ischemic Brain Injury : A Proteomic Approch

성진희 경상대학교 대학원 2008 국내석사

It is known that melatonin protects neuronal cells against ischemic barin damage. This study investigated the alterations in the protein expression by melatonin during ischemic brain injury. Rats were subjected to cerebral ischemia by unilateral occlusion of the middle cerebral artery (MCAO). Adult male rats were treated with melatonin (5 mg/kg) or vehicle prior to MCAO. Brains were collected at 24 h after MCAO and infarct volumes were analyzed. This study confirms that melatonin significantly reduces infarct volume and decreases the positive reaction of TUNEL staining in the cerebral cortex. Global protein analysis was performed the cerebral cortex using two-dimensional gel electrophoresis. Two-dimensional gel electrophoresis resolved about 997 protein spots. Protein spots with more than a 3-fold change in intensity were identified by mass spectrometry. Among of these proteins, glyoxalase was significantly increased in vehicle-treated group, melatonin prevents increase of these proteins. Whereas, hippocalcin, gamma enolase, ubibutin thioesterase, adenosylhomocysteinase, protein phosphatase 2A, isocitrate dehydrogenase[NAD] subunit alpha, thioredoxcin and sthatmin were significantly decreased in vehicle-treated group, melatonin prevents decline of these proteins. Thus, this study suggest that melatonin prevents cell death resulting from ischemic brain injury and that its neuroprotective effects are mediated by up- and down-regulation of various proteins. Melatonin은 송과샘에서 생성되며, 생체리듬을 조절하는 호르몬으로 잘 알려져 있다. 최근, melatonin이 뇌 손상시 신경세포를 보호한다는 사실이 밝혀졌다. 본 연구에서는 대뇌 허혈성 모델에서 멜라토닌의 뇌세포 방어 효과와 melatonin에 의해 조절되는 단백질의 변화를 조사하였다. 성숙한 수컷 흰쥐를 사용하여 melatonin (5mg/kg)을 DMSO에 녹여 투여하였고 대조군으로 DMSO만을 투여하였다. 투여 후 30분에 중간대뇌동맥폐쇄술을 실시하여 중간대뇌동맥을 차단하였고 24시간 후 뇌 조직을 적출하여 TTC stain과 TUNEL 면역염색을 실시하여 뇌 손상시의 melatonin의 신경 방어 효과를 평가 하였다. TTC stain을 통하여 melatonin이 대뇌 피질의 뇌경색부위를 현저하게 감소시켰음을 알수 있었고 TUNEL 면역염색을 통해 apoptotic cell의 수를 현저하게 감소시켜 뇌 손상 시 melatonin은 뇌세포를 보호함을 확인 할 수 있었다. Two-dimensional gel electriphoresis를 이용하여 두 개의 대조군과 실험군의 단백질 발현 량의 변화를 확인하였고 MALDI-TOF (matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight)를 이용하여 변화된 단백질을 동정하였다. 여러 가지의 단백질 중에서, 뇌 손상시 대조군에서 glyoxalase은 현저하게 증가 하였고 멜라토닌은 이들 단백질의 증가를 억제하였다. 반면에 hippocalcin, gamma enolase, ubibutin thioesterase, adenosylhomocysteinase, protein phosphatase 2A, isocitrate dehydrogenase[NAD] subunit alpha, thioredoxcin 그리고 sthatmin 등의 단백질은 감소하였고 멜라토닌은 이들 단백질의 감소를 막았다. 본 연구를 통하여 멜라토닌은 대뇌 허혈성 모델에서 뇌 세포사를 현저하게 억제함을 확인하였고, melatonin의 뇌세포 보호 기능은 다양한 단백질의 조절작용을 통하여 나타난다는 것을 알 수 있었다.

Studies on the neuroprotective effects and mechanisms of Akt phosphorylation by melatonin

Pil-Jae Kong 강원대학교 2007 국내박사

Melatonin, the major secretory product of the pineal gland, has a variety of important physiological functions. It has been reported that melatonin protects neurons in culture from cell death induced by several neurotoxins. In the present study, the underlying protective mechanism of melatonin on kainic acid (KA)-induced excitotoxicity was examined in the hippocampus of mice. KA, administered intracerebroventricularly (i.c.v.), induced marked neuronal cell death with concurrent microglial activation and subsequent induction of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in the hippocampus. Histopathological analysis demonstrated that melatonin (10 mg/kg), administered 1 hr prior to KA, attenuated KA-induced death of pyramidal neurons in the CA3 region. Melatonin obviously suppressed KA-induced microglial activation and consequent iNOS expression that were determined by increased immunoreactivities of microglial marker OX-6 and iNOS, respectively. Akt, a downstream effector of PI3K, is a critical mediator of neuronal survival in pathological neuronal cell death such as excitotoxic injury. In order to determine whether Akt is activated by melatonin treatment, the level of Akt phosphorylation was examined in CA3 region of hippocampus up to 24 hr after melatonin treatment. Increased phosphorylation of Akt in pyramidal neurons was observed as early as 2 hr after administration of melatonin. After melatonin administration, Akt and cAMP response element (CRE) binding protein (CREB) were also phosphorylated in astrocyte and the expression of glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) and transforming growth factor-β (TGF-β), was increased. Considering that CREB is the substrate of p-Akt, and p-CREB can increase GDNF and TGF-β expression, astrocytic Akt phosphorylation by melatonin can be one of the important mechanisms of neuroprotection. To evaluate the pathway of astrocytic Akt phosphorylation activated by melatonin, I treated wortmannin, specific inhibitor of PI3K, and luzindole, a non-selective melatonin receptor antagonist, prior to the administration of melatonin. The results showed that wortmannin completely blocked the melatonin induced phosphorylation of Akt. In contrast, luzindole partially did it. Also GDNF and TGF-β expression by melatonin was inhibited by pretreatment of wortmannin or luzindole. The results of the present study demonstrate that melatonin exerts its neuroprotective action against KA-induced excitotoxicity both through the activation of neuronal and astrocytic Akt, and through the direct and indirect inhibition of microglial activation. Therefore, the present study suggests that melatonin is potentially useful in the treatment of acute brain pathologies associated with excitotoxic neuronal damage such as epilepsy, stroke, and traumatic brain injury. Melatonin은 송과체에서 분비되는 신경호르몬으로 생리기능의 변화에 중요한 역할을 한다. 지금까지의 연구를 통해 melatonin은 여러 가지 신경독성물질로 유발되는 세포 사멸로부터 신경세포를 보호한다는 것이 밝혀졌다. 본 연구는 kainic acid (KA)에 의해 유도되는 신경흥분독성에 대한 melatonin의 보호기전을 쥐의 해마에서 규명하고자 하였다. 뇌실로 주입된 KA는 해마부위의 현저한 신경세포 사멸과 소교세포 활성화 그리고 소교세포 활성화에 따른 iNOS의 유도를 야기하였다. 조직병리학적 분석을 통해 KA 주입 1시간 전의 melatonin 투여가 KA로 유발되는 CA3 영역의 신경세포 사멸을 감소시킨다는 것을 확인하였다. 또한 OX-6 와 iNOS 항체의 면역반응성을 측정하여 Melatonin이 KA로 유발되는 소교세포 활성화와 그에 따라 발생하는 iNOS의 발현을 현저하게 억제하는 것을 확인하였다. PI3K의 하부 효력기인 Akt는 흥분독성 손상과 같은 병리적인 신경세포 사멸에 있어 신경세포의 생존을 위한 중요한 매개물이다. Melatonin에 의해 Akt가 활성화 될 수 있는지 규명하기 위해 melatonin을 처치한 후 24시간 까지 해마의 CA3 영역에서 Akt 인산화 정도를 관찰하였다. Melatonin 처치 2시간 후부터 신경세포의 Akt 인산화 증가가 관찰되었다. 또한 melatonin은 성상세포의 Akt와 전사조절인자인 CREB을 인산화 시켰고, 신경성장인자인 GDNF와 TGF-β의 발현도 증가시켰다. CREB이 인산화된 Akt의 기질임을 고려하면 Akt의 인산화에 따른 CREB의 인산화가 GDNF와 TGF-β의 발현을 증가시킬 수 있을 것으로 사료된다. 따라서 melatonin에 의한 성상세포의 Akt 인산화는 신경세포 보호의 중요한 기전 중 하나일 가능성이 있다. 이러한 성상세포의 Akt 인산화 기전을 규명하기 위하여 본 연구자는 PI3K의 특징적 억제제인 wortmannin과 melatonin 수용체의 비선택적 길항제인 luzindole을 melatonin 주입 전에 전처치 하였다. 그 결과 melatonin에 의해 유도되는 Akt의 인산화는 wortmannin에 의하여 완벽하게 억제되었고, luzindole에 의해서는 부분적으로 억제되었으며 GDNF와 TGF-β의 발현 또한 억제되었다. 본 연구자는 KA로 유발되는 신경흥분독성에 대한 melatonin의 신경보호 효과가 신경세포와 성상세포의 Akt 인산화, 그리고 소교세포 활성화의 억제를 통해서 이루어지는 것을 규명하였다. 따라서 본 논문은 간질, 발작, 외상성 뇌손상과 같은 흥분독성으로 인한 신경세포의 손상과 연관된 급성 뇌질환의 치료에 있어 melatonin이 사용 가능한 약물임을 제시하였다.