Studies on Transcriptional and Epigenetic Mechanisms of NANOG gene in Chicken Primordial Germ Cells

정현교 서울대학교 대학원 2017 국내석사

Primordial germ cells (PGCs), the precursors of sperm and oocytes, are the only cell type which can transfer genetic information to next generation. These distinct characteristics are largely dependent on germ cell- specific gene expression. They are controlled by coordinated actions of many key regulators such as transcription factors (TFs), RNA Binding proteins (RBPs) and specialized epigenetic modification. Nanog, the mostly conserved protein between species, are well- known to be a core transcriptional factor in the early formation of embryonic development. Nanog is also expressed in cells from pluripotent cells to gonads through the developmental status of PGCs, which means that the role of Nanog is to perpetually maintain germ cell characteristics containing stemness and germness in general germ cell development. Indeed, Nanog regulates PGCs by signaling pathways with other key transcription factors. Furthermore, induction of mouse PGC-like cells(PGCLCs) from epiblast-like cells(ESCs) is available with Nanog alone. In chicken, Nanog expression is observed from early development. And then, the pattern of the gene is restricted to PGCs after HH3. These results suggest that Nanog in chicken is a key factor of regulation of PGC characteristics. Recent studies find that epigenetic regulations, such as loss of 5mC in whole genome, DNA methylation, histone and chromatin modifications have a crucial role in PGCs. However, studies of histone and chromatin modifications and also the control of epigenetic patterns in chicken are highly limited. In the previous studies, methylation and acetylation during germ cell specification to differentiation activate germ cell specific genes and repress somatic cell genes in mouse. And also, in chicken, germ cells are also epigenetically regulated. In contrast to mammals, the H3K27me3 global level is reduced, whereas the H3K9me3 level is increased in chicken with still acetylation level in PGCs yet unknown. In this study, we investigated the elaborate regulatory mechanisms that govern epigenetic and transcriptional programs of Nanog. Histone deacetylase (HDAC) regulates NANOG in PGCs. And also, methylation patterns of CpG islands in cNanog upstream, the regions which the transcription factors bind to, are hypomethylated in PGCs. The result of this study using a series of experiment for functionality testing, including siRNA mediated knockdown, overexpression, immunocytochemistry, luciferase reporter assay, TFs motif analysis, and western blotting demonstrates that chicken has specific epigenetic regulation during PGC development. Intriguingly, we showed that transcriptional program of NANOG was strictly regulated by specific isotype of HDACs (HDAC1 and HDAC2) and the REST repressor complex, suggesting that avian PGCs have the different molecular regulatory mechanism from that of mammals. In conclusion, chicken PGCs display the unique epigenetic and transcriptional program of Nanog. Our findings first time provide valuable insight on chicken PGCs to unravel important regulatory components as well as biological roles regarding the genetic and epigenetic regulation for stemness and germness of Nanog and better understanding of germ cell fate. The study of avian species can be adapted to important vertebrate model for the research of developmental biology and speciation.

Characteristics and Quality of Duck Meat Products

엠디샤우알리 경상대학교 대학원 2008 국내박사

The purpose of the study was to investigate the characteristics and quality of duck meat product in respect of storage, processing and processed food product. In first experiment 24 chickens (Ross broiler) and 24 ducks (Cherry barry) breast meat were compared in relation to pH declining pattern at different post-mortem time, proximate composition, and the changing pattern of quality characteristics during storage for 7 days. No significant differences were found in pH at different post-mortem times except at 30 min postmortem, where duck breast showed significantly lower pH than chicken breast. Duck breast meat had significantly higher redness (a*), but lower lightness (L*) value compared to chicken breast. During whole storage time, the a* value remained constant in duck breast. Cooking loss (%) was higher in duck breast compared to chicken breast during the whole storage time. Shear force decreased with increasing storage time in both chicken and duck breast meat, moreover, it decreased rapidly in duck breast compared to chicken breast. The TBARS values increased with increasing storage time in both duck breast and chicken breast meat and was significantly higher in duck breast. The fatty acids (%) C14:0, C16:0, C16:1, C18:2 and C18:3 were significantly higher while C18:0 was significantly lower in duck breast compared to chicken. SFA was increased, while USFA and MUSFA decreased only in duck breast during the 7 day storage time. The 2nd experiment, 3 different trials were done to evaluate the response of duck meat in relation to different chill water temperature. In 1st trial, among 39 duck carcasses, 36 duck carcasses were chilled at 3 different chilled water temperatures and evaluated the breast meat at 24 h postmortem. Drip loss, cooking loss, moisture content, sarcomere length, shear force, protein solubility and protein denaturation through SDS-Page gel electrophoresis were done at 24 h postmortem, and observed no significant differences among different chilled water temperature treated breast meat samples for these parameters. However, significant differences were found in CIE* color values. Lightness (L*) increased, while redness (a*) decreased with increasing the chilled water temperature. Lower yellowness (b*) was found in breast meat samples at 10℃ chill water temperature. The pH of breast meat and carcass temperature found significant differences in early period of post-mortem, while no significant differences were found at 24 h post mortem. 2^(nd) trial was done to compare the effect of chilled water temperature between breast and leg meat of 18 duck carcasses. To test the temperature effect and meat type effect simultaneously, the data were analyzed using a mixed model. The model included the fixed effect of temperature, meat type and their interaction and the random effect of duck to account the dependency of the measures from same duck. Results showed no significant effects of chilling temperature on ultimate pH, protein solubility, sarcomere length and shear force value for duck breast or leg meat (p>0.05). Leg meat had higher ultimate pH, redness and shear force value, lower cooking loss, lightness, yellowness, and protein solubility values than breast meat. The interaction of meat type and chilling temperature on cooking loss was significant. The effect of chilling temperature on cooking loss was more severe on leg meat than breast meat and 20 ℃ chilling resulted in significantly higher cooking losses than the other chilling temperatures. Results of this experiment revealed that duck carcass can be chilled at 10℃ without any harmful effects on meat quality including the toughness of meat. The 3^(rd) trial was carried out to investigate the chill water temperature effect on duck breast meat muscle strip at 4 different chill water levels. Result showed that the cooking loss and drip loss were highest at 30℃, while lowest at 10℃. The pH was highest at 0℃, while lowest at 30℃. No significant differences were found in lightness and different protein solubility value of muscle strips for different chill water temperature, while redness and yellowness value found to be lower at 0℃ and 30℃. Sarcomere length was lowest at 30℃ with highest shear force value, while highest at 10℃ with lowest shear force value. Results of this experiment revealed that muscle shortening in duck breast muscle strip was lowest at 10℃ chilled water temperature. The 3^(rd) experiment was carried out to evaluate the sensory and textural properties of duck meat sausages with different cereal flours, comparing with pork and chicken sausages and the storage quality while added grape seed oil as replacement of animal fat with 3 differet experimental trials. In experimental trial, Low fat sausages were made with or without 10% hydrated different cereal flours with duck meat and compared their physical and sensory properties with control sausages made without animal fat and with 10% animal fat. Results showed that moisture content was significantly lower in added animal fat control than those of others. Protein content was significantly higher in without animal fat control, while fat content was significantly higher in animal fat added control. Both protein and fat content reduced when different cereal flours were used for making sausages with duck meat. Texture analysis showed that hardness significantly reduced while using different cereal flours for making sausages. In all texture analysis significantly lower values were found in rice flour added sausages, although no significant differences were found in springiness among the sausages. Sensory evaluation indicates that lower overall acceptability of without animal fat control duck sausages due to it's significantly higher off-flavor score. However, overall acceptability of rice flour added sausages found higher because of its higher tenderness value. Second experimental trial was done to compare the duck sausages with pork and chicken sausages with or without added 10% rice flour. Crude protein, crude fat and total ash content significantly reduced in rice flour added group compare to without rice flour group. Crude protein and crude fat was significantly highest in pork sausages without rice flour (p<0.05). Adding 10% rice flour reduced TFE in all meat type sausages. Cooking loss also decreased when 10% rice flour used for making sausages from chicken and pork, however, no changes were found in duck meat by adding rice flour in cooking loss. Again, the highest cooking loss was found in pork sausages with out rice flour and lowest in chicken sausages with 10% rice flour. Lightness (L*) increased, while redness (a*) decreased with adding rice flour in all meat type sausages. Results showed that hardness significantly reduced when 10% rice flour added with pork, chicken and duck meat compare to without rice flour. This may be due to increased water retention activity of rice flour after cooking, while it decreased in different meat type after cooking. Sensory evaluation indicates that the overall acceptability for pork and chicken sausages were same with or without rice flour, however duck sausages without rice flour was worst among the sausages for it highest off-flavor score. However, added rice flour increased the overall acceptability of duck sausage like pork and chicken sausages. The 3rd experimental trial was done in order to evaluate the effect of incorporation of grape seed oil as a replacement of beef fat in duck meat sausages with 10% added rice powder. For manufacturing sausages beef fat (12% beef fat added in control) was replaced at a level of 25%, 50% and 75% with grape seed oil, and then vacuum packaged and stored at 4℃ temperature for 21 days. Averaging the storage time, no significant effect of pH and TBARS value were found in duck meat sausages between control and treatments. However, storage had effect on pH and was significantly decreased at 21 days. Both treatments and storage times had significant effect on CIE* color values and nitrite content of sausages. Texture profile analysis revealed that treatments and storage times had significant effect on hardness, gumminess, chewiness and cohesiveness. Hardness was significantly higher in control sausages averaging the storage time, while averaging the treatments higher value was found at 14 and 21 days storage. The essential fatty acid C18:2 (linoleic acid) found significantly increased in grape seed oil incorporated sausages. Sensory evaluation indicates that the overall acceptability was same for sausages of control and incorporated grape seed oil by 25% and 50% replaced animal fat. Results of this study revealed that a likable low-fat duck sausage can be made in which animal fat can be replaced up to 50% by grape seed oil without any effect on sensory parameters. 본 연구는 오리고기와 오리고기를 이용한 육제품의 특성을 구명하여 저장성과 품질을 향상시키고자 다양한 실험들을 실시하였다. 첫 번째 연구는 닭고기와 오리고기간의 비교실험으로, 일반성분 및 사후 근육의 해당속도와 저장시간 별 육질의 특성 차이를 비교 조사하였다. 두 번째 연구는 오리도체의 냉각방법이 오리가슴육의 근육단축과 육질에 미치는 영향을 3가지의 실험을 통해 알아보았다. 세 번째 연구는 오리고기를 이용한 육제품의 활용 가치를 확인하고자 다양한 방법으로 제조된 오리고기 소시지의 관능적, 조직적 및 저장특성을 조사키 위해 3가지 실험을 실시하였다. 첫 번째 연구에서, 오리고기는 사후 30분경에 닭고기에 비해 유의적으로 낮은 pH를 보였다(P<0.05). 또한 오리가슴육은 닭가슴육에 비해 지방 함량, 적색도(a*), 가열감량, 전단가 및 지방산패도(TBARS)가 유의적으로 높게 나타났으며, 조단백질과 조회분 함량 및 명도(L*) 값은 닭가슴육보다 낮게 나타났다(P<0.05). 특히, 닭가슴육 및 오리가슴육 모두 저장기간이 증가함에 따라 TBARS 값은 증가하였는데 오리고기가 닭고기에 비해 높은 TBARS값을 나타내었다. 그러나 전단가는 오히려 오리고기가 닭고기에 비해 유의적으로 낮은 것으로 나타났다(P<0.05). 지방산 조성의 비교에서 오리고기는 닭고기에 비해 C14:0, C16:0, C16:1, C18:2 및 C18:3 등이 유의적으로 높은 반면, C18:0는 유의적으로 낮았다(P>0.05). 그 결과, 냉장저장 7일 동안, 닭고기에 비해 오리고기의 SFA는 증가한 반면 USFA와 MUSFA는 감소하였다. 두 번째 연구의 첫 번째 실험에서 오리도체의 냉각수 온도별(0, 10 및 20℃) 오리고기의 육질특성을 조사한 결과, 사후 24시간째 수분함량, 육즙감량, 가열감량, 전단가, 근절길이 및 단백질용해성에선 유의적인 차이가 나타내지 않았으나(P>0.05), 도체 냉각수의 온도가 높을수록 육색 중 적색도(a*)는 감소하고 명도(L*)는 증가하였다. 두 번째 실험에서는 냉각수 온도가 오리 부분육(가슴 및 다리)에 미치는 영향에 대해 비교?분석하였는데, 그 결과 도체 냉각수 온도 차이는 가슴 및 다리부위의 최종 pH, 단백질용해성, 근절길이 및 전단가에는 영향을 미치지 않았으며(P>0.05), 가슴부위에 비해 다리부위에서 높은 최종 pH 및 전단가, 낮은 가열감량, 명도(L*), 황색도(b*) 및 단백질용해성을 나타내었다. 따라서 도체 냉각 온도는 오리고기의 가슴 부위에 비해 다리 부위 가열감량에 더한 영향을 미치는 것으로 판단되며, 0 및 10℃의 냉각수 온도보다는 20℃의 높은 냉각수 온도가 유의적으로 높은 가열감량을 초래하는 것으로 나타났다(P<0.05). 세 번째 실험은 4 가지의 다른 냉각수 온도가 발골된 오리가슴육의 육질 특성에 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과, 30℃의 가장 높은 냉각수 처리시 오리가슴육의 가열감량 및 육즙감량 값이 가장 높게 나타났으며, 10℃의 냉각수 처리시 가장 낮은 값을 나타내었다. 또한 30℃ 냉각수 처리시 가장 짧은 근절길이를 나타내며, 가장 높은 전단가를 나타내었다. 따라서 본 실험 결과, 오리가슴육의 근육단축도는 10℃ 냉각수 처리도시 가장 적은 것으로 나타났다. 이상의 두 번째 연구 결과들을 종합해보면, 오리 도체를 10℃ 냉각수로 처리하는 것이 가장 바람직 할 것으로 사료된다. 세 번째 연구는 오리육을 이용한 다양한 육제품의 제조 가능성을 확인하는 3가지 실험을 실시하였다. 그 첫 번째 실험으로 오리고기를 이용한 저지방소시지 제조를 위해, 동물성 지방을 이용한 대조구 소시지와 다양한 수화곡류들을 10% 범위 내에서 첨가하여 제조한 소시지의 품질 특성을 비교하였다. 그 결과, 일반성분은 10% 수화곡류 첨가구가 낮은 조단백질 및 조지방 함량을 나타내었다. 조직감에서도 10% 수화곡류 첨가구에서 낮은 hardness 값을 보여 연한 조직감을 자지는 것으로 확인되었다. 두 번째 실험은 돼지고기, 닭고기 및 오리고기에 10% 수화쌀가루를 첨가하여 제조한 소시지와 대조구의 품질특성을 비교하였다. 그 결과, 조단백질, 조지방 및 조회분 함량이 수화쌀가루를 첨가한 것이 대조구에 비해 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05). 그러나 조단백질 및 조지방 함량은 10% 수화쌀가루의 첨가하지 않은 돈육소시지에서 가장 높게 나타났다(P<0.05). 또한 모든 10% 수화쌀가루를 첨가한 처리구에서 높은 명도(L*) 및 낮은 적색도(a*)가 나타났다. 조직감 측정 결과, 10% 수화쌀가루를 첨가하지 않은 대조구에 비해 돈육, 계육 및 오리육 등에 10% 수화쌀가루를 첨가한 처리구가 낮은 hardness(경도) 값을 나타내었다. 이러한 결과는 소지지의 제조 공정 중 10% 수화쌀가루의 첨가는 가열을 통한 수분손실을 적게 하고 수분보유능력을 높이는 것으로 사료된다. 한편 관능특성 결과, 10% 수화쌀가루의 첨가는 소시지의 전체적인 기호도에 크게 영향을 미치지 않은 것으로 나타났다. 또한 오리육 소시지의 경우 10% 수화쌀가루를 첨가하는 것이 전체적인 기호도를 향상시키는 것으로 나타났다. 세 번째 실험은 육제품에 첨가되는 동물성 지방인 우지방의 대체제 개발을 위하여 포도씨유를 우지방의 25%, 50% 및 75%를 대체하여 오리고기 소시지를 제조하였다. 제조된 소시지는 진공포장을 한 후 4ºC 냉장온도에서 21일 동안 저장하였는데, 저장기간별 대조구와 처리구간에 pH 및 TBARS 값의 차이는 나타나지 않았지만 모든 처리구에서 저장 21일에 pH 값이 감소하는 것으로 나타났다. 경도는 모든 저장기간에서 대조구가 유의적으로 높게 나타났다. 지방산 조성에서 C18:2과 같은 필수지방산 함량은 포도씨유가 첨가된 처리구에서 유의적으로 높은 것으로 나타났다. 관능검사에서는 25% 및 50% 포도씨유로 대체구가 대조구와 유사한 기호도를 보인 것으로 나타났다. 이러한 결과는 25% 및 50% 포도씨유의 첨가는 소시지의 관능특성에 영향을 미치지 않으며, 따라서 오리고기 소시지 제조시 포도씨유를 우지방의 대체제로서의 사용가능할 것으로 사료된다.

(The) cloning and characterization of novel chicken Interleukin-34

박보영 중앙대학교 대학원 2016 국내석사

대식세포는 세망내피계(RES)나 단핵식세포계(MPS)의 조직 분화된 단핵구로 성숙한 것이다. 일반적으로 대식세포는 식균작용 기능을 주로 담당하며, 그 밖에 항상성 조절과 면역, 염증 반응에서도 중요한 기능을 담당한다. M-CSF ligand가 M-CSF receptor (M-CSFR)에 결합하여 골수 간세포를 자극하면 대식세포가 발달한다. 최근 IL-34가 M-CSFR에 결합 가능한 두 번째 ligand 새로운 가능성이 보고되고 있다. IL-34는 M-CSFR과 결합을 통해 M-CSF와 비슷한 기능을 하는 것으로 알려졌다. 또한 IL-34 사이토카인이 단핵구 생존과 대식세포 형성에 관여한다는 연구가 류마티스 관절염 환자 등을 대상으로 실행되었다. 하지만 여전히 닭에서의 IL-34 기능은 실험적으로 전혀 밝혀지지 않았다. 따라서 본 연구는 잠재적 생물학적 활성을 평가하기 위하여 계획하였다. IL-34 발현 패턴 분석을 위해 다양한 닭 계통과 병원균이 사용되었다. 먼저 IL-34와 M-CSF를 클로닝하고 다음 분석을 위한 단백질을 생산하였다. IL-34와 M-CSF 재조합 단백질에 의한 염증 사이토카인의 발현을 포함하여 모든 유전자 발현 패턴은 qRT-PCR 기법을 중심으로 분석하였다. IL-34와 M-CSF, M-CSFR의 발현은 원인불명의 다리 장애가 관찰된 닭에서 증가하였지만 반대로 병원균을 직접 감염시킨 닭에서는 발현이 감소하였다. 예상했던 대로 IL-34와 M-CSF 재조합 단백질에 의해 M-CSFR이 유도되었고 IFN-γ 는 두 단백질에 의한 유도 결과가 상이하게 나타났다. 모든 처리구에서 IL-12의 발현 변화는 관찰되지 않았고, 항염증 사이토카인인 IL-1 는 감소하였다. 이러한 결과는 IL-34와 M-CSF가 이질성을 갖는 classical macrophage와 alternative macrophage 모두에서 작용한다는 것을 의미한다. 종합해보면, 본 논문은 pathogenic trials을 통하여 in vitro와 in vivo 모두에서 IL-34와 M-CSF를 비교 분석한 최초의 연구를 토대로 작성되었다. 닭에서의 IL-34는 대식세포와 함께 염증 전, 후 반응에 있어서 중요한 역할을 수행할 것으로 예측된다. 그러므로 IL-34의 발현을 유도하는 사이토카인과 IL-34에 의해 유도되는 케모카인에 대한 연구가 앞으로 수행되어야 할 것이고 더 나아가 염증 관련 pathway 내에서 IL-34의 위치와 역할을 확인하는 연구가 이루어져야 한다. Macrophages are mature, tissue-differentiated monocytes of the reticuloendothelial system (RES) or mononuclear phagocyte system (MPS). These are usually emphasized on phagocytosis and ubiquitously distributed mononuclear phagocytes responsible for numerous homeostatic, immunological, and inflammatory processes. The development of macrophages requires macrophage colony stimulating factor (M-CSF) through its binding to the MCSF receptor (M-CSFR) on bone marrow progenitor cells. The effects of M-CSF are mediated by its cell-surface receptor M-CSFR and they have a role in ligand-receptor binding to the regulation of signal transduction as homodimers or heterodimers. Recently, interleukin 34 (IL-34) has been identified as the second functional ligand for MCSFR. Through binding to M-CSFR, IL-34 shares similar functions with M-CSF. The cytokine IL-34 supports human monocyte survival and promotes the formation of macrophage. Until now, chicken IL-34 data was reported just by predicted sequence and not by experimental research. There is still no information about IL-34 function in chicken. To suggest potent biological activity, we examined chicken IL-34 in laboratory. Several chicken lines and bacteria were used to confirm chicken IL-34 expression. The cloning of chicken IL-34 and M-CSF was firstly designed, performed, and characterized. Then we investigated which modulation of proinflammatory cytokine genes expression by recombinant IL-34 and M-CSF proteins, in vitro. Mainly gene expression was analyzed by qRT-PCR. IL-34, M-CSF, and M-CSFR are up-regulated in leg dysfunction chicken (unknown cause). However, IL-34 is down-regulated in most tissues of pathogen-stimulate tissues. M-CSFR is enhanced by chicken IL-34 and M-CSF recombinant protein, in vitro. IFN-γ expression was increased by recombinant IL-34, but not M-CSF. However, IL-12 expression was not regulated by all treated cells. IL-1β was decreased by all tissues. These results indicate that IL-34 and M-CSF have a role in both classical and alternative macrophages. Taken together, our finding demonstrates, for the first evidence, that the presence of IL-34 in chicken for pathogenic trials, in vitro and in vivo. In this report, we predict that IL-34 protein play a role both of pro- and anti-inflammatory function with macrophage. Therefore, further research will perform what kind of cytokine can induce IL-34, what kind of chemokine can induce by IL-34, and estimate function of IL-34 on inflammatory pathway.

Molecular Mechanisms Underlying Aflatoxin B1 and Ochratoxin A-induced Hepatotoxicity in Chickens

So-Young Choi 강원대학교 대학원 2020 국내박사

곰팡이독소(Mycotoxin)는 곡류, 과일, 축산물에서 발생하는 곰팡이의 이차대사산물로, 곰팡이독소에 오염된 곡식 또는 이를 이용한 사료의 섭취에 의해 가축에서 발암, 간독성, 신장독성 및 신경독성을 유발한다. Aspergillus, Penicillium 등에 의해 생성되는 아플라톡신B1(Aflatoxin B1)과 오크라톡신A(Ochratoxin A)는 각각 세계보건기구의 International Agency for Research on Cancer(IARC)에서 Group 1과 Group 2B에 속하는 발암물질이다. 곰팡이독소의 독성기작에 관한 연구는 많은 축종의 in vitro, in vivo 모델을 통해 보고된 바 있으나 곰팡이독소에 높은 감수성을 보이는 닭에서의 연구는 다소 미흡하다. 따라서 본 논문은 독소의 1차적인 독성반응과 축적이 발생하는 닭의 간에서 두 종의 곰팡이독소의 독성기작을 구명하고자 닭의 간암세포주인 LMH 세포와 White Leghorn의 유정란을 이용하였으며, mRNA 시퀀싱을 통한 전사체 발현 분석과 2DE-MS/MS를 통한 단백체 발현 분석이 수행되었으며 이러한 정보들을 기반으로 생물정보 분석을 통해 아플라톡신B1과 오크라톡신A에 의한 간독성의 분자기작(Molecular mechanisms)을 구명하였다. in vitro 모델로 White Leghorn 유래의 간암세포주인 LMH 세포를 사용하였다. LMH 세포에 다양한 농도의 아플라톡신B1, 오크라톡신A 그리고 동량의 곰팡이독소를 처리하여 MTT assay를 통해 각 곰팡이독소의 농도 의존적인(dose-dependent) 세포독성을 확인하였다. 또한 세포독성결과를 기반으로하여 두 독소간의 ‘Combination index’를 계산하였을 때, 아플라톡신B1과 오크라톡신A가 안타고니즘(antagonism)의 성격을 띄는 것을 확인하였다. 대조군에 비하여 50% 세포성장이 저해되는 농도(IC50)인 1uM의 아플라톡신B1, 15uM의 오크라톡신A, 각각 1uM의 곰팡이독소가 처리된 복합처리구로부터 mRNA를 추출하여 총전사체분석에 이용하였다. RNA 시퀀싱을 통하여 곰팡이독소를 처리하지 않은 대조구 대비 발현이 2배이상 차이가 나며 통계적인 유의성을 가지는, 차등발현 유전자(deferentially expressed genes)가 아플라톡신B1 처리구에서 1,797개, 오크라톡신A 처리구에서 4,362개 확인하였으며 복합처리구에서는 2,987개의 유전자가 유의적으로 차등발현됨을 확인할 수 있었다 (q>0.01). 특히 복합처리구의 약 70% 차등발현 유전자들은 아플라톡신B1 처리구 또는 오크라톡신A 처리구의 차등발현유전자와 일치하였다. 이러한 차등발현 유전자들을 가지고 DAVID와 KOBAS를 활용한 생물정보분석을 수행하여 GO와 KEGG pathway 결과를 얻었다. 3가지로 구성되는 GO term중 cellular component에 많은 차등발현 유전자들이 매치되는 것을 확인할 수 있었으며 주된 GO term으로는 inflammatory response, cell adhesion, immune response, positive regulation of apoptotic process가 확인되었다. 또한 KEGG pathway분석에서 아플라톡신B1과 오크라톡신A의 처리에 의해 닭의 간에서 PPAR signaling pathway등이 하향 조절되었으며, MAPK signaling pathway, calcium signaling pathway, focal adhesion등이 상향 조절되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 두 곰팡이독소의 복합처리구에도 비슷한 양상을 보였다. 이러한 아플라톡신B1과 오크라톡신A의 독성반응의 유사성은 두 곰팡이독소가 안타고니즘 관계에 영향을 줄 것이라 사료된다. 동물실험과 유사한 실험모델로서 in ovo 모델을 확립하였다. 인공수정된 유정란의 부화 9일령부터 11일령까지 3일간 다양한 농도의 곰팡이독소를 달걀의 air sac부분에 주사하였으며 11일령에 태아를 얻어 태아의 무게, 간의 무게 등을 측정하고 해부하여 간을 적출하여 면역염색법을 통하여 간변병 및 조직의 변화를 확인하였다. 약 15%의 폐사율을 보이며 간에서 병변 및 염증반응이 관찰되는 농도인 4.2 ㎍/egg의 아플라톡신B1과 25%의 폐사율을 보이는 30 ㎍/egg를 오크라톡신A을 3회 처리한 닭의 간조직으로부터 mRNA를 추출하여 전사체분석에 사용하였다. 차등발현 유전자의 개수는 대조구 대비 아플라톡신 처리구에서 총 734개, 오크라톡신 처리구에서 3,319개로 in vitro 모델에 비해 상대적으로 적은 수의 차등발현 유전자를 확인하였다. 오크라톡신 처리구의 경우 in vitro 모델과 유사하게 PPAR signaling pathway와 drug metabolism 등이 하향 발현되고, MAPK signaling pathway, focal adhesion등이 상향 조절된데 반해 아플라톡신 처리구에서는 이와 반대의 경향을 보이거나 확인되지 않았다. 특히 in ovo 오크라톡신A 처리구에서 ‘bile acid biosynthesis’기작과 연관된 유전자들 중 과반수 이상이 하향 조절되는 것이 확인되었다. 이러한 담즙산 생합성의 억제 기작은 외래물질(xenobiotics)를 독성을 가지는 담즙산 (toxic bile acid)로 인지하여 이에 대한 체순환 및 장기내의 축적을 방지하기 위해 담즙산의 생합성을 억제하는 오크라톡신A에 대한 항독성 기작으로 사료된다. 독소에 의한 생물체의 반응은 전사체의 발현 조절로 시작하여 단백질 수준에서의 변화로 이어지며 이러한 단백질 발현이 개체의 독성반응을 유도한다. 따라서 아플라톡신과 오크라톡신의 처리로 인해 간에서 차등발현을 나타내는 전사체들이 단백질 수준에서의 변화까지 이어지는지 확인하고, 전사체 분석으로 미처 확인하지 못한 또다른 독성기작을 확인하고자 in ovo 모델의 전사체 분석과 동일한 실험방법으로 얻어진 간조직으로부터 단백질을 추출하여 2-DE 방법을 통해 분리 후, MS/MS를 통하여 동정하였다. 대조구에 비해 2배이상 차등 발현되는 단백질 spot은 아플라톡신 처리구에서 128개, 오크라톡신 처리구에서 105개로 나타났으며 앞선 전사체 분석결과와는 달리 오크라톡신의 차등발현 단백질 수가 더 적게 나타났다. 이들 중 두 곰팡이독소 처리구에서 동일한 양상으로 조절되는 점 33개 중 23개의 단백질 시퀀스를 확인하여 MASCOT 데이터 베이스내에서 시퀀스가 일치하는 단백질을 확인하였다. 개중 MS/MS에서 확인되지 않는 4개의 spot을 제외하고 총 19개의 spot간의 연관성을 DAVID를 통해 분석하였을 때, 당 대사 관련 기작과의 연관 외에 특징적인 기작이 나타나지 않았으나 각각의 단백질을 확인했을 때 전사체분석에서 확인되지 않았지만 선행연구에서 곰팡이독소의 표지인자로 활용되어온 알부민의 발현이 감소되는 것과 in vitro, in ovo 모델을 통틀어 아플라톡신 처리구와 오크라톡신 처리구에서 모두 동일하게 하향 조절되었던 GSTT1과 GPD1L2 단백질의 하향조절을 확인하였다. 이러한 알부민의 발현 변화는 닭에서의 곰팡이독소의 노출이 혈장 알부민과 결합하여 Lysine-adduct를 형성하는 것을 방해하고 독소가 알부민과 결합하여 체내에서 오랜기간 잔존하는 것을 억제하는 하는 항독성 기작으로 사료된다. 반면에 연관된 GSTT1의 하향조절은 무독화(detoxification)의 일종인 글루타티온(glutathione)포합반응에 악영향을 미칠 수 있다. 이러한 아플라톡신 B1과 오크라톡신A 처리에 의한 무독화 연관 효소의 발현 감소는 닭의 높은 독성민감도에 영향을 줄 수 있을 것이다. 이러한 단백질 분석결과는 보다 많은 spot을 분석하여 기존의 전사체 분석결과를 뒷받침하는 단백체 분석결과를 얻을 수 있을 것으로 사료된다. 외래대사체(xenobiotics)가 DNA, protein-adduct를 형성하기 위해서는 대한 Cytochrome P450(CYP450) 매개의 제1상반응(phase I)을 통해 친전자성대사체라는 활성중간대사체(reactive intermediates)로 생체전환 되어야 하는데 이때 CYP450유전자들의 전사에 AhR, CAR, PPARs, LXR등의 다양한 핵 수용체가 관여한다. 앞선 in vitro, in ovo 모델에서의 전사체발현분석에서 PPAR signaling pathway의 하향조절되는 차등발현 유전자들과의 연관성은 CYP450의 유전자 발현을 감소시켜 곰팡이독소의 생체전환(biotransformation)에 영향을 줄 수 있다. 생체전환된 활성중간대사체와 결합하여 독성반응을 유발하는 알부민의 발현감소 또한 CYP450 유전자 발현이 감소와 함께 곰팡이독소에 대한 항독성 작용의 일종이라 사료된다. 또한 체내에서 생체전환을 통해 친전자성을 띄는 활성중간대사체(reactive-intermediates)를 무독화하는 GST 매개의 포합반응에 중요한 글루타티온 합성을 크게 좌우하는 GCL 유전자의 활성은 Nrf2, MAPK signaling과 연관되어있다. 아플라톡신B1과 오크라톡신A의 처리에 의한 MAPK signaling의 활성화는 글루타티온의 합성을 자극하여 항독성작용을 할 것으로 기대되지만 이에 관여하는 효소인 GST의 발현은 감소되는 것으로 확인되었다. 오크라톡신의 in vitro 모델과 in ovo 모델에서의 결과가 매우 유사했던 것과 같이 적정농도의 아플라톡신 처리시에 두 비동물성 모델에서 유사한 결과를 얻을 수 있을 것으로 기대된다. 최근 동물복지 관련 목소리가 높아진 바, LMH 세포를 활용한 in vitro 모델과 닭의 유정란을 활용한 in ovo 모델의 확립은 실험동물을 이용하는 in vivo 모델을 대신하여 닭에서의 독성기작연구에 활용될 수 있을 것이다. 아플라톡신과 오크라톡신은 닭의 간에서 상당히 유사한 독성기작을 보이며 기존연구에서는 이들의 독성기작이 산화적 스트레스로 일축된 것에 반해 본 실험에서는 CYP450 전사 관련 핵수용체의 조절, 글루타티온 합성 자극 그리고 담즙산의 생합성 저해 등을 통해 닭의 간에서 곰팡이독소에 대한 항독성작용을 밝혀내었다. 반면에 글루타티온 포합반응에 작용하는 GST 효소의 유전자, 단백질 수준에서의 발현 감소는 닭의 곰팡이독소에 대한 높은 독성민감도의 원인이 될 수 있을 것이다. 이러한 두 곰팡이독소에 독성기작에 관련 총 전사체 및 단백체 연구결과는 이후 독소의 독성기작을 충분히 이해하고 이를 완화할 수 있는 첨가제의 개발, 유전체연구를 통한 강한 항독성을 가지는 품종 개발 등에 기초자료로써 활용될 것이다. Aflatoxin B1 (AFB1) and ochratoxin A (OTA) are mycotoxins that cause adverse effects in humans and animals resulting in illness and economic losses. However, the molecular mechanisms underlying their action in chickens are still unclear, even though poultry is highly susceptible to AFB1 and OTA. Therefore, a series of studies were conducted to explore toxic responses to AFB1 and OTA exposure from transcriptional and proteomic perspectives. In Chapter 1, chicken hepatocarcinoma cell lines (LMH) were treated with individual or binary combinations of AFB1 and OTA, and gene expression was analyzed using mRNA sequencing. As a result of mycotoxin treatment, cell viabilities decreased significantly (p < 0.01) in a dose-dependent manner of both mycotoxins. The combination interaction of AFB1 and OTA displayed concentration-dependent antagonism effects in chicken hepatic carcinoma cells. The number of differentially expressed genes (DEGs, fold-change ≥ 2, false discovery rate (FDR) <0.01) were obtained using either 1.0 μM AFB1 (1,797 DEGs) or 15 μM OTA (4,362 DEGs) or a combination of both mycotoxins at 1 uM concentration (2,987 DEGs) compared with control groups. Bioinformatic analysis using these DEGs revealed that the pathways involved in the toxic effect, peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) signaling pathway and focal adhesion, mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway and calcium signaling pathway, are enriched and that the same pathways are triggered after AFB1 and OTA-induced cytotoxicity in chicken hepatic cells. These results suggest that AFB1 and OTA can share and compete for some toxic pathways in their mode of action (MOA). In fact, antagonistic characteristics between AFB1 and OTA are induced by sharing and competition of toxic mechanisms in chicken hepatocarcinoma. In Chapter 2, fertilized White Leghorn eggs were incubated to in ovo administration and exposed to various concentration of AFB1 or OTA for 9 to 11 days. After 3 days of mycotoxins exposure, fetal body weight was measured and liver was dissected, weighed and used for histopathologic analysis and mRNA sequencing. Mortality, decrease of liver weight (p < 0.05) and changes in histomorphology were assessed in 4.2 ㎍/egg AFB1 and 30 ㎍/egg OTA treated embryonic chickens. A total of 734 genes were found to be significantly regulated by AFB1 exposure, while 3,319 DEGs were found in OTA treated embryonic chickens (fold-change ≥ 2, FDR <0.01). In AFB1 treatments, 72% of DEGs behaved similarly among the commonly significant DEGs in vitro and in ovo and the results of bioinformatic analysis were also different with in vitro experiment. Meanwhile, the DEGs regulated in OTA in ovo exposure showed a similar pattern to in vitro administration with a comparable concentration of OTA (over than 90%). The DEGs of OTA treated chickens were related with metabolic pathways, PPAR signaling pathway, focal adhesion, and MAPK signaling pathway, as mentioned in Chapter 1. It was considered that up-regulation of MAPK signaling, which plays a role in cell survival, antiapoptotic activity, and cancer development, to be one of genetic mechanisms induced by aflatoxicosis and ochratoxicosis in chickens. Contrastingly, down-regulation of PPAR signaling could provide a pathophysiological explanation to the mycotoxins-induced liver damage. Especially, dysregulation to primary bile acid biosynthesis was identified which is related with detoxification process for mycotoxicosis in the livers of OTA treated embryonic chickens. The depression of bile acid biosynthesis at the gene expression level could induce an increase of toxic effects through disturbance of mycotoxin excretion. Additionally, it was suggested that by comparing the results of transcriptomic analyses in Chapter 1 and 2, a total of 50 common DEGs in in vitro and in ovo exposure to both mycotoxins, including glutathione-S-transferase tetra 1 (GSTT1) and Glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1 like protein (GPD1L), could be identified as major genes related to mycotoxin toxicity. In Chapter 3, proteomic analysis using 2DE-MS/MS was used to identify differentially expressed proteins (DEPs) in the AFB1 or OTA exposed chicken livers in the same conditions as the experiments detailed in Chapter 2. A total of 128 and 105 differentially expressed spots exhibited more than 2.0-fold differences in AFB1 or OTA treatments, respectively, compared with controls and 33 spots of these DEPs were co-regulated in both treatments. Among these co-regulated DEPs, 18 spots were successfully identified in the chicken protein database. I revealed that some proteins that persisted in transcriptomic and proteomic analysis (e.g. GST and GPD1L) could be key proteins associated with AFB1 and OTA toxicity. Moreover, proteomic analysis can identify proteins involved in toxicity even if they are not detected using mRNA expression. Preproalbumin (ALB) and GST are remarkable proteins that are down-regulated in both mycotoxin treatments and were identified by proteomic analysis. The down regulation of ALB was considered to be a protective mechanism against mycotoxicosis through suppression of protein adduct production in chickens. However, dysregulation of the GST protein, a detoxicate enzyme mediating the GSH conjugation, can induce an increase in the toxicity of AFB1 and OTA. Additionally, the persistence of changes in expression from mRNA to protein by ochratoxicosis were verified by protein immunoblotting using antibody for PPAR and fatty acid binding protein (FABP1) in chickens. It is suggested propose that lipid metabolism is related to the toxic mechanisms of OTA in the chicken liver. Analysis of the changes in gene expression in hepatocarcinoma cells and in the livers of the mycotoxins-exposed chickens suggest that the four distinctive pathways (PPAR signaling pathway, MAPK signaling pathway, focal adhesion, and primary bile acid biosynthesis) may play a role in mediating AFB1 and OTA hepatotoxicity. In addition, the proteomic study of chicken liver showed that AFB1 and OTA can cause the depression of ALB and GST expression. Presumably, the mechanisms of aflatoxicosis and ochratoxicosis are very similar, and a common MOA is involved in biotransformation and detoxification processes. The pathways involved in PPAR or MAPK signaling could be considered to be the main mechanisms underlying the toxicity of AFB1 and OTA at the genetic level in chicken livers. The genes involved in biotransformation (i.e. activation of toxicity) were deregulated by the regulation of nucleic receptors. Moreover, down-regulation of genes related to bile acid biosynthesis could induce a disturbance in toxin excretion and additional toxicity by AFB1 and OTA. Additionally, the down-regulation of detoxicant enzyme (GST) prevents detoxification and provokes a high sensitivity to aflatoxicosis and ochratoxicosis in chickens. Despite these toxic mechanisms of mycotoxins, the down-regulation of ALB can exert protective effects through the inhibition of proteins binding with xenobiotics and the accumulation of protein complexes. This study is the first to report on the integrated analysis of transcriptomic and proteomic effects on the chicken liver exposed to AFB1 and OTA. This study will provide further insights into the mechanism of aflatoxicosis and ochratoxicosis induced hepatotoxicity and may aid the development of new protective supplements for toxicity that is caused by mycotoxin contamination in poultry.

면역관련 신호체계 활성화를 통한 사이토카인 생산증진 닭 면역 유전자의 특성 연구

츠엉 앵 득 중앙대학교 대학원 2018 국내박사

The immune genes play a role an important in protecting chickens against various pathogens, viral and fungi as it does in the case of mammals. In the present study, I describe the cloning and functional characterization of several novel chicken immune genes. In the first chapter, chicken interleukin 26 (chIL-26), a member of the IL-10 cytokine family, can induce the production of proinflammatory cytokines by T cell that were identified and functional characterization in chicken. I demonstrated that the chIL-26 cDNA encodes an 82-aa protein whose amino acid sequence has 22.63%, 43.15%, and 46.31% homology with IL-26 of human, canary, and pig, respectively. I examined the response of signal transduction pathways to chIL-26 stimulation in the chicken T (CU91), macrophage (HD11), and fibroblast (OU2) cell lines. chIL-26 activated JAK2 and TYK2 phosphorylation, as well as STAT1, STAT3, and SHP2 via tyrosine/serine residues. I also showed that chIL-26 activates the phosphorylation of NF-κB1, TAK1, and MyD88 kinase, which are key regulators of NF-κB signaling pathways. Moreover, chIL-26 stimulation upregulated mRNA expression of chemokines (CCL4, CCL20, and CXCL14), Th1 (IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-1β, and IL-6), Th2 (IL-4 and IL-10), and Th17 (IL12-p40, IL-17A, and IL-17F), and the Treg cytokines (TGF-β4); additionally, it increased Th1 and Th17 protein levels and nitric oxide production but did not affect cell proliferation. Taken together, I suggest that chIL-26 induced activation of chemokines, Th1, Th2, and, Th17, and the Treg cytokines which are mediated through JAK-STAT and NF-κB signaling pathways in chicken cell lines. Using bioinformatics approach, I composed second chapter: cloning of chicken IL-23p19 (chIL-23α) and the function of the IL-23 complex in birds. Multiple alignments of chIL-23α with other known IL-23α amino acid sequences revealed regions of amino acid conservation. It indicated that the homologies of chIL-23α, IL-12p35, and similar mammalian subunits ranged 26% to 42%. I also showed that chIL-23α consisted of four exons and three introns; similar to those in humans and mice, and limited conservation of synteny between the human and chicken genomes was observed. Using bioinformatics tools, I specified several transcription factors such as NF-κB, C/EBPα-β, c-Jun, c-Rel, AP-1, GATA-1, and ER in chIL-23α. Moreover, IL-23α mRNA was more highly expressed than IL-12p40 and IL-12p35 mRNA in several organs of chickens infected with Salmonella. In addition, the chIL-23 complex is associated with IL-23R, IL-12Rβ1 receptors; activate the JAK2/TYK2, STAT1/3, SOCS1 genes, and induced proinflammatory cytokines in chicken immune cells. Collectively, these results indicate that chIL-23 is a member of the IL-12 family, has proinflammatory properties related to IL-23R and IL-12Rβ1 receptor expression, and activates the JAK-STAT signaling pathway that results in the interaction of chIL-23α with chIL-12p40 to form the novel chIL-23 complex. In the third chapter, I represent the description of the cloning, structural analysis, and functional characterization of two LILRAs (LILRA2 and LILRA6) in chickens. Multiple sequence alignments and construction of phylogenetic tree of chicken LILRA2 and LILRA6 with mammalian proteins revealed a high conservation between chicken LILRA2 and LILRA6, and a close relationship between chicken and mammalian proteins. The mRNA expression of LILRA2 and LILRA6 was high in HD11 macrophages and the small intestine compared to that in several other tissues and cells tested. To examine the function of LILRA2 and LILRA6 in chicken immunity, LILRA2 and LILRA6 were transfected into HD11 cells. Our findings indicated that LILRA2 and LILRA6 are associated with the phosphorylation of Src kinases and SHP2 that play a regulatory role in immune functions. Moreover, LILRA6 associated with and activated MHC class I and β2-microglobulin, and induced the expression of transporters associated with antigen processing, but LILRA2 did not. Furthermore, both LILRA2 and LILRA6 activated JAK-STAT, NF-κB, PI3K/AKT, and ERK1/2 MAPK signaling pathways, and induced Th1-, Th2-, and Th17-type cytokines, and toll-like receptors. Taken together, this study indicates that LILRA2 and LILRA6 are essential for macrophage mediated immune responses, and they could be useful as potential therapeutic proteins in chickens. In last fourth chapter, I will describe the cloning of chicken IL-11 (chIL-11) and the function of the chIL-11 in birds. Multiple alignments of chIL-11 with other known IL-11 amino acid sequences revealed regions of amino acid conserved. The homologies of chIL-11 protein to mammals and fishes ranked between 52-53% and 22-24%, respectively. These results demonstrated that chIL-11 are functional ligands for the IL-11RA and IL-6ST in chicken HD11 and OU2 cell lines. I also showed that chIL-11 activated and regulated of JAK-STAT, NF-κB, and MAPK signaling pathways in chicken cell lines. Additionally, chIL-11 inhibited nitric oxide production and affect cell proliferation in both cell lines. Moreover, chIL-11 acts to inhibit Th1/Th17 production as well as IL-26, IL-12, and IL-17A-induced IFN-γ production and enhances Th2 (IL-4 and IL-10) production in cell culture model. The ability of chIL-11 to modulate cytokine production from activated HD11 and OU2 cells provides a mechanism through which chIL-11 may as anti-inflammatory and reduce inflammatory injury. As a result, it suggests that the functions of chIL-11 expression through by binds IL-11RA and IL-6ST and activates the JAK-STAT, NF-κB, MAPK signaling pathway, modulates cytokines expression and indicating a role of chIL-11 in innate and adaptive immune system. Based on these results, I suggested a key role of IL-26, IL-23, LILRA2, LILRA6 and IL-11-induced the immune responses and might use for therapeutic approaches combination with molecules that activate immune cells via activation JAK-STAT, NF-κB, and MAPK signaling pathways. 닭의 면역유전자는 다양한 병원균, 바이러스, 곰팡이로부터 숙주를 보호하는 역할을 한다. 이번 연구에서, 나는 새로운 닭의 면역 유전자를 클로닝 하였으며 그 특성을 규명하였다. 첫 번째 장은 interleukin-10 cytokine family 중의 하나인 IL-26에 대한 연구이다. 이번 연구를 통하여 chicken IL-26(chIL-26)은 닭의 T cell에서 proinflammatory cytokine 생성을 유도하는 역할을 밝혀내었다. chIL-26의 cDNA는 82 아미노산을 coding하며, 아미노산 서열은 다른 인간, 카나리아, 돼지에서 각각 22.63%, 43.15%, 46.31%의 상동성을 보였다. 나는 또한, 닭의 T (CU91), macrophage (HD11), and fibroblast (OU2) cell lines에서의 chIL-26의 signal transduction pathway를 연구하였다. chIL-26은 JAK과 TYK2의 phosphorylation을 일으키고, tyrosine/serine residue를 통하여 STAT1, STAT3, SHP2 활성화하는 역할을 보였다. chIL-26은 NF-κB signaling pathways의 중요 부분인 NF-κB1, TAK1, and MyD88 kinase의 phosphorylation 일으키는 특징을 보였다. chIL-26은 chemokines (CCL4, CCL20, and CXCL14), Th1 (IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-1β, and IL-6), Th2 (IL-4 and IL-10), Th17 (IL12-p40, IL-17A, and IL-17F), Treg cytokines (TGF-β4)의 mRNA 발현을 활성화 하였다. 두 번째 장은 chicken IL-23p19 (chIL-23α)의 클로닝과 IL-23 complex의 기능에 대한 연구이다. chIL-23α과 다른 종의 아미노산 서열을 multiple alignment한 결과, 보존된 아미노산 서열 부분을 확인할 수 있었다. chIL-23α은 4개의 exon과 3개의 intron으로 구성되어 있는데, 이것은 사람 및 쥐와 비슷한 구성을 나타낸다. 또한 bioinformatics tool을 이용하여, NF-κB, C/EBPα-β, c-Jun, c-Rel, AP-1, GATA-1, ER 과 같은 다양한 transcription factor가 chIL-23α과 관련되어 있는 것을 확인하였다. chIL-23α은 IL-23R, IL-23Rβ1 receptor와 연관되어 있으며, 이것을 통해 면역세포에서 STAT1/3, SOCS1 유전자와 proinflammatory cytokine 발현을 유도하였다. 세 번째 장에서, 나는 닭의 LILRA2와 LILRA6에 대한 cloning과 특성을 연구하였다. Multiple sequence alignment와 계통수 분석을 통하여 닭의 LILRA와 다른 포유동물 간의 높은 유사성을 확인할 수 있었다. HD11 cell에 LILRA2와 LILRA6을 transfection 함으로서 우리는 LILRA2와 LILRA6이 면역 기능에서 중요한 역할을 하는 Src kinase와 SHP2를 인산화 한다는 것을 밝혀 내었다. LILRA6은 MHC class I 과 β2-microglobulin을 활성화 하는 역할을 가지며, antigen processing과 관련된 transporter의 발현을 유도하는 기능을 나타내었다. 또한, LILRA2와 LILRA6 모두 JAK-STAT, NF-κB, PI3K/AKT, ERK1/2 MAPK signaling pathway를 활성화하는 역할을 보였다. 네 번째 장에서는 chicken IL-11(chIL-11)의 cloning과 chIL-11의 기능을 밝히는 연구이다. chIL-11과 다른 종의 IL-11의 아미노산 서열을 비교한 결과, conserved된 부분을 확인할 수 있었다. chIL-11 연구를 통해 chIL-11이 HD11과 OU2 cell line에서 IL-11RA와 IL-6ST와 결합을 한다는 것을 알 수 있었다. 또한, chIL-11이 chicken cell line에서 JAK-STAT, NF-κB, MAPK signaling pathway를 활성화한다는 결과를 얻었다. chIL-11은 Th1/Th17 cytokine 생성과 IL-26, IL-12, IL-17A-induced IFN-γ 생성을 저해 하는 역할을 보였으며, Th2 cytokine 생성을 증가시켰다. 마지막으로, 이번 연구를 통하여 나는 IL-26, IL-23, LILRA2, LILRA6, IL-11의 JAK-STAT, NF-κB, MAPK signaling pathway를 통한 면역작용에서의 역할을 규명하였으며, 이를 통해 새로운 치료제 계발에 큰 도움을 줄 수 있을 것으로 생각한다.

닭도체 개체관리를 위한 온라인 도계 품질등급 자동화 및 안전성 확보 연구

조성호 성균관대학교 일반대학원 2011 국내박사

수입자유화 이후 외국에서 생산된 농·축산물의 수입이 급증하고 있다. 그러나 질이 낮은 수입산이 국산으로 둔갑하는 일이 자주 발생하면서 농·축산물의 신뢰도 및 판로에 부정적인 영향을 미쳐왔다. 이에 농·축산물의 생산이력관리에 대한 필요성이 커지고 있다. 닭도체 가공공정은 등급판정 관련 공정을 제외하고 대부분의 공정이 기계화 자동화되어 있다. 현재, 등급판정 공정은 단순한 중량측정 공정으로 대체되어 있는 실정이다. 초당 처리 도계의 수가 2&#12316;3마리 정도이며 닭도체 사육농가에 대한 정확한 구분이 전혀 시행되고 있지 않다. 본 연구에서는 닭도체의 가공 및 제품의 생산에 있어서 생산이력과 품질이력을 관리하기 위한 기초 연구로써 가공현장에서 닭도체의 품질등급을 실시간으로 판정할 수 있는 알고리즘을 개발하였고 프로토타입 시스템을 구축하였다. 닭도체 온라인 품질 등급판정 시스템은 프로그래시브 칼라 컴퓨터시각 시스템을 구축하여 닭도체의 다양한 외관품질 인자(닭도체 부위분활, 피멍검출, 날개 탈골, 이상 체형 등)를 비접촉, 비파괴적 방법으로서 실시간으로 자동 계측하는 알고리즘을 개발하였고 결과를 검증하였다. 샘플시료 부위 분활, 피멍 검출, 날개탈골 각각 78, 60, 30샘플에 대하여 알고리즘을 시험한 결과 모두 성공적인 결과를 보였으며 평균 처리속도는 0.25초였다. 닭도체의 2차원 투영영상과 3개 라인의 Non-Gaussian 레이저 구조광에 의한 닭도체 입체 정보의 조합을 통해 닭도체의 중량을 추정할 수 있는 14개의 독립변수로부터 SPSS로 분석 결과를 토대로 4개의 변수를 선정하였다. 이들 4개 변수에 대하여 닭도체의 중량 추정 다중 선형회귀식 모델을 개발하였고 이를 검증하였다. 닭도체 중량 결정계수가 0.960으로 나타났으며, 31개의 검증 셋을 이용하여 다중 회귀방정식 검증 결과 닭도체 중량 최대 상대 오차는 8.8%으로 나타났다. RFID 태그와 닭도체 색인장치를 구축하여 닭도체의 사육농가별 수율 그리고 품질 및 생산이력을 관리할 수 있도록 하였다. 본 시스템은 닭도체의 도계에서부터, 가공, 출하에 이르는 전 과정을 컴퓨터 시스템에 RFID 태그로부터 입력받아 관리된다. 이에 사용자가 원하는 정보를 언제 어디서든지 인터넷을 이용하여 출하이력에 관한 내용을 제공할 수 있도록 하였다. RFID 태그를 활용한 닭도체 통합 생산관리 소프트웨어를 개발하여 닭도체의 중량, 품질판정 결과 등이 개체별로 저장 관리되도록 하였다. These days, the amount of imported foreign agricultural produce has been increased rapidly. However, the imported low quality agricultural produce was deceived frequently as high quality home produce during the distribution process. As a result, home produce had negative credibility and had difficulty in expanding its marketing channel. Nowadays consumer market greatly requires the traceability system of the agricultural produce for the home made and imported ones. Processes of chicken carcass has been mechanized and even automated except quality grading part. Weight evaluation process is the only quality measurement stage at this time. Chicken processing companies in Korea has many farm suppliers of live chickens. Once live chickens were processed as chicken products, the processing company could not identify the corresponding farm to the chicken products. And the processing speed of chicke carcass was 2~3 chickens per second. As a fundamental research to manage the traceability of the production and quality of chicken carcass, real time image processing algorithms were developed and the prototype was built for the quality grade evaluation of chicken carcass at the processing site. On-line real time quality grade system was composed of the progressive color computer vision system with high frequency fluorescent lamp, RFID reader and tags installed to the shackle, 3-line non-Gaussian laser structured lighting with color camera, and system controller. Color image processing algorithm for the segmentation of chicken carcass into 5 parts such as left and right wings, left and right legs, and trunk was developed. Algorithms for bruise detection, dis-articulation of wing, and abnormal shape of trunk were also developed as non-contact and non-destructive methods. Algorithms were verified using 78, 60, and 30 samples of chicken carcass and showed successful results. And average processing speed to determine whole three features was 0.25 sec. Two dimesional projective image and structured lighting image acquired from the three non-Gaussian laser lines were analyzed. According to the results of SPSS analysis, four variables were selected among 14 independent variables related to the volumetric information of chicken carcass. Multi-regression model for the weight estimation from the image information was developed and verified. The model showed 0.96 of coefficient of weight determination. Thirty one sets were used for the verification and the maximum relative weight error was 8.8%. RFID tag and reader and electro-pneumatic chicken marker were set-up for the proto-type on-line quality grading and production traceability system. RFID tag installed to the individual shackle stores various informations such as quality factors, producer and farm information, meat production ratio of farm. The integrated management software of an individual chicken carcass was developed and consumer can get the information of chicken product in a ubiquitous manner.

Studies on Modulating Chicken Host Factors of Influenza A Virus through CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing

우승제 서울대학교 대학원 2022 국내석사

Influenza A Viruses (IAVs) cause severe pandemic diseases in poultry industry worldwide with enormous economic loss and some types of IAVs can even infect humans, which raised huge concerns about their influence on human society. Currently, both vaccination and drug-based therapies targeting viral protein have provided the efficient strategy to prevent and control IAV infection. However, new types of IAVs frequently emerge, forcing to develop novel vaccine and drug to confront newly evolved viruses. In the meantime, IAVs must utilize host cellular factors to successfully complete their lifecycle. Therefore, modifying interaction network between host factors and viruses could be an alternative strategy to control IAV replication and growth, overcoming disadvantage of vaccination and drug treatment. In addition, avian genome editing technology through clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system has enabled to precisely modify host factors used by IAV. Collectively, the precise modification of host factors of IAV is one of the promising solutions for development of avian cell-originated vaccine and IAV-resistant chicken. In the first study, I engineered chicken melanoma differentiation associated protein 5 (cMDA5) to function like retinoic acid inducible gene-I (RIG-I) which is absent in chicken. The RIG-I, MDA5 are members of RIG-I like receptors (RLRs) family. Although much of the structure is well-conserved between MDA5 and RIG-I, C-terminal domain (CTD) structure of both proteins showed distinct feature, which explains different preference of recognizing RNA ligands. Especially, RNA binding loop of RIG-I plays major role in sensing blunt end including 5’ triphosphate moiety (5’ppp) while that of MDA5 is disordered and MDA5 CTD recognizes double stranded RNA (dsRNA) stem rather than end. Although cMDA5 senses IAV to partially compensate for the loss of RIG-I, chickens are much more susceptible than waterfowl species which possess RIG-I. In this study, I engineered cMDA5 molecule to harbor CTD of RIG-I (cMDA5-RIG-I CTD) and compared its function in recognizing RNA ligands with wild type cMDA5. I also mutated cMDA5 histidine 925 (H925) into phenylalanine (F) (cMDA5 (H925F)), which is critical residue of RNA binding loop to recognize blunt end of dsRNA. I expressed wild type cMDA5 or cMDA5-RIG-I CTD in cMDA5 knock out DF1 cells and found that cMDA5-RIG-I CTD induced significantly higher interferon beta (IFN-β) activity and induced even higher IFN-β activity in response to RNA ligands than wild type cMDA5. cMDA5 (H925F) induced higher IFN-β activity than wild type cMDA5 when stimulated by RNA ligands. In addition, expression of cMDA5-RIG-I CTD and cMDA5 (H925F) induced higher interferon beta and related gene expression when stimulated by RNA ligands. Finally, I expressed engineered cMDA5 (H925F), cMDA5-RIG-I CTD or wild type cMDA5 in cMDA5 knock out DF1 cells and challenged with IAV infection. The results showed that cMDA5-RIG-I CTD reduced 10-folds lower IAV titer than wild type cMDA5. Collectively, this study enhanced function of cMDA5 and likely contributed to developing IAV-resistant chicken by increasing innate immunity against viral infection. In the second study, I focused on non-immune related host factors studied in mammalian system and validated its function in avian system. In mouse and human, it was reported that fragile X mental retardation protein (FMRP), key regulator to prevent fragile X syndrome (FXS), stimulated IAV ribonucleoprotein (vRNP) assembly and export vRNP from nucleus to the cytoplasm. However, its role as a host factor of IAV in chicken system was poorly understood. To investigate chicken FMRP translational regulator 1 (cFMR1) function, I precisely disrupted cFMR1 gene in DF1 cells through CRISPR/Cas9. After expanding cFMR1 knock out clones, IAVs were infected into cFMR1 knock out clones. The results showed that cFMR1 did not affect viral progeny production and did not support viral polymerase activity at 24 hours post infection (h.p.i). When cFMR1 was overexpressed to rescue its function, viral titer was not significantly changed compared to control. However, disruption of cFMR1 significantly reduced viral gene expression at 3 and 6 h.p.i., indicating that cFMR1 only supported viral transcription in an early time during viral life cycle. Therefore, unlike human or mouse, cFMR1 did not play crucial role in IAV but only promoted viral gene expression in an early stage. This study implied that IAV-avian host factor interaction network is distinct from that of mammals and such difference should be carefully considered when designing anti-viral strategy in chicken system. Based on these researches, I demonstrated that precise genome editing mediated by CRISPR/Cas9 of host factors such as MDA5 and FMR1 could restrict or promote the growth of IAVs in the chicken system. These findings suggest that modifying host factors of IAVs is efficient strategy to control IAV infection. This study can be applied to developing avian cell-derived vaccine and avian influenza virus (AIV)-resistant chicken model, which provides novel solution to seasonal AIV outbreak. 인플루엔자 A 바이러스 (Influenza A virus)는 조류 인플루엔자 바이러스의 원인 병원체로 잦은 빈도로 돌연변이가 발생하는 RNA 바이러스이다. 특히, 조류 인플루엔자 바이러스는 가금류 뿐만 아니라, 인간을 포함한 포유류를 감염 시키는 돌연변이가 보고되어 인류 보건에도 큰 위협을 가하고 있다. 기존에는 바이러스의 증식을 제어하기 위해 바이러스 단백질 및 유전자를 조절하여 항 바이러스성 치료제를 개발하거나 백신을 개발하였으나 돌연변이 바이러스에는 기존의 치료제 및 백신이 효율이 떨어진다는 문제점이 존재한다. 이러한 단점을 극복하기 위해, 최근에는 바이러스가 이용하는 숙주 인자를 조절하여 바이러스의 증식을 조절하는 방안이 고안되었다. 하지만 규명된 숙주 인자들은 주로 포유류에서 연구되어 온 것들로, 조류 인플루엔자의 주요 숙주인 닭의 숙주 인자는 많이 연구되어 오지 않았다. 조류 인플루엔자를 비롯한 가금 질병을 효율적으로 제어하기 위해서는 바이러스와 상호작용하는 조류 숙주 인자의 발굴 및 이에 대한 기능의 검증이 이루어져야 한다. 본 연구에서는 첫번째로 닭MDA5에 RIG-I의 C 말단 도메인 (C-terminal domain, CTD)을 붙여 닭 면역 반응을 증진시켰다. MDA5와 RIG-I은 RIG-I 유사 수용체 (RIG- I like receptor) 단백질 족에 속하며, 두 단백질 모두 바이러스 RNA를 인지한다. 특히, 두 단백질에는 CTD가 존재하는데 이 도메인이 바이러스 RNA와 상호작용하는데 중요한 역할을 한다. 비록 MDA5, RIG-I CTD의 구조는 비교적 잘 보존되어 있으나, RIG-I의 RNA binding loop는 바이러스 RNA의 말단 5’삼 인산기 (5’ppp)를 인지하지만 MDA5의 RNA binding loop는 5’ppp를 인지하지 못하고 RNA 리간드 (ligand)의 중간 부분에 붙어 바이러스를 인지한다. 따라서 인플루엔자 바이러스는 주로 RIG-I에 의해 인지된다. 한편, 닭에는 RIG-I이 존재하지 않고 MDA5만 존재하여 RIG-I을 가지고 있는 오리 등에 비해 조류 인플루엔자 바이러스에 취약하다. 따라서 본 연구에서는 닭 MDA5의 CTD를 제거하고 사람이나 오리의 RIG-I CTD를 붙인 닭 MDA5 키메라를 개발했다. 닭 MDA5/RIG-I CTD는 RNA 리간드와 더 높은 친화도를 가지고 상호작용할 것으로 예측되고, 야생형 닭 MDA5에 비해 RNA 리간드 및 인플루엔자 A 바이러스에 반응하여 유의적으로 높은 면역 활성을 보였다. 또한, RIG- I CTD와 5’ppp RNA 말단과의 상호작용에 중요한 역할을 하는 RNA binding loop의 페닐알라닌 (Phenylalanine, F)으로 925번째 히스티딘 (Histidine, H)을 치환 시켰을 때 닭 MDA5의 활성이 유의적으로 높아졌다. 마지막으로, 닭 MDA5/RIG-I CTD는 야생형 닭 MDA5 에 비해 유의적으로 바이러스 역가를 감소시켜 닭 MDA5/RIG-I CTD 를 닭 체내에 도입시켜 조류 인플루엔자 바이러스에 저항성을 갖는 닭 개발에 이용될 수 있을 것으로 생각된다. 두번째 연구에서는 포유류에서 인플루엔자 A 바이러스의 촉진 인자로 알려진 FMRP 의 기능을 닭에서 검증하는 것에 대한 것이다. FMRP는 본래 Fragile X syndrome (FXS)라는 정신병의 원인 유전자로 FXS는 FMR1 유전자의 5’비 번역 부위 (untranslated region, UTR)에 CGG 반복 서열이 200 개 이상일 때 과도한 메틸화가 진행되어 유전자 발현이 줄어들어 발병한다. FMRP에는 KH1, KH2, RGG box 라는 3 개의 RNA binding 도메인이 존재하여 뇌의 뉴런 (neuron) 신호 전달에 필요한 유전자의 messenger RNA (mRNA)에 붙어 발현을 조절한다. 또한 FMRP에는 핵 내 유도 신호 시퀀스 (Nuclear leading sequence, NLS), 핵 외 유도 신호 시퀀스 (Nuclear export sequence, NES)가 존재하여 FMRP 에 붙은 mRNA를 핵에서 세포질로 운송하는 역할도 수행한다. 인플루엔자 A 바이러스는 이러한 특징을 이용하여 바이러스 NP와 FMRP의 상호작용을 유도하여 바이러스 리보핵산단백질 (viral ribonucleoprotein, vRNP)의 조립을 돕고 vRNP를 핵 내에서 세포질로 운송하여 증식한다. 따라서 포유류에서는 FMRP가 인플루엔자 A 바이러스의 촉진 인자로 알려져 있다. 하지만, 닭 FMRP의 숙주인자로서의 기능은 연구되지 않아 포유류의 경우처럼 FMRP를 항 바이러스성 치료제의 목표 단백질로 선정하거나 해당 유전자의 조류 인플루엔자 바이러스 숙주 인자로의 효용성을 판단하기 어려운 문제점이 있다. 따라서 본 연구에서는 CRISPR/Cas9 유전자 가위를 통해 닭 FMR1 유전자를 제거한 DF-1 세포 주를 개발했다. 닭 FMR1 유전자가 제거 됐음에도 불구하고 바이러스 중합 효소 활성 및 바이러스 역가는 유의적인 변화가 없었다. 또한, 닭 FMR1 이 제거된 DF-1 세포 주에 야생형 닭 FMR1 유전자를 발현했음에도 불구하고 유의적인 바이러스 역가 증가가 나타나지 않았다. 하지만, 닭 FMR1 유전자가 제거되었을 때, 바이러스 감염 후 6시간 때 바이러스 M2 유전자 발현이 감소했다. 이러한 감소 효과는 감염 후 9시간부터 줄어들다가 감염 후 12시간 때부터는 사라졌다. 이를 통해 닭 FMRP는 포유류의 것과는 달리 바이러스 생활사 초기에 바이러스 유전자 발현을 촉진하는 기능을 한다는 것을 알 수 있고, 해당 유전자는 조류 인플루엔자 바이러스 조절을 위한 숙주인자로서의 효용성은 낮다고 생각된다.

Protein Induced Differentiation into Male Germ Cell Lineage from Chicken Fetal Bone Marrow Stem Cells : 단백질을 통한 닭의 골수 유래 줄기 세포의 웅성 생식 세포로의 분화 연구

JU MI YOO 건국대학교 대학원 2012 국내석사

Bone marrow (BM)-derived stem cells are capable of differentiation into multilineage cells like muscle, bone, cartilage, fat, and nerve cells. In this study, we investigated the capability of BMCs into germ cell differentiation in the chicken. Chicken BMCs were isolated day 20 fertilized fetal chicken femurs. Isolated cells were cultured in advance Dulbecco’s modified eagle medium (ADMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 1% penicillin/streptomycin. Once confluent, cells were subcultured until four passages. The cultured cells showed fibroblast-like morphology. Expressions of pluripotent genes were studied. Three different induction methods were conducted to examine the ability of differentiation into male germ cells. In group 1, BMCs were cultured in ADMEM containing retinoic acid (RA). In group 2, BMCs were permeabilized by chariot™ delivery reagent and treated with chicken testis extracts. In group 3, BMCs were permeabilized by chariot™ delivery reagent, treated with chicken testis extracts and cultured in ADMEM with RA. It was found that chicken BMCs had a positive expression of Sox2 and a small population of chicken BMCs seem to differentiate into male germ cell cells. These cells had the positive expression of early germ cell markers and male germ-cell-specific markers as analyzed by reverse transcriptase-polymerase chain reaction and immunocytochemistry. These results demonstrated that chicken BMCs may differentiate into male germ cells and chicken testis extract also induced germ cell differentiation like RA. The germ cell differentiation could be used as a potential source for production of transgenic chickens.

Studies on Chicken Bioreactor Verification and Transcriptome Analysis

심지현 서울대학교 대학원 2022 국내석사

Chicken bioreactor is optimal system for production of recombinant protein because it has a lot of valuable advantages including relative short generation compared to other animal bioreactors, abundant egg white protein in a single egg (~4g per egg), low complexity of egg white protein, which is of help for ease purification of exogenous protein, cost-effectiveness and genetic stability to succeed to next generation. More importantly, post-translational modification (PTM) process is possible and glycosylation pattern is similar to that of human, which is critical aspect in therapeutic protein efficacy. Due to these characteristics, chicken bioreactor system has been gone through great improvement until now. In past, virus-mediated and transposon-mediated transgenesis system were actively used. However, with advent of clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system, precise gene targeting has become possible. Moreover, non-homologous end joining (NHEJ) or homology-directed repair (HDR)-mediated gene insertion using CRISPR/Cas9 system has allowed recombinant protein to be produced in targeted gene. Especially, Ovalbumin (OVA) gene has been preferred because OVA shows specific expression in magnum portion and OVALBUMIN protein is the most abundant one among the egg white proteins consisting over 50% of total egg white protein. In the first study, I successfully generated EGFP knock-in chicken (OVA EGFP KI) by CRISPR/Cas9-mediated NHEJ at the OVA gene locus. However, in chicken bioreactor system, the verification of exogenous protein is possible when G1 transgenic chickens lay eggs, which takes approximately 18 months, from production of G0 germline chimera to generation of G1 hen and finally to reaching to sexual maturation of the transgenic chicken. Compared to cell-based bioreactor, which is possible to verify at each step; from the introduction of exogenous genes and expansion of host cells, to the identification isolation and purification of foreign proteins, the verification period of chicken bioreactor system is time consuming and inefficient. To solve this problem, I subsequently inserted diethylstilbestrol (DES) pellet, known as estrogen analog, in 7-day-old young chick for 10 days to induce OVA expression artificially. Because estrogen induces the proliferation and differentiation of immature chick oviduct, DES increases the expression level of Ovalbumin with development of the oviduct. This strategy allows the confirmation of exogenous protein expression at 3 weeks of age. Furthermore, we confirmed the exogenous protein expression in oviduct and eggs from OVA EGFP KI hen. Therefore, we successfully shortened the exogenous protein verification period in chicken bioreactor. However, high exogenous protein expression in KI eggs results in unexpected phenomenon, such as sterility of G1 hen, diminished egg size and reduced egg white protein concentration. Further research is needed to know how exogenous protein production affects the level of other egg white protein. Collectively, in this study, I confirmed this sequential target protein verification system makes it possible to verify the exogenous protein expression in a very shortened time and I hope this system could be applied to chicken bioreactor for the production of therapeutic proteins and its evaluation including efficacy and toxicity testing in advance. In the second study, I focused on how high exogenous protein expression affects egg white protein concentration. In this study, I used two chicken bioreactor models; one is OVA EGFP KI, which showed high productivity in exogenous protein, and the other is OVA IgG KI, which showed low productivity in it. Although these two chicken bioreactors were generated through similar transgenesis system, OVA targeted exogenous gene insertion via NHEJ-mediated KI using CRISPR/Cas9 system, they showed significant difference in exogenous protein and also in egg white protein concentration. I performed transcriptome analysis of DES-treated OVA EGFP KI, OVA IgG KI and wild type (WT) through RNA sequencing. As a result, a lot of differentially expressed genes (DEGs) were identified and annotated into various gene ontology (GO) terms. Among them, GO terms including response to estrogen, cellular protein modification process and protein transport were showed opposite fold change in OVA EGFP KI and OVA IgG KI, meaning a lot of DEGs were significantly decreased in OVA EGFP KI compared to WT but increased in OVA IgG KI compared to WT. This study implied that high concentration of exogenous protein may affect response to estrogen, cellular protein modification process and protein transport, resulting in significant decreased in egg white protein concentration in OVA EGFP KI but slightly increased in egg white protein concentration in OVA IgG KI. Based on these studies, I demonstrated that exogenous protein verification period could be tremendously shortened via 10 days of DES treatment in 7-day-old chick, and this strategy could be applied to other chicken bioreactor system arousing effectiveness in time and economy. Also, I found that high exogenous protein level may disturb response to estrogen and subsequently affect to egg white protein synthesis and transport. 닭 생물 반응기 시스템은 다른 동물 생물 반응기 시스템에 비해 상대적으로 짧은 세대 간격, 달걀 1개 당 약 4g의 풍부한 단백질함량, 난백 단백질 조성의 낮은 복잡성으로 정제의 용이성, 경제적 효율성 그리고 다음 세대로 계승되는 유전적 안정성 등의 수많은 가치 있는 장점들을 포함하기 때문에 재조합 단백질 생산에 있어 최적의 시스템이다. 더욱 중요한 것은 번역 후 수정 (post-translational modification) 과정이 가능하고 글라이코실화 (glycosylation) 패턴이 사람과 유사하다는 것인데, 이런 특징은 치료 단백질 효능을 결정하는 데 중요한 측면이다. 이렇듯 다양한 가치 있는 특성으로 인해 닭 생물 반응기 시스템은 지금까지 큰 발전을 거쳐왔다. 과거에는 바이러스 매개, 트랜스포존 (transposon) 매개 트렌스제네세스 (transgenesis) 시스템이 활발하게 이용되어 왔다. 하지만 CRISPR/Cas9 시스템의 출현으로, 정확한 유전자 표적이 가능해졌다. 또한 CRISPR/Cas9 시스템을 사용한 비상동성 말단 결합 (NHEJ) 또는 상동재조합 (HDR) 매개 유전자 삽입은 표적 유전자에 재조합 단백질을 생성할 수 있게 하였다. 특히 오브알부민 (ovalbumin) 유전자는 닭의 난관의 메그넘 (magnum) 부위에 특이적인 발현을 보이고, 난백 단백질 중 가장 풍부한 단백질로 알려져 있기 때문에 표적 유전자로서 선호되어 왔다. 본 연구에서는 첫번째로 비상동성 말단 결합 (NHEJ)를 매개CRISPR/Cas9 시스템을 활용하여 오브알부민 유전자 좌위에 EGFP 유전자가 삽입된 닭 (OVA EGFP KI)을 성공적으로 생산하였다. 하지만 닭 생물 반응기 시스템에서 외인성 단백질의 검증은 G1 트렌스제닉 닭이 알을 낳을 때 가능하며, 이는 G0 생식선 키메라의 생산에서 G1 암탉의 생산 그리고 성성숙에 도달하기까지 약 18개월이 걸린다. 외인성 유전자의 도입과 숙주세포의 확장에서부터 외인성 단백질 분리 및 정제가 각 단계마다 가능한 세포 매개 생물 반응기 시스템에 비교하였을 때, 닭 생물 반응기 시스템에서의 외인성 단백질의 검증은 시간이 많이 소요되고 비효율적이다. 따라서 이러한 문제를 해결하고자 본 연구에서는 에스트로겐 유사체인 디에틸스틸베스트롤 (DES)를 7일령의 어린 병아리에 열흘 간 처리하여 ovalbumin의 발현을 인위적으로 유도하였다. 에스트로겐이 미성숙한 병아리의 난관의 증식과 분화를 유도하기 때문에, DES는 난관의 발달과 함께 ovalbumin의 발현을 유도하였다. 이러한 전략으로 외인성 단백질의 검증이 약 3주령의 병아리에서 가능하게 됐다. 더 나아가 우리는 OVA EGFP KI 성축의 난관과 달걀에서 외인성 단백질의 발현을 확인하였다. 그러므로 본 연구를 통해 닭 생물 반응기 시스템에서의 외인성 단백질의 검증 기간을 효과적으로 단축시켰다. 하지만 달걀에서 외인성 단백질의 높은 발현 수준은 G1 암탉의 불임, 달걀 크기의 감소 그리고 난백 단백질 함량의 감소를 야기하였다. 이런 예상치 못한 결과에 대해서는 추가적인 연구를 통해 외인성 단백질의 높은 수준의 발현이 다른 단백질의 발현 수준에 어떻게 영향을 하는지 밝힐 필요가 있다. 종합적으로, 본 연구에서는 순차적인 표적 단백질 검증 시스템으로 외인성 단백질의 발현 검증을 짧은 시간 내에 가능하다는 것을 밝혔다. 이 시스템을 앞으로 다른 닭 생물 반응기 시스템에 적용을 시켜 외인성 단백질의 효율적인 검증이 가능하기를 바라고 특히 치료용 단백질 생산을 할 때, 그것의 효능과 독성 테스트 등을 사전에 해 볼 수 있는 좋은 시스템으로 발전하길 바란다. 두번째 연구는 외인성 단백질의 높은 발현 수준이 어떻게 난백 단백질의 농도에 영향을 끼치는지에 초점을 맞추어 진행하였다. 연구를 위해 두 종류의 닭 생물 반응기 시스템모델이 사용되었다. 첫번째 모델은 첫번째 연구에서의 OVA EGFP KI 모델로 외인성 단백질이 높게 발현을 하였다. 두번째 모델은 OVA EGFP KI 과 비슷한 방식으로 생산된 닭 생물 반응기로서 인간 단일 항체를 생산하고 외인성 단백질이 낮게 발현하는 것이 특징이다 (OVA IgG KI). 첫번째 연구와 비슷한 방식으로 7일령의 병아리에 DES를 20일간 처리하여 인위적으로 난관 발달을 유도하였다. 그 중 magnum 부위를 채취하여 RNA sequencing을 통한 전사체 분석을 진행하였다. 그 결과 많은 차등 발현 유전자 (differentially expressed genes, DEGs) 와 유전자 온톨로지 (gene ontology, GO) 가 확인이 되었다. 그 중에서 에스트로겐에 대한 반응 (response to estrogen), 세포 내 단백질 변형 과정 (cellular protein modification process), 단백질 수송 (protein transport)에 속한 DEGs의 발현 배수 (fold change)가 OVA EGFP KI 과 OVA IgG KI에서 반대의 양상을 보였다. 즉, OVA EGFP KI 과 야생형(wild type, WT)을 비교를 하였을 때, 대부분 DEG가 downregulation 되었지만, OVA IgG KI 과 WT를 비교하였을 때는 반대로 많은 DEG가 upregulation 된 것을 확인하였다. 한편 난관에서 난백 단백질의 합성은 에스트로겐에 의해 조절된다고 알려져 있다. 따라서 이를 종합하여 봤을 때, OVA EGFP KI 에서는 에스트로겐에 대한 반응 수준이 떨어져 난백 단백질 합성이 저해된다고 볼 수 있고, 세포 내 단백질 변형 과정과 단백질 수송에 대해서도 그 수준이 WT 보다 낮다고 볼 수 있다. 반대로 OVA IgG KI 에서는 에스트로겐에 대한 반응 수준이 높기 때문에 난백 단백질 합성 또한 야생형에 비해 활발할 것이다고 유추할 수 있고 세포 내 단백질 변형 과정과 단백질 수송 능력 또한 WT에 비해 활발하다고 결론 지을 수 있다. 이런 차이는 자연적으로 성숙한 두 모델의 난백 단백질 함량 및 조성에서 또한 극명한 차이를 보였다. 따라서 본 연구를 통해 외인성 단백질이 높게 발현을 하고 있을 경우 이는 에스트로겐에 대한 반응을 방해하고 결과적으로 난백 단백질의 합성과 수송에 영향을 주는 것을 확인하였다.

Molecular Characterization of Avian Interleukin-17 Gene and its Promoter Region : 가금의 인터류킨-17 유전자와 프로모터 지역의 분자생물학적 특성 분석

유정미 경상대학교 대학원 2012 국내박사

Interleukin-17 (IL17)은 CD4+ T cell로부터 분화되는 Th1, Th2와 다른 새로운 T helper cell lineage로 규명된 Th17 cells 로부터 생성되는 proinflammatory cytokine이다. IL17은 CTLA-8 (cytotoxic T lymphocyte-assosicated antigen) 또는 IL17A라고 불리며, IL17 family에는 IL17A-F까지 총 6종이 포함되어있다. 또 이에 대한 5가지의 receptors (IL-17 RA/RC, RA/RB, RD, RA/RD, RE)가 보고되어 있다. IL17의 기능은 적응면역 시스템과 내재면역 시스템의 사이에서 가교역할을 한다고 보고되어 있다. IL17은 병원체를 인식한 내재면역에서의 IL17은 monocytes 와 γб T cells, NKT cell에서 생성되며, 이는 neutrophils와 granulocytes의 활동을 자극하여 IL6와 PGE2, IL8등에 의해 병원체를 제거하는 과정에 참여하게 된다. 만약 제거에 실패할 경우, TGFβ와 IL6에 의해 Th17 분화가 촉진되며 결국엔 자가면역질환을 유도하게 되는 역할을 수행한다. 자가면역과 관련된 IL17은 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 루프스, 위염, 기관지 천식, 동종 이식편 거부반응 등의 자가면역 질환과 관련이 있으며 또는 Mycoplasma pneumoniae, Toxoplasma gondii, HIV, Eimeria 등에 의한 염증성 질환에 관여하는 주요 사이토카인으로 보고되어 있다. IL17의 amino acid homology를 살펴보았을 때, 대표적인 가금인 chicken의 IL17은 human과 46%, mouse나 rat 과 40%의 상동성을 나타내는 등, 포유류와 37-47%의 유사성을 보이므로, 상용화된 포유류의 IL17 항체를 가금의 IL17 연구에 어려움이 뒤따른다는 것으로 사이토카인의 단백질 발현 등과 같은 면역학적 연구에 대한 접근에 한계가 있다. 본 연구의 제 1장에서는 chIL17의 생물학적 특징을 조사하기 위하여, 세균을 통해 발현된 chIL17의 재조합형 단백질에 대한 6개의 단일클론항체를 확보하여 항체의 특이성을 분석하였다. 항체는 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)를 이용한 재조합형 chIL17 단백질에 특이적으로 결합 반응을 나타내는 것에 한하여 선별하고, 이러한 선별된 단일클론항체들은 western blot analysis에 의해서 분석하였다. ChIL17에 대한 특이적인 단일클론항체들은 CU205의 세포 배양액과 세포 용해물에서 20-21 kDa의 chIL17 단백질을 특징적으로 구분 지었다. 이러한 단일클론항체들은 conconavalin A (Con A)에 의해 자극된 세포의 용해물 내에 존재하는 chIL17에 대해서 특이성을 나타내었지만, 일반 비장세포의 림프구에서는 눈에 띄는 특이성을 관찰할 수 없었다. 뿐만 아니라, 선별된 단일클론항체들은 CU205의 세포 용해물에 N-acteylglusamine transferase의 억제제인 tunicamycin 처리하였을 때 16 kDa의 단백질을 탐지되는 것으로 보아 IL17은 glycosylation되는 것을 확인하였고, CU205의 세포내 단백질에 대한 형광염색을 실시한 유세포 분석을 통해서 단일클론항체의 유효성을 검증할 수 있었다. 나아가 이러한 결과들은 chIL17에 대해서 특이성을 탐지하고, 앞으로 가금의 IL17에 대한 유전자의 구조 및 면역학적 연구들을 수행하는데 유용한 도구로써 이용될 수 있을 것으로 사료된다. 제 2장에서는 Con A에 의해 자극된 오리의 비장 림프구의 cDNA를 5', 3'-RACE와 RT-PCR을 수행하여 1034 bp의 IL17 유전자를 클로닝 하였다. DuIL17 gene은 510 bp의 ORF (open reading frame)의 169 amino acid으로 부호화되며 이는 약 18.8 kDa, 29개의 NH2-terminal signal peptide residues와 하나의 N-terminal glycosylation site, 그리고 포유류의IL17과 일치하는 6개의 cystein residues를 가지고 있음을 확인하였다. 오리 IL17 (duIL17)의 amino acid sequence는 chicken IL17과 84%의 높은 상동성 (homologue)을 확인할 수 있었고, 포유류와 Herpesvirus saimri의 13 (HVS 13)의 ORF과의 상동성은 36-47%임을 확인하였다. DuIL17의 유전학적 구조 성상은 chicken과 mammailian에 상응하는 종(mammailan counterparts)과 매우 유사했다. DuIL17의 mRNA 발현은 RT-PCR을 통해서 정상적인 조직들 (liver, bursa, brain, kidney, lung, thymus, spleen)과 대조되는Con A-자극된 비장 림프구에서만 확인할 수 있었다. 마지막으로chIL17에 대한 단일클론항체 2가지가 indirect ELISA와 western blot analysis를 통해서 duIL17에 대한 교차반응을 나타내는 것을 발견할 수 있었다. 본 연구를 통해 IL17의 단백질 구조가 가금류 사이에서의 매우 보존이 잘되어 있음을 확인할 수 있었으며, 두 개의 단일클론항체를 통해 IL17의 common epitopes를 갖는 특징을 발견하였으며 이는 앞으로의 가금류에서의 IL17에 대한 분자적 및 면역학적 연구에 효과적으로 이용할 수 있을 것으로 사료된다. 제 3장에서는 가금류에서는 처음으로 chicken IL17 (chIL17)의 전사를 조절하는 promoter region을 클로닝 하고, chIL17의 전사개시를 조절하는 cis-acting elements를 포함하는 promoter activity analysis를 통해 이에 대한 분자적 연구를 위한 접근을 시도하였다. chIL17 gene의 promoter로 추정되는 5'-flanking region (약 3.5 Kb)를 T&A vactor에 삽입하여 클로닝 하였고, transcriptional factors의 위치를 TFSEARCH program과 MatInspector system을 이용하여 확인하였다. chIL17 gene의 5'-flanking region을 단계적인 삭제를 통해 총 6개의 유전자 조각 (-3348 ~ -381/+186)을 각각 pGL-3 Basic vector에 제한효소 (Xho I/Hind Ⅲ) 처리를 통해 sub-cloning하였고, 이것을 닭의 세가지 세포 (닭의 lymphoblast cell line, CU205, macrophage cell line, HD11 cells 와 primary culture한 chicken embryonic fibroblast cells)에 pRL-TK 와 pGL-ch17p 시리즈를 co-transfection 실시한 후, Dual-Luciferase reporter assay 실시한 결과를 종합해볼 때 chIL17 gene의 transcription start site (TSS)를 포함하는 5'-flanking region 3.3 Kb의 범위 내에서 5'-flanking region의 약 2 Kb가 삭제된 -1381/+186의 유전자 조각이 특징적으로 luciferase activity를 증가시킴을 확인할 수 있었다. 또한 MatInspector 와 TFSEARCH program을 사용하여 닭과 사람 그리고 쥐의 동일한 유전자 부위의 염기서열의 분석을 실시한 결과, chIL17의 전사를 조절하는 주요 transcriptional factors인 GATA, NF-kap, OCT-1, AP1, RORα, RORγt 그리고 C/EBP 등을 포함하는 많은 transcription factors의 위치를 확인하였다. 그리고 -1381/+186의 유전자 조각이 닭의 세 가지 세포 중에서도 chicken의 CU205에서 empty vector plasmid와 비교했을 때 약 3.3 배 이상의 luciferase activity를 증가시킴을 확인하였다. 이 결과로 chIL17의 전사 개시를 조절하는 중요한 역할을 하는 cis-acting elements가 -1381/+186의 유전자 조각 범위 내에 있음을 추정할 수 있었다. 나아가 확인된 chIL17의 promoter region 범위 내에 존재하는 주요 cis-acting elements의 특징과 기능 분석을 통해 가금의 IL17의 전사 조절을 깊이 있게 이해할 필요가 있을 것으로 사료된다. 본 연구를 통해 가금의 IL17에 대해 특이적으로 반응할 수 있고, 면역학적 분석에 보다 접근이 용이하도록 닭의 IL17에 대한 단일클론항체를 생산하였고 또한, 오리의 IL17 유전자를 닭과 비교하여 분자적 특징을 연구하고자 하였으며, 이러한 IL17의 전사를 조절하는 이 유전자의 프로모터 지역에 대한 연구를 수행함으로써 가금의 IL17에 대한 분자적 및 생물학적 특징에 대한 연구에 보다 유용한 도구로 활용될 수 있을 것이라고 사료된다.