C5a 수용체 작용제인 Co1 펩타이드의 보체 C5a 수용체 표적화를 통한 대식세포에서의 훈련 면역 조절

심은현 전북대학교 일반대학원 2021 국내석사

Immune memory was a defining hallmark of the adaptive immune system, but it is also recently suggested in the innate immune system. This phenomenon has been termed ‘trained immunity’. Trained immunity is a concept of innate immune memory and means enhanced responsiveness to subsequent stimulation. For instance, an infectious agent or β-glucan induces epigenetic and metabolic reprogramming in innate immune cells, which leads to enhanced and sustained immune responses against secondary infections. The complement system is one of the major parts of the innate immune system, but its role in trained immunity has not been extensively explored. Our previous study reported C5a receptor (C5aR) agonist, Co1 peptide (SFHQLPARSPLP), and its function as a mucosal vaccine adjuvant. Thus, we aimed to investigate whether Co1 peptide might induce trained immunity through C5aR in macrophages. In this study, Co1 peptide showed binding activity to C5aR expressed on macrophages through flow cytometry analysis and confocal laser scanning microscopy. In RAW 264.7 macrophages, C5aR mediated Co1 signaling induced activation of mammalian target of rapamycin (mTOR) pathway correlating with metabolic alteration in trained immunity and expression of IL-1β which has been proposed to a crucial role in trained immunity. In vivo mouse model, C5aR-Co1 peptide axis induced the trained immunity in peritoneal macrophages, which was confirmed by analyzing the expression of surface molecules on trained peritoneal macrophages and measuring the level of pro-inflammatory cytokines. Collectively, we identified the unknown role of C5aR on macrophage trained immunity using Co1 peptide and suggest that Co1 peptide can be used as a trained immunity-based adjuvant. 면역 기억은 후천성 면역계의 일반적인 특징으로 알려져 있었지만, 최근에 선천성 면역계에서도 나타난다는 연구 결과가 보고되고 있다. 이 현상을 ‘훈련 면역’이라고 한다. 훈련 면역은 선천성 면역 기억의 개념으로 재감염에 대해 더 신속하고 강화된 면역 반응을 일으키는 현상이다. 예를 들어, 감염원 또는 베타-글루칸에 의해 자극받은 선천 면역 세포에서는 대사 및 후성 유전학적 리프로그래밍이 일어나고 2차 감염에 대해 강화되고 지속적인 면역 반응을 일으킬 수 있다. 보체계는 선천성 면역계에서 일어나는 주요 반응 중 하나이지만, 훈련 면역과 관련된 기능에 대해서는 아직 많은 연구가 이루어지지는 않았다. 이전 연구에서 Co1 펩타이드(SFHQLPARSPLP)는 C5a 수용체(C5aR)의 또 다른 작용제이고 점막 백신 보조제로서 기능할 수 있음을 확인했다. 이번 연구에서는 Co1 펩타이드가 대식세포에서 C5aR을 통해 훈련 면역을 유도할 가능성을 확인하고자 했다. 먼저, 유세포 분석 및 공초점 레이저 주사 현미경을 이용해 대식세포가 발현하는 C5aR에 Co1 펩타이드의 결합하는 것을 확인했다. 그리고 RAW 264.7 대식세포에서 Co1 펩타이드와 C5aR의 상호작용은 훈련 면역의 대사 변화를 매개하는 mTOR (mammalian target of rapamycin) 신호 전달을 유도했고 또한, 훈련 면역에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 IL-1β의 생성을 유도했다. 생체 내 마우스 모델에서는 Co1 펩타이드에 의해 훈련된 복막 대식세포에서 표면 분자의 변화를 분석하고 전 염증성 사이토카인 생성 수준을 측정하여 Co1-C5aR 신호 전달이 복막 대식세포에서 훈련 면역을 유도했음을 확인했다. 종합적으로, 이번 연구에서는 Co1 펩타이드를 사용하여 대식세포에서 일어나는 훈련 면역에 대한 C5aR의 알려지지 않은 역할을 확인하고 Co1 펩타이드가 훈련 면역 기반 백신 보조제로 사용될 수 있음을 제안할 수 있다.

Innate immunity에 관한 최근 연구 동향

김성숙 경성대학교 임상약학대학원 2001 국내석사

In higher organisms, immunity can be broadly characterized into adaptive and innate immunity. Adaptive immunity is mediated by clonally distributed T and B lymphocytes which provide immunological specificity and memory. Wheareas innate immunity is mediated by the action of other cells such as macrophages and neutrophils, and traditionally has been chracterized as nonspecific. However, recent findings have shown that innate immunity has some capacity for specific recognition. Recent studies have identified a human homologue of the Drosophila protein, Toll, and Toll-like receptor in mammals. These Toll-like receptor proteins appear to present a conserved family of innate immune recognition receptors. In this paper, we will discuss the structure and function of Toll and Toll-like receptor(TLR), and we will illustrate the links between innate and adaptive immunity.

Mechanism of cross-protection and trained immunity by live attenuated bacterial/viral vaccines and immunostimulants in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)

이경민 국립부경대학교 대학원 2024 국내박사

최근 수산생물에서 질병을 유발하는 다양한 병원체의 출현이 증가함에 따라 감염성 질병을 제어할 수 있는 효과적인 전략의 수립 필요성이 높아졌다. 일반적으로 사용되는 적응 면역에 기반한 백신들은 분리주에 대해서는 높은 방어 효과를 나타내는 것으로 확인되었으나, 지속적으로 발생하는 변이주, 새롭게 출현한 병원체 그리고 복합 감염에 대해서는 효과가 낮다. 따라서 여러 종류의 병원체에 대해 비특이적으로 높은 방어 효과를 나타내는 백신 및 미생물 유래 물질의 탐색 및 발굴이 필수적이다. 다양한 연구들을 통해 특정 백신들이 백신주와 연관이 없는 병원체의 감염에 대해 비특이적으로 방어 효과를 나타내는 것이 확인되었고, 이는 면역 체계의 기억 시스템에서 다른 메커니즘이 존재함을 의미한다. 이를 Heterologous immunity 라고 하며, 대표적으로 두 가지 메커니즘인 (i) Cross-reactive B cell 과 T cell 에 의한 교차 적응면역 반응, (ii) 특정 자극에 노출된 단핵구/대식세포, 호중구, 수지상세포, 자연살해세포 등의 선천면역 세포가 후성적, 기능적 변화를 통해 비특이적으로 기억을 형성하는 Trained immunity 로 설명된다. 본 연구에서는 heterologous immune response 유도제로서 사용될 수 있는 백신 또는 미생물 유래 물질을 확인하고자 하였고, 이를 위해 무지개송어에서 다양한 타입의 세균 및 바이러스 백신과 면역자극제의 교차방어능을 확인한 뒤, 교차 적응면역 반응과 trained immunity 에 중점을 두어 방어 메커니즘을 조사하였다. 약독화 세균 백신은 체액성 면역과 세포성 면역을 모두 자극하여 다른 백신 타입에 비해 높은 면역원성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 이 특성은 약독화 백신이 동종 균주 뿐만 아니라 이종 균주에 대해서도 방어능을 가질 수 있도록 한다. 본 연구에서는 넙치 분리 균주인 Vibrio anguillarum JJ 를 기반으로 한 약독화 백신인 Δalr1Δalr2 V. anguillarum 이 동종 균주 뿐만 아니라 무지개송어 분리 균주인 V. anguillarum 90-11-287 에 대해서도 높은 방어 효과를 나타내는 것을 확인하였다. 흥미롭게도, 이종 균주에 대한 방어는 주로 교차항체에 의한 것으로 나타난 반면, 동종 균주에 대한 방어는 체액성 면역 반응에 크게 의존하지 않는 것으로 확인되었고, 혈청 응집 시험과 LPS 분석을 통해 V. anguillarum JJ 가 다른 균주에 비해 짧은 O-antigen repeat 를 가지는 특성이 낮은 항체 반응에 기여했을 가능성을 확인하였다. 또한 Δalr1Δalr2 V. anguillarum 를 면역 주사한 무지개송어에서 공격 접종 시 IL-6 가 상향 발현되는 것으로 확인되어 약독화 생백신이 trained immunity 를 유도할 수 있을 것으로 추측하였다. 본 결과는 V. anguillarum 백신의 방어 메커니즘이 백신 타입 뿐만 아니라 공격 접종한 균주에 따라서 달라질 수 있음을 나타낸다. 세균의 증식에 필수적인 역할을 하는 영양요구성 유전자를 넉아웃한 영양요구성 돌연변이는 일반적인 약독화 생백신에 비해 면역 주사 시 질병을 유발할 수 있는 가능성이 낮다. 하지만 병독성 관련 유전자들을 모두 포함하고 있어 고농도로 어체에 주사 시 질병 및 폐사를 일으킬 수 있는 단점이 있으며 alanine racemase (alr) 유전자를 넉아웃한 돌연변이의 경우 백신의 역가가 높아질수록 첨가해 주어야 할 D-alanine 의 농도가 높아져 백신 생산 단가를 높일 수 있다. 본 연구에서는 이와 같은 단점들을 극복하기 위해 낮은 역가의 formalin-killed Vibrio anguillarum (FKC)과 Δalr1Δalr2 V. anguillarum (LAV)를 혼합한 KIVE 백신을 제안하였다. 무지개송어에서 1 x 106 CFU 의 FKC 와 1 x 104 CFU 의 Δalr1Δalr2 V. anguillarum 을 혼합한 KIVE-64 가 1 x 107의 FKC (FKC-7)와 1 x 105의 Δalr1Δalr2 V. anguillarum (LAV-5) 보다 높은 방어효과를 나타내었고, KIVE 백신이 FKC 보다는 낮고, LAV 보다는 높은 항체가를 유도하였다. 백신의 면역 반응을 조사하기 위한 전사체 분석 결과, LAV-5 와 KIVE-64 가 FKC-7 보다 많은 DEG 개수를 나타냈으며, 대부분 cytokine-cytokine receptor interaction pathway 에 포함되는 것을 확인하였다. 본 연구에서 제안한 KIVE 백신은 V. anguillarum 뿐만 아니라 다른 Vibrio 종에도 사용될 수 있을 것으로 생각된다. Muramyl dipeptide (MDP)는 세균의 펩티도글리칸 층을 구성하는 최소의 구성 성분으로, 포유류에서 trained immunity 를 유도하는 것으로 알려져 있다. 현재 어류에서 이루어진 연구들에서 MDP 의 trained immunity 유도 가능성이 확인되었지만, 추후 연구는 이루어지지 않은 실정이다. 본 연구에서는 MDP 의 투여가 무지개송어에서 Vibrio anguillarum 을 방어할 수 있는 것을 확인하였으며, 방어능은 최소 3-4 주간 지속되는 것으로 보인다. 공격 접종 후, 대조구에 비해 MDP 투여 그룹이 낮은 세균 수를 나타냈으며, 전염증성 사이토카인 유전자 (TNF-α, IL-1β, IL-6)가 상향 발현되는 것을 확인하였다. 또한, 해당하는 전염증성 사이토카인 유전자들의 promoter region 에 H3K27ac 이 높은 수준으로 modification 되어있는 것을 ChIP-qPCR 을 통해 확인하여 MDP 의 투여가 무지개송어에서 trained immunity 를 유도할 수 있는 가능성을 입증하였다. Heat-killed mycobacteria 는 포유류에서 면역자극제 및 trained immunity inducer 로 잘 알려져 있다. 본 연구에서는 무지개송어에서 heat-killed Mycobacterium marinum 의 백신 어쥬번트 효과와 trained immunity 유도능을 확인하고자 하였다. 백신과 heat-killed M. marinum 의 혼합 접종 시, 백신 단독구에 비해 높은 항체가 및 면역 관련 유전자들의 상향 발현이 확인되었으며, 공격 접종 시 높은 생존율을 나타내었다. 또한, 높은 농도로 heat-killed M. marinum 을 면역 주사한 경우 Vibrio anguillarum 에 대해 높은 방어효과가 나타났으며, 공격 접종 후 대조구에 비해 낮은 세균 수와 전염증성 사이토카인 (TNF-α, IL-1β, IL-6)의 상향 발현, 그리고 해당하는 사이토카인 유전자들의 promoter region에 H3K4me3와 H3K27ac이 높은 수준으로 modification 되어있는 것을 확인하였다. 따라서 무지개송어에서 heat-killed M. marinum 이 백신 어쥬번트 뿐만 아니라 trained immunity inducer 로서 사용될 수 있을 것으로 생각된다. Single-cycle virus 는 바이러스의 유전체를 구성하는 구조 유전자를 넉아웃한 replication-incompetent virus 로, 약독화 백신으로서 사용될 수 있다. Genotype IVa 기반 viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV)의 glycoprotein (G) 유전자를 결실시킨 single-cycle virus 인 rVHSV-ΔG 가 어류에서 높은 방어능을 나타낸 선행 연구 결과에 기반하여, 본 연구에서는 다른 유전형인 genotype Ia 에 대한 방어능을 무지개송어에서 확인하고자 하였으며, 일반적으로 많이 사용되는 백신 중 하나인 formalin-killed VHSV (FKC)와 방어 효과를 비교하였다. 그 결과, rVHSV-ΔG 가 genotype Ia 에 대해 FKC 보다 높은 방어효과를 나타냈으며, genotype Ia 에 대한 교차항체가 방어에 관여한 것으로 확인되었으나 유의적으로 높은 항체가는 유도되지 않은 것으로 나타났다. 또한, 공격 접종 후 Type I interferon (IFN) 반응에서 FKC 와 rVHSV-ΔG 그룹 간의 발현양의 차이가 확인되지 않았다. 하지만 공격 접종 후 rVHSV-ΔG 그룹에서 낮은 바이러스 copy number, 전염증성 사이토카인 (TNF-α, IL-1β, IL-6)의 상향 발현이 확인되었으며 해당하는 유전자의 promoter region에 H3K4me3와 H3K27ac가 높은 수준으로 modification 되어 있는 것을 확인하였다. 본 연구에서는 교차항체와 trained immunity 가 genotype IVa 기반 rVHSV-ΔG 의 genotype Ia 에 대한 높은 교차방어능에 기여했을 가능성을 확인하였다. 본 연구에서는 무지개송어에서 동종 병원체, 이종 병원체에 대한 약독화 세균 및 바이러스 백신, 면역자극제의 방어능을 확인하였으며, 교차 적응면역과 trained immunity 에 기반한 방어 메커니즘을 입증하였다. 본 연구는 다양한 어류 질병을 예방 및 제어하기 위한 새로운 접근 방법 및 전략으로 생각되며, 수산양식에 있어 백신 개발에도 도움을 줄 것으로 생각된다.

國家免除에 關한 一考察 : 國家免除原則의 制限事由 및 範圍에 對한 比較法的 分析을 中心으로

심영규 漢陽大學校 大學院 1995 국내석사

Molecular Insight into Plant Innate Immunity : 식물 선천성 면역반응의 심화 연구

이보영 과학기술연합대학원대학교 2012 국내박사

Generally the immunity consisted of innate immunity and adaptive immunity, the latter is considered as a special feature of animals. Innate immunity is an inborn immunity which is inherited, and existed both in animal and in plants. Although plants have only innate immunity, are non-motile and do not have specialized immune cells, plants effectively defend themselves from surrounding pathogens through multiple layered innate immune systems. Aim of this thesis is to understand molecular basis of plant innate immunity which renders plants endure and survive in the hostile environment. In the first chapter, it will be given general description of known layers of plant innate immune systems with reviewing published literatures. Plant innate immunity consisted of MAMP triggered immunity (MTI) which is begun with recognizing common structures of microbes and effector triggered immunity (ETI) which is specialized immunity starts with recognizing certain effector proteins secreted by pathogens through type III secretion systems (TTSS). In addition, systemic acquired resistance as a result of ETI or induced systemic resistance triggered by non-pathogenic microbes, and defense priming associated with induced resistance will be discussed. The following chapter II contains the first report describing bacterial RNAs among diverse bacterial genetic materials could be a novel MAMP to increase plant immune responses against pathogenic bacteria. Plants recognize non-self structure that is general cues from invading pathogens referred to as microbe associated molecular patterns (MAMPs) such as chitin from fungi, flagellin and elongation factor of bacteria. Plant immunity triggered by the MAMP perception is addressed as MAMP triggered immunity which primes plant defense responses to subsequence attack of pathogens. The basic structures of MAMPs, MAMP receptors and the signaling process of MAMP perception are conserved both in animal and plants. Nucleic acid-MAMPs such as bacterial CpG DNA, bacterial mRNAs, 16S ribosomal RNA were reported while unmethylated plasmid DNA from bacteria was only reported determinant inducing plant immunity. The pre-treatment of RNAs from Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 enhanced resistance to subsequent infection of the same bacteria in Arabidopsis thaliana. In addition, bacterial RNAs application on leaf disks induced superoxide anion production, callose deposition, MAPK cascade activation, and defense gene expression. The ribosomal RNA which is the most abundant RNA species from P. syringae pv. tomato DC3000 also could mount most of plant defense response as total bacterial RNAs led to the bacterial rRNA might be the determinant triggering plant immune responses and could be a novel nucleic acid MAMP in plant. In the chapter III, it will be provided new evidence that aphid phloem sucking herbivore increased plant systemic immunity against the biotrophic bacterial pathogen Xanthomonas axonopodis in chili pepper (Capsicum anuum L.). As one of the wide distributed plant pathogen, herbivore elicits plant defense responses in diverse aspects. Conversely, pre-challenge with the compatible pathogen X. axonopodis on pepper leaves significantly reduced aphid numbers. Interestingly, the bacterial populations of the beneficial plant growth-promoting rhizobacteria Bacillus subtilis GB03 was higher than control, the saprophyte Pseudomonas fluorescens Pf-5 was same as control, and the pathogenic Ralstonia solanacearum SL1931 was lower than control at 7 days after aphid infestation. This study provides a new understanding of tri-trophic (insect-plant-beneficial root bacteria) interactions and their role in the induction of defence mechanisms. In the last chapter contains that a long chain volatile organic compound (VOC) emitted from Paenibacillus polymyxa strain E681 could promote plant growth and prime plant defense in Arabidopsis. A form of plant induced resistance, induced systemic resistance (ISR) triggered by non-pathogenic microbes especially PGPRs. VOCs from B. subtilis GB03 and B. amyloliquefaciens IN937a were demonstrated by Ryu and coworkers as one of determinants that promoted growth of Arabidopsis and also elicited ISR against necrotrophic pathogen Pectobacterium carotovorum subsp. carotovora. In this study, our objective was to evaluate whether species specific VOCs from a PGPR strain P. polymyxa strain E681. VOC emissions released from E681 primed transcriptional expression of the salicylic acid, jasmonic acid, and ethylene signaling marker genes PR1, ChiB, and VSP2 respectively. In addition, tridecane, a C13 hydrocarbon, was found to be released exclusively from strain E681 but not from strain GB03 which can induce PR1 and VSP2 genes. These results provide new insight into the existence of VOC signal molecule produced by P. polymyxa for plant growth promotion and P. polymyxa specific long-chain VOC tridecane that serves as a bacterial determinant of induced resistance in plants. Collectively, this study provided information about layered mechanisms of plant innate immunity, proposed bacterial ribosomal RNA as a novel nucleic acid MAMP in plant and provided new evidence of multi-trophic interactions and their role in the induction of plant defence mechanisms. In addition, this study suggested long-chain VOC tridecane which was specific VOC from P. polymyxa is a bacterial determinant for plant induced resistance. 일반적으로 면역계는 선천성면역계(innate immunity)와 후천성면역계(acquired immunity)로 구분 할 수 있는데, 후천성면역계 동물에서만 나타나는 특징으로 여겨지지만, 선천성면역계의 경우 최근 동∙식물에 공통적으로 존재한다고 알려져 있다. 후천성면역계외에도 식물은 운동성이 없고, 면역을 담당하는 특화된 기관이나 면역세포가 없는데도 불구하고 외부로부터의 병원균의 침입에 대하여 여러 종류의 다양한 면역반응들을 이용하여 효과적으로 자신을 보호할 수 있다. 식물의 선천성면역계는 세균의 진화적으로 보존된 특징적 구조인 MAMP (microbe-associated molecular pattern)를 인식하는 것으로 시작되는 MAMP-triggered immunity (MTI), 세균이 type III secretion system을 통해 분비하는 effector 단백질을 인식하는 것으로 비롯 되는 effector-triggered immunity (ETI), ETI의 결과로 유도되는 전신획득저항성, 비 병원성 세균에 의한 전신유도저항성 그리고 유도저항성의 결과 형성되는 저항성의 priming등을 포함한다. 특히 priming은 저항성 반응을 활성화 시키는데 필요한 능력이 증가된 상태 즉 병원균의 감염에 민감하게 반응하는 상태가 된 것을 말한다. 따라서 priming상태에 있는 식물은 병원균의 감염에 대해 더 빠르고 강한 저항성 반응을 나타내는 특징이 있다. 본 논문의 목적은 식물이 불리한 환경을 견뎌내고 생존할 수 있게 하는 선천적 면역 체계를 분자적 수준에서 이해하고자 하는데 있다. 본 논문의 첫 번째 장에서는 이미 보고된 문헌 연구를 통하여 식물의 다양한 선천성면역계에 관해 논의 하였다. 제 2장 에서는 식물의 면역반응을 일으키는 세균 RNA를 소개하며, 세균 RNA가 새로운 식물 MAMP 의 후보물질이 될 수 있음을 증명하였다. 지금까지 알려진 식물의 MAMP로는 곰팡이의 키틴, 세균의 lipopolysaccharide, 편모(flagella)단백질, 세균의 translation elongation factor (EF-Tu) 등이 있다. MAMP의 종류와 구조, 이를 인식하는 수용체의 구조 그리고 MAMP 인식 후의 정보전달 과정은 동물과 식물이 매우 유사한데, 동물에서는 앞서 언급한 식물의 MAMP이외에도 세균의 CpG DNA, mRNA, 16S 리보솜 RNA 등의 핵산으로 이루어진 다양한 MAMP가 보고되었다. 그러나 식물에서는 아직 핵산으로 이루어진 MAMP가 보고된바 없다. 이에 본 연구에서는 세균의 핵산 물질 중에서도 RNA가 동물에서와 유사하게 식물에서 MAMP로서 인식되고 면역반응을 유도 하는 것을 보여 줌으로써 식물의 새로운 핵산 MAMP로서의 가능성을 제시하였다. 애기장대에 Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000에서 분리한 전체 RNA를 잎에주사(infiltration)한 5일 뒤 동일한 세균을 감염 시켰을 때 식물의 저항성이 대조군에 비해 증가했다. 또한 애기장대의 잎에 세균 RNA를 처리 했을 때, 과산화물 음이온 (superoxide anion)의 생산, 칼로스축적 (callose deposition), mitogen activated protein kinase 활성화, 또는 저항성 관련 유전자인 PR1, VSP1, ChiB, ERF1의 발현이 증가하는 현상이 나타났다. 세균의 전체 RNA의 대부분을 차지 하는 리보솜 RNA를 전처리 하면 세균 전체 RNA를 처리 했을 때와 마찬가지로 식물의 저항성 반응이 증가하는 경향을 보였다. 따라서 전체 세균 RNA중에서도 세균의 리보솜 RNA는 식물 면역 반응을 유도하는 결정요인이며, 식물이 인식하는 새로운 MAMP의 후보 물질로 여겨진다. 제 3장은 고추(Capsicum anuum L.)를 초식성 곤충인 진딧물 (aphid)이 식물의 전신 면역반응을 일으켜 반활물기생성(semi-biotrophic)세균인 Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria 감염에 대한 저항성을 증가시킨다는 내용을 담고 있다. 진딧물은 흡즙성 해충의 하나로 고추에 감염 시켰을 경우 CaPR9과 CaLOX1 저항성 유전자의 발현이 priming 되었다. 한편, X. axonopodis pv. vesicatoria 를 고추 엽면에 먼저 감염 후 진딧물 처리시 개체수가 대조구에 비해 2/3 수준으로 줄어들었다. 또한 진딧물을 감염 시킨 7일 뒤에 식물생장촉진근권세균(plant growth-promoting rhizobacteria; PGPR)인 그람 양성 Bacillus subtilis GB03의 세균수가 대조군에 비해 5.64배 증가하였고, 이에 반해 Pseudomonas fluorescens Pf-5의 세균수는 대조군과 비슷하였으며 병원균인 Ralstonia solanacearum SL1931의 세균수는 대조군에 비해 17% 수준으로 줄어들었다. 진딧물의 감염은 식물의 세균에 대한 저항성을 유도 하며, 진딧물에 감염된 식물은 병원균의 감염에 대응하기에 유리하도록 식물에 유용한 근권세균의 밀도를 증가시켰다. 본 연구는 곤충-식물-식물생장촉진근권세균의 다자간 상호작용을 이해 하는데 필요한 분자생물학적인 기초를 제공하였다. 제 4장에서는 애기장대를 대상으로 PGPR인 Paenibacillus polymyxa strain E681 이 생산하는 volatile organic compound(VOC)가 식물의 생장을 촉진하며 동시에 식물의 저항성을 priming 한다는 내용을 제시했다. 식물의 유도저항성의 일환인 전신유도저항성(ISR)은 PGPR에 의해 유도 된다. B. subtilis GB03와 B. amyloliquefaciens IN937a가 생산 하는 휘발성 물질이 애기장대의 생장을 촉진하며, necrotrophic 병원균인 Pectobacterium carotovorum subsp. carotovora에 대한 식물의 전신유도저항성을 유발한다. 본 연구에서는 P. polymyxa strain E681이 생산하는 long chain VOC가 식물의 생장을 촉진하며, 위에서 언급한 B. subtilis GB03 와 B. amyloliquefaciens

Hormonal Regulation in the Pattern Triggered Immunity-mediated Resistance or Susceptibility in the Xanthomonas campestris pv. campestris-Brassica napus Pathosystem

엠디 알 마문 전남대학교 2022 국내박사

Phytohormones was found to regulate the metabolic and physiological responses to biotic stress in Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc)-Brassica napus pathosystem . Still, the phytohormonal regulation in pattern triggered immunity (PTI) and effector triggered immunity/susceptibility (ETI/ETS) in relation with immune related genes is unknown. The aim of the study was to characterize the phytohormonal regulation in cytoplasmic kinases?and resistance gene-signaling for activation of PTI and ETI in Brassica napusto black rot disease, caused by a destructive pathogen Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc), which is responsible for limiting the quality and productivity of cruciferous vegetables. In chapter 1, Xcc has found in hemibiotrophic nature as cause the asymptomatic infection in early biotrophic phase (2 DPI) and turn into necrotrophic phase with V-shaped-visual necrosis to induce the necrosis at the later necrotrophic phase (7-14 DPI). The necrotrophic phase (7-14 DPI) was initiated by the elevated H2O2 concentration, darkest spots in O2 .? localization along with Ca2+ channel-related genes (Ca2+ ATPase) along with elevated cytokinin (CK) level . The opposite results were observed at early biotrophic phase (2 DPI). In chapter 2, the aim of study was to characterize the significance of Xcc-induced phytohormones- [especially, abscisic acid; (ABA)] and exogenous ABA-induced stomatal conductance in relation with immune related genes. Xcc-infection and ABA-pretreatment were applied in Brassica napus (cv. Mosa). In this time course study, PTI-related cytoplasmic kinase BIK1 was induced in asymptomatic early phase (2 DPI) along with increased jasmonic acid (JA) level, whereas at later phase of Xcc-infection (7-15 DPI), elevated level of ABA was found along with highly expressed R-gene (TAO1) resulted in slow anion channel-1 (SLAC1)- mediated stomatal closed through calcium dependent protein kinase 5 (CDPK5) along with increment of cytosolic Ca2+. Exogenous ABA-application induced the expression of ABA- receptor (PYR1) resulted in increased endogenous ABA level leading to confirming SLAC1 mediated stomatal closer by inhibiting JA signaling with moderate cytosolic Ca2+. The aim of in ‘chapter 3’ was to characterize the hormonal regulations in the transition between biotrophic and necrotrophic phases of Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) infection. The length of the V-shaped lesions increased significantly with the progression of infection along with the increasing of H2O2 accumulation and the expression of NADPHoxidase. The early biotrophic phase (2DPI) to Xcc-infection was found with reduced levels of salicylic acid (SA), ABA, whereas the opposite results were found in the necrotrophic phase transition. In chapter 4, the aim was to understand the R-genes mediated Ca2+ signaling and phytohormones in ETI and disease susceptibility (ETS), Xcc was inoculated in resistance and susceptible cultivars (cultivar Capitol and cultivar Mosa) of B. napus. The R-gene (CC-NBLRR-type, ZAR1) was found to initiate SA-mediated JA signaling through calmodulin (CaM) and calcium-sensing receptor (CAS) for ETI in cv. Capitol, whereas (TIR-NB-LRR)-type R-gene, TAO1, was involved in higher accumulation of SA and significantly lower JA level along with visual symptoms at 14 DPI in cv. Mosa. Calcium channel-related Ca2+ ATPase, CDPK5 and calcium-sensing protein 60g (CBP60g) were also found to be highly expressed in disease development (ETS). The aim of this study (in chapter 5) was to identify the hormonal interaction with proline metabolism in regulation of the transition between PTI and ETS. In early phase (3DPI), highly expressed BIK1 and moderate level of salicylic acid (SA) accumulation-initiated activation of ZAR1 paused the additional proline accumulation with moderate level of SA and JA in later phase in resistance cultivar (cv, Capitol). Whereases early elevated JA level confirmed upregulation of TAO1 was consistent with an increase in SA and abscisic acid (ABA) levels and resulted in an antagonistic depression of JA, which led to a proline accumulation along with significant disease susceptibility (ETS). Taken together, among the phytohormones, SA and JA synergism involves in plant resistance [pattern/effector triggered immunity (PTI/ETI)], whereas SA and ABA interaction was found to prohibited JA signaling to induce the disease development [effector triggered susceptibility (ETS)]. 식물호르몬은 유채와 병원성 박테리아 Xanthomonas campestris pv. campestris(Xcc)의 병체계에서 대사적 반응 및 생리학적 반응을 조절하는 것으로 밝혀졌다. 그러나 면역 관련 유전자와 관련된 패턴 유발 면역 (pattern triggered immunity, PTI)과 효과인자 유발 면역(effector triggered immunity/susceptibility, ETI/ETS)의 식물 호르몬 조절은 아직 잘 알려져 있지 않다. 따라서, 본 연구의 목적은 작물의 품질과 생산성을 제한하는 병원체 Xcc의 접종에 의해 유발된 검은썩음병에 대한 유채의 면역 반응 PTI와 ETI의 활성화를 위한 세포질 키나아제와 저항성 유전자 신호전달에 있어서 식물호르몬 조절을 특성화 하기 위한 것이다. 제1장에서는 Xcc가 병원균 접종 초기 (2일)에 biotrophic (생물영양) 단계에서 무증상 감염을 일으키고 접종 후기 (7-14일)에 necrotrophic (괴사영양) 단계에 V자형 괴사를 유도하는 것으로 보아 hemibiotrophic (반생물영양) 특성임을 확인하였다. Necrotrophic 단계(7-14일)는 Ca2+ 채널과 관련된 유전자 (Ca2+ ATPase) 및 사이토카인의 증가와 함께 활성산조종인 O2 -와 H2O2의 증가에 의해 시작되었다. 반대되는 결과는 초기 biotrophic 단계 (2일)에서 발견되었다. 제2장에서는 면역 유전자와 관련된 Xcc에 의해 유도된 식물호르몬 [특히, 앱시스산 (ABA)]과 외인성 ABA공급에 의해 유도된 기공 전도도의 중요성을 특성화 하기 위해서 유채 품종 Mosa에 Xcc 접종 및 ABA 전처리를 수행하였다. 이 실험 기간동안, PTI와 관련된 세포질 키나아제 BIK1은 자스몬산 (JA) 농도의 증가와 함께 무증상 초기 단계 (2일)에서 유도된 반면, Xcc 감염의 후기 단계(7-14일)에서 고도로 발현된 R-유전자 (TAO1)와 함께 발견된 ABA의 증가는 세포질의 Ca2+ 증가와 calcium-dependent protein kinase 5 (CDPK5) 발현 증가를 통해 slow anion channel-1 (SLAC1) 매개 기공 폐쇄를 초래했다. 외인성 ABA 공급은 ABA-receptor (PYR1)의 발현을 유도하여 내인성 ABA 수준을 증가시켜 세포질 Ca2+ 조절에 의한 JA 신호전달을 억제함으로써 SLAC1 매개 기공 폐쇄를 일으켰다. 제3장에서는 Xcc 접종에 의한 biotrophic과 necrotrophic 단계 사이의 전환에서 호르몬 조절을 특성화 하였다. V자형 병변 길이는 H2O2축적과 NADPH-oxidase의 발현의 증가와 함께 감염이 진행됨에 따라 현저히 증가하였다. Xcc 감염에 대한 초기 biotrophic 단계 (2일)에서는 살리실산 (SA)와 ABA의 감소가 나타난 반면 necrotrophic 단계에서 반대되는 결과가 발견되었다. 제4장에서는 ETI와 질병감수성(ETS)에서 R-유전자 매개 칼슘 신호전달 및 식물호르몬을 이해하기 위해서, 유채의 병 저항성 품종인 Capitol과 감수성 품종인 Mosa에 Xcc를 접종하였다. CC-NB-LRR-type R-유전자인 ZAR1는 저항성 품종인 Capitol에서 ETI에 대한 calmodulin (CaM)과 calcium-sensing receptor (CAS)를 통한 SA 매개 JA 신호전달 개시와 관련이 있는 반면, TIR-NB-LRR-type R-유전자 TAO1은 감수성 품종인 Mosa에서 14일째에 시각적 병증과 함께 SA의 더 높은 축적 및 현저히 낮은 JA의 수준과 관련이 있었다. 또한 Ca2+ 채널과 관련된 Ca2+ ATPase, CDPK5, calcium-sensing protein 60g (CBP60g)도 질병감수성 (ETS)에서 높게 발현되었다. 제5장에서는 PTI와 ETS 사이의 전환 조절에 있어서 프롤린 대사와 호르몬 상호작용을 밝히기 위해 수행되었다. 저항성 품종 (Capitol)의 Xcc 감염 초기단계 (3일)에서 고도로 높게 발현된 BIK1과 적당한 수준의 SA 축적에 의해 개시된 ZAR1의 활성은 후기 단계에서 적당한 수준의 SA 및 JA와 더불어 추가적인 프롤린 축적을 일시적으로 중지했다. 반면에, 감수성 품종 (Mosa)에서 Xcc 감염 초기 상승된 JA 수준은 TAO1를 상향 조절했으며 이는 SA와 ABA 수준의 증가와 일치하였고 결과적으로 JA의 길항성 억제를 초래하여 현저한 질병 감수성 (ETS)과 함께 프롤린 축적을 초래했다. 이상의 결과들을 종합해 보면, 식물호르몬 중에서 SA와 JA의 상승작용은 식물 저항성 [패턴 유발 면역 /효과인자 유발 면역 (PTI/ETI)]과 관련이 있는 반면, SA와 ABA 상호 작용은 질병 발병을 유도하는 (효과인자 유발 감수성, ETS) JA 신호전달의 억제와 관련이 있다고 생각된다.

Modulation of host immunity by nuclear effectors of the rice blast fungus, Magnaporthe oryzae

김성범 서울대학교 대학원 2021 국내박사

식물 병원체는 전세계 곡물 생산에 큰 손실을 일으켜 식량 문제를 일으킨다. 식물의 면역체계는 대부분의 외부 침입을 막아내지만 병원체는 다양한 종류의 이펙터(effector)를 활용하여 기주의 방어반응을 무력화한다. 병원체가 식물에 접촉한 후 식물침입이 이루어지는 과정에서 공간적 분리가 일어나는데, 이러한 공간적 분리에 따라 병원체 이펙터는 세포 간극 이펙터(apoplastic effector)와 세포질 이펙터(cytoplasmic effector)로 나누어진다. 식물 침입과정에서 기주의 핵으로 이동하여 작동하는 이펙터를 핵 이펙터(nuclear effector)로 분류하며, 병원체가 병 발생환경을 효과적으로 조작하는데 큰 영향을 준다. 핵 이펙터는 주로 식물병원성 세균과 난균에서 기능이 분석되었으며 공통적으로 방어 유전자 발현, 호르몬 신호전달체계, 세포사멸 등을 조절하는 것으로 알려져 있다. 하지만 식물병원성 곰팡이의 핵 이펙터에 대한 기능분석은 상대적으로 부족한 상황이다. 본 연구에서는 벼 수확량에 큰 손실을 일으키는 벼 도열병균 (Magnaporthe oryzae)의 핵 이펙터 기능을 분석하였다. 벼 도열병균의 침입과정을 살펴보면, 포자가 벼 표면에 부착, 발아한 후 부착기를 통해 물리적으로 식물 세포를 침입한다. 침입 후 벼 도열병균은 기주 면역을 조절하기 위해 이펙터를 분비하는데, 세포 간극 이펙터는 세포 외 기질(extracellular matrix)로 분비되어 기주 방어반응을 방해한다. 세포질 이펙터는 활물기생 계면 복합체(biotrophic interfacial complex)를 통해 기주 세포 내부로 이동하며 특정 소기관에서 작동한다. 벼 도열병균의 핵 이펙터로 동정된 유전자들 중 MoHTR1과 MoHTR2는 침입균사로부터 분비된 후 식물 세포 내부로 이동하고, 핵에 도달한다. 그리고 이펙터 결합 인자(effector binding element)를 지니고 있는 벼 유전자의 프로모터(promoter)에 결합하여 목표 유전자 발현을 억제하고, 간접적인 효과로 식물 면역 유전자의 발현을 재 프로그래밍한다. MoHTR1과 MoHTR2를 발현하도록 설계한 유전자 도입 식물체는 반활물기생 병원체인 벼 도열병균과 벼 흰잎마름병균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)에 대한 감수성이 증가하며, 반대로 사물기생 병원체인 벼 깨씨무늬병균(Cochliobolus miyabeanus)에 대한 저항성이 증가한다. 병원체의 생활사에 따라 다르게 나타나는 병 저항성은 양가 면역의 한 사례로 볼 수 있으며, MoHTR의 목표 유전자들이 벼 도열병 저항성에 관여할 뿐만 아니라 다른 병원체의 저항성에도 관여할 수 있다는 것을 나타낸다. 본 연구 결과는 벼와 벼 도열병균 상호 작용 기작에 대한 새로운 정보를 제공하며, 병원체 핵 이펙터에 의한 식물 면역 조절이 다른 병원체에 대한 저항성에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지를 제시한다. Plant pathogens threat human being for devastating crop loss in worldwide. Two-layered plant immune systems, PAMP- and effector-triggered immunity, eliminate most of invaders. Despite of robust immune systems of plants, compatible pathogen effectors neutralize hostile environment during infection via versatile strategies. Spatial compartments emerged during the plant infection classify the effectors such as apoplastic effector and cytoplasmic effector. Translocated cytoplasmic effectors move to specific organelles and modify immune responses. A group of effectors located in host nuclei are classified as nuclear effector, facilitating efficient colonization of plant tissues. Numerous nuclear effectors are discovered in bacterial and oomycete pathogens, and some of them target the same immune responses in terms of biological processes such as transcriptional regulation, hormonal signaling, programmed cell death. However, functional mechanism of fungal nuclear effectors remains to be revealed. Magnaporthe oryze, rice blast pathogen, causes serious yield loss for rice production. Rice-M. oryzae pathosystem is used for model of plant-microbe interaction owing to plenty of genome/transcriptome information and robustness of experimental system. M. oryzae penetrates rice cell wall using appressoria, and invaginates plant plasma membrane using invasive hyphae. Apoplastic effectors are secreted into extracellular matrix, interfering host defense responses. Cytoplasmic effectors are translocated via a specialized secretory structure, biotrophic interfacial complex (BIC), and moved to cellular organelles. In this study, two nuclear effectors of rice blast fungus named as MoHTR1 and MoHTR2 are characterized. Both nuclear effectors are translocated via BIC, and transferred into the nuclei of initially penetrated and surrounding cells. Theses effectors bind effector binding elements in target gene promoters and reprogram the expression of immunity-associated genes in rice. Transgenic rice expressing each MoHTR showed ambivalent response to pathogens with different lifestyles: increased susceptibility to M. oryzae and Xanthomonas oryzae pv. oryzae, hemibiotrophic pathogens, but enhanced resistance to Cochliobolus miyabeanus, a necrotrophic pathogen. The opposite effect of the transcriptional reprogramming by these effectors on defense against hemibiotrophic pathogen vs. necrotrophic pathogens, a phenomenon defined as ambivalent immunity, suggest that they target genes and processes involved in defense against all types of pathogens, not just M. oryzae. Findings in this study help understanding functional role of DNA-targeting nuclear effectors in fungal pathogen, and solve the question underlying how pathogens manipulate plant immunity. CHAPTER I. Nuclear effectors of plant pathogens Crop plants provides essential foods to mankind, but numerous plant pathogens destroy substantial amount of the products worldwide. Among the microbial pathogens, bacteria, oomycete, and fungi are major causal agent. They invade different strategies according to their lifestyle such as biotrophy, necrotrophy, and hemibiotrophy. Host plants protect themselves via two-layered immune systems. PAMP- and effector-triggered immunity efficiently block the offense of the pathogens, but compatible pathogens evade the immune systems using effectors. Effectors, molecular weapons of pathogens, are secreted and change the infection environment. According to the effector localization, they classified as apoplastic effectors and cytoplasmic effectors. Some effectors are transferred to host nuclei, essential organelle for immunity regulation, interrupting host defense responses. This type of effectors is called nuclear effector, and several effectors are discovered in the bacteria, oomycete, and fungi. In this review, nuclear effectors that have been discovered in the plant microbial pathogens are described. How these effectors modulate plant immunity is also highlighted in terms of biological processes and molecular functions. CHAPTER II. Two nuclear effectors of the rice blast fungus modulate host immunity via transcriptional reprogramming Pathogens utilize multiple types of effectors to modulate plant immunity. Although many apoplastic and cytoplasmic effectors have been reported, nuclear effectors have not been well characterized in fungal pathogens. Here, two nuclear effectors are characterized in the rice blast pathogen Magnaporthe oryzae. Both nuclear effectors are secreted via the biotrophic interfacial complex, translocated into the nuclei of initially penetrated and surrounding cells, and reprogram the expression of immunity-associated genes by binding on effector binding elements in rice. Their expression in transgenic rice caused ambivalent immunity: increased susceptibility to M. oryzae and Xanthomonas oryzae pv. oryzae, hemibiotrophic pathogens, but enhanced resistance to Cochliobolus miyabeanus, a necrotrophic pathogen. Findings in this study help remedy a significant knowledge deficiency in the mechanism of M. oryzae-rice interactions and underscore how effector-mediated manipulation of plant immunity by one pathogen may also affect the disease severity by other pathogens.

Impaired Mammalian Epimorphic Regeneration in the Absence of Adaptive Immunity

이지은 포항공과대학교 융합대학원 2025 국내석사

Regeneration refers to the restoration of damaged tissues or organs to their original structure and function. While mammals exhibit limited regenerative capabilities, digit tip regeneration represents a rare example of epimorphic regeneration, characterized by the formation of a blastema, a mass of undifferentiated cells. This study investigates the role of adaptive immunity in mammalian digit tip regeneration using Rag1-KO mice, which lack functional adaptive immunity. Immunostaining revealed the presence of T cells during digit tip regeneration, suggesting their involvement in the process. In Rag1-KO mice, the absence of adaptive immunity led to reduced nail area and shortened digit tip length. These external changes were accompanied by internal structural deficits, including a reduced mesenchymal area and impaired bone regeneration, characterized by diminished volume and weakness. Single-cell RNA sequencing further demonstrated decreased mesenchymal cell proliferation and late-stage osteogenic differentiation in Rag1-KO mice, confirming that the absence of adaptive immunity influences proliferation and differentiation of blastema. Furthermore, the absence of adaptive immunity resulted in increased infiltration of innate immunity, including macrophages and neutrophils, disrupting the blastema microenvironment. These findings suggest that adaptive immunity indirectly regulates proliferation and differentiation of blastema by modulating innate immunity. This study provides important insights into the role of adaptive immunity in mammalian epimorphic regeneration and offers potential directions for enhancing regenerative outcomes in mammals.

GIGANTEA Regulates R Protein-Mediated Defense Responses in Plants

딘 샤합 경상국립대학교 대학원 2024 국내박사

Combined immunogenic cell death and phagocytosis enhancement awakens intrinsic immunity against cancer : immunogenic clearance for cancer immunotherapy

남기훈 KU-KIST Graduate School of Converging Science and 2019 국내박사

A growing appreciation of the relationship between the immune system and tumorigenesis has led to the development of cancer immunotherapy aimed at ‘re-editing’ the immune system to kill cancer cells. Activation of T-cell immune response is critical for the therapeutic efficacy of cancer immunotherapy. Current immunotherapies including immunecheck point blockades have shown remarkable clinical success against several cancers; however, significant responses remain restricted to a minority of patients. Here, we suggest a novel strategy that is combining immunogenic cell death and phagocytosis enhancement for cancer immunotherapy, namely “immunogenic clearance”, which seeks to awaken intrinsic immunity against cancer. In part 1, I designed a ferritin nanocage termed FHSirpα that contains the Sirpα variant on the surface of a nanocage composed of 24 ferritin heavy chains and is loaded with doxorubicin. This nature-derived nanocage not only efficiently presents ligands that enhance cancer cell phagocytosis, but also delivers drugs that induce immunogenic cancer cell death. The designed nanocage-therapeutics induce the release of neoantigens and danger signals from dying tumor cells, and lead to enhancement of tumor cell phagocytosis and cross-priming of tumor specific T cells by neoantigen peptide-loaded antigen-presenting cells (APCs). We observed potent inhibition of tumor growth and systemic tumor-specific T-cell responses in tumor draining lymph node (TDLN) and spleen and further, infiltration of CD8+ T cells into the tumor site. Remarkably, after removal of the primary tumor, all mice treated with this nanocage-therapeutics are protected against subsequent challenge with the same tumor cells, suggesting development of lasting, tumor-specific responses. In part 2, we tried the same therapeutic strategy that combines enhancing the phagocytic activity of antigen-presenting cells with immunogenic cell death to trigger efficient antitumour immunity. Rho-kinase (ROCK) blockade increases cancer cell phagocytosis and induces antitumour immunity through enhancement of T-cell priming by dendritic cells (DCs), leading to suppression of tumor growth in syngeneic tumor models. Combining a ROCK blockade with immunogenic chemotherapy leads to increased DC maturation and synergistic CD8+ cytotoxic T-cell priming and infiltration into tumors. This therapeutic strategy effectively suppresses tumor growth and improves overall survival in a MMTV/Neu tumour model. This therapeutic tactics for overcoming the activation-energy threshold of the immunosuppressive tumor microenvironment and mediating the delivery and presentation of tumor neoantigens to the host’s immune system awakens the host’s immune system and provokes a durable systemic immune response against cancer. Collectively, these results suggest that boosting intrinsic cancer immunity using immunogenic killing and enhanced phagocytosis is a promising therapeutic strategy for cancer immunotherapy.