Combination of melatonin and pterostilbene synergistically induces apoptosis through miR-25-5p mediated NEDD9/SOX10 axis signaling in colorectal cancer cells

신은아 경희대학교 대학원 2017 국내박사

Although melatonin has antitumor efficacy in several cancers, the underlying interaction between melatonin and daily fruits still remains unclear so far. Here the antitumor mechanism by combination of melatonin and pterostilbene (Combination) was elucidated in colorectal cancers (CRCs). Combination synergistically showed cytotoxicity compared to melatonin or pterostilbene alone in HT29, SW480 and HCT116 CRCs. Also, Combination suppressed the proliferative activity and Ki67 expression and increased Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) positive cells in CRCs. Consistently, Combination cleaved poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) and caspase 3, activated sex determining region Y-Box10 (SOX10) and also attenuated the expression of Bcl-xL, RAS, phosphorylation of AKT and extracellular signal regulated kinases (ERK), neural precursor cell expressed developmentally downregulated protein 9 (NEDD9) and SOX9 in CRCs. Of note, Combination induced differentially expressed microRNAs (upregulation: miR-25-5P,miR-711, miR-4725-3P, miR-542-5P, miR-4484; downregulation: miR-4504, miR-195-3p, miR-668-3p, miR-3121-5p, miR-5194) in HT29 cells. Consistently, Combination upregulated miR-25-5p at mRNA level and conversely miR-25-5p inhibitor or NEDD9 overexpression reversed cytotoxicity, decreased colony formation, PARP cleavage induced by Combination in CRCs. Likewise, immunofluorescence revealed miR-25-5p inhibitor blocked the fluorescence of reduced NEDD9 and increased SOX10 in HT29 cells. Overall, our findings provide evidences that combination of melatonin and pterostilbene synergistically enhances apoptotic effect via miR-25-5p mediated NEDD9/SOX10 axis signaling in colon cancer cells as a potent therapeutic strategy for colorectal cancer prevention or treatment. Melatonin은 여러 암에서 항 종양 효능이 있지만, melatonin과 과실류 사이의 상호작용은 아직 까지 명확하지 않는다. 이 논문에서는 대장암 (CRCs) 세포주 에서 melatonin과 pterostilbene (조합)의 조합에 의한 항암 기전에 대해 밝혔다. HT29, SW480, HCT116 대장암 (CRCs)에서 melatonin이나 pterostilbene 단독 처리 한 것에 비해 combination으로 처리 한 것이 synergistically 하게 세포 독성을 보였다. 또한, 이러한 조합은 증식 활성 및 Ki67을 억제 하고 CRCs에서 TUNEL 양성 세포를 증가 시켰다. 일관되게, 이러한 조합은 PARP와 caspase-3를 분해 하고 SOX10을 활성화 시켰으며, Bcl-xL, RAS, p-AKT, p-ERK와 NEDD9와 SOX9을 CRCs에서 발현 시켰다. 중요한 것은, 이러한 조합은 HT29 세포에서 차별적으로 발현된 miRNA를 유발 하였다. (상향조절 : miR-25-5P, miR-711, miR-4725-3P, miR-42-5P, miR-4484; 하향조절: miR-4504, miR-195-3p, miR-668-3p, miR-3121-5p, miR-5194). 일관되게 Combination 처리는 mRNA level에서 miR-25-5p를 상향 조절 하였고, 역으로 miR-25-5p 억제제 또는 NEDD9의 과 발현은 세포독성을 감소시키고, colony형성을 감소시켰으며, CRCs에서 조합에 의한 PARP절단을 뒤바꾸었다. 마찬가지로, 면역형광법 에서 miR-25-5p억제제는 NEDD9의 감소와 SOX10의 증가를 차단 시킨다는 것을 HT29 세포주에서 보여주었다. 전반적으로, 우리의 발견은 melatonin과 pterostilbene의 조합이 colorectal 암 예방 또는 치료를 위한 강력한 치료 전략으로, 대장암 세포에서 miR-25-5p을 매개로 하여 NEDD9/SOX10 신호 전달을 통해 세포 사멸 효과를 상승적으로 향상 시킨다는 것을 시사 한다.

Melatonin의 사람의 각질형성세포인 HaCaT keratinocyte와 동물실험에서 UVB로 유도된 주름의 억제 효과

박은경 경희대학교 동서의학대학원 2017 국내박사

Melatonin은 항염증, 항산화, 항암 효능이 발표되었으나 주름의 억제 작용기전연구는 아직도 부족한 실정이다. 이에 본 연구를 통하여 melatonin의 t-BOOH 처리 사람의 각질형성세포와 UVB조사된 누드생쥐실험을 통하여 주름억제 효과를 증명하였다. 다양한 농도의 melatonin은 t-BOOH로 인한 ROS의 증가와 독성을 억제하는 효과를 보여, 주름을 유발하는 인자를 억제하는 효과를 보여주었다. 동물실험에서도 8주간 UVB를 조사한 마우스에서 melatonin을 처리한 군에서는 주름형성을 막아주는 효과가 있음을 확인하였다. 또한, 조직학적인 분석을 통하여 melatonin은 표피부분의 두께를 감소시키며, 진피부분의 collagen의 분해를 억제하는 효과를 보여주었다. 또한, collagen 분해효소인 Matrix metalloprotease 1 (MMP-1)의 발현량을 감소시켰다. 이상의 결과 melatonin은 UVB로 유도된 산화적인 스트레스에서 세포보호 및 ROS 생성억제, MMP-1의 발현억제를 통하여 주름을 억제하여 항노화의 효과에 대한 가능성을 시사 한다. Though melatonin was known to improve ultraviolet B (UVB)-induced oxidative damage and inflammatory conditions via blockade of nuclear factor (NF)-κB, interleukin (IL)-6, there is no report on anti-wrinkle effect of melatonin to date. Hence in the present study, anti-wrinkle mechanism of melatonin was elucidated in UVB treated HaCaT keratinocytes and hairless mice. Melatonin protected against a radical polymerization initiator tert-Butyl hydroperoxide (t-BOOH) induced redox oxygen species (ROS) production and cytotoxicity in HaCaT keratinocytes, based on the previous evidences that reactive oxygen species (ROS) are responsible for skin damage due to UVB-radiation. Consistently, melatonin protected skin from wrinkle formation, transdermal water loss in hairless mice irradiated by UVB for 8 weeks. Furthermore, melatonin prevented against epidermal thickness and dermal collagen degradation in UVB irradiated hairless mice by Hematoxylin & Eosin and Masson’s trichrome staining. Taken together, these findings suggest that melatonin protects skin from wrinkle formation and aging process by UVB irradiation via inhibition of ROS and Matrix metalloprotease 1 (MMP-1) signaling.

Neuroprotective Effect of Melatonin in Ischemic Brain Injury : A Proteomic Approch

성진희 경상대학교 대학원 2008 국내석사

It is known that melatonin protects neuronal cells against ischemic barin damage. This study investigated the alterations in the protein expression by melatonin during ischemic brain injury. Rats were subjected to cerebral ischemia by unilateral occlusion of the middle cerebral artery (MCAO). Adult male rats were treated with melatonin (5 mg/kg) or vehicle prior to MCAO. Brains were collected at 24 h after MCAO and infarct volumes were analyzed. This study confirms that melatonin significantly reduces infarct volume and decreases the positive reaction of TUNEL staining in the cerebral cortex. Global protein analysis was performed the cerebral cortex using two-dimensional gel electrophoresis. Two-dimensional gel electrophoresis resolved about 997 protein spots. Protein spots with more than a 3-fold change in intensity were identified by mass spectrometry. Among of these proteins, glyoxalase was significantly increased in vehicle-treated group, melatonin prevents increase of these proteins. Whereas, hippocalcin, gamma enolase, ubibutin thioesterase, adenosylhomocysteinase, protein phosphatase 2A, isocitrate dehydrogenase[NAD] subunit alpha, thioredoxcin and sthatmin were significantly decreased in vehicle-treated group, melatonin prevents decline of these proteins. Thus, this study suggest that melatonin prevents cell death resulting from ischemic brain injury and that its neuroprotective effects are mediated by up- and down-regulation of various proteins. Melatonin은 송과샘에서 생성되며, 생체리듬을 조절하는 호르몬으로 잘 알려져 있다. 최근, melatonin이 뇌 손상시 신경세포를 보호한다는 사실이 밝혀졌다. 본 연구에서는 대뇌 허혈성 모델에서 멜라토닌의 뇌세포 방어 효과와 melatonin에 의해 조절되는 단백질의 변화를 조사하였다. 성숙한 수컷 흰쥐를 사용하여 melatonin (5mg/kg)을 DMSO에 녹여 투여하였고 대조군으로 DMSO만을 투여하였다. 투여 후 30분에 중간대뇌동맥폐쇄술을 실시하여 중간대뇌동맥을 차단하였고 24시간 후 뇌 조직을 적출하여 TTC stain과 TUNEL 면역염색을 실시하여 뇌 손상시의 melatonin의 신경 방어 효과를 평가 하였다. TTC stain을 통하여 melatonin이 대뇌 피질의 뇌경색부위를 현저하게 감소시켰음을 알수 있었고 TUNEL 면역염색을 통해 apoptotic cell의 수를 현저하게 감소시켜 뇌 손상 시 melatonin은 뇌세포를 보호함을 확인 할 수 있었다. Two-dimensional gel electriphoresis를 이용하여 두 개의 대조군과 실험군의 단백질 발현 량의 변화를 확인하였고 MALDI-TOF (matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight)를 이용하여 변화된 단백질을 동정하였다. 여러 가지의 단백질 중에서, 뇌 손상시 대조군에서 glyoxalase은 현저하게 증가 하였고 멜라토닌은 이들 단백질의 증가를 억제하였다. 반면에 hippocalcin, gamma enolase, ubibutin thioesterase, adenosylhomocysteinase, protein phosphatase 2A, isocitrate dehydrogenase[NAD] subunit alpha, thioredoxcin 그리고 sthatmin 등의 단백질은 감소하였고 멜라토닌은 이들 단백질의 감소를 막았다. 본 연구를 통하여 멜라토닌은 대뇌 허혈성 모델에서 뇌 세포사를 현저하게 억제함을 확인하였고, melatonin의 뇌세포 보호 기능은 다양한 단백질의 조절작용을 통하여 나타난다는 것을 알 수 있었다.

Microarray Analysis of Gene Expression in Melatonin-treated A549 Human Lung Cancer Cell Line during Oxidative Stress

강양일 경희대학교 대학원 2010 국내박사

Melatonin은 SOD, glutathione peroxidase, glutathione reductase, catalase 등의 많은 항산화 효소들을 자극하는 것으로 알려져 있다. 또한, 활성산소와 활성질소를 탈독성화 함으로서 free radicals의 직접적 scavenger로 작용하며, 간접적으로는 항산화 방어기전의 활성을 증가시킨다. 이 연구에서는 산화적 스트레스를 받은 인간 폐암 세포주 A549에 melatonin을 투여시 세포독성 완화 효과를 알아보았고 이 때의 유전자 발현을 마이크로어레이 검사로 확인해보았다. 우선 산화적 스트레스가 A549세포에 미치는 영향과 melatonin의 효과를 확인하기 위해 MTT 분석을 통해 melatonin이 사람 폐암세포주 A549에서 t-BPH에 의한 산화성 세포독성을 완화한다는 사실을 알 수 있었다. 또한, 세포독성과 melatonin의 보호효과의 정확한 기전 연구를 위해 cDNA microarray를 시행한 결과, melatonin 처치 시 JUN, NPM3, G6PD, RPS27 및 PDLIM7 유전자는 발현이 증가하였으며 WBSC18 유전자의 발현은 감소한 것으로 밝혀졌다. 이러한 결과는 산화적 스트레스로 인한 폐손상 및 폐의 만성적 염증에서의 melatonin의 기능을 연구하는 여타의 연구에 기초를 제공할 수 있을 것으로 사료된다. Melatonin stimulates a number of antioxidative enzymes, including superoxide dismutase, glutathione peroxidase, glutathione reductase, and catalase. In addition, melatonin has been shown to act as a direct scavenger of free radicals, detoxifying both reactive oxygen and reactive nitrogen species and thus indirectly increasing the activity of antioxidative defense systems. In this study, I investigated the protective effect of melatonin in A549 human lung cancer cells stimulated with the oxidative stressor tert-butyl hydroperoxide (tBHP) and carried out gene expression profiling using microarrays. Melatonin reduced the cytotoxicity associated with tBHP-induced oxidative stress in A549 human lung cancer cells. Of the genes downregulated more than 1.5-fold by oxidative stress in A549 cells, five genes—jun oncogene (JUN), nucleophosmin/nucleoplasmin, 3 (NPM3), glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD), ribosomal protein S27/metallopanstimulin 1 (RPS27), and PDZ and LIM domain 7 (PDLIM7)—showed more than a 1.5-fold increase in expression following treatment with melatonin. Similarly, expression of the Williams Beuren syndrome chromosome region 18 (WBSCR18) gene, which was increased more than 1.5-fold by tBHP, was decreased more than 1.5-fold by pretreatment with melatonin. The use of microarray analysis to identify genes differentially expressed in response to melatonin administration may provide a foundation for further studies on the function of melatonin in lung injury and inflammatory lung diseases.

Melatonin attenuates autophagy-like cell death through antioxidant enzymes in cerebellar Purkinje cells following asphyxial cardiac arrest

Cho Jeong-Hwi 강원대학교 일반대학원 2018 국내박사

Although multiple reports using animal models have confirmed that melatonin appears to promote neuroprotective effects following ischemia/reperfusion-induced brain injury, the relationship between its protective effects and the activation of autophagy in cerebellar Purkinje cells following asphyxial cardiac arrest and cardiopulmonary resuscitation (CA/CPR) remains unclear. Rats used in this study were randomly assigned to 6 groups; vehicle-treated sham-operated group, vehicle-treated asphyxia CA/CPR-operated group, melatonin-treated sham-operated group, melatonin-treated asphyxial CA/CPR-operated group, melatonin plus (+) 4P-PDOT (MT2 melatonin receptor antagonist)-treated sham-operated group and melatonin+4P-PDOT-treated asphyxial CA/CPR-operated group. In this study results demonstrate that melatonin (10 mg/kg, ip, 3 times after asphyxial CA) significantly improved the survival rates and neurological deficits compared with the vehicle-treated asphyxia CA/CPR rats (survival rates ≥ 40% vs 10%). And demonstrated that melatonin exhibits a protective effect against asphyxia CA/CPR-induced cerebellar Purkinje cell death in rats. The protective effects of melatonin in the Purkinje cell death of asphyxial CA/CPR-induced rats paralleled a dramatic reduction in superoxide anion radical (O2·-), intense enhancement of CuZn superoxide dismutase (SOD1) and MnSOD (SOD2) expression, as well as a remarkable attenuation of autophagic activation (LC3 and Beclin-1), which is MT2 melatonin receptor-associated. Furthermore, the protective effects of melatonin were notably reversed by treatment with 4P-PDOT. In brief, this study shows that melatonin conferred neuroprotection against asphyxial CA/CPR-induced cerebellar Purkinje cell death by inhibiting autophagic activation by reducing the expression of reactive oxygen species, while increasing the expression of antioxidative enzymes, and suggests that MT2 is involved in the neuroprotective effects of melatonin in cerebellar Purkinje cell death induced by asphyxial CA/CPR. 지금까지의 많은 연구들이 허혈/재관류에 의한 뇌손상에서 멜라토닌의 신경보호 효과를 증진시키는 것으로 발표하였다. 그러나, 멜라토닌이 질식성심정지 및 심페소생술(CA/CPR) 후 소뇌의 조롱박세포 사멸에 대한 보호 효과와 자가소화작용의 활성화에 미치는 영향에 대한 연구는 아직까지 알려져 있지 않다. 본 연구에서 사용된 동물은 SD 랫드(Sprague-Dawley rats)로서 1) 식염수 처치+모의수술군, 2) 식염수 처치+질식성 심정지 수술군, 3) 멜라토닌 처치+모의수술군, 4) 멜라토닌 처치+질식성 심정지 수술군, 5) 멜라토닌과 4P-PDOT(MT2 멜라토닌 수용체 길항제) 처치+모의수술군, 6) 멜라토닌과 4P-PDOT 처치+질식성 심정지 수술군 등 6개의 실험군으로 나누어 구분하였다. 본 실험의 결과는 CA/CPR 후 멜라토닌(10 mg/kg, 복강투여, 질식성 심정지 유도 후 3회 투여)의 처치가 식염수를 처치한 경우와 비교해 생존율을 향상시켰고, 신경학적 결손율을 낮춘 것을 확인하였다. 이와 더불어 멜라토닌이 CA/CPR 후 소뇌의 조롱박세포 사멸에 대한 보호 효과가 있는 것을 확인하였다. 멜라토닌이 CA/CPR 유도된 조롱박세포의 사멸을 보호하는 효과는 초과산화물 음이온기(O2·-)의 감소, CuZn 과산화물 제거효소(SOD1)와 Mn 과산화물 제거효소(SOD2)의 발현의 증가, 그리고 자가소화작용 활성관련인자(LC3 및 Beclin-1)가 감소함으로써 보호 효과를 보였는데, 이는 MT2 멜라토닌 수용체 길항제인 4P-PDOT의 처치로 멜라토닌에 의해 증가된 이들 물질들의 발현이 억제되고, 조롱박세포 사멸을 다시 증가시키는 것을 확인하였다. 따라서 멜라토닌은 MT2 멜라토닌 수용체를 통하여 활성산소종의 발현을 감소시키고, 항산화효소의 발현을 증가시킴으로써 과도한 자가증식작용의 활성화를 억제하여 조롱박세포에 대해 신경보호 효과를 보이는 것으로 사료된다.

벼에서의 세로토닌과 멜라토닌 생합성 기작에 관한 분자생물학적 특성분석

박상규 전남대학교 대학원 2012 국내박사

CHAPTER I Rice NADPH-cytochrome P450 Reductases differentially affect cytochromeP450-mediated serotonin and melatonin biosynthesis in rice Eukaryotic cell 내에는 약 450여 가지에 달하는 많은 종류의 membrane- bound cytochrome P450 monooxygenases (P450s)가 존재한다. NADPH- cytochrome P450 reductases는 P450에 전자를 제공하여 P450의 활성을 촉진한다. 다양한 plant P450의 E. coli에서의 발현을 통한 P450의 대사산물 생산 연구는 E. coli의 내재적 electron donation system과 plant P450과의 호환성이 미미한 관계로 그 한계를 지닌다. 본 연구에서는 벼의 NADPH- cytochrome P450 reductases(OsCPR)를 cloning 및 characterization하여, serotonin을 생산하는 벼의 P450인 tryptamine 5-hydroxylase (T5H)에 가장 적합한 OsCPR을 발굴하고자 하였으며 그 결과 OsCPR1, OsCPR2, OsCPR3의 세가지 유전자를 발굴하였다. 벼의 조직 별, 다양한 처리구 별로 이들의 mRNA 발현 양상을 조사한 결과 OsCPR1, OsCPR2는 비교적 상시 발현하는 양상으로 보이는 반면 OsCPR3는 이들에 비해 낮은 발현량을 나타냈다. 또한 세가지 OsCPR모두 drought, 제초제, 중금속 처리구에서 높은 발현유도 양상을 나타냈다. GFP fusion을 통한 OsCPR protein의 tobacco세포내에서의 localization을 확인한 결과 세가지 모두 endoplasmic reticulum으로 targeting되는것으로 확인되었다. N-terminal deletion된 OsCPR1 과 OsCPR2 protein을 정제하여 kinetic assay를 수행한 결과 Δ105OsCPR2 protein이 정제가 가장 용이하며 기질친화도 역시 높게 나타났다. 한편 OsCPR1,2,3와 T5H 의 호환성 확인 및 bacteria를 통한 serotonin 과다 생산을 모색하기 위한 접근으로 OsCPR과 N-terminal deleted Δ37T5H를 E. coli내에서 co-expression하여 serotonin생산량을 측정하였다. 그 결과 co-expression시 Δ37T5H만을 발현시킨 것에 비해 serotonin생산량이 OsCPR1,2,3 모두에서 증가하였으며 특히 OsCPR2의 경우 10배이상 증가하였다. 아울러 N-terminal deleted OsCPR2와 Δ37T5H의 co-expression의 경우 full length OsCPR보다는 낮으나 control에 비해 높은 serotonin 생산량을 나타냈다. 이러한 결과는 OsCPR2와 T5H가 가장 호환성이 높은 조합이라는 것을 나타내며 이들의 protein간 상호interaction은 N-terminal membrane spanning domain이 없어도 이루어진다는 것을 나타낸다. 그러나 N-terminal deletion에 비해 full length OsCPR 발현 시 가장 높은 T5H 활성도를 나타내므로 OsCPR의 N-terminal은 최상의 활성도를 위한 중요한 요소이다. 한편 GST pull-down, Ni-NTA pull down assay를 통하여 OsCPR과 T5H간의 protein- protein interaction을 확인하였으며 그 결과 OsCPR1,OsCPR2 모두 T5H와 직접적인 binding을 하는 것으로 나타났으며 OsCPR1에 비해 OsCPR2가 높은 binding affinity를 보이는 것을 확인하였다. 한편 12시간 light/12시간 dark cycle조건에서 배양된 3주된 벼의 TDC1, T5H, OsCPR 발현양상을 조사하여 light/dark cycle에 따른 serotonin 함량변화에 위 유전자들이 어떠한 양상으로 관여하는지를 확인하였다. TDC1과 T5H의 경우 light period에 미세하게 발현량이 증가하였으며 OsCPR1은 변화가 없었고, OsCPR3는 light에서의 미세한 증가 양상이, OsCPR2는 light에서의 두드러진 발현 증가양상이 나타났다. 이에 상응하여 light period에서 tryptamine, serotonin 과 melatonin이 증가하는 것을 확인하였다. 이를 통해 OsCPR2는 light/dark cycle에 따른 벼의 serotonin, melatonin 생합성 조절에 있어서 중요한 요소임을 알 수 있다. CHAPTER II Tryptamine 5-hydroxylase-deficient Sekiguchi rice induces synthesis of 5-hydroxytryptophan and N-acetyltryptamine but decreases melatonin biosynthesis during senescence process of detached leaves Serotonin 생합성 효소인 Tryptamine 5-hydroxylase (T5H) 유전자의 knock out mutant인 Sekiguch rice는 유도된 노화과정(senescence)에서 wild-type인 Asahi rice보다 많은 양의 tryptamine과 N-acetyltryptamine이 축적되었다. 한편 T5H activity가 부재함에도 불구하고 senescence시 Sekiguchi에서 소량의 serotonin이 검출되었다. 이것은 senescence에 의해 5-hydroxytrptophan 생합성이 유도되고 decarboxylation되어 serotonin으로 변환될 수 있기 때문이다. 따라서 Sekiguchi와 Asahi 모두 senescence 유도 후 6일 까지는 serotonin의 acetylated form인 N-acetylserotonin이 비슷한 수준으로 검출된다. 한편 Sekiguchi leaf에서는 이 시기에 다량의 N-acetyltryptamine이 축적되는데 이것은 벼의 arylalkylamine N-acetyltransferase (AANAT) enzyme에 의해 tryptamine이 acetylation되기 때문이다. senescence 유도 후 6일까지 비슷한 수준의 N-acetylserotonin이 축적되었음에도 Sekiguchi 에서는 Asahi에 비해 매우 낮은 수준의 melatonin이 검출되었다. 이는 Sekiguchi내의 증가된 N-acetyltry.ptamine이 melatonin생합성을 저해하기 때문이다. 이것은 senescence 기간 동안 0.1 mM N-acetyltryptamine의 외부처리 시 Asahi에서의 melatnin생합성이 완전히 저해된 것으로서 확인할 수 있다 CHAPTER III Cloning and characterizations of rice N-acetylserotonin methyltransferase isotypes 벼에서 Melatonin을 생합성하는 효소인 (Oryza sativa) N-acetylserotonin methyltransferase (osASMT),의 세가지 putative isotypes(osASMT11, osASMT13, osASMT15)에 대한 cloning및 characterization을 수행하였다. 아미노산 서열은 매우 높은 유사성을 나타냈으나 mRNA level 에서의 발현양상은 다소 차이를 보였다. osASMT15의 경우 벼의 leaf에서 높은 발현양상을 나타냈으며, osASMT13은 flower에서 두드러진 발현을 나타냈다. osASMT11과 osASMT15는 발현양상이 유사하게 연동되는 반면 osASMT13은 발현률 자체가 매우 낮았다. GFP fusion을 통한 osASMTs protein의 tobacco세포내에서의 localization을 확인한 결과 모두 microbody로 targeting되는것으로 추정된다. osASMT15는 기존에 cloning되어 bacterial expression을 통한 media assay로 activity가 확인된 바 있으나 정제를 통한 kinetic assay는 진행되지 않았다. 본 연구에서는 osASMT15의 bacterial expression을 통한 정제 및 kinetic assay를 통한 효소의 특성분석을 수행하였으며, 또한 세가지 osASMT 유전자들을 각각 과다발현 시킨 벼 형질전환체를 구축하여 분석하였다. osASMT11과 osASMT15 형질전환체 에서 증가된 melatonin 함량이 검출되었다. 정제된 GST-fused, GST-free osASMT15의 specific activity는 각각 6.6과 12.6 pmol/min/mg protein으로 확인되었으며 GST-free osASMT15는 864μm의 Km value를 나타냈다. 한편 동물의 ASMT와는 달리 osASMT15는 높은 기질농도에 의한 활성도의 저해가 나타나지 않았다. CHAPTER I Rice NADPH-cytochrome P450 Reductases differentially affect cytochromeP450-mediated serotonin and melatonin biosynthesis in rice NADPH-cytochrome P450 reductases (CPR; E.C.1.6.2.4) donate electrons to a large number of membrane-bound cytochrome P450 monooxygenases (P450s) that exist in eukaryotic cells. Production of P450-mediated metabolites in Escherichia coli has been limited due to the lack of bacterial electron donors compatible with various plant and mammalian P450s needing to be expressed. Here, we describe cloning and characterization of three rice (Oryza sativa) CPRs (OsCPRs) that are potential donors to plant P450s, including tryptamine 5-hydroxylase (T5H) in serotonin synthesis and cinnamate 4-hydroxylase (C4H) in phenylpropanoid synthesis. With 76% amino acid identity shared among these three OsCPRs, OsCPR1 and OsCPR2 transcripts are constitutively expressed in rice leaves, whereas OsCPR3 transcripts are expressed at a marginal level. Notably, all three OsCPR transcripts are induced to varying degrees by drought, herbicides and metal stress (CdCl2). Fusion of the OsCPR proteins with a GFP reporter indicated that all three are exclusively targeted to the endoplasmic reticulum in tobacco protoplasts. Co-expression of full-length OsCPR1, OsCPR2 and OsCPR3 with either T5H or C4H in E. coli indicated that the OsCPR2/T5H and OsCPR2/C4H constructs displayed the highest T5H and C4H catalytic activities, yielding levels of serotonin and 4-coumaric acid that were 10- and 14-fold higher than in control strains lacking CPR. Co-expression of different N-terminal deletion mutants indicated that the N-terminal residues of OsCPR2 were required for peak electron transfer activity to P450 even though deletion mutants with short N-terminal deletions were capable of functioning as an electron donor. GST-pulldown assay between T5H and OsCPRs deletion mutant protein shows that the T5H activity stimulated by OsCPR2 is due to direct protein-protein interaction with higher affinity than others despite the N-terminal deletions of both T5H and OsCPR. The expression level analysis of TDC1, T5H, OsCPRs of 3-week-old rice plant under 12hr-light/12hr-dark regime showed obvious enhancement of mRNA and protein of OsCPR2 and slight enhancement of TDC1, T5H at light time. According to the increased levels of related metabolites accumulations at light time, Light/Dark regulation of serotonin and melatonin biosynthesis is controlled mainly by OsCPR2. CHAPTER II Tryptamine 5-hydroxylase-deficient Sekiguchi rice induces synthesis of 5-hydroxytryptophan and N-acetyltryptamine but decreases melatonin biosynthesis during senescence process of detached leaves Melatonin biosynthesis was examined in Sekiguchi mutant rice lacking functional tryptamine 5-hydroxylase (T5H) activity, which is the terminal enzyme for serotonin biosynthesis in rice. During senescence process, the leaves of Sekiguchi mutant rice produced more tryptamine and N-acetyltryptamine compared to the wild-type Asahi leaves. Even though T5H activity is absent, Sekiguchi leaves produce low levels of serotonin derived from 5-hydroxytrptophan, which was found to be synthesized during senescence process. Accordingly, both rice cultivars exhibited similar levels of N-acetylserotonin until 6 d of senescence induction; however, only Asahi leaves continued to accumulate N-acetylserotonin after 6 d. In contrast, a large amount of N-acetyltryptamine accumulated in Sekiguchi leaves, indicating that tryptamine was efficiently utilized as substrate by the rice arylalkylamine N-acetyltransferase (AANAT) enzyme. An increase of N-acetyltryptamine in Sekiguchi had an inhibitory effect on synthesis of melatonin since little melatonin was produced in Sekiguchi leaves at 6 d of senescence induction, even in the presence of equivalent levels of N-acetylserotonin in both cultivars. The exogenous treatment of 0.1 mM N-acetyltryptamine during senescence process completely blocked melatonin synthesis. CHAPTER III Cloning and characterizations of rice N-acetylserotonin methyltransferase isotypes Rice (Oryza sativa) N-acetylserotonin methyltransferase (osASMT), the last enzyme in the synthesis of melatonin, was expressed in Escherichia coli and purified. We then characterized its enzyme kinetics, which is the first time this has been done in plants. Purified glutathione S-transferase (GST)-fused recombinant osASMT (GST-osASMT) and GST-free osASMT showed specific enzyme activities of 6.6 and 12.6 pmol/min/mg protein, respectively. When evaluated by the Lineweaver-Burk equation, GST-free osASMT exhibited a Kmof864μm. An in vitro enzyme assay of purified osASMT showed melatonin formation to be proportional to the enzyme and substrate concentrations, as well as time. Unlike animal ASMT, high substrate concentrations did not inhibit the activity of osASMT. Finally, melatonin biosynthesis in rice seedlings was affected by light intensity, with etiolated shoots grown in continuous darkness producing more melatonin than shoots grown in continuous light. The level of melatonin in relation to the light intensity closely paralleled the mRNA level of osASMT in the shoots, suggesting that endogenous melatonin is upregulated in darkness, as is the case in animals.

난형낭반 전정유모세포에서 확인한 Melatonin의 항산화 작용과 세포고사 억제 효과

김정범 단국대학교 2007 국내석사

신생쥐에서 유발시킨 저산소 허혈 뇌손상에 대한 melatonin과 저체온치료 병용요법의 효과

박재현 계명대학교 대학원 2014 국내박사

Melatonin is a naturally occurring hormone produced by the pineal gland. Melatonin has many pharmacological effects in different tissues or organs. Melatonin is especially known to have antioxidant and neuroprotective effects. Hypothermia is a therapeutic tool against hypoxia-ischemia (HI) of the brain. This study examines the effect of combined therapy using melatonin and hypothermia in neonatal rats with HI. Seven-day old rats were subjected to HI and randomized into four groups: vehicle, melatonin alone, vehicle and hypothermia, and melatonin and hypothermia. Melatonin (30 mg/kg) was intraperitoneally administered in two doses: immediately following HI, and 24 h later. Hypothermia consisted of whole-body cooling (3 hours, 27 ℃). Sham-treated animals not subjected to HI were also studied. P10, P14, and P35 rats were sacrificed for experiments. Vehicle-treated P10 rats increased in brain infarction compared to controls in TTC staining study. And also, P35 rats decreased in brain volume of injured hemisphere in H&E stain. Melatonin or hypothermia alone did not show any protective effect against HI. However, a combination of melatonin and hypothermia effectively reduced the brain injury. In addition, the results of in situ zymography, TUNEL assay and immunofluorescence studies showed that neuroprotective effects were achieved only with combined therapy. In conclusion, melatonin may contribute to synergistic effects to neuroprotection of hypothermia on brain damage after HI. Melatonin은 송과샘 호르몬으로 여러 조직에 있어 다양한 약리작용을 나타낸다. 특히, melatonin은 우수한 항산화제로 신경 보호작용이 알려져 있다. 저체온치료는 뇌손상 억제를 위해 임상에서 제한적으로 사용된다. 연구자는 melatonin과 저체온치료가 신생쥐에서 유발시킨 저산소 허혈에 대하여 뇌손상을 억제하는지 알아보고자 하였다. 이 연구에서 생후 7일된 Sprague-Dawely 종의 쥐를 사용하였다. 실험군은 vehicle군과 melatonin 단독투여군, vehicle 및 저체온치료 병합요법군, melatonin 및 저체온치료 병합요법군으로 나누었다. 정상 대조군은 저산소 허혈 뇌손상을 유발하지 않은 sham 수술군으로 하였다. Melatonin은 30 mg/kg 용량으로 복강 내 주사하였는데 저산소 허혈 손상 직후 및 24시간 경과 시점으로 구분해서 2차례 투여하였다. 저체온치료는 전신 냉각으로 27 ℃ 환경에서 3시간 시행하였다. 수술 후 3일(P10), 1주 경과(P14) 및 4주 시점(P35)에서 실험쥐를 희생시켜서 뇌조직 절편을 만든 후 저산소 허혈에 의한 뇌손상을 평가하였다. TTC 염색에서 vehicle 투여한 P10 실험쥐는 저산소 허혈로 인한 뇌경색이 대조군에 비해 현저하였다. 또한, H&E 염색에서 P35 실험쥐는 손상측 뇌위축이 현저하였다. Melatonin이나 저체온치료 단독으로는 뇌의 경색이나 위축을 유의하게 억제하지 못하였으나 melatonin 및 저체온요법의 병합치료는 뇌손상을 줄이는 효과가 있었다. In situ zymography 및 TUNEL 염색, 면역형광법을 이용해서 뇌손상을 평가한 결과, 신생쥐의 저산소 허혈 뇌손상에 대해서 병합요법만이 신경 보호효과를 나타내었다. 향후 뇌손상 억제의 기전적 배경에 대한 연구가 필요하나 melatonin과 저체온치료를 병합하는 임상적용의 가능성을 확인하였다.

Melatonin synergistically increases resveratrol-induced heme oxygenase-1 expression through the inhibition of ubiquitin-dependent proteasome pathway : A possible role in neuroprotection

김민경 건국대학교 대학원 2011 국내석사

Melatonin (MEL)은 송과선에서 분비되는 indoleamine 계열의 물질이다. 뿐만 아니라 식물에서도 자연적으로 합성되는데, 이중 하나인 resveratrol (RSV)은 많은 종류의 식물류에서 자연적으로 합성이 되며, 특히 적포도주의 주 성분으로서 신경보호작용과 항산화의 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 최근 연구된 바에 의하면, RSV은 알츠하이머 치매나 뇌졸중에서 신경세포의 사멸을 억제하는 것으로 알려져 있고, MEL이 첨가되면 알츠하이머 치매로 인한 인지 능력 손상이 회복이 되는 것으로 나타났다. HO-1(heme oxigenase-1)은 특정 조직에 항산화 효과를 줄 수 있는 산화 환원반응 조절 효소이다. 본 실험에서는 MEL과 RSV을 함께 처리했을 때, HO-1을 통한 신경 보호의 역할이 나타나는지를 in vitro상에서 관찰 하였다. RSV을 첨가한 군에서는 태아의 대뇌피질의 뇌세포와 별아교세포에서 첨가한 RSV의 농도에 따라 HO-1단백질의 발현량이 증가하는 것을 관찰 하였다. 반면에 MEL을 첨가한 군에서는 MEL의 농도에 따라 HO-1 단백질의 발현량에 큰 차이를 보이지 않았다. RSV과 MEL을 함께 첨가한 군에서는 HO-1 단백질의 발현이 RSV만 처리한 군에 비해 더욱 증가하였다. 그러나 HO-1 mRNA의 발현량은 RSV 처리에 의해서만 증가했을 뿐, MEL과 RSV+MEL 처리한 군에서는 모든 농도에서 비슷하게 나타나는 것을 확인 하였다. 태아의 대뇌피질의 뇌세포와 해마의 절편 배양에서 과산화수소로 인한 산화적 신경 독성에 대해서 MEL이나 RSV 하나만 처리 한 군에 비해 MEL과 RSV을 함께 처리한 군에서 현저히 감소한 것이 나타났다. HO-1 단백질의 발현을 HO-1 mRNA에 특이적인 shRNA를 이용하여 억제시켰을 때, MEL과 RSV의 처리에 의한 HO-1 단백질의 발현에 대한 증가 효과는 나타나지 않았고, 과산화수소에 의한 산화적 손상에 대한 신경 보호 효과를 억제하는 것으로 나타났다. proteosome의 억제제로 알려져 있는 MG132와 RSV을 함께 처리함으로써, MEL+RSV을 처리한 효과와 비슷하게 만들어 실험한 결과, MEL과 RSV을 함께 처리한 것과 같은 결과를 얻음으로서 MEL과 RSV에 의한 HO-1 단백질 발현의 증가는 HO-1의 ubiquitination을 억제함으로서 나타남을 확인하게 되었다. 이러한 결과는 MEL이 ubiquitin 의존적인 proteosome pathway를 억제함으로써 HO-1의 발현을 더욱 증가시킴으로 인해, 산화적 손상으로부터의 신경 보호 역할을 하는 RSV의 기능을 더욱 좋게 함을 알게 되었다. 본 실험에서 밝혀진 MEL과 RSV의 혼합처리에 의한 신경 보호 기능은 신경손상으로 인한 장애를 치료하는데 보다 효과적인 방법을 제시한 것이라 볼 수 있다. Melatonin is an indoleamine secreted by the pineal gland as well as a plant-derived product and resveratrol (RSV) is a naturally occurring polyphenol synthesized by a variety of plant species; both molecules act as a neuroprotector and antioxidant. Recent studies have demonstrated that RSV reduced the incidence of Alzheimer’s disease and stroke, while melatonin supplementation was found to reduce the progression of the cognitive impairment in AD. The HO-1 is an inducible and redox-regulated enzyme that provides tissue-specific antioxidant effects. We assessed whether the co-administration of melatonin and RSV shows synergistic effects in terms of their neuroprotective properties through HO-1. RSV significantly increased the expression levels of HO-1 protein in a concentration-dependent manner both in primary cortical neurons and astrocytes, while melatonin per se did not. Melatonin+RSV showed a synergistic increase in the expression levels of HO-1 protein but not the HO-1 mRNA level compared to either melatonin or RSV alone. Treatment of melatonin+RSV significantly attenuated the neurotoxicity induced by H2O2 in primary cortical neurons, and also in organotypic hippocampal slice culture. The blockade of HO-1 induction by shRNA attenuated HO-1 induction by melatonin+RSV and hindered the neuroprotective effects against oxidative stress induced by H2O2. The treatment of MG132+RSV mimicked the effects of melatonin+RSV, and melatonin+RSV inhibited ubiquitination of HO-1. These data suggest that melatonin potentiates the neuroprotective effect of RSV against oxidative injury, by enhancing HO-1 induction through inhibiting ubiquitination-dependent proteasome pathway, which may provide an effective means to treat neurodegenerative disorders.

Melatonin 투여가 틸라피아 치어의 성장 및 성 발달에 미치는 영향

김보경 선문대학교 대학원 2011 국내석사

어류의 번식은 외부 환경적 요인에 영향을 받는다. 이중 광정보 변화는 번식과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 또한 어류는 번식을 감당할 수 있을 만큼의 충분한 체성장(somatic growth)을 이룬 다음 번식활동을 위해 여러 가지 생물학적 변화가 일어나는 puberty 단계에 도달하는데, 이 단계에 도달하는 시기는 번식성공에 결정적인 영향을 미칠 수 있다. 광정보 전달 호르몬인 melatonin은 밤에는 분비량이 높고 낮에는 낮은 일별 주기가 잘 확립되어있다. 따라서 최근에는 광정보 전달 호르몬인 melatonin을 이용하여 광주기 조절효과와 유사한 효과를 얻으려는 시도가 이루어 지고 있다. 그러나 처리한 melatonin의 체내 작용경로는 아직 정확하게 이해되지 못한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 melatonin의 작용을 매개하는 것으로 알려진 melatonin receptor gene 중 눈과 뇌에서 특이적으로 발현하는 melatonin receptor 1c (mel 1c) gene을 cloning 하였으며, 나일 틸라피아(Oreochromisniloticus) 치어에 투여한 외인성 melatonin이 melatonin receptor gene (mel 1A, mel 1c) 발현에 미치는 영향을 조사하였다. 또한 melatonin 처리에 따른 치어의 성장, 산란율, 구중부화 성공률과 자어의 수 및 초기 생존율 변화를 조사하였으며 melatonin 처리 농도별로 성 성숙 개시시기의 차이를 비교 분석하였다. 나일 틸라피아(O. niloticus)에서 총 881 bp의 mel 1c gene (partial) sequence를 얻었다. 이 sequence는 European sea bass (Dicentrarchus labrax), golden rabbitfish (Siganus guttatus ), chicken (Gallus gallus), sparrow (Passer domesticus) 등 타 종의 mel 1c gene sequence와 73~88%에 이르는 높은 상동성을 나타냈다. 이 결과는 틸라피아에 mel 1c gene이 존재 함을 보여준다. 외인성 melatonin은 틸라피아 mel 1A gene과 mel 1cgene의 발현에 영향을 미치지 않았으며, mel 1c gene은 뇌보다 눈에서 더 많이 발현되었다. Mel 1A gene은 일장증가에 관계없이 일정한 발현량을 나타냈지만, mel 1c gene의 발현은 일장증가 따라 감소하는 경향을 보였다. 이는 mel 1c gene이 틸라피아에서 광주기 변화에 따른 번식활성의 변화에 연관되어 있을 가능성을 제시한다. Melatonin 투여 시 대조구와 처리구 사이에 체장 및 체중의 차이는 나타나지 않았다. 이는 melatonin 투여가 어체에 부정적 영향을 미치지 않았음을 의미한다. 생식소 발달패턴 역시 대조구 및 melatonin 처리구 사이에 차이를 나타내지 않았다. 그러나 틸라피아 치어에 대한 melatonin 투여는 저농도(2.5 ㎍/g)에서 산란율과 구중부화 성공률, 자어의 수 그리고 초기 생존율에 긍정적인 영향을 나타냈다. 이는 melatonin이 치어에서 성숙유도 역할을 했을 가능성을 시사한다. 반면 고농도(25 ㎍/g)처리구에서는 한 개체가 가장 먼저 산란을 하기는 하였지만, 산란율과 구중부화 성공률, 자어의 수, 그리고 초기 생존율은 타 실험구에 비해 낮았으며, melatonin 투여중지 후에도 정상적 산란활성을 회복하지 못하였다. 이는 지나치게 높은 농도의 melatonin이 어체의 성장과 생식소 발달에 영향을 미치지는 않았지만, 산란활성에는 부정적 영향을 주었을 가능성을 의미한다. 본 연구의 결과는 틸라피아에 mel 1c gene이 존재하며, 치어에서 mel 1c gene이 뇌에 비해 눈에서 더 많이 발현되고, 또한 광주기 변화에 따른 번식활성 변화와 연관되었을 가능성이 있음을 제시한다. 뿐만 아니라 이 종에 대한 적정농도의 melatonin 투여는 산란율, 구중부화 성공률, 자어의 수 및 초기 생존율에 긍정적 효과를 가져올 수 있음을 제안한다. Fish reproduction is influenced by various external environmental factors. Among these factors, changes of photic conditions are thought be most closely related to the reproduction of many fish species. Fish grow sufficiently and accumulate energy for reproduction, before they reach puberty, which is a process of biological changes at the time of sexual development, and the timing of puberty can have a decisive effect on reproductive success. Melatonin mediates the changes of photic condition outside. The daily pattern of melatonin secretion is much conserved among vertebrates. The pineal organ produces melatonin at night, thus, its level is high during the night and low during the day. In recent studies, melatonin has been used in an attempt to get a similar effect to photoperiod manipulation without changing photoperiod. However, the results of these manipulations were not consistent because they were dependent on too many factors. Understanding the route of melatonin action could reduce the unwanted variations in the effects of exogenous melatonin. In this study, melatonin receptor 1c (mel 1c) gene was partially cloned and the effects of exogenous melatonin on the expression of melatonin receptor genes (mel 1A, mel 1c) at the time of puberty Nile tilapia (Orochromis niloticus). In addition,the spawning activity, the rate of mouth brooding success rate and early survival rate of laval tilapia. The partial fragment of mel 1c gene cloned in this study comprised of 881 bp nucleotides. This melatonin receptor gene showed high homology (73~88%) with the sequence of mel 1c from including sea bass, rabbit fish, chicken, sparrow. This analysis confirmed that the melatonin receptor gene cloned in this study belonged to the mel 1c receptor type. The expressions of melatonin receptor genes (mel 1A, mel 1c) from melatonin treated fish were not significantly different from the expressions in control fish. Mel 1c mRNA was more abundant in eyes than in the brain. In addition, mel 1c gene expression tended to decrease as day length increases. It can be suggested that mel 1c gene might be involved in the changes of reproductive activity by photoperiod in Nile tilapia. There were no significant differences of somatic growth between control (no melatonin) and melatonin-treated groups, indicating that melatonin administration did not cause any negative effects on the growth of experimental fish. And also, the patterns of gonadal development are same between control and melatonin-treated groups were almost the same. In juvenile tilapia, treatment with low-dose melatonin (2.5 ㎍/g) resulted in the increase of spawning rate, the rate of mouth brooding success and early survival rate of laval tilapia. However, high-dose melatonin (25 ㎍/g) was first reveled spawning activity, however, resulted in the decrease of spawning rate, the rate of mouth brooding success and early survival rate of laval tilapia. Although the earliest spawning occurred in one of the high-dose group fish. Fish in High-dose melatonin group failed to recover from reproductively suppressed state activities even after the cease of melatonin treatment, indicating that too much melatonin might act negatively on spawning activities and gonadal maturation in Nile tilapia. In conclusion, findings of this study confirm that melatonin receptor 1c type exists in Nile tilapia, and the expression of mel 1c gene is more abundant in eyes than in the brain. The expression of this gene tended to decrease as day length increases, suggesting that melatonin receptor 1c gene might be involved in the changes of reproductive activity by photoperiod in Nile tilapia. The results from this study also suggest the possibility that a pertinent dose of melatonin treatment can effectively accelerate the spawning rate and the rate of mouth brooding success, and bring positive effects on early survival rate of tilapia lavae.