GABAa receptor regulates the dopamine D2 receptor-mediated ERK activation in hippocampal neuronal cells

윤동훈 Graduate School, Korea University 2013 국내석사

Dopamine D2 receptor(D2R) plays an important role in regulation of numerous dopaminergic functions including locomotor activity, hormone secretion, addiction, and cognition. D2R Knock out mice(D2R-/-) show impairment in locomotor activity and the level of glutamic acid decarboxylase (GAD) was strongly increased in the cortex and the striatum, displaying also altered GABAergic neurotransmission involving GABAA receptor in these mice. To investigate the interaction between D2R and GABAA receptor, I conducted co-immunoprecipitation and I found that GABAA receptor α1 subunit could bind to D2R. I also investigated how GABAA receptor can regulate the D2R-mediated extracellular signal-regulated kinase(ERK) activation in hippocampal neuronal cells where D2R and GABAA receptor co-express in brain. I observed that muscimol, GABAA receptor agonist, suppressed the D2R agonist-induced-ERK phosphorylation in hippocampal neuronal cells. ERK phosphorylation is important for spine development. I investigated the effect of D2R-mediated ERK activation for development of spine density and whether GABAA receptor could regulate this effect. Spine density increased by D2R activation and this effect was inhibited by MAPK inhibitor, D2R antagonist, and GABAA receptor agonist in hippocampal neuronal cells. 도파민은 운동, 호르몬 분비, 중독, 인식 등 많은 도파민성 기능에 관여한다. D2R Knock out mice(D2R-/-)는 운동능력감소와 함께 cortex와 striatum 부위에서 glutamic acid decarboxylase(GAD)의 증가가 관찰되었고, GABA성 신경전달 또한 야생형과 비교했을 때 다르다는 것이 관찰되었다. D2R과 GABAA receptor간의 상호작용을 규명하기 위해 Co-Immunoprecipitation 실험을 실시한 결과, GABAA receptor α1 subunit이 D2R과 결합할 수 있다는 것을 확인했다. 또한, GABAA receptor가 D2R과 GABAA receptor를 함께 발현하는 hippocampal neuronal cell에서 D2R 매개 extracellular signal-regulated kinase(ERK)를 어떻게 조절하는지도 살펴보았다. GABAA receptor의 agonist인 muscimol을 처리하였을 때, D2R 매개 ERK의 인산화가 저해되는 것을 확인하였다. ERK의 인산화는 spine 발달에 중요하기 때문에, D2R 매개 ERK의 인산화가 spine 발달에 미치는 영향과, GABAA receptor가 관여하는지에 대해서도 알아보았다. 그 결과, hippocampal neuronal cell의 spine 발달은 D2R의 활성화에 의해서 증가하였고, MAPK inhibitor, D2R antagonist, GABAA receptor agonist에 의해서는 그 증가효과가 저해됨을 확인할 수 있었다.

Memory consolidation and retrieval regulated by GABAA receptor

김동현 경희대학교 대학원 2010 국내박사

GABAA receptor modulates memory acquisition, consolidation, and retrieval. The aim of this study is to confirm the effect of GABAA drugs and to identify the mechanism of these effects of GABAA drugs on memory consolidation and retrieval. First, we clarified the contribution of hippocampal mature brain-derived neurotrophic factor (mBDNF) level at restricted time point induced by GABAA receptor blockade on the enhancement of memory consolidation. With the administration of acquisition trial in na?ve mice using the passive avoidance task, the mBDNF levels were temporally changed in the hippocampal CA1 region and the lowest levels were observed 9 h after acquisition trial. Bicuculline significantly increased latency time in the one-trial passive avoidance task until 1 h post-training administration. Concomitantly, mBDNF level was significantly increased 9 h after bicuculline administration in na?ve mice. Although mBDNF level was increased 12 h after acquisition trial with 3 h post-training administration of bicuculline, facilitation of memory consolidation did not exhibited. This means that the increase of mBDNF level at restricted time after GABAA receptor blockade is required for the enhancement of memory consolidation. In addition, exogenous BDNF administration into hippocampal CA1 region and anisomycin-induced inhibition of protein synthesis confirmed that the increase of mBDNF level around 9 h after acquisition trial with GABAA receptor blockade plays a key role in the enhancement of memory consolidation. Second, to test the effects of modulation of GABAA receptor on memory retrieval and the co-involvements of signaling molecules, such as, ERK, CaMKII, and CREB in the hippocampus, we conducted one-trial passive avoidance and novel object recognition tasks with pre-retention trial drug administration. In a pilot study, we observed that ERK phosphorylation was required for memory retrieval during the task. Accordingly, to investigate whether GABAA receptor activation or inhibition induces ERK phosphorylation during memory retrieval, GABAA receptor targeting drugs were treated 15 min prior to retention trial of passive avoidance task and test session of novel object recognition task. Diazepam and muscimol, GABAA receptor agonists, blocked retrieval-induced ERK phosphorylation, and also impaired memory retrieval. Furthermore, co-treatment with sub-effective doses of muscimol and U0126 (a MEK inhibitor), or diazepam and U0126 blocked upregulation of pERK expression by the retrieval and impaired memory retrieval. In addition, bicuculline (a GABAA receptor antagonist) increased the ERK phosphorylation induced by memory retrieval and facilitated memory retrieval. Moreover, these effects of bicuculline were blocked when it was co-treated with subeffective dose of U0126. Taken together, this study suggests that GABAA receptor-induced memory retrieval is closely related with hippocampal ERK phosphorylation. GABAA 수용체의 조절은 기억의 습득, 강화 및 도출을 조절한다고 알려져 있다. 본 연구에서는 이런 GABAA 수용체의 기억의 각 단계에 대한 조절 작용에 대한 기전을 밝히고자 한다. 기억의 강화에 있어서 BDNF(brain-derived neurotrophic factor)의 발현은 중요한 영향을 미친다. 본 연구에서는 학습 훈련 후 9시간대에 BDNF의 합성은 일어나지 않으나 이 시간대에 mBDNF(mature BDNF)의 발현을 증가시키면 기억의 강화를 증진시킬 수 있다는 사살을 확인하고 GABAA 수용체의 길항제인 bicuculline이 학습 후 9시간대에 mBDNF를 증가시키는 기전을 통해 기억의 강화를 증진 시킨다는 사실을 확인하였다. 이는 bicuculline을 학습 후 1시간 이내에 투여하였을 경우에는 기억의 강화를 증진시키나 3시간 이후에 투여하였을 경우에는 아무런 영향이 없는 실험 결과와 일치하는 결과이다. 다음으로 기억의 도출단계에 대한 GABAA 수용체의 조절 작용에 대하여 알아보았다. 본 연구에서는 수동회피시험의 기억 도출 과정 이후 ERK(extracellular signal-regulated kinase), CaMKII(Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II), 및 CREB(cAMP responsive element binding protein)의 활성화가 나타난다는 사실을 확인하고 기억의 도출 직전 이들 신호의 억제를 통해 ERK의 활성화가 기억의 도출에 핵심적인 역할을 한다는 사실을 확인하였다. 이에 GABAA 수용체의 효능제 및 길항제가 기억의 도출 과정에서 ERK의 활성화에 미치는 영향을 확인해본 결과 효능제는 억제효과를 길항제는 증진효과를 나타내었다. 또한 수동회피시험에서의 도출과정에 있어서 효능제는 기억의 감퇴효과를 길항제는 기억의 증진효과를 나타내었다. 따라서 GABAA 수용체는 기억의 도출과정에서 나타나는 ERK의 화성화를 조절함으로써 기억의 도출을 조절한다는 사실을 알 수 있었다. 이상의 결과로 GABAA 수용체는 기억의 강화 과정 및 도출과정을 조절하는데 이는 특정 시간대의 BDNF의 발현 및 ERK의 활성화를 조절하기 때문이라는 결론을 도출할 수 있다.

Sleep-Promoting Effects of Saaz-Saphir Hops Mixture Mediated by the GABAA Receptor in Invertebrate and Vertebrate Animal Models

Byungjick Min 고려대학교 대학원 2022 국내박사

Hops are the flowers of the hop plant (Humulus lupulus L.) that have been used to increase the shelf life and palatability of foods and they exhibit a variety of pharmacological effects, including sleep promotion and antioxidant effects. In order to evaluate the sleep-promoting activity of hops, the sleep-promoting effects of extracts of various hops cultivars were investigated in invertebrate and vertebrate animal models. The active ingredients related to sleep-promoting according to hop varieties were analyzed by HPLC (High-performance Liquid Chromatography) and their sleep-promoting activities were evaluated in vertebrate and invertebrate animal models. The content of α-acids, -acids, and xanthohumol was higher in hop 70% alcohol extracts of hop than in hot water extracts of hop. Among the alcohol extracts, Citra contained a high α-acid content (229.32 μg/mg), while Saphir showed high -acid and xanthohumol content (66.37 and 4.23 μg/mg, respectively). In Drosophila melanogaster, Simcoe and Mosaic water extracts and Saphir and Simcoe alcohol extracts significantly increased total sleep time at night. Total sleep time of mice with pentobarbital-induced sleep was significantly increased by Simcoe and Mosaic water extracts and Saphir and Simcoe ethanol extracts compared to the normal group. Oral administration of Simcoe water extract and Saphir alcohol extract improved sleep pattern in the caffeine-induced insomnia model and upregulated the mRNA expression of GABA(γ-aminobutyric acid)A and GABAB receptors in mouse brains. Additionally, Saphir alcohol extract significantly increased the GABA content in mouse brains. Simcoe water extract and Saphir ethanol extract modulated GABAergic signaling to improve sleep-related behaviors, including sleep duration. To select the mixing ratio of Saaz, Saphir, and Simcoe, which had high sleep-promoting activity, the sleep-promoting activity and reactive oxygen species (ROS) scavenging activity were evaluated in pentobarbital-induced sleep and H2O2-treated HT22 cells, respectively. Compared to administration of Saaz, Simcoe, and Saphir alone, the administration of Saaz/Saphir (75:25) and Simcoe/Saphir (50:50) mixtures resulted in slightly longer sleep durations in pentobarbital-administered mice. The Saaz/Saphir (75:25) group showed a longer sleep duration in the caffeine-induced insomnia model and slightly lower IC50 values for radicals than the Simcoe/Saphir (50:50) group. Xanthohumol present in hop mixtures suppressed ROS production and increased the expression of superoxide dismutase-1, catalase, and glutathione peroxidase-1 in H2O2-treated HT22 cells. Collectively, Simcoe/Saphir (50:50) and Saaz/Saphir (75:25) mixtures were more effective in removing ROS in brain cells and promoting sleep than hops alone. Finally, the sleep-enhancing activity of a Saaz-Saphir hops mixture was measured. In the caffeine-induced insomnia model, the administration of a Saaz-Saphir mixture increased sleep time compared to the administration of Saaz or Saphir alone, which was attributed to the increase in NREM (Non-rapid Eye Movement) sleep time by δ-wave increase. Oral administration of the Saaz-Saphir mixture for 3 weeks increased the GABA content in the brain and increased the expression of the GABAA receptor. As the GABA antagonists picrotoxin and bicuculline showed a decrease in sleep activity, it was confirmed that the GABAA receptor was involved in the Saaz-Saphir mixture activity. In addition, the GABAA receptor antagonist also reduced the sleep activity induced by xanthohumol and humulone contained in the Saaz-Saphir mixture. Therefore, xanthohumol and humulone contained in the Saaz-Saphir mixture show sleep-promoting activity mediated by GABAA receptors. The mixture of the Saaz and Saphir hop varieties may thus help mitigate sleep disturbance compared to other hop varieties. We confirm that Saaz-Saphir mixture extracted with 70% EtOH has superior sleep-promoting effect, compared to other hop varieties. The Saaz-Saphir mixture increased the total sleep time, NREM sleep and δ-waves which was observed in EEG signaling during the deepest stage of sleep. Moreover, the Saaz-Saphir mixture shows sleep-promoting activity mediated by GABAA receptors. To sum up, the Saaz-Saphir mixture is expected to be utilized as nutraceuticals and beverages to mitigate sleep disturbance and enhance the quality of sleep.

(The) sedative-hypnotic effect of Peacilomyces japonica extract in receptor binding assay and in the pentobarbital-induced sleep mouse model

정우진 경희대학교 대학원 2023 국내석사

Background: One of the cordyceps species, Paecilomyces japonica (PJ), which is cultivated on silkworm larvae, has been widely used to treat a wide range of mental illnesses, including depression and sleeplessness. However, sedative-hypnotic effect of PJ has not been enough investigated. Thus, this study was carried out to investigate the sedative-hypnotic effects of the methanol extract of PJ (MTPJ) measuring in vitro receptor binding affinity and pentobarbital-induced sleep latency and sleep duration in the mice. Method: The mechanisms of sedative-hypnotic effects of MTPJ were investigated through examining its receptor binding activity on the well-known molecular targets for sleep regulation, GABAA and 5-HT2C receptors. The animals were randomly divided into six groups: The DZP-treated (Diazepam 2mg/kg), and MTPJ-treated groups (0, 100, 250, 500, and 1000mg/kg, respectively). DZP and MTPJ were administered orally to animals, 30 minutes before receiving an injection of pentobarbital (40mg/kg). The sedative-hypnotic activity of MTPJ was evaluated by measuring the sleep latency and sleep duration with hypnotic dose of pentobarbital after oral administration of MTPJ in mice. Results: In the GABAA and 5-HT2C receptor competition binding assay, MTPJ bound to the GABAA receptor (IC50, 1.22 ± 1.66mg/ml) and 5-HT2C receptor (IC50, 5.24 ± 1.43mg/ml). The MTPJ was more sensitive to 5-HT2C receptor than GABAA receptor. MTPJ enhanced pentobarbital-induced sleep behaviors in mice, showing a dose-dependent decrease in sleep onset time and prolonged sleep duration. Conclusion: The present study demonstrated that MTPJ augmented pentobarbital-induced sleep behaviors by modulating 5-HT2C receptor in mice, suggesting that MTPJ may be useful for the treatment of insomnia. 불면증은 대표적인 수면장애 중 하나로 신체 및 정신적 건강에 나쁜 영향을 미치게 된다. 불면증 치료제로 알려진 수면제는 벤조디아제핀과 비벤조디아제핀 등이 있으며 이러한 수면제는 급성 불면증에 대한 단기간 치료에는 큰 효과를 나타내지만 만성 불면증 치료에 대한 장기간 복용은 여러 부작용을 유발한다고 보고되고 있다. 이에 기존 수면제보다 부작용이 적으며 안정성이 높은 천연물 유래 수면제 및 수면보조제 개발의 관심이 증가하고 있다. 본 연구에서는 항우울, 항산화 스트레스, 면역 조절, 치매 예방 등으로 알려져 있는 눈꽃동충하초가 수면 및 진정 효과를 가지는지 알아보고자 하였다. 눈꽃동충하초의 수면 및 진정 효과를 확인하기 위해 눈꽃동충하초의 메탄올 추출물을 이용하여 5-HT2C와 GABAA 수용체 결합분석과 펜토바비탈 유도 수면 실험을 진행하였다. 5-HT2C와 GABAA 수용체 결합분석 결과, MTPJ의 농도가 20mg/ml일떄 50%의 치환율을 가진 GABAA 수용체 보다 5-HT2C 수용체에서 80%로 높은 치환율이 나타났다. 이를 통해 눈꽃동충하초는 5-HT2C 수용체를 조절에 관여함을 확인하였다. 펜토바비탈 유도 수면 실험결과, 펜토바비탈 수면 유도 마우스에서 눈꽃동충하초를 투여한 그룹은 수면개시시간 (Sleep onset latency)이 유의적으로 감소하였으며 전체수면시간 (Sleep duration time)이 유의적으로 증가함을 확인하였다. 결론적으로, 이러한 눈꽃동충하초의 진정 및 수면효과는 5-HT2C 수용체의 결합 통한 세로토닌 경로를 조절을 통해 기인한 것으로 사료된다. 따라서 본 연구는 눈꽃동충하초가 천연물유래 수면유도제로서 불면증 치료에 도움이 될 것을 제안하고 있다.

Poria cocos Ethanol Extract Enhances Pentobarbital- Induced Sleeping Behaviors via GABAA-ergic Systems : 복령 추출물의 GABAA-ergic 시스템을 통한 Pentobarbital 유도 수면 증가 효과

Shah Vikash Kumar 충북대학교 2014 국내석사

불면증의 효과적인 치료를 위한 다양한 약물학적 시도를 수행하고 있다. 복령은 pachymic acid (PA)를 주성분으로 수면유도 효과가 있으며 pentobarbital 유도 수면 행동을 증가시킨다. 복령 추출물 및 PA 를 경구투여하고 자발운동을 억제하는데 이는 GABA 수용체에서의 benzodiazepine 결합부위에 관한 상호작용과 관련이 있다는 것을 추정하였다. 이는 중추에서 pentobarbital 과 GABA system 을 통한 작용으로 생각된다. 또한 복령 추출물과 PA 는 1 차 배양 시상하부 신경세포에서 세포 내 연소이온을 증가시켰다. 복령추출물이나 PA 가 GABA 의 생합성을 통하여 GABA 수용체를 활성화 활 수 있다. 따라서, 복령추출물과 PA 가 GAD 의 활성을 신경세포에 8 일간 배양하여 측정한 결과 GAD 를 증가시키는 것을 확인하였다. 더 나아가, GABAA 수용체의 아형 (알파, 베타, 감마)의 과발현을 조사하였으며, 이들 알파 및 감마 아형은 아형의 단백질이 과발현하였으며, 감바는 다소 억제되었다. 이와 같은 결과를 바탕으로 복령 추출물과 PA 는 GABA 수용체 및 염소이온의 세포내 증가로 인한 억제성을 증가로 수면을 유도하는 것으로 사료된다. Poria cocos (Hoelen), a Chinese herbal medicine (CHM) has been commonly used for treating insomnia in Asian countries for centuries. However, its claimed benefits and mechanism are not fully understood. The present study aimed to investigate whether the herb ethanol extract (PCE) and its active constituent pachymic acid (PA), possesses hypnotic effects and/or enhances pentobarbital-induced sleeping behaviors. In addition, the mediation of γ-aminobutyric acid (GABA)-ergic systems were defined to understand the possible mechanism. Oral administration of PCE and PA inhibited the locomotion activity in mice. Moreover, both the samples prolonged pentobarbital-induced sleep time, and shorten sleep latency at the hypnotic (40 mg/kg) dose of pentobarbital in mice. Interestingly, it was observed that both PCE and PA increased the number of sleeping mice and total sleeping times, showing synergistic effects similar to muscimol (0.2 mg/kg) at the sub-hypnotic (28 mg/kg) dose of pentobarbital in experimental animals. Notably, the extract and PA raised intracellular chloride levels in primary cultured hypothalamic neuronal cells. PCE and PA increased glutamic acid decarboxylase (GAD65/67) protein levels by western blot. Furthermore, α-, β-, and γ-subunits of GABAA receptors were remarkably over-expressed by PCE treatment. However, the expression studies showed that α-, and β-subunits were remarkably increased by PA, but decreased γ-subunit protein levels in GABAA receptors. To sum up, the data suggest that the herb ethanol extract and its major constituent PA may be useful for the treatment of insomnia via GABAA-ergic mechanisms.

천마의 근경 에탄올 추출물의 GABAA-ergic 시스템을 통한 펜토바비탈-유도 수면 행동과 REM 수면 강화 효과

최재준 忠北大學校 2015 국내석사

천마의 근경 에탄올 추출물 (GR-EX)의 GABAA-ergic system을 통한 pentobarbital-유도 수면과 EEG 측정 효과에 관하여 중점을 두었다. GR-EX (25, 50, 100 mg/kg, i.p)는 양성 대조군인 dizepam (2 mg/kg)과 마찬가지로 농도의존적인 locomotor 활성을 감소시켰다. Pentobarbital-유도 수면에서는 GR-EX의 전 처리가 50, 100 mg/kg에서 pentobarbital (42 mg/kg, i.p.)을 통한 수면 대기 시간의 단축되었지만 오직 100 mg/kg에서만 총 수면 시간의 연장을 유도하였다. 마찬가지로 50% 유도 수면 pentobarbital 농도에서도 GR-EX의 농도의존적인 처리로 수면 유도된 쥐의 수와 총 수면 시간의 증가를 볼 수 있었다. 6시간의 EEG 측정을 통해서 100 mg/kg의 GR-EX 경구 투여는 수면 각성주기 횟수의 감소와 총 수면 시간과 REM 수면 시간을 연장시켰다. REM 수면의 d 파장에서 유의적인 증가를 EEG 전력밀도에서 확인하였다. 8일령 쥐의 소뇌 과립 세포 내의 염소 이온 유입을 pentobarbital (10 mM)과 GR-EX (0.1, 1, 10 mg/ml)에서 모두 유의적 증가를 보였다. 시상하부세포에서는 GAD에서 저농도와 고농도의 GR-EX에서 농도의존적인 단백질 과발현을 보였다. 그리고 GABAA 수용체의 subunits의 활성이 양성 대조군인 pentobarbital (10 mM)의 a5, g3 subunit를 제외한 나머지에서 유의적 증가를 보였으며, 10 mg/ml GR-EX에서는 대부분의 subunits에서의 유의적 증가를 보여줬다. 이 실험들을 통해서 GR-EX는 GABAA 시스템 활성을 통해서 수면을 촉진시키는 효과가 있음을 확인하였다. This research were designed to identify whether the Gastrodia Rhizome ethanol extract (GR-EX) enhances pentobarbital-induced sleep via g-aminobutyric acid (GABA)-ergic systems, and modulated sleep architectures in animals. GR-EX (25, 50, and 100 mg/kg, p.o.) inhibited locomotor activity in mice, in a dose-dependent manner. GR-EX not only prolonged total sleep time, but also reduced sleep latency time in pentobarbital (42 mg/kg)-treated mice. Sub-hypnotic pentobarbital (28 mg/kg, i.p.) also increased the number of total sleeping animals in concomitant administration of GR-EX. GR-EX (100 mg/kg) alone reduced the count of sleep/wake cycles in electroencephalogram. Furthermore, GR-EX increased total sleep time, and rapid eye movement (REM) sleep. From the in vitro experiments, GR-EX increased intracellular chloride level in primary cultured cerebellar granule cells. Protein expressions of glutamine acid decaboxylase (GAD) and GABAA receptors subtypes by westernblot were increased. Therefore, it is suggested that GR-EX enhance pentobarbital-induced sleeping behaviors, and increased REM via the activation of GABAA-ergic transmission in rodents.

Rosmarinic Acid from Perilla frutescens Potentiates Pentobarbital-induced Sleep Behaviors and Non-Rapid Eye Movement (NREM) Sleep through GABAA-ergic Systems in Rodents

Kwon, Yeong Ok 충북대학교 일반대학원 2016 국내석사

Rosmarinic acid contained in Perilla frutescens has been recognized as the folk remedy to treat the allergy and cancer. Also, It has been known that rosmarinic acid has a somewhat effective for anxiety. This study was done to confirm whether rosmarinic acid (RA) may enhance pentobarbital-induced sleep through γ-aminobutyric acid (GABA)A-ergic systems in rodents. RA (0.5, 1.0, 2.0 mg/kg, p.o.) reduced the locomotor activity in ICR mice. RA decreased sleep latency and increased the total sleep time in pentobarbital (42 mg/kg, i.p.)-induced sleep. RA also increased sleeping time and number of falling sleep mice after treated with sub-hypnotic pentobarbital (28 mg/kg, i.p.). In electroencephalogram (EEG), RA (2.0 mg/kg) not only decreased the counts of sleep/wake cycles and REM sleep, but also increased the total sleep and NREM sleep. The power density of NREM sleep showed the increase in δ-wave and the decrease in α-wave. RA increased intracellular Cl- influx via the GABAA receptors in the hypothalamus of Sprague Dawley (SD) rats. RA increased the expression of GAD and GABAA receptors subunits except β1 subunit. In conclusion, RA improved pentobarbital-induced sleeping behaviors through GABAA-ergic transmission by Western blot. Thus, it is suggested that RA may be useful for the treatment of insomnia.

배뇨조절 골반 자율신경에서 GABA에 의한 흥분성 작용의 분자적 특성

김성훈 연세대학교 대학원 2007 국내박사

Major pelvic ganglia (MPG) controlling micturition play roles of not only a station relaying commands from the central nervous system (CNS) to effectors but also a center integrating various local infromation. A distinctive feature of the pelvic ganglia that differentiate them from other autonomic ganglia is the colocalization of both sympathetic and parasympathetic neurons within the same ganglion capsule. Because of their relative simple anatomy and thus, ease of isolation and quantification, MPG has been used as a model system for studying physiological and pathophysiological mechanisms underlying neural control of pelvic organs such as the urinary bladder.In mature neurons of the CNS, GABA is a inhibitory neurotransmitter. However, GABA depolarized membranes of the MPG neurons from adult rat. Accordingly, the purpose of the present study was to examine for the first time molecular mechanism underlying excitatory GABA action in the MPG of adult rat. In this regard, various experimental techniques including gramicidin- perforated patch-clamp, RT-PCR, intranuclear microinjection of genes, and immunohistochemistry were employed.GABA currents were recorded mostly in the sympathetic MPG neurons with large capacitance and T-type Ca2+ channels and were found to be conducted through bicuculin- and picrotoxin-sensitive GABAA receptors. In addition, reversal potentials of the GABA currents (EGABA) varied in proportion to external Cl- concentration, indicating that Cl- is primarily permeable to the GABAA receptors. Immunohistochemistry revealed presence of GABA and preferential expression of GABAA receptors in TH-positive sympathetic neurons. In the sympathetic MPG neurons, application of GABA produced depolarization of which amplitude was time-dependently decreased. Conversely, the GABA action was not observed in the parasympathetic MPG neurons. Three to four hours after dissociation, EGABA was about -43 mV which was lower than resting membrane potentials. As estimated using the Nernst equation, the concentration of intracellular Cl- ion([Cl]in) was estimated at about 30 mM. The [Cl]in tended to be decreased after 24 hour culture. RT-PCR analysis showed that MPG express NKCC1 and KCC1 but not KCC2 which is critical for setting [Cl]in low. When KCC2 was overexpressed in the sympathetic MPG neurons, EGABA was negatively shifted about 30 mV and physiological [Cl]in was reduced from 22 mM to 6.5 mM. Furthermore, GABA produced hyperpolarization, which was prevented by furosemide, a KCC2 blocker in the sympathetic MPG neurons overexpressing KCC2. In addition, EGABA was not altered by external HCO3- and bumetanide, a NKCC1 blocker.Taken together, it was concluded that the excitatory GABA action arises from lack of KCC2 exprresson which is capable of lowering [Cl]in in the sympathetic MPG neurons of adult rats. 배뇨반사를 조절하는 주골반 신경절은 중추신경계의 명령을 효과기에 전달하는 릴레이 스테이션 역할도 하지만 국부적으로 발생하는 다양한 정보를 가지고 통합하는 지역통합센터의 역할을 담당하고 있다. 주골반신경절은 같은 신경절 캡슐 내에 교감 및 부교감 신경세포를 가지고 있는 다른 자율신경절과는 구별돠는 특징을 가지고 있다. 이러한 주골반 신경절은 그 해부학적 구조가 단순하여 분리 및 정량화가 용이하기 때문에 골반장기의 신경조절의 생리 및 병태생리학적 메커니즘을 규명하는 연구의 모델 시스템으로 많이 사용되고 있다.성숙된 신경에서 GABA는 억제성 신경전달물질로 알려져 있지만 주골반 신경 절에서 가바는 세포막의 탈분극을 유발하는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 연구의 목적은 지금까지 규명되지 않은 주골반신경절에서 흥분성 가바작용이 나타나는 메커니즘을 분자 수준에서 최초로 규명하고자 하였다. 이를 위하여 그라미시딘 천공 패치클램프 방법, 역전사 연쇄 중합반응, 세포핵 내 미세 주입에 의한 유전자의 도입, 면역조직화학 등의 연구방법을 사용하였다.가바 전류는 세포의 전기용량이 크며 티-형 칼슘채널을 발현하는 주골반 교감신경세포에서 주로 기록되었는데 비큐쿨린과 피크로톡신에 의해 억제되었기 때문에 가바 에이 수용체 활성을 통해 나타났음을 알 수 있었다. 또한 세포외 액의 염소이온 농도를 변화시켰을 때 가바전류의 역전전압이 이에 비례하여 변하는 것을 관찰하여 가바전류가 염소이온의 이동에 의한 것임을 확인하였다. 면역조직화학 염색으로 주골반신경절 내에 가바가 생리적으로 존재하는 것과 가바 에이 수용체가 타이로신 수산화효소에 양성인 교감신경세포에서 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 주골반 교감 신경세포에서 가바에 의한 탈분극이 일어났으며 그 크기는 시간 의존적으로 감소하는 경향을 보였다. 그러나 주골반 부교감 신경세포에서는 가바에 의한 막전압의 변동이 나타나지 않았다. 분리한 후 3~4시간 경과 후 주골반 교감 신경세포에서 기록된 가바전류의 역전전압은 약 -43 밀리볼트로 안정막 전압보다 낮다는 것을 확인하였고, 넌스트 공식을 사용하여 세포 내 생리적인 염소이온의 농도는 약 30 밀리몰인 것으로 추정하였다. 가바의 역전전압과 세포 내 염소이온의 농도는 세포를 24시간 배양 한 후 감소하는 경향을 보였다. 역전사 연쇄중합반응 분석 결과 주골반 신경절은 소듐-포타슘-염소이온 공수송체 1과 포타슘-염소이온 공수송체 1을 발현하나 신경특이적으로 분포하여 세포 내 염소이온의 농도를 낮게 세팅하는 역할을 하는 포타슘-염소이온 공수송체 2는 발현하지 않는 것을 확인하였다. 포타슘-염소이온 공수송체 2를 주골반 교감 신경세포에 과발현 시켰을 때 녹색형광 단백질만 과발현하는 대조군에 비해 가바의 역전전압이 음성으로 약 30 밀리볼트 정도 이동하였으며 세포 내 생리적인 염소이온의 농도가 22 밀리몰에서 6.5 밀리몰로 감소하였음을 알 수 있었다. 포타슘-염소이온 공수송체 2가 과발현된 주골반 교감 신경세포에 가바를 가하였을 때 탈분극이 아닌 과분극이 유발되었으며 이러한 가바의 억제성 작용은 포타슘-염소이온 공수송체 2 차단제인 퓨로세마이드의 전 처치에 의해 소실되었다. 주골반 교감 신경세포에서 기록된 가바 전류의 역전전압은 소듐-포타슘-염소이온 공수송체 1을 차단하는 부메타나이드에 의해 크게 영향을 받지 않았으며, 세포외액에 중탄산염을 포함시켰을 때도 변동되지 않았다.이상의 결과들을 토대로 성숙 쥐의 주골반 신경세포에서 가바의 흥분성 작용이 세포 내 염소이온의 농도를 낮추는 포타슘-염소이온 공수송체 2의 발현 부재에 의해서 기인한다는 결론을 얻었다.

주골반 신경절에서 protein kinase C에 의한 흥분성 GABAA 수용체의 조절

최윤종 연세대학교 대학원 2006 국내박사

Activation of autonomic nervous system in various pelvic organ plays a role of various physiological functions. Major pelvic ganglia(MPG) is implicated in autonomic reflexes such as penile erection and micturition in urogenital system and in bowel.γ-aminobutyric acid(GABA) is the major inhibitory neurotransmitter in the central nervous system, and its actions are mediated by subtypes of GABA receptors, GABAA, GABAB, and GABAC. GABAA, receptor consisting of α, β, γ and δ subunits is a heterooligomeric ligand-gated chloride channel. It is well known that the occupation of GABAA receptor by GABA leads to hyperpolarize the membrane potential due to increasing in chloride conductances in many neuronal cells.This study was performed to confirm which types fo GABAA receptors are expressed in the neurons of MPG and how protein kinase C(PKC) are involved in the regulation of GABAA receptor function.GABAA receptors are expressed particular in sympathetic MPG neurons and one mediated made excitatory function in neuronal excitability. Immuno-staining studies revealed that major expression pattern of GABAA subunits was β2 or β3 in sympathetic neurons and RT-PCR showed expression of mRNA for α2-6, β2, γ1 and γ2. However, mRNA of ρ subunit consisting of GABAC was not detected.The GABA-induced inward current was increased by PKC activators in time-dependent manner and decreased by PKC inhibitors. These effects were not associated with intracellular Ca2+ and OAG, membrane permeable diacylglycerol (DAG) analogue. This result means that the subfamily of PKC participating in activation of GABAA receptor is atypical PKC (aPKC). ξ isoform of aPKC was detected by RT-PCR. Taking together, we suggests that excitable GABAA receptor in sympathetic MPG neuron seemed to be regulated by aPKC. On the other hands, the GABA-induced current was decreased by PKA activators and increased PKA inhibitors. These results suggest that GABAA receptor could be also modulated by adenylyl cyclase-PKA.The regulatory roles of PKC on excitatory GABAA receptors in sympathetic neurons of MPG seemed to be an important factor to control the functional activity of various pelvic organs such as bowel movement, micturition and erection. 주골반 신경절(MPG)은 방광, 전립선 및 음경 등과 같은 비뇨생식계 기관과 일부의 장(bowel)을 지배하며(Langworthy, 1965; Dail 등, 1975; Keast, 1991; De Groat 및 Booth, 1993), 배뇨(micturition)나 발기(erection)와 같은 자율신경 반사를 조절한다(Zoubek 등, 1993). 골반 장기에 분포하는 자율신경계의 활성화는 매우 다양한 생리적 기능을 담당한다. GABA(γ-aminobutyric acid)는 중추 신경계에서 주된 억제성 신경전달물질의 하나로 알려져 있으며, GABA 수용체는 몇 가지 효현제나 길항제들의 효과와 작용기전에 따라 3가지 아형(subtype)이 보고 되고 있다(Barnard 등, 1998; Lu 등, 1999). GABAA 수용체의 활성화는 Cl- 의 세포막 투과도를 증가시킨다. 대부분의 신경세포에서 이들 음이온들의 유입은 세포막 전압을 과분극(hyperpolarization) 시킨다(Farrant 및 Nusser, 2005). 본 실험에서는 주골반 신경절 세포에 GABAA 수용체가 존재하는지의 유무와 존재한다면 그 GABAA 수용체의 아형 및 기능을 확인하고, protein kinase C에 의한 수용체 조절의 특성의 일부를 규명해보고자 하였다.주골반 신경절에서 GABAA 수용체는 주로 교감신경에만 발현되어 있었으며, 막전압의 탈분극을 유도하는 흥분성 효과를 나타내었다. 면역염색결과 GABAA 수용체를 구성하는 β2 혹은 β3 subunits가 주로 교감신경에서 확인되었고, RT-PCR 결과 α1을 제외한 α2-6 아형과 β2, γ1 및 γ2가 확인되었으나, GABAC 수용체를 구성하는 ρ subunit는 검출되지 않았다. 주골반 신경의 교감신경에 존재하는 GABAA 수용체는 PKC activator들에 의해서 활성화되었고, 억제제들에 의해서는 억제되었는데, 이들의 효과는 세포내 칼슘이온과 무관하게 이루어졌다. 한편 diacylglycerol(DAG)의 세포투과형 유도체인 1, 2-oleoylacetylglycerol(OAG)에 의한 GABAA 수용체의 활성도는 변함이 없어서 이 과정에 관여하는 PKC는 비정형(atypical) PKC(aPKC)임을 알 수 있었고, 이를 RT-PCR을 통해 재확인할 수 있었다.GABA 유발 전류가 adenylyl cyclase(AC)-PKA의 activator에 의해서 증가하고, 억제제에 의해 감소하여 GABAA 수용체가 AC-PKA에 의해서도 조절받음을 확인하였다.이상의 결과로 미루어 보아 주골반 신경절의 교감신경세포에서 확인된 흥분성 GABAA 수용체는 PKC에 의해 더욱 강력히 활성화되며, 여러 아형 중 비정형 PKC가 관여한다. 이와 같은 효과는 교감신경 말단에서의 noradrenaline의 분비를 조절하여 더욱 효과적인 기능을 담당하고 이는 장(bowel) 운동, 배뇨 및 발기 등과 같은 최종 복강장기의 활성도를 조절하는 주요 인자가 될 수 있으리라 여겨진다.

MDL 72222, 5-HT3 Antagonist, Inhibits the Methamphetamine-Induced Conditioned Place Preference via GABAA Receptors

이하경 성균관대학교 일반대학원 2011 국내석사

Drug dependence is a problem, in that it is a disease without a clear understanding of its mechanisms and there is no effective treatment. Among the drug of abuse, methamphetamine dependence is increasing especially in Asia and Europe. One of the candidates for treating drug abuse is the 5-HT3 antagonist. They are reported to reduce the conditioned place preference (CPP) of methamphetamine (MAP). And in previous study, MDL 72222, one of the 5-HT3 antagonists, increased [3H]flunitrazepam binding which was reduced in MAP-treated mice which were used for the open field locomotor activity test. So it was hypothesized that the action of MDL 72222 is mediated by GABAA receptors in CPP paradigm. The objective of present study is to investigate the influence of MDL 72222 on GABAA receptors in MAP CPP paradigm. I examined whether MDL 72222 can reduce the MAP CPP at the dose of 1mg/kg and 5mg/kg. Then I performed autoradiography with the brain taken from the mice which were used for MAP-induced CPP, pretreated with MDL 72222, to investigate GABAA receptor binding using [3H]muscimol and [3H]flunitrazepam for GABA binding site and benzodiazepine binding site, respectively. As a result, the MDL 72222 treated group showed reduced place preference with increased levels of the GABAA receptor binding for both [3H]muscimol and [3H]flunitrazepam. Enhancement of [3H]muscimol binding was found in some regions including dorsal striatum and prefrontal cortex and [3H]flunitrazepam binding was increased dominantly in the prefrontal cortex. Furthermore, I examined whether flumazenil (10 and 20mg/kg, i.p.), benzodiazepine site agonist, can reverse the place preference in mice which have received MDL 72222. The mice treated with flumazenil showed increased place preference for methamphetamine which was reduced by MDL 72222. In conclusion, 5-HT3 antagonist attenuates the MAP CPP indirectly by modulating GABAA receptors especially in the prefrontal cortex and dorsal striatum. This study provides the information about the information about the mechanism of 5-HT3 receptor antagonists on GABAA receptor, and it shows the possibility of 5-HT3 receptor antagonists as a candidate for drug dependence. 약물 의존성은 그 작용 기전이 분명히 알려져 있지 않은데다 효과적인 치료제 역시 개발되지 않아 문제가 되고 있다. 그 중에서도 메스암페타민은 아시아와 유럽을 중심으로 그 사용이 증가하고 있다. 이러한 약물 중독 치료제로서 후보가 되는 약물 중 하나가 5-HT3 길항제이다. 이는 메스암페타민에 의해 유도된 장소 선호도를 감소시키는 것으로 알려져 있다. 이전 연구에서 메스암페타민 투여 후 실행한 locomotor activity 실험에서 감소되었던 벤조디아제핀의 결합 부위에 대한 수용체 결합이 5-HT3 길항제 중 하나인 MDL 72222를 전처치하였을 때 벤조디아제핀의 수용체 결합을 증가시켰다. 따라서 메스암페타민의 장소 선호도 실험에 대해서 MDL 72222의 작용이 GABAA 수용체를 경유하여 나타날 것이라고 가정하였다. 이 실험의 목적은 메스암페타민의 장소 선호도 패러다임에서 MDL 72222가 GABAA 수용체에 미치는 영향을 연구하는 것이었다. 그래서 1mg/kg과 5mg/kg의 MDL 72222가 메스암페타민의 장소 선호도를 억제시킬 수 있는지 실험하였다. 그 후 실험한 쥐의 뇌를 취하여 GABA 결합 부위에 대한 ligand인 [3H]muscimol과 벤조디아제핀 결합 부위에 대한 ligand인 [3H]flunitrazepam을 사용하여 수용체 결합 autoradiography를 수행하였다. 그 결과, MDL 72222를 처리한 그룹에서 장소 선호도가 감소하였고, [3H]muscimol의 결합과 [3H]flunitrazepam의 결합이 증가하였다. [3H]muscimol 결합의 증가는 dorsal striatum을 포함한 여러 부위에서 나타났고, [3H]flunitrazepam 결합의 증가는 prefrontal cortex에서 두드러졌다. 더 나아가, 벤조디아제핀 작용제인 flumazenil 10mg/kg과 20mg/kg이 MDL 72222 투여로 인해 감소된 장소 선호도를 다시 증가시킬 수 있는지 실험하였다. Flumazenil을 투여한 쥐는 MDL 72222에 의해 감소되었던 메스암페타민에 대한 장소 선호도를 증가시켰다. 결론적으로 5-HT3 길항제는 GABAA 수용체를 통해 메스암페타민 장소 선호도를 억제시키고, 이것은 특히 prefrontal cortex와 dorsal striatum에 존재하는 GABAA 수용체의 변화를 통해 이루어진다. 그 중에서도 벤조디아제핀 결합 부위의 변화는 prefrontal cortex에서만 이루어지는 것으로 나타났다. 따라서 이번 연구는 5-HT3 수용체 길항제의 가능성 있는 작용 기전에 대한 정보를 제공하고, 5-HT3 수용체 길항제의 약물 의존성에 대한 치료제 후보로서의 가능성을 보여준다.