HPLC 및 LC-MS/MS를 이용한 산마늘과 박새의 판별법 개발

이청미 조선대학교 대학원 2018 국내석사

In the recent past, there is an increasing trend in society to use natural and pollution free food in view to maintain good health. Every year in the spring season, a variety of plants are collected from mountains and agriculture fields to consume as food for good taste and refresh lives. However, food poisoning is continuously reported in relation to intake of spring herbs and the majority of these cases are due to mistakes in selection of wild edible plants due to their similar appearance with toxic plants. The wild edible plant Allium victorialis is often confused with plant Veratrum patulum, due to similarity in physical appearance. V. patulum causes poisoning symptoms such as hypotension, vomiting, dizziness, and abdominal pain. Thus to avoid any confusion of V. patulum with A. victorialis; an accurate method is very much required at the time of harvesting plants. This study is therefore designed to develop an analytical method for identification of A. victorialis and to prevent its possible adultration due to V. patulum. First the elemental contents were analyzed and applied to identify V. patulum contained in A. victorialis. Then a discriminant method for analyzing selected indicator was carried out, after method validation and blind tests confirmation. Finally, the developed method was applied to the processed foods in the markets to confirm the indicator compound for any adultration. The HPLC-DAD and LC-MS/MS were used as analytical techniques in this study. The HPLC-DAD screening test was performed with the samples solutions in which the polarity index was sequentially extracted using a soxhelt apparatus; to check the indicator component. Peak was confirmed as luteolin-7-O-glucuronide and analyzed using LC-MS/MS for the confirmed peak, and was established as the final indicator component of V. patulum after comparative analysis with the standard. For efficient analysis, this study developed an efficient extraction method too for analytical analysis of luteolin-7-O-glucuronide contained in V. patulum. A methanol reflux extract under the condition of 2 hours was found as optimum extraction method. Proper method validation was carried out to obtain the reliability of the developed method and effectiveness of the obtained results. In order to confirm V. patulum contained in A. victorialis, the luteolin-7-O-glucuronide analysis method was applied to 19 processed foods commonly consumed in South Korea, and were found that there is no contamination of V. patulum and safe from causing aforementioned symptoms of poisoning. From this research, the indicator compound of luteolin-7-O-glucuronide was developed and the analysis method so designed was applied successfully to determine whether there is any mixing of V. patulum with A. victorialis in processed foods from open markets of South Korea. As a result of this research, it will be possible to minimize damage by prompt response to the cause of food poisoning caused by V. patulum in A. victorialis. This will improve the reliability foods especially made of spring herb A. victorialis.

HPLC‐MS를 이용한 벌독 멜리틴 효소분해 생리활성 펩타이드 구조분석에 대한 연구

서정인 호서대학교 2017 국내박사

In the present study, the author have researched honey bees as a representative environmental indicator species. bee poison(venom) is usefully used for anti-cancer, antibiotic, anti-inflammation, etc., and its main pharmacological component is melittin . Melittin consists of 26 amino acids and has a molecular weight of 2,846.46 Da. It ha a α-helx single strand for primary structure.. It is a amphiphillic membrane binding protein with amino acid sequence of NH2-GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-CONH2. Melittin protein has the toxicity that disintegrates and necrotizes cell membrane composed of phospholipid at high concentration. The toxicity LD50 value of 50% mortality of a person's melittin is 2.8 mg/kg. In order to use the bee venom melittin for medical purposes, this toxicity requires very deep attention. In this study, we found that the partial hydrolysis of the bee venom melittin with the specific enzyme reduced the toxicity of melittin and maintained the abovementioned medical efficacy, and studied the cytotoxicity and molecular weight distribution of the bee venom melittin enzyme digestion peptides . Melittin purified were obtained from bee venom according to the membrane filtration method, and digested with alcalase (EC NO. 232-752-2, A product Novozyme Corp.) At 37 ° C for 10 minutes, heat-treated to inactivate the enzyme, added cold ethanol(-20℃) to precipitate unreacted proteins, centrifuged to obtain supernatant, Enzymatic digestion peptide complexes were obtained by enriching and removing ethanol. The safety of the obtained bee venom melttin enzyme digested peptide complex was evaluated by the protein stabilization test, the cell viability test and the degranulation inhibition test, and the bioactivity was evaluated by the anti - inflammatory test. In addition, HPLC-MS was used to determine the molecular weight of the bee venom melittin enzyme-degrading peptide complex. As a result, it was found that the protein denaturation can be inhibited even at a low concentration of 40 μg/ml of 50% (IC50) inhibition rate of the peptide complex obtained in this study, and in the cell viability test by MTT assay, no toxicity was observed below 200㎍/㎖ of peptides complex. In addition, inhibition of β-hexosaminidase secretion also showed that the inhibitory effect on the secretion of β-hexosaminidase induced by a A23187 increased with dose. In the anti-inflammatory test, cytokine TNF-α derived from TH1 cell and cytokine IL-4 derived from TH2 cell were measured, and the production of inflammatory cytokine was decreased according to the administration concentration. In ionic curent chromatograms  of HPLC-MS analysis, main peaks were observed at 2.4, 2.9, 3.6, and 4.6 minutes. So, The authors decided to perform molecular weight measurements from 2.0 to 4.7 minutes. As a result, the following results were obtained. 1). HPLC-MS analysis of the melitin enzyme digesting peptide complex prepared by this study was performed. As a result, there are 4 kinds of free amino acids, 7 kinds of di-peptides, 7 kinds of tri-peptides, 12 kinds of tetra-peptides, 12 kinds of penta-peptides, 9 kinds of hexa-peptides and hepta peptide, 3 kinds of nona-peptide, 3 kinds of deca-peptide, 1 type of hendeca-peptide, 1 kind of dideca-peptide, 3 kinds of trideca-peptide, 4 kinds of tetradeca-peptide, 7 kinds of pentadeca-peptide, 1 kind of hexadeca-peptide, respectively, and the molecular weight of each peptide was specified. 2). The major peaks of the melitin enzyme digestion peptide complexes prepared by this study were 2.4, 2.9, 3.6, and 4.6 minutes, respectively. The main compound molecular weights were 1482, 1556, 1383, 1038, 620, 1569, 607, 973, and high degree oligomers composed with at least 5 or more peptide bonds. 3). Compared to the type of peptide identified by G. Kreil (two heptapeptides, four tetra peptides, one pentapeptide, six types of tripeptide, and three dipeptides), the type of peptide I could see a lot. In addition, it has been shown that the peptide complexes of melittin, trypsin and chymotrypsin hydrolyzates of G. kreil are composed of low molecular weight peptides, whereas the peptide complexes obtained in this study are composed of oligo peptides with molecular weight of 5 or more amino acids . 4). On the other hand, the enzymatic digestion of G. kreil showed a low molecular peptide complexes of 3-4 peptides on average, whereas the bee melittin enzyme digesting peptide complex in this study showed more than 5 peptides and more than 10 high oligo peptides. By this structure, it is thought that the peptide complex of this study is preserved without losing its physiological activity. 5). The peptides produced by this study inhibited the heat denaturation of albumin protein and inhibited the production of TNF-α and IL-4, which are inflammatory cytokines, without inducing cytotoxicity as a result of MTT assay.   From these results, it was possible to characterize the constituents and molecular weight of the active substance at the molecular level by applying HPLC-MS to a small amount of physiologically active substance which is small in quantity and difficult to be detected by conventional HPLC analysis. The results are expected to be useful as a means of evaluating small amounts of environmental pollutants in the natural world.

HPLC/UVD 와 HPLC/ELSD를 이용한 Thaumatin의 정량적 동시분석법 개발

노광재 아주대학교 아주대학교 공학대학원 2016 국내석사

현대 사회에서 비만의 큰 원인은 많은 양의 설탕이 들어가는 음식이 원인이다 그와 동시에 선진국에서 Life- Style과 밀접한 관련이 있는 질병이라 불리우는 비만, 당뇨, 심혈관 장애 같은 질병도 같이 확산되는 현상을 보였다. 이는 고칼로리의 음식 및 과다 섭취에 기인하여 엄청난 증가추세를 보이고 있다. 이에 타우마틴은 Sweet-tasting 을 내는 단백질로서 저칼로리에 설탕을 대체할 천연 물질로서 주목을 받고 있다. 타우마틴은 서부 아프리카의 열대 다우림 지대에 자생하는 다년생 식물인 Thaumatococcus Daniellii의 과실 중에 포함되어 있는 단백질이다. 207개의 아미노산으로 구성된 분자량 약 22kDa 으로 자당보다 2000~3000배 정도 단맛을 내고 저칼로리의 물질로서 다이어트 식품 및 고지혈증 이나 당뇨병 환자들을 대상으로 좋은 대체 물질이 될 것이다. 이에 본 연구에서는 타우마틴에 대한 HPLC-ELSD 와 HPLC-UVD 를 이용하여 신속한 동시 분석법을 개발 하였다. ELSD 와 UVD 의 공통 분석 조건으로는 Cosmosil Protein-R (4.6 mm x 150mm) 컬럼을 사용하였고, 아세토니트릴과 0.1% TFA를 이용하여 유량 1.0mL/Min 으로 기울기 용리시켰다. 또한 Injection volume 20μL, 컬럼오븐 온도 40 °C 가 최적의 조건임을 확인 하였다. ELSD 의 경우 Gas 압력 52 -54 Psi 로 분사 되게 설정 하였고, Drift Tube의 온도는 60˚C 로 설정하였다. Carrier Gas는 99% 초고순도 질소를 사용했다. 이러한 분석방법으로 L.O.D, L.O.Q, 직선성, 정밀성, 정확성 에 대한 파라미터의 신뢰성을 확보 하였고, HPLC-ELSD와 HPLC-UVD에 대한 정량적인 분석방법이 적합함을 확인하였다. Life-Style related diseases such as diabetes, high blood pressure, obesity, Hyperlipidemia , and metabolic syndrome have raised important problems in developed countries. These might be linked to staggering increases in the incidences of being overweight and obesity attributable to excessive intake of high-calorie foods. Therefore, low-calorie sugar substitutes can be used in beverages, foods, and medicines. Sweet-tasting proteins have a potential as low-calorie sugar substitutes. Thaumatin is the most potently sweet tasting protein isolated from the arils of Thaumatococcus daniellii, a plant native to tropical West Africa. Thaumatin is a single polypeptide chain protein of 207 amino acid residues with eight disulfide bonds and the molecular mass of protein is 22 kDa. Thaumatin is nearly 2000~3000 times sweeter than sucrose on a molar basis and non caloric And, for that reason, Medicines or food additives Product expected to be used in the diet and diabetes. Also, We studied a rapid and reliable HPLC-ELSD and HPLC-UVD method for the simultaneous determination of Thaumatin from Thaumatococcus daniellii was developed and validated. ELSD and UVD are commonly, The analytes were injected into a Cosmosil Protein-R (4.6 mm x 150mm) column with gradient elution composed of acetonitrile and 0.1% T.F.A at a flow rate of 1.0 mL/min and the injection Volume was 20μL. The column oven temperature was maintained at 40 °C. The evaporative light scattering detector was operated at an evaporating temperature of 60 °C and the optimum flow pressure of nebulizing gas (Nitrogen, 99%-High purity) at 52-54 Psi. These methods were fully validated with respect to the linearity, accuracy, precision, repeatability, L.O.D, L.O.Q. The results indicated that the established HPLC-ELSD and HPLC-UVD methods are Suitable for the quantitative analysis of Thaumatin.

HPLC/UV-vis을 이용한 과일류 중의 지베렐린 산(GA3) 분석

마경나 경기대학교 일반대학원 2013 국내석사

지베렐린(Gibberellin)은 대표적인 식물호르몬으로서 식물의 신장을 유도하고 발아를 촉진시키는 역할을 하며 농가에서는 과일류의 수확시기를 앞당기기 위해 지베렐린을 무분별하게 과다하게 사용하는 경우도 있다. 지베렐린류 중 가장 잘 알려진 것은 지베렐린 산(gibberellic acid)으로 GA3라고 명명된다. 이 지베렐린 산은 자외선-가시광선 분광광도법에서 최대 흡수 파장이 낮고, 화학적인 특징이 없기 때문에 HPLC/UV-vis로 분석하기가 어려워 정량보다는 단순한 검출에만 국한되어 있다. 본 연구는 유도체화를 통해 지베렐린 산의 최대 흡수 파장을 높여 과일류 (사과와 배) 중에 존재하는 지베렐린 산을 효과적으로 분석하는 방법을 확립하였다. 물:황산(1:1, v/v)용액을 사용하여 균질화된 수용액 시료의 pH를 3으로 조절하고 에틸아세테이트를 용출용매로 사용하여 시료로부터 용출하였다. 인산 완충용액을 사용하여 분석물질을 정제한 뒤, pH를 3으로 맞춘 인산 완충용액으로부터 에틸아세테이트로 추출하는 액체-액체 추출방법(LLE)을 사용하였다. 추출한 지베렐린 산은 반응 용매로 THF, 반응 염기로 TEA, 유도체화 물질로 phenacyl bromide를 사용하였고 이들에 대한 최적의 반응조건을 확립함으로써 최대 흡수 파장을 높여 HPLC/UV-vis로 분석하였다. HPLC/UV-vis의 이동상은 물과 메탄올을 사용한 기울기 용리 용매조건에서 분석을 실시하였다. 컬럼은 C18 (4.6 × 150mm, 5 μm) 컬럼을 사용하였으며, 유속은 0.8 mL/min의 최적의 조건에서 분석물질을 분리하였다. 사과 시료에서의 유도체화된 지베렐린 산의 검출한계(LOD)와 정량한계(LOQ)는 각각 0.008 mg/kg와 0.027 mg/kg 이었으며 배 시료 중에서의 검출한계 (LOD)와 정량한계(LOQ)는 각각 0.003 mg/kg와 0.012 mg/kg 이었다. 검정곡선은 사과의 경우 0.15 ∼ 3.2 mg/kg, 배의 경우 0.15 ∼ 4.0 mg/kg 범위에서 상관계수(r2)가 0.996 이상의 직선성을 나타내었다. 정밀도(RSD)는 사과에서 4.6%, 배에서 3.8% 이하 값을 보였고 정확도(상대회수율)는 84.4 ∼ 108.4%의 범위에서 나타났다. 본 연구를 통해 확립된 분석방법은 현재 단순히 검출에만 국한되어 있는 HPLC/UV-vis을 이용한 지베렐린 산 분석법에 비해, 유도체화 반응을 통해 고감도의 분석조건을 확립함으로써 극미량(수십 μg/kg)까지 정량분석이 가능하게 되었다. 또한 기존에 설정된 전처리 방법보다 신속하고 경제적이며, 낮은 검출한계와 정량한계를 나타낸 확립된 분석법은 과실류의 발달을 촉진하기 위해 농약으로 사용하는 지베렐린 산의 잔류 분석법으로 활용이 가능할 것이다. Gibberellins (GAs) are a class of plant growth hormones that exert profound and diverse effects on plant growth and development such as seed germination, fruit external ripening and fruit development and others. GAs are increasingly applied in agriculture to improve crop quality and yields. But, there is no regulation of GAs in Korea. On the other hand, the MRL(Maximum residual limits)s of Gibberllic acid (GA3) in Japan and EU are 200 μg/kg and 500 μg/kg, respectively. Analysis of gibbrellic acid from fruit using HPLC/UV-vis has always been extremely difficult, since gibberellic acid has little ultraviolet(UV) absorbance. Therefore, a simple and accurate analytical method for determination of gibberellic acid in fruit was developed. The method involves liquid-liquid extraction and derivatization using phenacyl bromide for effective and high sensitive HPLC/UV-vis analysis. For optimized liquid-liquid extraction condition, extraction times, extraction solvent and pH during sample preparation process were investigated. And also, experiment factors which are reaction time, reaction temperature and amount of derivatizing reagent and base, for the effective derivatization, were optimized. The HPLC/UV-vis was equipped with C18 column (4.6 mm I.D.× 150 mm, 5 μm) using a binary solvent system composed of water and methanol and flow rate was 0.8 mL/min. As a result, the limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) were different for the various matrix combinations but were in all cases below 0.008 and 0.027 mg/kg, respectively. Calibration curves for the quantitation showed good linearity (above r2=0.996) in the concentration dynamic ranged of 0.15∼3.2 mg/kg in apple and 0.15∼4.0 mg/kg in pear. The relative recovery were from the spiked sample matrix in ranged 88.2 ∼105.8% (apple) and 84.4 ∼108.4% (pear). The established method can be used to determine μg/kg levels of gibberellic acid from fruits sample using HPLC/UV-vis.

역상 HPLC를 이용한 Salmon calcitonin의 세가지 放射性 요오드化법의 비교

강태석 성균관대학교 대학원 1995 국내석사

Salmon calcitonin을 Chloramine-T, Iodogen, Indobead의 세가지 방사성 요오드화법으로 방사성 유도체화하고 이를 역상 HPLC를 이용하여 비교하였다. Salmon calcitonin의 방사성 요오드화 혼합물을 고상추출 후, Bondclone 10 C18 column (7.8x300mm)을 고정상으로 사용한 HPLC를 이용하여, 요오드화 되지않은 salmon calcitonin, 단일 요오드화 salmon calcitonin, 이중 요오드화 salmon calcitonin 및 요오드화 과정중에 생성된 부산물 각각을 분리하였다. 이동상은 TFA를 0.1% 함유한 34% acetonitrile 을 사용하였다. HPLC 주입량은 500μl였고, 유속은 분당 4㎖이었다. Salmon calcitonin의 요오드 치환부위를 확인하기 위하여 trypsin처리를 하였다. Trypsin 처리로 생성된 4개의 분획은 W-porex 5C 18 300A column (4.6x250mm)을 고정상으로 사용한 HPLC를 이용하여 분리하였다. Trypsin 처리된 sCT의 HPLC 분석조건은 시료주입후 8분간 100% 용매 A로 유출하였고 그 후 34분까지 55% 용매 B가 되도록 linear gradient system으로 유출하였다. 이 때, 용매 A는 TFA를 0.1%함유한 증류수였고, 용매 B는 TFA를 0.1% 함유한 acetonitrile이었다. HPLC 주입량은 50μl였고, 유속은 분당 1.2㎖이었다. Salmon calcitonin과 요오드화된 Salmon calcitonin 그리고 trypsin 처리된 Salmon calcitonin 분획들은 모두 UV 215nm에서 흡광도를 측정하였고, on-line으로 Exitation 282nm/Emission 312nm에서 형광을 측정하였다. HPLC로부터의 유출물을 일정시간 간격으로 받아서 Gamma counter를 이용하여 방사선량을 측정하였다. Salmon calcitonin을 trypsin 처리하여 생성된 4개의 peak중 3번째 peak만이 형광을 나타내었고, 아미노산 분석을 통하여 tyrosine을 함유하고 있음을 알 수 있었다. 또한 요오드화된 Salmon calcitonin의 trypsin처리시, 3번째 peak만이 방사성을 나타내는 것으로 보아 이 부분이 요오드가 치환된 부분임을 알 수 있었다. Chloramine-T와 Iodogen법은 요오드화 반응 중 알 수 없는 부산물을 생성하는 반면, Iodobead법은 부산물을 생성하지 않을 뿐 아니라 반응 조건이 까다롭지 않고 사용하기에도 편리한 장점이 있었다. 이에 Chloramine-T, Iodogen, Iodobead의 세가지 방법중에서, Salmon calcitonin의 요오드화 유도체법으로는 Iodobead법이 가장 적합함을 알 수 있었다. 또한 salmon calcitonin과 요오드화된 Salmon calcitonin의 trypsin처리와 아미노산 분석을 통하여 pH 7.0에서는 tyrosine에만 요오드가 치환되었음을 알 수 있었다. Three radioiodination methods including chloramine-T, Iodogen, Iodobead were compared for salmon calcitonin (sCT) and the radioiodinated sCT (I-sCT) were characterized using reversed-phase HPLC. After solid phase extraction of sCT iodination mixture using C18 Bond Elut, the eluate was subjected to isocratic reversed-phase HPLC (Bondclone 10 C18 column, 7.8 x 300mm) to separate into mono- and di-I-sCT from uniodinated sCT. Mobile phase for the separation of sCT iodination mixture was 0.1% TFA in 34% acetonitrile and injection volume and flow rate were 500μl and 4.0ml/min, respectively. sCT was digested with trypsin to identify the iodination site in sCT. Four fragments were produced by tryptic digestion and separated by reversed-phase gradient HPLC (W-porex 5C 18 300A column, 4.6 x 25Omm). For tryptic digested fragments, a linear gradient was employed : 0% B : 100% A to 55% B : 45% A over 16 min after isocratic elution of A for 8min. Solvent A was 0.1% TFA in distilled water and solvent B was 0.1% TFA in acetonitrile. The injection volume and flow rate were 50μl and 1.2㎖/min, respectively. sCT, I-sCT and tryptic digested fragments were monitored at 215nm for UV and Exitation 282nm/Emission 312nm for fluorescence. Radioactivity of eluates from HPLC was also measured. Iodination site in sCT was identified as tyrosine not histidine by amino acid analysis of tryptic digested fragments. Among three different methods including Chloramine-T, Iodogen and Iodobead, the Iodobead method was selected as the method of the radioiodination for sCT. Two other methods produced several degradation products during the reaction. The Iodobead method offered several advantages over chloramine-T and Iodogen methods in the flexibilities in radiolabelling conditions and the simplicity of use. Only the tyrosine-containing fragments from tryptic digested mono- and di-I-sCT showed radioactivity which means radioiodination occurred on the tyrosyl residue and but not on the histidyl residue at pH 7.0.

HPLC-DAD 및 LC-MS/MS를 이용한 강황 내 합성 착색제의 검출법 밸리데이션 및 측정불확도 추정

양효진 서울과학기술대학교 2023 국내석사

HPLC를 이용한 인플루엔자백신 헤마글루티닌 함량 측정

노항식 충북대학교 2017 국내박사

2009년 21세기 첫번째 인플루엔자 판데믹으로 인류는 큰 혼란을 겪어야 했다. 인플루엔자는 매년 세계 인구의 15 %를 감염시키고 500,000여명의 죽음을 야기하는 바이러스로 아직까지 알려진 효과적인 예방법은 백신접종이다. 인플루엔자 백신의 항원 함량은 바이러스의 주항원인 헤마글루티닌(HA) 함량을 기준으로 한다. 방사면역확산법(Single radial immunodiffusion, SRID)은 바이러스 타입별 특이성과 정확성으로 1970년대 확립되어 현재까지도 HA양를 측정하는 유일한 공인 시험법이지만, 시간이 오래 걸리고 처리량에 비하여 매우 노동 집약적이라는 단점 이외에도 SRID에 사용되는 표준항원과 표준항체를 개발하는 데에 2~3개월이 소요되어 판데믹 상황 시 신속한 백신 개발에 걸림돌이 된다는 문제점을 안고 있다. 따라서 본 연구에서는 SRID를 보완 혹은 대체할 수 있는 HA 함량 측정 시험법을 개발하고자 하였다. HPLC 방법은 분석이 간단하면서도 빠르고, 표준항체가 필요하지 않으며 새로운 바이러스에 대한 항원이 아닌 기존의 표준항원으로도 분석이 가능하기 때문에 HA 함량을 빠르게 측정하여 백신 개발에 필요한 시간을 단축하는데 큰 도움이 될 수 있다. 크기배제 고성능액체크로마토그래피(Size exclusion high performance liquid chromatography, SE-HPLC)에 의해 특이적으로 HA가 분리될 수 있고, trimeric HA는 trypsin 등 효소처리에 의해서 single disulfide bridge로만 연결되어있는 HA1, HA2 subunit으로 분해되고, 환원반응을 통해 disulfide bridge가 분해되어 쉽게 HA1과 HA2가 분리된다는 사실에 근거를 두고 역상 고성능액체크로마토그래피(Reversed phase high performance liquid chromatography, RP-HPLC)로 HA1 함량을 측정하고자 하였다. SE-HPLC를 이용하여 표준항원, 2009년 H1N1 판데믹 백신, 2010년 계절 인플루엔자 백신(H1N1, H3N2, B)의 원액에 대한 HPLC fraction을 받아 ELISA와 immunoprecipitation(IP)을 통해 크로마토그램에서의 HA peak 위치와 분리 시간을 확인하였다. 백신의 HA함량에 대해 SRID로 측정한 결과 값과 SE-HPLC HA peak 면적 간에 특이적인 비율(R)의 상관성이 있음을 확인하였다. 따라서 실제 백신에 포함되어 있는 HA 함량은 표준항원과 백신의 HA peak 면적으로부터 계산된 HA 함량을 이 면적 비율로 나눈 값으로 추정할 수 있다. 마찬가지로, RP-HPLC을 이용하여 표준항원과 백신의 fraction을 받아 Western blot과 silver staining을 통해 HA1의 peak를 확인하였다. 백신의 HA함량에 대해 SRID로 측정한 결과 값과 RP-HPLC HA1 peak 면적 값으로 검량선을 작성한 뒤 계절백신단가원액 12로트의 HA를 측정한 결과 값을 비교하였을 때 밀접한 상관관계를 나타내었다. 이번 연구를 통해 SRID를 대체 또는 보완할 수 있는 HPLC 시험법을 개발하였다. 우선적으로 HPLC를 이용하여 임상용 백신을 제조하여 임상시험을 수행하고 표준항원과 표준항체가 개발되어 SRID 시험이 가능해지면 임상시험용 백신에 대한 HA 함량을 재확인한다면 그만큼 백신개발기간을 단축할 수 있다. 단, 이번 연구는 동일한 제조공정으로 제조한 H1N1, H3N2 및 B 바이러스 type에 대한 제한적인 정보를 담고 있어 H5N1 등 다양한 type과 여러 제조공정의 백신에 대한 추가적인 연구를 통해 시험법을 확립한다면 판데믹 상황 등 즉시 표준항원·표준항체를 사용할 수 없거나 SRID법을 수행하기 어려운 백신원액 등에서 HPLC를 이용하여 HA 함량측정이 가능할 것이다. Key words: Influenza vaccine, Haemagglutinin, SRID, SE-HPLC, RP-HPLC

다양한 사슬구조와 작용기를 가진 고분자의 분리 및 분석

안준영 포항공과대학교 일반대학원 2020 국내박사

Physical properties of synthetic polymers are greatly influenced by the distributions in their molecular characteristics such as molecular weight, molecular weight distribution (MWD), chemical composition distribution (CCD), chain structure and chain end functionality (CEF). In this disserration, particularly focus was on chain structure and CEF. The chain structure of polymers (linear, branched and cyclic polymer) affect many of its physical properties including glass transition temperature , strength, toughness, solution viscosity, solubility and the size of individual polymer coils in solution. Chain end functionalization of polymers has found many applications, for example, in making telechelic polymer, surface modification, grafting onto approaches and producing multiblock copolymers. However, the inevitable inhomogeneity in the chain structure and CEF in synthetic polymers, precise molecular characterization is necessary. High performance liquid chromatography (HPLC), 1H nuclear laser magnetic resonance (1H NMR), and matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) are the most suitable analytical techniques to separate and characterize the synthetic polymers. In chapter 1, basic principles of HPLC and MALDI-TOF MS for the characterization of synthetic polymers are briefly reviewed. HPLC separation of polymer can be largely divided into three different mods: size exclusion chromatography (SEC), interaction chromatography(IC) and liquid chromatography at the critical condition (LCCC). To predict the retention behavior of polymers in HPLC, the overall understanding of basic separation modes is needed. MALDI-TOF MS is a soft ionization method that enables resolution of individual n-mers of polymers in a mass spectrum distribution. This resolution enables the elucidation of not only mass distribution and repeat unit mass, but also the identity and fidelity of CEF. In chapter 2, the influence of chain structure and CEF of polymers for critical adsorption point (CAP) of liquid chromatography was investigated. To examine the influence of chain structure and chemically different CEF separately, two different linear polymers (Linear PS, 2-arm PS) and a 4-arm star PS were synthesized and studied by normal phase and reversed phase liquid chromatography (NPLC and RPLC). The experimental results were then compared with the computer simulation results to elucidate the effect of chain structure and chemically different CEF on the CAP of linear and branched polymers. It was found that the column temperature at CAP (TCAP), TCAP (Linear PS) = TCAP (2-arm PS) > TCAP (4-arm PS) in both RPLC and NPLC which can be attributed to the variation in chain structure. However, the elution times at CAP (tE,CAP) of three polymers are all different: In NPLC, tE,CAP (Linear PS) > tE,CAP (2-arm PS) > tE,CAP (4-arm PS) while in RPLC, tE,CAP (4-arm PS) > tE,CAP (2-arm PS) > tE,CAP (Linear PS). The variation of tE,CAP can be explained by the contribution of the CEF. The computer simulation results are in good agreement with the chromatography experiments results and support the interpretation of experimental data. In chapter 3, living and dead chain of polystyrene synthesized by RAFT polymerization were separated and characterized by HPLC, 1H NMR and MALDI-TOF MS. To achieve full chromatographic resolution of different living and dead chains, a polystyrene with distinctive CEF was prepared in RAFT polymerization by using a specially designed chain-transfer agent (R−S−(C = S)−S−Z) with polar hydroxyl end groups at both R and Z and a thermal initiator without hydroxyl group. The structures of separated living chains derived from the RAFT agent and initiator were characterized using 1H NMR and MALDI-TOF MS. Molecular-weight distribution (MWD) of the living chains derived from the RAFT agent is close to the Poisson distribution. However, the living chains grown from the initiator have a broader MWD with low molecular weight tailing. As the [initiator]/[RAFT agent] ratio increases, both the amount and the dispersity of the living chains initiated by the initiator fragment increase while the MWD of the living chains initiated by the fragment of the RAFT agent remains unchanged. In chapter 4, various topological polymers such as 4-arm star, tricyclic, eight shaped and polyring are synthesized by ATRP and characterized by SEC, 1H NMR and MALDI-TOF MS. Although hydrodynamic volume of the products with the same molecular weight were somewhat different depending upon their chain structure, but the difference was not large enough to be fully resolved by SEC. As a result, SEC analysis alone is not enough to confirm the chain structure transformation of polymer. To identify the chain structure transformation, the topological polymers were determined by 1H NMR and MALDI-TOF MS. 합성 고분자는 분자량 분포, 화학조성, 사슬구조, 말단 작용기에 따라서 물리적 특성이 크게 변한다. 특히 고분자의 사슬구조 (선형, 분지형, 고리형)는 유리전이 온도(glass transition temperature), 강도(strength), 인성(toughness), 용액점도, 용해도 및 사슬의 크기를 비롯한 많은 물리적 특성에 영향을 미치며, 고분자의 말단 작용기는 텔리켈릭 고분자(telicalic polymer), 그래프팅 고분자 (grafting polymer), 블록 공중합체(block copolymer) 등 다양한 고분자 중합 또는 표면 개질 (surface modification)에 응용된다. 하지만, 고분자는 합성과정에서 말단 작용기의 존재 유무와 사슬의 구조가 불균일하기 때문에 합성 후 정밀 분석과 정제과정을 필요로 한다. 본 학위 논문에서는 합성 고분자를 고성능 액체 크로마토그래피법 (high performance liquid chromatography), 1H NMR 그리고 질량 분석법 (MALDI-TOF MS)을 이용하여 합성 고분자를 분리하고 분석하였다. 1장에서는 HPLC와 MALDI-TOF MS의 원리에 대해 간략하게 설명하였다. HPLC는 분리 원리에 따라 크기 배제 크로마토그래피 (Size Exclusion Chromatography, SEC), 임계조건 액체 크로마토그래피 (Liquid Chromatography at Critical Condition, LCCC), 상호작용 크로마토그래피 (Interaction chromatography, IC)로 분류할 수 있으며, 각 크로마토그래피의 개념 및 분리 원리에 대해 설명하였다. MALDI-TOF MS의 연성 이온화법 (soft ionization method)은 고분자의 n-단량체의 분해를 가능하게 하여 질량 분포 스펙트럼을 얻을 수 있으며, 이 분해능은 반복 단위 질량뿐만 아니라 고분자 사슬 말단 작용기를 명확하게 특정할 수 있기에 그 기본 개념과 이론에 대해 설명하였다. 2장에서는, HPLC에서 고분자의 사슬 구조와 말단 작용기의 영향을 알아보기 위해, 임계 흡작점 (critical adsorption point)에서 고분자의 거동을 연구하였다. 사슬의 구조와 말단 작용기의 영향을 개별적으로 알아보기 위해 말단 작용기 개수가 다른 두개의 선형 고분자 (Linear PS, 2-arm PS) 와 구조가 다른 별형 고분자 (4-arm star PS)를 합성하고, 정상 액체 크로마토 그래피 (normal phase liquid chromatography, NPLC)와 역상 액체 크로마토 그래피 (reverse phase liquid chromatography, RPLC)에서 고분자의 거동을 연구하였다. 또한 사슬 구조 및 말단 작용기의 효과를 이해하기 위해 실험 결과와 컴퓨터 시뮬레이션 결과를 비교하였다. NPLC와 RPLC 둘 다에서 고분자들의 임계 흡착점 온도 (TCAP)는 TCAP(linear PS) = TCAP(2-arm PS) > TCAP(4-arm PS)로 고분자 사슬구조 변화에 기인 된 것임을 설명 할 수 있다. 그러나 고분자들의 임계 흡작점 용출 시간 (tE,CAP)은 NPLC에서 tE,CAP (linear) > tE,CAP (2-arm PS) > tE,CAP (4-arm PS)인 반면, RPLC에서는 tE,CAP (4-arm PS) > tE,CAP (2-arm PS) > tE,CAP (linear)로 고분자들의 용출 순서가 뒤 바뀐 결과를 가져왔으며, 이는 고분자 사슬 말단기의 기여에 의해 설명 될 수 있다. 컴퓨터 시뮬레이션 결과는 실험결과와 잘 일치하며, 이를 통해 실험 데이터를 해석하였다. 3장에서는 RAFT 중합으로 합성된 폴리스티렌(PS)에서 살아있는 사슬 (living chain) 과 죽은 사슬 (dead chain)을 HPLC, 1H NMR그리고 MALDI-TOF MS를 통해 분리 분석 하였다. Living chain과 dead chain을 분리하기 위해 극성의 OH작용기를 양쪽에 가진 사슬 전달체 (chain transfer agent)(R−S−(C = S)−S−Z)와 극성의 작용기가 없는 열분해 개시제 (initiator) 를 이용하여 PS를 합성하였다. 사슬의 말단 작용기 종류에 따라 분리된 2종류의 living chain의 구조는 1H NMR과 MALDI-TOF MS를 통해 확인하였다. 사슬 전달체로부터 성장한 living chain의 분자량 분포는 Poisson distribution과 거의 일치하였으나, 개시제로부터 성장한 living chain은 저 분자량의 테일링을 갖는 보다 넓은 분자량 분포를 가졌다. [개시제] / [사슬 전달체]의 비가 증가함에 따라서 개시제에 의해 성장한 living chain의 양 및 분포도가 증가하는 반면, 사슬 전달체로부터 성장한 living chain은 분자량 분포가 변하지 않고 유지되었다. 4장에서는 ATRP로 합성된 위상적인 고분자들 (4-arm star, tricyclic, eight shaped and polyring)을 합성하고 SEC, 1H NMR그리고 MALDI-TOF MS를 통해 분리 분석 하였다. 동일한 분자량을 갖는 고분자들의 유체 역학적 부피는 그들의 사슬 구조에 따라서 다소 다르기 때문에, SEC 분석을 통해서 사슬의 구조가 변형된 것을 확인 할 수 있다. 하지만 SEC 분석만으로는 고분자의 사슬 구조 변형을 확인하기에 충분하지 않기에 이를 1H NMR과 MALDI-TOF MS 통해서 사슬구조를 규명하였다.

HPLC를 이용한 식품 중 아황산염(sulfite) 및 카르민(carmine) 분석법 개발

송성봉 東國大學校 2017 국내박사

이산화황은 식품에서 항산화제 및 보존료 등의 용도로 사용되고 있으며, 현행 식품공전 시험법인 모니어윌리엄스법이 생성된 황산을 알칼리로 적정하는 정량분석하는 적정법을 활용도가 높은 방법을 확립하고자 하였다. 먼저 논문 및 국내외 분석법 등의 자료 조사를 통하여 장단점을 비교하고 전처리 방법과 기기분석조건을 검토하여 HPLC-UV법, 개량랜킨법을 확립하였다. HPLC-UV법, 개량랜킨법 전처리 조건결과, 직접 추출법은 회수율이 낮았고 재현성이 떨어져서 보완할 수 있는 증류법으로 검토하였다. 개량랜킨법은 증류장치를 이용하여 증류시간, 질소유량, 포집액, 인산농도 등의 비색반응 시간 검토 및 전처리 조건 통하여 확립하였다. HPLC-UV법은 컬럼과 이동상을 검토하여 분석조건을 확립한 후 증류장치를 사용하여 증류시간, 질소유량, 포집액, 인산농도 등을 검토하여 전처리 조건을 확립하였다. HPLC-UV법은 AS9-SC 컬럼과 1.8 mM sodium carbonate-1.7 mM sodium bicarbonate을 사용하여 흡광도 파장 210 nm로 확립하였다. 확립된 분석법은 직선성, 회수율, 정량한계, 검출한계, 정밀성 등의 검토를 통하여 검증하였다. 또한, 확립된 분석법을 유통 식품에 적용해서 이산화황 함유량을 확인한 결과, 모두 적합하였다. 따라서, 검토 결과를 통해 HPLC-UV법과 개량랜킨법이 현행 시험법을 보완할 분석방법으로 판단되었다. 카르민은 식품에서 착색료로 사용되는 식품첨가물로 제외국 분석법 및 논문 등을 통하여 전처리 방법과 분석조건을 검토하여 카르민으로 분석하는 HPLC 및 TLC 방법을 확립하였다. TLC 방법에서 이소프로판올:물:0.5M황산(5:5:1)을 사용하여 전개하였을 때 전개 거리는 동일하였으나 카르민의 반점 적색이 카르민산의 짙은 보라색과 뚜렷이 구별되었다. HPLC를 이용한 분석법은 Novapak C18 컬럼으로 분석하였고 카르민을 0.05 M NaOH 용액으로 추출하는 시험용액이 조제된다는 점이다. 이 방법을 적용하여 국내유통 식품 중 카르민을 분석한 결과, 음료에서 973.9±2.8 mg/L으로 가장 높게 검출되었으며, 과자류에서 865.0±4.7 mg/L, 당류가공품에서 754.7±2.8 mg/L, 과채가공품에서는 149.9±4.0 mg/L 순이었다. 검출된 제품은 카르민이 표시되어 있었으며, 사용기준에 모두 적합하였다. 본 연구에서 확립된 분석법은 식품에서의 이산화황 함유량 조사 자료 및 카르민의 기준규격 및 위해평가 자료로 활용될 수 있을 것으로 사료된다. The sulphur dioxide is used for antioxidants and preservatives, this study was established to devlop the analytical methods that is Korea Food Standard Code ; Monier-Williams method to conduct it more precisely. First, It was compared with the advantages and disadvantages of the method by analyzing the data such as the paper of journal and domestic and international methods, and was examined the preprocessing method and instrumental analysis conditions to establish the HPLC-UV method and the modified Rankine method. The direct extraction method was considered as distillation method which can be complemented by low reproducibility and low reproducibility in HPLC-UV method, modified Rankine method, pretreatment condition. The modified Rankine method was established through the review of the colorimetric reaction times such as distillation time, nitrogen flow rate, absorption solution, and phosphoric acid concentration, and pretreatment conditions using a distillation apparatus. The HPLC-UV method was used to determine the conditions for the analysis of the column and the mobile phase, and the conditions for the pretreatment were established by examining distillation time, nitrogen flow rate, absorption solution, and phosphoric acid concentration using a distillation apparatus. The HPLC-UV method was established with an AS9-SC column and 1.8 mM sodium carbonate-1.7 mM sodium bicarbonate at an absorbance wavelength of 210 nm. The established analytical methods were verified by examining the linearity, recovery rate, quantitative limit, detection limit, and precision. In addition, It was confirmed by the content of sulfur dioxide by applying the established analytical method to the distribution food, and all were suitable. Therefore, the HPLC-UV method and the modified Rankine method were judged to be an analytical method to complement the current test method. Carmine is a food additive used as a coloring agent in foods. It has been established by HPLC and TLC method by analyzing the pretreatment method and analysis conditions through foreign analysis methods and the paper of journal. The development distance was the same when developed using isopropanol: water: 0.5 M sulfuric acid (5:5:1) in the TLC method, but the spot redness of the carmine was distinct from the dark purple of carminic acid. HPLC analysis is performed on a Novapak C18 column and a test solution is prepared in which carmine is extracted with 0.05 M NaOH solution. As a result of analyzing the carmine in domestic food, the highest concentration was 973.9 ± 2.8 mg / L in beverages, 865.0 ± 4.7 mg / L in cookies, 754.7 ± 2.8 mg / L in processed sugars, and 149.9 ± 4.0 mg / L for processed products. The detected product was carmine, and all of the criteria were matched at Korea Food Additives Code. The analytical method established in this study can be used as the data on the sulfur dioxide content in food and standardㆍspecification revision and risk assessment data for carmine.

HPLC-UV, ELSD, RI를 이용한 자일리톨 분석법 비교

서은빈 서울과학기술대학교 2022 국내석사

고려한 전처리법과 분석 조건을 조사하고 국내 유통중인 제품의 xylitol의 함량을 구하였다. 사용된 분석법은 우선적으로 유효성 검증을 진행하여 확립하고 측정불확도를 산출하였다. 또한, 분석법의 적용성을 확인하기 위해 국내에 유통되는 츄잉껌, 캔디류, 혼합음료, 고형차 중 xylitol을 정량하여 그 결과를 확인하였으며, 결과를 비교함으로써 보다 합리적인 분석법을 선정하여 xylitol이 사용되는 제품을 추가적으로 구매하여 모니터링을 진행하였다. HPLC-UV를 이용한 xylitol 분석법의 전처리는 p-nitrobenzoyl chloride 시약을 이용해 유도체화를 진행하였다. 유효성 검증을 통해 특이성을 확보하였으며, 직선성은 r2=1.0000 이었다. LOD와 LOQ는 각각 0.01, 0.04 mg/kg이었으며, MDL과 MQL은 0.36, 1.10 mg/kg이었다. 정확성과 정밀성은 94.46~99.52%, 0.17~1.81%으로 양호한 결과를 나타냈으며, AOAC guideline에서 제시된 범위에 적합하였다. 측정불확도를 산출한 결과, 상대불확도는 1.12~3.98%로 확인하였으며, 이는 Codex의 농도별 상대불확도 범위에 적합하였다. 또한, 적용성 검토 결과 모든 제품에서 xylitol을 정량할 수 있었다. HPLC-ELSD를 이용한 xylitol 분석법은 물 추출을 통한 전처리를 진행하였으며, 유효성 검증을 통해 특이성을 확보하였다. 검량선은 이차함수로 나타났으며, r2=0.9994이었다. LOD와 LOQ는 2.85, 8.63 mg/kg이었으며, MDL과 MQL은 56.93, 172.52 mg/kg이었다. 정확성과 정밀성은 94.25~105.73%, 0.52~5.97%으로 AOAC guideline에서 제시된 범위에 적합하여 양호한 결과를 나타냈다. 산출된 상대불확도는 0.87~11.98%였으며, Codex에 제시된 농도별 상대불확도 범위에 적합하였다. 또한, 적용성 검토 결과 모든 제품에서 xylitol을 정량할 수 있었다. HPLC-RI를 이용한 xylitol 분석법은 ELSD와 동일하게 물 추출을 통한 전처리를 진행하였으며, 유효성 검증을 통해 특이성을 확보하였다. 직선성은 r2=1.0000 이었고, LOD와 LOQ는 각각 40, 110 mg/kg이었으며, MDL과 MQL은 377.53, 1,144.02 mg/kg이었다. 정확성과 정밀성 결과는 96.87~101.52%, 0.65~2.59%으로 AOAC guideline에서 제시된 범위에 적합하였다. 측정불확도를 산출한 결과, 상대불확도는 0.78~4.78%로 나타났다. 이는 Codex의 농도별 상대불확도 범위에 적합하였다. 적용성 검토 결과, 2건의 제품에서 불검출로 나타났다. HPLC-UV, ELSD, RI을 이용한 xylitol 분석법의 유효성 검증 및 측정불확도의 결과를 확인하였다. HPLC-UV의 경우, LOD, LOQ의 값이 다른 두가지 분석법과 비교하였을 때 낮은 결과를 보였고, 낮은 상대불확도의 범위를 나타냈기 때문에 식품 중 미량의 xylitol까지 정량 가능할 것으로 판단하였다. 따라서, HPLC-UV를 이용하여 모니터링을 실시하였고 3반복의 전처리를 실시하고 각각의 분석을 진행하여 데이터 결과의 평균값 (g/kg)을 구하였다. HPLC-UV를 이용한 모니터링 결과(n=160), 츄잉껌 (n=50)의 자일리톨 함량은 13.823~749.510 g/kg의 범위에서 평균함량은 409.399 g/kg이었으며, 캔디류 (n=45)는 1.474~979.472 g/kg의 범위에서 104.229 g/kg, 혼합음료 (n=21)은 0.469~379.238 g/kg의 범위에서 37.079 g/kg, 고형차 (n=20)는 0.053~144.033 g/kg의 범위에서 24.373 g/kg, 기타가공품 (n=14)은 2.455~398.956 g/kg의 범위에서 75.259 g/kg, 음료 베이스 (n=10)에서 0.315~96.017 g/kg의 범위에서 16.462 g/kg이었다. In this study, xylitol, which can replace sucrose in low-calorie foods as an additive among various foods as a sweetener, was quantified using HPLC that can be universally used. Using UV, ELSD and RI, which are representative detectors of HPLC, analysis methods of xylitol were set up and applied to obtain the content of xylitol in foods distributed in Korea. The proposed methods were established by conducting validation and evaluated measurement uncertainty. The application of the methods was confirmed by quantifying xylitol in chewing gum, candy, beverage and tea distributed in Korea. The optimal analysis method was selected by comparing the results of application, and food items containing xylitol were additionally purchased for monitoring. For the pretreatment of xylitol analysis method using HPLC-UV, derivation was performed using PNBC. Specificity was confirmed, and good linearity was also represented (r2=1.0000). LOD and LOQ were 0.01 and 0.04 mg/kg, respectively. MDL and MQL were 0.36 and 1.10 mg/kg, respectively. Accuracy and precision showed satisfactory results with 94.46~99.52% and 0.17~1.81% within the range suggested by the AOAC guideline. As a result of the measurement uncertainty, the relative uncertainty was showed 1.12~3.98% satisfied with the range suggested by Codex guideline. The application was confirmed to quantify xylitol in all food items. Analysis method of xylitol quantification using HPLC-ELSD was pre-treated through water extraction, and specificity was satisfied. The calibration curve was shown as a quadratic function, and r2=0.9994. LOD and LOQ were 2.85, 8.63 mg/kg, and MDL and MQL were 56.93, 172.52 mg/kg, respectively. The accuracy and precision were 94.25~105.73% and 0.52~5.97% shown as satisfactory results with the range suggested by the AOAC guideline. The relative uncertainty was 0.87~11.98% suitable for the Codex guideline. As a result of application, it was also possible to quantify xylitol in all food items. The xylitol analysis method using HPLC-RI was pre-treated through water extraction in the same way as ELSD. Specificity was satisfied, and linearity also satisfied with r2=1.0000. LOD and LOQ were 40, 110 mg/kg, and MDL and MQL were 377.53, 1,144.02 mg/kg, respectively. The results of accuracy and precision were 96.87~101.52% and 0.65~2.59%, which were shown within the range suggested by AOAC guideline. As results of the measurement uncertainty, the relative uncertainty was shown to 0.78~4.78%. This was satisfied with the Codex guideline. The application results were shown that non-detected (N.D.) was confirmed in 2 food items. As the xylitol analysis methods of HPLC-UV, ELSD and RI, the results of validation, measurement uncertainty and application were compared. In the case of HPLC-UV, LOD, LOQ, MDL, and MQL were lower than the other methods, and also it showed a low range of relative uncertainty. It was determined that the analysis method using HPLC-UV could quantify even trace amounts of xylitol. Therefore, a total of 160 food items, including chewing gum (n=50), candy (n=45), beverage (n=21), tea (n=20), other processed products (n=14), and beverage base (n=10), were analyzed using method using HPLC-UV. The average amount (g/kg) of the results was obtained by carrying out in 3 replicates. As a result of monitoring using HPLC-UV, the average content of xylitol in chewing gum was 409.399 g/kg in the range of 13.823 to 749.510 g/kg, 104.229 g/kg in the range of 1.474 to 979.472 g/kg for candy, and 37.079 g/kg in the range of 0.469 to 379.238 g/kg for beverage, 24.373 g/kg in the range of 0.053 to 144.033 g/kg for tea, 75.259 g/kg in the range of 2.455 to 398.956 g/kg for other processed products, 16.462 g/kg in the range of 0.315 to 96.017 g/kg for beverage base.