Identification of HLA-specific tumor associated antigen (TAA) epitope in lung cancer

이나은 성균관대학교 일반대학원 2023 국내석사

Immunotherapy using immune checkpoint inhibitors (ICIs) represents one of the most promising therapeutic approaches in lung cancer, but only about 30% of all lung cancer patients show responsiveness. Therefore, we investigated the tumor associated antigen (TAA) candidates in lung adenocarcinoma (LUAD) and lung squamous cell carcinoma (LUSC) related to specific T cell activation. The expression of four TAA candidates including hTERT, WT1, NY-ESO-1, MAGEA was examined by immunohistochemistry (IHC). hTERT was highly expressed in LUAD and hTERT, MAGEA was highly expression in LUSC. Moreover, it was analyzed that MAGEA high expression in LUSC is associated with overall survival (OS). HLA type was analyzed to predict HLA specific TAA, HLA subtype of A24:02 (41%), B 15:01 (32%) and C01:02 (45%) were predominant. To confirm HLA-specific T cell response, we predicted HLA-specific binding affinity to tumor associated antigen (TAA). Endogenous T cell response to TAA was measured using ELISpot assay, FACS for secreted IFN-γ. We confirmed that the T cell response was TAA synthetic peptide concentration-dependent and stimulation time-dependent. In addition, it was confirmed that 2 weeks of stimulation time is required to induce an endogenous T cell response to TAA in NSCLC. Finally, we identified HLA-specific WT1 epitope (#2 and #4) that responded dominantly in NSCLC patients. Therefore, we suggest that T cell activation stimulated with HLA-specific TAA candidates may affect the therapeutic effect of lung cancer patients treated with immune checkpoint inhibitors (ICIs). 면역 관문 억제제를 포함한 면역항암제는 폐암에서 새롭게 대두되는 효과적인 치료제이다. 하지만, 전체 폐암 환자에서 30%정도만 치료에 대한 반응성을 보이고 있다. 본 연구에서는 비소세포폐암 환자에서 종양관련항원에 반응성을 나타내는 T 세포에 대한 연구를 수행하였다. 비소세포폐암 환자의 조직으로 4종류 종양관련항원 (hTERT, WT1, NY-EOS-1, MAGEA)에 대한 발현양상 및 발현양상을 면역조직염색을 이용하여 확인하였다. 선암 (adenocarcinoma) 조직에서는 hTERT, 편평세포암 (squamous cell carcinoma) 조직에서는 hTERT, MAGEA가 높은 발현빈도를 보였다. 특히, 편평세포암 조직에서 MAGEA가 높은 발현빈도를 보였던 환자군에서는 전체생존기간 (overall survival)이 더 길었던 것으로 분석되었다. HLA에 따라 종양관련항원에 대한 결합 친화도을 예측하기 위해, HLA 유형을 분석하였으며, A24:02 (41%), B 15:01 (32%) and C01:02 (45%)가 우세하게 나타나는 것으로 확인되었다. HLA에 따라 T 세포 반응성을 확인하기 위해, 종양관련항원에서 HLA 유형에 따라 결합 친화도를 예측하여 펩티드 (peptide)를 제작하였다. 제작된 HLA 특이적 펩티드가 내인성 T 세포 반응을 유도하는지 ELISpot assay, FACS를 통해 확인하였다. 합성된 종양관련항원 펩티드 (peptide)는 농도 의존적 및 stimulation time 의존적으로 T 세포 반응성을 유도하였다. 또한, 합성된 종양관련 펩티드 (peptide)에 대한 내인성 T 세포 반응성을 유도하기 위해서는 약 2주간의 stimulation time이 필요함을 확인하였다. 결론적으로, 본 연구에서는 비소세포폐암 환자에서 우세하게 반응하는 HLA 특이적 WT1 epitope (#2 및 #4)를 발견하였으며, 이러한 WT1 epitope는 비소세포페암 환자의 면역 관문 억제제 치료와의 보조제로서 영향을 줄 수 있음을 제시하고자 한다.

가와사끼병과 주조직적합성 유전자의 연관성 연구 : Association of human leukocyte antigen (HLA) genes with Kawasaki disease

이혜선 울산대학교 대학원 2017 국내석사

Kawasaki disease (KD) is a childhood autoimmune disease accompanying fever and clinical signs of mucocutaneous inflammation. Coronary artery aneurysms (CAA) develop in 15% to 25% of untreated children. Intravenous immunoglobulin (IVIG) is the standard treatment of KD but approximately 10% of patients are unresponsive. Human leukocyte antigen (HLA) genes can regulate immune systems by presenting peptides on the cell surfaces and this is essential in protecting our bodies from invaders. Genome-wide association study (GWAS) data indicated that a few loci in HLA region were associated with KD. In this study, to identify whether coding variants of HLA genes are associated with KD, we sequenced all coding regions of the 4 selected KD-associated HLA genes (HLA-E, LTA, HLA-C, HLA-DOA) from our previous GWAS data and additional candidate gene HLA-DPB1 using 24 KD patients’ DNA samples. We found a total of 42 nonsynonymous SNPs (nsSNPs): 1 nsSNP in HLA-E, 1 nsSNP in LTA, 35 nsSNPs in HLA-C, and 15 nsSNPs in HLA-DPB1. No nsSNP was found in HLA-DOA genes. A total number of 6 nsSNPs in HLA-C were selected for genetic association study considering call rate (> 0.8) and functional effect of protein change. In case-control association study (604 cases and 608 controls), 6 nsSNPs in HLA-DPB1were associated with KD: rs1042133, rs1042153, rs9277348, rs1042136, rs41555313 and rs9277355 (P < 0.05). Especially, a nsSNP in HLA-DPB1 (rs1042133 G>C: Glu86Asp) was significantly associated with KD (odds ratio = 1.628, P = 0.000517). In addition, another nsSNP (rs41555313) located in exon 2 of HLA-DPB1 gene was also significantly associated with KD (P = 0.007954). Particularly, rs41555313 is a rare variant and only three genotypes of heterozygote and two genotypes of homozygote were found in KD samples (n = 600) but not in control samples (n = 602). These results indicate that HLA-DPB1 gene can play a critical role in the development of KD.

인공신경망을 이용한 HLA-A, -B, -DR 혈청학적 특이도의 결정 규칙 추출

최성은 울산대학교 대학원 2009 국내박사

배경: HLA는 인간에게서 알려진 유전자 중에서 가장 다형한데, 고형장기이식에서 기본적으로 검사되는 HLA-A, HLA-B, HLA-DR의 경우 혈청학적 수준에서만 각각 28, 62, 24 종류, 아미노산 서열 수준에서는 2008년 8월까지 각각 527, 911, 546 종류가 보고되어 있다. HLA 대립유전자의 아미노산 서열간 차이를 명명하기 위해 4 digits 체계가 사용되고 있는데, 첫 2 digits은 혈청학적 특이도를, 나머지 2 digits은 아미노산 서열의 다름을 나타내고 있다. 그런데 최근에 보고되는 새로운 대립유전자들은 혈청학적 반응도가 거의 보고되지 않고 아미노산 서열의 유사도(sequence homology)에 의해서만 명명이 이루어지기 때문에 첫 2 digits 명명에 오류가 발생하고 있다. 따라서 본 연구에서는 인공신경망(artificial neural network)을 이용하여 혈청학적 특이도(serologic specificity)를 결정짓는 규칙을 찾아내고자 하였다. 재료 및 방법: IMGT HLA Database http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/)에 보고된 2008년 4월 Release 2.21의 대립유전자 정보를 이용하였다. 혈청학적 특이도를 결정짓는 규칙을 추출하기 위하여 2004년 WHO Nomenclature Report 중에서 혈청학적 특이도가 보고된 HLA-A, -B, -DRB1 대립유전자 각각 142개, 304개, 159개를 학습데이타 세트(training set)으로 훈련하여 인공신경망을 구축하였다. 학습된 인공신경망으로부터 혈청학적 특이도를 결정짓는 규칙을 추출하기 위해 분해적 접근법(decompositional approach) 기반의 ordered-attribute search (OAS) 알고리즘을 이용하였다. 또한 학습데이타 세트에 사용하였던 대립유전자를 제외한 나머지 HLA-A, -B, -DRB1 대립유전자 각각 364개, 568개, 307개를 평가데이타 세트(test set)로 하여 인공신경망의 성능을 평가하였다. 이들 중 혈청학적 특이도가 보고된 HLA-A, -B, -DRB1 각각 37개, 51개, 15개 단백질 대립유전자의 경우는 해당 혈청학적 특이도과 인공신경망 결과를 비교하였고, 혈청학적 특이도가 보고되지 않은 HLA-A, -B, -DRB1 각각 326개, 516개, 292개의 대립유전자는 첫 2 digits를 혈청학적 명명으로 간주하고 인공신경망을 평가하였다. 결과: 학습데이타 세트를 이용하여 평가한 결과 학습된 인공신경망은 모든 대립유전자들에 대해 100% 일치하는 혈청학적 특이도를 예측하였다. 학습데이타 세트에 사용되지 않았던 HLA-A, -B, -DRB1 대립유전자 각각 363개, 565개, 307개에 대해서는 각각 97% (352/363), 94% (532/565), 97% (297/307)의 일치율을 보였다. 이들 중 혈청학적 특이도가 보고된 HLA-A, -B, -DRB1 각각 37개, 51개, 15개에 대해서는 A*0278, A*3308, DRB1*1457, DRB1*1609 등 4가지에서만 차이를 보여 각각 95% (35/37), 100% (51/51), 87% (13/15)의 일치율을 보였다. 결론: 인공신경망을 구축을 통해 HLA 대립유전자들의 혈청학적 특이도를 결정짓는 규칙을 추출할 수 있었다. 학습된 인공신경망과 추출된 규칙은 향후 새로운 대립유전자를 정확히 명명하는데 크게 도움이 될 것이다. 아울러 추출된 규칙은 혈청학적 에피토프(serologic epitope)를 규명하는 기초자료가 되며, 고형장기 이식에서 시행되는 panel reactive antibody 검사와 같은 체액성 면역반응을 해석하는데 활용될 수 있을 것이다.

Promotion of Cancer Cell Migration by the Interaction of MYPT2 Isoform f and FAT10

Seong Eun Song 부산대학교 대학원 2019 국내석사

Study on the regulation of the FAT10 by CHFR in rheumatoid arthritis synovial fibroblast

Park, Ji Su 부산대학교 2021 국내석사

Study on the Biochemical Interaction between FAT10 and ABI3

Hyojin Um 부산대학교 대학원 2019 국내석사

인간 백혈구 항원 B27 (HLA-B27) 아형 단백질의 자가면역질병 특이성 연구

최민경 서울대학교 대학원 2020 국내석사

과학 기술과 의학의 발달로 기대 수명이 늘어나면서 세계적으로 만성 질환의 유병률 및 발병률이 매년 꾸준히 증가하고 있다. 특히 현대사회에서 자가면역질병은 만성 질환 및 희귀성 난치 질환으로 분류되는 질환이 많아 질병이 발생한 후에는 완치가 어려운 경우가 대부분이고 사망에 이를 때까지 지속적인 치료가 필요한 경우가 많으며, 오랜 연구에도 불구하고 아직 명확하게 원인을 밝힐 수 없는 경우가 거의 없어 예방이 어렵다. 최근 유전체 분석 기술의 발달로 인해 전장 유전체 연관성 분석(Genome-Wide Association Study) 등 다양한 방법으로 질병 발생과 관련된 유전자 및 유전자의 발현 양상을 조절하는 단백질에 관심을 가지고 연구가 진행되고 있다. 자가면역질병인 척추관절병증의 중요 유전자로 알려진 HLA-B27의 대립 유전자는 인종 또는 민족 간 양상이 다양하게 나타나는데 우리나라의 경우 강직 척추염 환자를 대상으로 단면 연구 식의 임상 연구가 주로 이루어졌을 뿐 질병의 근본적 원인을 과학적으로 규명하기 위한 시도가 활발하지 않으며, 전 세계적으로 강직 척추염과 관련된 임상 연구의 양에 비해 HLA-B27이 유전적으로 어떻게 관여하여 질병의 발생에 영향을 주는지 여러 가설이 존재할 뿐 아직 과학적으로 규명되지 못한 상황이다. 본 연구에서는 자가면역질병 중 하나인 강직 척추염의 발병과 관계가 있다고 임상적으로 확인된 HLA-B27 유전자를 생명정보학 관점으로 접근하여 단백질 구조 비교를 통해 연관성을 분석하고, 다형성으로 인해 발생한 단백질의 구조 변화가 질병 발생 요소에 영향을 주는지에 대한 가능성을 검증하고자 했다. 인간 백혈구 항원 B27 아형 단백질에 대하여 류마티즘 관절염 발생과 관련성이 밝혀진 인간 백혈구 항원 DRB1(HLA-DRB1)에 대하여 IPD-IMGT/HLA database와 PDB database를 이용하여 다중서열정렬 및 계통수 분석, 단백질 입체구조의 분석을 통해 단백질 구조의 차이와 질병 발생의 연관성을 상대적으로 비교하였다. 인종 또는 민족 간 다양하게 나타나는 유전적 다형성과 해마다 증가하는 강직 척추염의 유병률을 고려했을 때, 향후 우리나라 강직 척추염 환자의 조기 진단에 필요한 다형성 검사 연구가 활발해질 수 있는 단초를 제공하고자 했다. 임상적 소견 외에 유전자 및 발현 단백질을 이용한 강직 척추염의 조기 진단이 가능해진다면, 일반적인 척추관절병증에서 함께 발생하는 말초 부위 합병증의 예방 가능성이 증가하여 조기 치료를 통해 질병의 진행을 늦출 수 있을 것으로 기대된다. 그로 인해 꾸준히 증가하고 있는 강직 척추염 환자들의 삶의 질을 현재 수준보다 높일 수 있고 이를 통해 공중보건의 향상에도 기여할 수 있을 것이다. With the advancement of science technology and medicine, people are living longer lives and suffering from more chronic diseases every year. Autoimmune diseases in modern societies are often classified as chronic, rare and difficult to cure. They are hard to prevent because despite long-term studies, their definite causes have not been identified, and they have a long treatment period. Recently, due to the development of genome analysis technology, research has been conducted using various methods such as Genome-Wide Association Study, with a focus on proteins regulating gene expression patterns and genes related to disease occurrence. The allele of HLA-B27, which is known as an important gene for the occurrence of spondyloarthropathy, shows various race or ethnic patterns. However, in Korea, where the majority of research has been cross-sectional, they have not been sufficiently examined. Even in overseas studies, despite the abundance of clinical research related to ankylosing spondylitis, the various hypotheses surrounding HLA-B27 and its genetic role in disease development remain undetermined. In the early stages of diseases of the spondyloarthropathy, a clear diagnosis is difficult to make. In this study, I approached the link between HLA-B27 and ankylosing spondylitis, through a bioinformatics approach. The purpose of this study was to examine the possibility that changes in the protein structure caused by polymorphism affect disease occurrence. Here, the difference of HLA-B27 alleles in protein structure has been investigated through multiple sequence alignment, phylogenetic tree and RSMD analysis, using IPD-IMGT/HLA database and PDB database about leukocyte antigen B27 subtype protein and human leukocyte antigen DRB1 protein, which has been found to be related to the occurrence of rheumatoid arthritis. Considering the correlation between genetic polymorphism, which develops differentially between races and ethnic groups and the prevalence of ankylosing spondylitis, which is increasing year by year, this study will highlight the need of polymorphism tests for early diagnosis of ankylosing spondylitis in Korean patients. As well as clinical findings, if the diagnosis of ankylosing spondylitis based on testing of genes and expression proteins becomes possible, peripheral site complications occurring in common spondyloarthropathy will be more likely prevented and disease progression controlled through early treatment. As a result, the quality of life for an increasing number of ankylosing spondylitis patients will be enhanced, which will improve public health.

Human leukocyte antigen-G polymorphism and expression in breast cancer patients

정세리 연세대학교 대학원 2014 국내박사

Human leukocyte antigen-G (HLA-G) is implicated in a tumor-driven immune escape mechanism in malignancies. The purpose of this study was to investigate the influence of HLA-G polymorphism and expression on breast cancer. Eighty patients with breast cancer and 80 healthy individuals were included in this study. HLA-G alleles were determined by direct DNA sequencing procedures from blood samples, and soluble HLA-G (sHLA-G) was detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) from serum specimens. HLA-G expression in 73 breast cancer lesions was also analyzed by immunohistochemistry staining. The HLA-G 3' untranslated region (UTR) 14 bp sequence insertion was analyzed and found to be associated with reduced risk of breast cancer susceptibility based on HLA-G expression in tissues (P=0.0407). Levels of sHLA-G were higher in the breast cancer group (median sHLA-G=117.2 U/mL) compared to the control group (median sHLA-G=10.1 U/mL, P<0.0001) and also presented a significant difference between the ductal carcinoma in situ and control (P<0.0001). The area under the receiver operating characteristic curve (AU-ROC) value of sHLA-G for distinguishing breast cancer from normal controls was 0.89. A similar AU-ROC value was observed for detecting metastasis from all other groups (0.89, P<0.0001), which was greater than that of the current tumor marker CA15-3 (0.54, P<0.0001). Thus, HLA-G polymorphism and expression may be involved in breast carcinogenesis and sHLA-G concentrations could be used as a diagnostic marker for detecting breast cancer.

Soluble human leukocyte antigen-G expression in hepatitis B virus infection and hepatocellular carcinoma

박용정 Graduate School, Yonsei University 2012 국내석사

We investigated soluble human leukocyte antigen-G (sHLA-G) expression according to the phases of hepatitis B virus (HBV) infections and hepatocellular carcinoma (HCC). A total of 267 sera from anti-HBs positive healthy individuals (n=50), chronic HBV carriers (n=45), as well as patients with active hepatitis B (n=46), liver cirrhosis (LC, n=46) and early stage HCC (n=80) were collected and assayed for sHLA-G. Relationships between sHLA-G levels and clinicopathologic parameters including HCC stages, differentiation grades, and levels of aminotransferases, HBV DNA and alpha-fetoprotein (AFP) were assessed. Concentrations of sHLA-G were higher in the active hepatitis B and HCC groups (median sHLA-G 53.7 and 178.8 U/mL, respectively) in comparison to other groups (P<0.05), and there were no statistically significant differences among sHLA-G levels of the anti-HBs positive group, chronic HBV carrier and LC groups. Serum sHLA-G concentrations were not associated with clinicopathologic indices including the levels of aminotransferases, AFP, anti-HBs titer, HBV DNA, as well as HCC stages, numbers of tumor nodules, pathologic grades and presence of vessel invasion. The receiver operating characteristic area under the curve (AUC) value of sHLA-G for differentiating HCC from LC was 0.98, which was greater than that of AFP (0.78) (P<0.0001), and sensitivity and specificity of sHLA-G were, respectively, 90.0% and 95.7% for HCC when applying a cut-off level of 97.3 U/mL. Serum sHLA-G levels could be used as a diagnostic marker for HCC. Although sHLA-G levels did not reflect the severity of HBV infections and HCC, they were related with phases of the disease.

Human leukocyte antigen-G polymorphism and expression in breast cancer patients

정세리 Graduate School, Yonsei University 2014 국내박사