Role of DEWAX2 AP2/ERF transcription factor and SAGL1 E3 ubiquitin ligase in the regulation of cuticular wax biosynthesis in Arabidopsis thaliana

김효진 전남대학교 2018 국내박사

The aerial parts of terrestrial plants are covered with hydrophobic wax layers, which represent the primary barrier between plant cells and the environment and act to protect plants from abiotic and biotic stresses. Although total wax loads are precisely regulated in environmental or organ-specific manner, regulatory mechanisms underlying cuticular wax biosynthesis remain largely unknown. In the present study, I investigated the role of cuticle membrane in the responses of Arabidopsis to oxygen deficiency. TEM analysis showed that the epidermal cells of hypoxia-treated Arabidopsis leaves and stems possessed a thinner electron-translucent cuticle proper and a more electron-dense cuticular layer. A reduction in epicuticular wax crystal deposition was observed in SEM images of hypoxia-treated Arabidopsis stem compared with normoxic control. Cuticular transpiration was more rapid in hypoxia-stressed leaves than in normoxic control. Total wax and cutin loads were decreased by approximately 6–12% and 12–22%, respectively, and the levels of C29 alkanes, secondary alcohols, and ketones, C16:0 ω-hydroxy fatty acids, and C18:2 dicarboxylic acids were also prominently reduced in hypoxia-stressed Arabidopsis leaves and/or stems relative to normoxic control. Genome-wide transcriptome and quantitative RT-PCR analyses revealed that the expression of several genes involved in the biosynthesis and transport of cuticular waxes and cutin monomers was downregulated more than 4-fold, but no significant alterations were detected in the transcript levels of fatty acid biosynthetic genes, BCCP2, PDH-E1α, and ENR1 in hypoxia-treated Arabidopsis stems and leaves compared with normoxic control. Taken together, an increased permeability of the cuticle is closely associated with downregulation of genes involved in cuticular lipid synthesis in hypoxia-stressed Arabidopsis. The present study elucidates one of the cuticle-related adaptive responses that may allow plants to cope with low-oxygen levels. Next, I characterized the Decrease Wax biosynthesis2 (DEWAX2), which encodes an AP2/ERF-type transcription factor that is predominantly expressed in rosette and cauline leaves. Total wax loads were increased by approximately 12 and 16% in rosette and cauline leaves of dewax2, respectively, but were not significantly altered in the stems of dewax2 relative to wild type (WT). The excess wax phenotype of dewax2 leaves was rescued upon expression of DEWAX2 driven by its own promoter. Overexpression of DEWAX2 decreased total wax loads by approximately 15 and 26% in the stems and rosette leaves compared with those of the WT, respectively. DEWAX2:eYFP was localized to the nucleus in Arabidopsis roots and hypocotyls. DEWAX2 possessed transcriptional repression activity in tobacco protoplasts. Transcriptome and quantitative RT-PCR analyses showed that the transcript levels of CER1, ACLA2, LACS1, LACS2, and KCS12 involved in cuticular wax biosynthesis were downregulated in DEWAX2 overexpression lines compared with WT. Transient transcriptional assays showed that DEWAX2 represses the expression of its putative target genes. Quantitative chromatin immunoprecipitation-PCR revealed that DEWAX2 binds directly to the GCC motifs of the LACS1, LACS2, KCS12, and CER1 promoters. These results suggest that DEWAX2-mediated transcriptional repression may contribute to the total wax load in Arabidopsis leaves. To understand the regulatory mechanisms underlying cuticular wax biosynthesis in response to changes in ambient humidity, a Kelch motif-containing E3 ubiquitin ligase, SMALL AND GLOSSY LEAVES 1 (SAGL1) was characterized. SAGL1 controls the stability of ECERIFERUM3 (CER3), a biosynthetic enzyme that is involved in the production of very long chain (VLC) alkanes, which are the major wax components and thereby negatively regulates cuticular wax biosynthesis in Arabidopsis. GUS expression was observed in roots of pSAGL1::GUS plants, but barely detected in their aerial organs. High humidity-induced levels of GUS activity and SAGL1 transcripts were reduced by ABA treatment and water-deficit. SAGL1:eYFP was more stable under relatively high humidity conditions. Disruption of SAGL1 caused increased wax accumulation in stems and leaves. Cytoplasmic SAGL1 physically interacts with CER3 and mediates the CER3 degradation by the 26S proteasome. This study revealed that the SAGL1-CER3 module contributes to the regulation of cuticular wax biosynthesis in above-ground organs of Arabidopsis in response to changes of humidity conditions.

중금속에 의한 식물 뿌리 성장 억제 기전에 관한 연구

김태윤 세종대학교 대학원 2010 국내석사

중금속은 비중 4 이상의 금속 원소의 총칭으로 크롬, 카드뮴, 구리, 아연 등을 포함한 40개의 원소로 구성되어 있고, 자연계에 미량으로 존재할 시에는 생체 내 효소 활성이나 단백질, 핵산의 구조적 안정성에 기여하는 중요한 역할을 담당하고 있다. 그러나 현대 산업화의 발달에 의해 농약이나 살충제의 무분별한 이용, 중금속 광석의 채광 및 공업적 이용과 산업 활동에 의한 유출로 인해 중금속이 특정 지역에 고농도로 축적되어 심각한 공해 현상을 유발하여 자연계에 심각한 위협을 가하고 있다(서영진 등, 2002). 이와 같은 중금속 중에서 우리나라 중금속 오염 토양에 높은 비중을 차지하는 것으로 알려진 비소와 카드뮴을 선별하여 실험을 수행하였다. 2. 비소(As) 비중 4이상의 금속 원소 중 지각에 50번째로 많이 존재하는 원소인 비소(As)는 독성이 강한 중금속으로 토양에 유입되어 농작물 오염과 지하수 오염 등을 초래할 수 있으며 장기적으로 누출 되었을 때 피부, 간, 신장, 폐의 종양세포의 성장을 증가 시키는 발암 줄질로 알려져 있다(Ann, M.B. 2002). 토양에서 발생하는 고농도의 비소(As)는 주로 인간의 산업 활동에 의한 것으로 광산 채광에 의한 배출, 비소 함유 농약 및 산업 폐기물의 살포 등에 의한 것으로 알려져 있다. 한국에서는 1920년대 이후 약 1,000여개의 소규모 금속광산이 채광 되어 그 중 약 760개 정도의 광산이 폐광된 상태로 남아 있다. 이러한 광산의 대 부분은 산간에 위치하고 있어 범람, 침투수에 의한 토양 및 하천 등의 오염 가능성이 높은 편이다 (서영진 등, 2002). 유해한 비소에 대한 과민성 기전에 관한 연구는 현재 E.coli에서부터 사람에 이르기까지 다양한 생명체에서 진행되고 있다(Bhattacjarkee H. 등,1999). 비소(As)는 구조적 측면에서 볼 때, 산화와 환원 두 상태로 존재하는데, 산화상태에서는 arsenate[As(V)]로 토양용액 중에서 H₂AsO₄^(-),HAsO₄^(2-),환원된 상태에서는 arsenite[As(III)]로써 H₃AsO₃로 존재 할 수 있으며 As(V)보다 독성이 강하고 이동성이 큰 편이다(서영진 등,2002). 식물체내에서 arsenate는 phosphate transporter를 통하여 토양에서 흡수되고 arsenite로 환원되어(Pickering 외.,2000; Beeker외.,2006) 관다발을 통하여 phosphate와 함께 이동하게 된다(Meharg와 Macnair.,1990). Arsenite는 arsenate와는 다른 방법으로 식물 세포내에 들어오는 것을 확인 하였으나 아직까지 구체적으로 밝혀지지는 않았다. Arsenite는 한 쌍으로 이루어진 thiol과 친밀도가 매우 높으며 peptide-thiol complex형태로 식물체의 지상부위인 잎과 줄기에서 발견됐다(Pickering 외.,2000; Cobbett 외.,2000). 토양에 있는 중금속을 가장 먼저 접하게 되는 식물체의 부위는 결국 뿌리이며, 중금속의 sensing이나 이동 기작에 핵심인자가 뿌리에 있을 가능성이 높다. 따라서 독성이 강한 환원된 형태인 'Arsenite'로 실험을 수행하였다. 3. 카드뮴(Cd) 카드뮴(Cd)은 여러 가지 환경을 오염시키는 물질로 인식되어 있는 물질로 비필수 원소이다. 식물체내 흡수된 과량의 Cd은 수분과 영양분의 흡수를 감소시켜 질소대사, 호흡, 광합성 등의 식물체 내의 대사를 직접적 또는 간접적으로 억제하여 식물의 성장을 억제하고, 생체량을 떨어뜨린다(Sanita di Toppi and Gabbrielli, 1999).(Wang et al., 2004). 식물의 성장에서 Cd의 부정적 효과는 세포분열을 조절하는 기작을 혼란시켜서 유도되는 것으로 제시되기도 하였다(Waisberg et al.,2003; Sobkowiak et al.,2004). Free sulfhydryl residues에 결합하여 protein의 활성을 저하 또는 변성 시킨다. 전사인자, 효소 등의 다양한 단백질로부터 조효소를 대체시킨다. 여러 종류의 활성산소를 발생시킨다. 또한 protein에 존재하는 Ca2+,Zn2+,Mg2+,Fe2+와 치환되고, 이것은 산화적인 스트레스의 결과를 초래한다(Stohs and Bagchi, 1995; Goyer, 1997). 식물체는 이런 독성이 있는 비필요 중금속에 대한 방어수단으로 다양한 기작을 수행한다. 1)mycorrhiza에 의한 root로의 중금속이동의 제한, 2) cell wall과 extracellular exudates에 중금속을 흡착, 3) plasma-membrane을 통한 중금속의 흡수를 제한, 4) apoplast 안으로의 중금속의 active efflux, 5) 다양한 ligand에 의한 세포질에서의 중금속 chelation, 6) plasma-membrane의 방어와 손상복구, 7) tonoplast-lacated transporter들을 이용한 액포로의 분리 등의 방법을 이용하여 식물은 자신의 방어 기작을 수행한다(Hall, 2002). 4. 뿌리 성장에 관여하는 유전자 앞서 설명한 arsenite, cadmium 은 일반적으로 뿌리 성장을 억제하는 것으로 알려져 있다. 따라서 뿌리 성장이 억제 된다는 것은, 뿌리 성장에 관여하는 유전자들이 이와 같은 현상과 관련이 있을 것으로 판단하여, 몇 가지 후보 유전자들을 선별하게 되었다. QC 주변의 딸세포에서 발현 하는 것으로 알려진 AtSHR, AtSCR 관다발과 형성층의 형성에 직접적으로 관여하는 것으로 알려진 AtAPL, primary root과 secondary root의 형성에 관여하는 것으로 알려진 AtSKP2A와 AtE2FC 그리고 lateral root의 형성과 trichome, root hair의 형성에 관여하는 것으로 알려진 AtTTG1, AtGEM 기본적인 후보로 하여 중금속 처리 후 발현 변화를 측정해보았다. 이중 arabidopsis에 중금속을 처리하였을 때 발현 변화를 보였

Molecular and biochemical characterizations of monoacylglycerol lipase gene family in Arabidopsis thaliana

김려진 Chonnam National University 2017 국내박사

Monoacylglycerol lipase (MAGL) catalyzes the final step of TAG breakdown, which is the hydrolysis of monoacylglycerol (MAG) to free fatty acids and glycerol. In the present study, I focused on the molecular and biochemical characterization of MAGL gene family in Arabidopsis thaliana. Computational modeling suggested that 16 Arabidopsis putative MAGLs (AtMAGLs) have a 3-dimensional structure that is similar to a human MAGL. Heterologous expression and enzyme assays indicated that 11 of the 16 encoded proteins indeed possess MAG lipase activity. Additionally, AtMAGL4 displayed hydrolase activity with lysophosphatidylcholine and lysophospatidylethanolamine (LPE) substrates and AtMAGL1 and -2 utilized LPE as substrates. All recombinant AtMAGLs preferred MAG substrates with unsaturated fatty acids over saturated fatty acids and AtMAGL8 exhibited the highest hydrolase activities with MAG containing 20:1 fatty acids. Except for AtMAGL4, -14, and -16, all AtMAGLs showed similar activity with both sn-1 and sn-2 MAG isomers. Spatial, temporal, and stress-induced expression of the sixteen AtMAGL genes were analyzed by transcriptome analyses. AtMAGL:eYFP fusion proteins provided initial evidence that AtMAGL1, -3, -6, -7, -8, -11, -13, -14, and -16 are targeted to the ER and/or Golgi network, AtMAGL10, -12, and -15 to the cytosol, and AtMAGL2, -4, and -5 to the chloroplasts. Among sixteen members, AtMAGL6 and -8 showed strong lipase activities, but several AtMAGLs including AtMAGL16 displayed very weak activities. To understand the internal factors that influence Arabidopsis MAGL activities, the significance of ‘GxSxS motif’, which is conserved in MAGLs was investigated. Frist, examine the significance of serine reside in GxSxG motif, I observed that the presence of a serine protease inhibitor, PMSF decreased the enzyme activity of AtMAGL6 and -8 by IC50 values of 2.30 and 2.35, respectively. Computational modeling showed that amino acid changes of the GxSxG motif in AtMAGL6 and -8 altered the nucleophilic elbow structure, which is the active site of MAGLs. Mutating the GxSxG motif in the recombinant MBP:AtMAGL6 and MBP:AtMAGL8 proteins to SxSxG, GxAxG and GxSxS motifs completely disappeared the activities of the mutant MAGLs. In contrast, no significant differences were observed between the activities of AtMAGL16 wild type form harboring the SxSxG motif, and mutant AtMAGL16 containing the GxSxG motif. These results revealed that the glycine and serine residues of the GxSxG motif are essential for AtMAGL6 and -8 enzyme activities. The results suggested that AtMAGL6 and -8 play a role as MAG lipase, and AtMAGL16 may not be involved in the hydrolysis of lipid substrates in Arabidopsis. In addition, the expression of AtMAGL8 was observed to be predominantly expressed in germinating seeds using microarray analysis. The expression patterns of AtMAGL8 were further examined in various organs of AtMAGL8 pro:GUS transgenic Arabidopsis plants. GUS expression was also observed in developing and germinating seeds, pollen, and pollen tubes. AtMAGL8:eYFP protein was detected to be associated with the surface of oil bodies in germinating seeds and leaves accumulating oil bodies. No remarkable differences were observed in the rate of seed germination, the number and size of cotyledonary oil bodies between T-DNA-inserted atmagl8 knock-out mutant and wild type, suggesting that an allele or alleles of AtMAGL8 might play a role in MAG breakdown during seed germination. Collectively, these results provide the broad characterization of one of the least well-understood group of Arabidopsis lipid-related enzymes and will be useful for better understanding their roles in planta. 모노아실글리세롤 라이페이즈 (Monoacylglycerol lipase; MAGL)는 TAG 분해과정 중에서 마지막 단계의 모노아실글리세롤 (Monoacylglycerol; MAG)을 글리세롤과 지방산으로 분해한다. 본 연구에서는, 애기장대 TAG 분해의 마지막 단계에 관여하는 MAGL 유전자 family의 분자적 및 생화학적 접근을 통해 그들의 특성을 규명하여 애기장대 MAGL을 밝히는데 중점을 두었다. 여러 lipase 유전자들 중에서 TAG 분해로 생성된 MAG를 분해하는 lipase 유전자 family는 16개로 추정되고 있다. 컴퓨터 모델링을 통해, 이미 잘 알려진 인간 MAGL 단백질 구조와 16개 애기장대 MAGL 단백질은 유사한 3차 구조를 보였으며, 그 중에서 AtMAGL8이 가장 유사하였다. 애기장대 MAGL의 효소활성을 조사하기 위해, 대장균을 이용하여 재조합 단백질을 정제한 후 효소 활성분석을 하였고, 그 중 11개 MAGL 단백질들은 MAGL 활성을 가졌다. 추가적으로, AtMAGL4은 라이조포스파티딜콜린 (Lysophosphatidylcholine; LPC)와 라이조포스파티딜에탄올아민 (Lysophosphatidylethanolamine; LPE)기질에 효소 활성을 보였으며, AtMAGL1과 -2은 LPE 기질에 활성을 보였다. 11개 재조합 AtMAGL 단백질들은 포화 지방산보다 불포화 지방산을 가진 MAG에 대한 효소활성이 높았다. AtMAGL4, -14, 및 -16을 제외한 다른 AtMAGL들은 sn-1과 sn-2 MAG에 대해 비슷한 효소 활성을 보였다. 애기장대의 조직 부위별, 종자발아 시간별, 잎 노화와 스트레스 유도에 따른 AtMAGL 유전자들의 발현을 전사체 데이타를 통해 비교분석하였다. 애기장대 MAGL은 식물 세포 내 어느 위치에서 기능하는지 알아보기 위해, 형광 단백질에 융합시킨 AtMAGL 단백질들을 이용하여 세포 내 소기관 위치를 확인하였다. AtMAGL1, -3, -6, -7, -8, -11, -13, -14 및 -16은 소포체와 골지체에 위치하였고, AtMAGL10, -12 및 -15은 세포질에 위치하며, AtMAGL2, -4 및 -5은 엽록체에 존재함을 확인하였다. 애기장대 MAGL 유전자 family 중에, AtMAGL6와 -8은 가장 강한 효소 활성을 보였지만, AtMAGL16을 포함한 몇몇의 AtMAGL들은 매우 약한 활성을 보였다. 더불어, 애기장대 MAGL 활성에 영향을 미치는 내부적인 요인들을 이해하기 위해서, AtMAGL family에 보존된 ‘GxSxG motif’의 중요성을 조사하였다. 먼저, GxSxG motif이자 catalytic site에 포함된 serine이 애기장대 lipase 활성에 중요한 영향을 미치는지 알아보기 위해, serine protease inhibitor인 PMSF를 이용하여 측정한 결과, AtMAGL6와 -8의 효소활성은 각각 IC50 2.30와 2.35로 감소하였다. 단백질 3차 구조분석을 통해, AtMAGL6와 -8의 GxSxG motif에서 각각의 아미노산 변화는 MAGL 활성부위인 nucleophilic elbow 구조를 변화시켰다. 이러한 결과에 근거하여 GxSxG motif를 SxSxG, GxAxG 및 GxSxS motif들로 각각 돌연변이시켜 maltose binding protein와 각각 퓨전된 AtMAGL6와 -8의 효소활성은 완벽히 사라졌다. 대조적으로, SxSxG motif인 AtMAGL16과 돌연변이시킨 GxSxG motif인 AtMAGL16는 효소활성에 차이가 없었다. 이러한 결과들은 GxSxG motif의 글라이신과 세린이 AtMAGL6와 -8의 효소활성을 갖기 위해 필수적이며 AtMAGL6와 AtMAGL8이 애기장대 MAGL로서 역할을 한다는 것을 보여주며, AtMAGL16은 MAG가 아닌 다른 지질분해에 관여할 수 있음을 의미한다. 추가적으로, AtMAGL8의 발현은 microarray 분석을 통해 발아종자에서 강한 발현을 관찰하였다. 특히, 식물의 발달과 조직 부위별 AtMAGL8의 발현양상을 관찰하기 위하여 AtMAGL8 pro:GUS 애기장대 형질전환체를 제조하였고, 이 형질전환 식물체의 다양한 기관에서 GUS 활성을 조사한 결과, GUS 발현은 발달종자와 발아종자 및 화분에서 관찰되었다. 또한 AtMAGL8:eYFP 단백질이 애기장대 발아종자의 잎과 지방체를 축적한 담배 잎에서 지방체 표면에 존재함을 확인하였다. 그러나 atmagl8 돌연변이체와 야생형 사이에서 종자 발아율과 자엽에서 지방체의 수나 크기에 현저한 차이가 없음을 확인하였고, 이는 AtMAGL8의 하나 또는 여러 개의 alleles가 종자 발아하는 동안에 MAG 분해하는 역할을 함께 할 수 있음을 시사한다. 종합적으로, 본 논문에서 애기장대의 지질 분해관련 유전자들 중에서 MAGL 유전자 family를 포괄적으로 효소특성을 규명하였으며, 앞으로 식물에서 MAGL 역할을 보다 더 잘 이해하는데 도움이 될 수 있다.

장내 RNA 바이러스에 대한 식물의 방어기작과 염소소독제의 역할

양하연 전북대학교 일반대학원 2023 국내석사

Untersuchungen zur Interaktion zwischen dem Arabidopsis thaliana Hitzeschockfaktor 1 und den potentiell negativen Regulatoren, HSP70/HSC70 und HSBP1

김병훈 Eberhard Karls Universitat Tubingen 2001 해외박사

모든 세포에서는 생리적 최적온도보다 높은 온도에서 heat shock proteins(HSP)들이 합성된다. HSP의 발현은 heat shock transcription factor(HSF)가 heat shock promoter에 존재하는 heat shock element (HSE)에 결합하여 이들 유전자의 전사를 유도함으로써 이루어진다. 여러 종(種)에서의 연구 결과들은 항상 발현되고있는 HSF가 생리적 최적온도에서는 억제인자들과 결합함으로써 비활성 상태를 유지하고 있음을 암시한다. 본 논문에서는 Arabidopsis HSF1이 그 억제인자로 주목되는 AtHSP70/HSC70또는 AtHSBP1과 실제로 결합하는지를 연구하였다. Arabidopsis의 crude extract를 사용한 EMSA 반응에 정제된 AtHSP70를 첨가하면 고분자량의 HSE:HSF:HSP70에 의한 supershift가 나타나며 이 복합체의 형성은 AtHSP70의 histidine tag에 반응하는 항체 또는 ATP를 첨가함으로써 억제되었다. Deletion construct를 이용한 yeast twohybrid 실험은 AtHSF1이 AtHSP70 뿐 아니라 AtHSC70(heat shock cognate 70)와도 결합하며 이를 위해 AtHSF1의 DNA-결합부위와 전사활성부위가 필요함을 보여준다. HSP70/HSC70에서 chaperone 기능에 필수적인 부분으로 여겨지는 C-말단의 제거는 이 결합에 아무런 영향도 미치지 않았다. 한편 정제된 AtHSF1과 AtHSP70 사이의 결합은 증명되지 못하였다. 이는 이들 단백질간의 결합이 간접적이거나 다른 보조인자를 필요로 함을 시사한다. Arabidopsis 세포 내에서의 이들 단백질의 결합을 알아보고자 in situ protein crosslinking에 이어서 HSF1:단백질복합체의 immunopreciptation이 수행되었다. 그러나 이 복합체로부터는 HSP70 보다 높은 분자량의 단백질이 HSP70-항체에 의하여 검출되었다. HSF1의 전사활성부위가 HSP70와의 결합에 필요하다는 사실과 HSP70가 heat shock 후 회복기에 HSF의 활성를 억제 한다는 사실[Lee JH, Schoffl F(1996) MGG 252:11-19]은 heat shock 후 회복기에 HSP70/HSC70가 HSF1의 전사활성부위에 결합하여 HSP 유전자의 전사를 억제함을 시사한다. HSBP1은 동물세포에서 HSF1의 활성을 억제하는 인자로서 발견되었다. 본 논문에서는 Arabidopsis의 HSBP1-homolge를 찾아 AtHSF1과의 결합여부와 heat shock 반응에의 영향을 조사 하였다. AtHSF1과 AtHSBP1이 효모에서 동시에 발현되었으나 EMSA, coimmunoprecipitation 그리고 protein-crosslinking을 이용한 실험들에서 두 단백질이 서로 결합한다는 증거는 발견되지 않았다. HSBP1 overexpressing/ antisense Arabidopsis 식물도 역시 EMSA, HSP17.6 발현 그리고 고온저항성 테스트에서 야생종과의 차이를 나타내지 않았다. 이결과는 식물과 동물의 HSBP1과 HSF가 가지는 차이점과 관련하여 논의 되었다.

Proteomic Studies of Plant-Rhizobacteria Interaction

권영상 경상대학교 대학원 2015 국내박사

The plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) facilitate plant growth and induced systemic resistance (ISR) against pathogens. In this study, we carried out integrative analyses on the proteome, transcriptome, and metabolome to investigate Arabidopsis root and shoot responses to PGPR strain Paenibacillus polymyxa (P. polymyxa) E681. Shoot fresh and root dry weights were increased, whereas root length was decreased by treatment with P. polymyxa E681. 2-DE approach in conjunction with MALDI-TOF/TOF analysis revealed a total of 41 (17 spots in root, 24 spots in shoot) that were differentially expressed in response to P. polymyxa E681. Biological process- and molecular function-based bioinformatics analysis resulted in their classification into seven different protein groups. Of these, 36 proteins including amino acid metabolism, antioxidant, defense and stress response, photosynthesis, and plant hormone-related proteins were up-regulated, whereas five proteins including three carbohydrate metabolism- and one amino acid metabolism-related, and one unknown protein were down-regulated, respectively. A good correlation was observed between protein and transcript abundances for the 12 differentially expressed proteins during interactions as determined by qPCR analysis. Metabolite analysis using LC-MS/MS revealed highly increased levels of tryptophan, indole-3-acetonitrile (IAN), indole-3-acetic acid (IAA), and camalexin. Arabidopsis plant inoculated P. polymyxa E681 also showed resistance to B. cinerea infection. Taken together, these results suggest that P. polymyxa E681 may promote plant growth by induced metabolism and activation of defense-related proteins against fungal pathogen. The polyketide antibiotic 2,4-diacetylphloroglucinol (DAPG) is a phenolic secondary metabolite produced by biocontrol Pseudomonas spp. In plants, the antibiotic 2,4-diacetylphloroglucinol (DAPG) has been shown to trigger induced systemic resistance (ISR) against pathogens. However, DAPG-mediated molecular mechanisms in plants are largely unknown. Here, we performed a proteome analysis to identify proteins differentially regulated in response to DAPG in Arabidopsis. Using both gel-based and gel-free proteomic techniques, total 281 proteins were identified in leaves, of which 13 proteins were commonly detected by both methods. These proteins were mainly involved in physiological processes, including antioxidant enzymes and other stress-related proteins. In particular, genes encoding enzymes for JA biosynthesis increased their expression, which occurred in parallel with JA accumulation. Moreover, we found that DAPG application significantly reduced necrosis caused by the Botrytis cinerea and inhibited fungal proliferation. The mode of action of DAPG against B. cinerea on Arabidopsis was investigated using mutants impaired in the plant hormone signal transduction pathways activated by pathogen infection. Unlike Col-0 wild-type plants, a JA signaling mutant coi1-1 showed no difference in B. cinerea proliferation after DAPG pretreatments, suggesting that DAPG-induced resistance requires COI1. Our results indicate that the defense responses elicited by DAPG in Arabidopsis are complex and involve the canonical defense hormone JA signaling, which may be important factors in boosting plant immunity. 식물생장 촉진 근권세균(plant growth promoting rhizobacteria; PGPR)은 식물의 생장을 촉진시킬 뿐 아니라 생물적/비생물적 스트레스로부터 유도저항성을 증대시키는 것으로 알려져 있다. PGPR의 식물생장촉진 기작은 식물생장조절제의 생산에 의한 직접적인 생장촉진과 항생물질이나siderophores의 생산에 의한 토양병원균 또는 해로운 미생물 억제를 통한 간접적인 생장촉진 효과 등이 보고되어 있다. 최근에는 PGPR 중 일부에서 식물체의 병저항성을 유도하는 능력을 갖고 있음이 밝혀졌고, 이러한 유도저항성의 기작에 관한 관심이 높아지고 있다. 본 연구는 식물생장 촉진 근권 세균인 P. polymyxa E681 균주에 의한 식물의 생장촉진과 곰팡이병에 대한 내병성 증대에 관여하는 기작을 프로테옴 분석과 다양한 생화학적인 분석기법을 적용하여 규명하고자 수행되었다. E681 균주에 의해 애기장대의 뿌리와 지상부에서 발현의 차이를 보이는 41개의 단백질을 2-DE분석을 통해 확인하였고, MALDI-TOF/TOF 질량분석기를 이용하여 동정하였다. 단백체 분석을 통해 확인된 단백질의 발현을 Q-PCR 기법을 적용하여 발현유무를 검정하였고, E681 균주에 의해 발현이 유의적으로 조절되는 단백질은 옥신 대사, 트립토판 대사, 자스몬산 신호전달, 생체방어물질인 카마렉신 생합성에 관여하는 단백질임을 확인할 수 있었다. 뿐만 아니라 LC-MS/MS를 이용한 대사체 분석을 통해 애기장대 생체내의 tryptophan, indole-3-acetonitrile (IAN), indole-3-acetic acid (IAA), camalexin의 함량이 E681균주에 의해 증가하는 결과를 도출하였다. 본 연구를 통해서 E681 균주에 의해 식물체 옥신 생합성 경로 및 생체방어물질(camalexin) 생산경로를 촉진하여 식물의 생장발달을 촉진할 뿐 아니라 곰팡이병에 내병성이 증진됨을 알 수 있었다. 2,4-diacetylphloroglucinol(DAPG)는 Pseudomonas spp. 세균에 의해 분비되는 2차 대사물질이며, 식물병원성 곰팡이에 항진균 활성을 가지며, 식물의 병저항성을 증대시키는 것으로 알려져 있다. 그러나, DAPG에 의해 유도되는 식물의 병저항성 유도 반응 메커니즘에 대한 연구는 수행된 바 없으며, 단백체 분석연구를 적용한 분자생물학적 연구는 거의 전무한 상태이다. 본 연구에서는 애기장대에서 DAPG에 의해 유도되는 식물병저항성 메커니즘을 규명하기 위해 단백체 분석연구를 수행하였다. 단백체 분석의 전형적인 방법인2-DE 기법과 LC-MS를 기반으로 하는 label free 방법을 적용하여 단백체 분석을 수행한 결과 281개의 단백질이 DAPG에 의해 발현이 조절되는 것을 확인하였다. DAPG에 의해 애기장대에서 유도된 단백질 중에서 특이적으로 자스몬산 생합성과 신호전달에 관여하는 단백질의 발현이 크게 증가하는 것을 확인하였고, 애기장대의 자스몬산 함량이 DAPG에 의해 증가하는 결과를 확인하였다. 또한, DAPG에 의해 식물병원성 곰팡이병균인Botrytis cinerea에 대해서 내병성이 획득됨을 알 수 있었다. 본 연구에서 DAPG에 의해 유도되는 곰팡이병에 대한 내병성은 애기장대의 생체방어 호르몬인 자스민산의 합성이 촉진됨으로써 자스몬산 신호 전달에 의존적으로 일어나는 것을 단백체 분석연구를 통해서 확인할 수 있었다.

Functional analysis of transcription factors that are phosphorylated by MAP kinases in Arabidopsis

니구엔 흉 칸 경상대학교 대학원 2012 국내박사

The mitogen-activated protein kinase (MAPK or MPK) pathways are ones of the most important and conserved signaling events in plants. MPKs directly modulate gene expression by phosphorylating their substrates such as transcription factors. Some Arabidopsis MPK-interacting transcription factors were isolated by high-throughput yeast two-hybrid screening. They are belonging to different families such as GRAS, AP2, bZIP, zinc finger, HSF and MYB proteins. Among them ERF5, ERF6, ERF8, MYB41, MYB44, MYB77, HSFA3 and ZAT10 transcription factors were phosphorylated by MPK3 and MPK6 in phosphorylation assays. ZAT10 and MYB44 were selected for further functional analyses. Phosphorylation assays showed that ZAT10 and MYB44 proteins were not only phosphorylated by recombinant MPK3/6 but also by plant extracted MPK3/6. By MALDI-TOF mass spectrometry S8 and S210 of ZAT10, and S53 and S145 of MYB44 were identified as MPKs phosphorylation sites, respectively. To confirm the specificity of these phosphorylation sites, serine residues were mutated to alanin by site-directed mutagenesis. MPK3/6 could phosphorylate original proteins (ZAT10WT/MYB44WT) but not phosphorylate mutated proteins (ZAT10AA/ MYB44AA). ZAT10 was known as a key member of the C2H2-type zinc finger transcription factor family in Arabidopsis. Gene expression analyses indicated that ZAT10 is induced by environmental stresses. ZAT10 overexpressing transgenic plants exhibited enhanced tolerance to osmotic stress, but zat10 knockout mutant plants showed an osmotic stress sensitive phenotype. These results demonstrated that ZAT10 is a positive regulator in conferring osmotic stress tolerance in Arabidopsis. The zat10 mutant phenotype was complemented by the expression of ZAT10WT protein but not by the expression of ZAT10AA mutant protein, indicating that the phosphorylation of ZAT10 by MPKs is essential for the physiological function of ZAT10 in plant. A member of Arabidopsis R2R3 MYB transcription factor family, MYB44, was known to be involved in various stresses such as dehydration, low temperature, salinity and ABA, ET or methyl jasmonate. Overexpressing MYB44 transgenic plants were enhanced the tolerance to salt and drought stresses via ABA-mediated signaling pathway. In this study, I show that the transcription of MYB44 is high accumulated in the dry seed as well as in the seedlings at low GA condition, and that transcription level is reduced in the germinating seeds. Decreased GA synthesis not only inhibits the germination of transgenic overexpressing MYB44 seeds but also enhances the germination of myb44 mutant seeds comparing to wilt-type. When two serine phosphorylation sites were mutated to alanin residues by site-directed mutagenesis, the phosphorylation of MYB44 by MPKs was abolished and the expression of MYB44AA mutant protein could not rescued the insensitive phenotype of myb44 mutant seeds to low endogenous GA and high exogenous ABA levels as MYB44WT protein did. Finally, MYB44 protein could be bound to ABI5-1 and ABI5-2 oligos which are containing the consensus MYB binding site (TAACTG) in ABI5 promoter. These results demonstrated that MYB44 transcription factor participate in the regulation of ABA and GA signaling to modulate the seed germination at transcriptional and post-translational levels in Arabidopsis. 식물체가 외부 자극을 인식하여 다양한 신호전달 기작을 통해 세포 내의 여러 유전자의 발현을 조절함으로써 자극에 대한 세포 반응을 하게 된다. 이러한 신호전달 기작 중의 하나로서 Mitogen-activated protein kinase (MAPK or MPK) 매개 신호전달 경로가 잘 알려져 있다. MPK들은 전사조절인자 같은 그들의 기질을 직접적으로 인산화 (phosphorylation) 시킴으로써 유전자의 발현을 조절한다. 본 연구에서는 high-throughput yeast two-hybrid screening을 통해서 MPK와 상호작용하는 전사조절인자를 동정하였다. 그 결과 GRAS, AP2, bZIP, zinc finger, HSF와 MYB과 같은 다양한 전사조절인자 그룹들이 동정되었다. 인산화 분석 (Phosphorylation assay)을 이용하여 그들 중에서 MPK3/6에 의해 ERF5, ERF6, ERF8, MYB41, MYB44, MYB77과 ZAT10이 인산화된다는 것을 확인했다. 그들 중 ZAT10과 MYB44을 선택하여 이후의 실험들을 진행하였다. ZAT10과 MYB44는 recombinant MPK3/6 뿐만 아니라 식물세포에서 추출된 MPK3/6에 의해서도 인산화된다는 것을 알 수 있었다. MALDI-TOP mass spectrometry를 통해 ZAT10의 S8과 S210, MYB44의 S53과 S145이 MPK에 의해 인산화되는 잔기라는 것을 확인했다. 인산화 잔기를 검증하기 위해 site-directed mutagenesis을 통해 serine 잔기를 alanine으로 치환하였다. 그 결과 ZAT10과 MYB44의 original protein은 MPK3/6에 의해 인산화 되는 반면 mutation시킨 protein (ZAT10AA/MYB44AA)은 인산화 되지 않음을 알 수 있었다. ZAT10은 애기장대에서 C2H2-type zinc finger transcription factor family로 잘 알려져 있으며 다양한 스트레스에 의해 ZAT10 유전자의 발현이 증가한다고 알려져 있다. ZAT10의 생리학적 기능을 규명하고자 다양한 스트레스를 처리한 후 ZAT10 형질 전환체와 zat10 돌연변이 식물체의 표현형을 관찰하였다. 그 결과 ZAT10 과발현 형질전환 식물체와 zat10 돌연변이 식물체는 각각 osmotic stress에 대해 저항성과 민감성 표현형을 나타냄을 알 수 있었다. 실험 결과로서 ZAT10은 애기장대에서 osmotic stress tolerance에 positive regulator라는 것을 확인 할 수 있었다. Complementation 실험을 통해 ZAT10AA mutant protein이 zat10 돌연변이 표현형을 회복 시키지 못함을 확인함으로써 MPK에 의한 ZAT10 단백질의 인산화가 그 기능에 필수적임을 보여주었다. MYB44는 애기장대에서 R2R3 MYB transcription factor family에 속한다. MYB44는 건조, 저온, 고염, ABA, ET 그리고 MeJ 같은 다양한 스트레스에 관여한다고 보고되어 있다. 본 연구에서 seed germination 동안에 MYB44의 transcript가 줄어드는 것을 확인하였다. 흥미롭게도 ABA가 함유된 배지에서 종자발아 분석을 통해 WT과 myb44 돌연변이에 비해 MYB44 과발현 형질전환 식물체가 ABA에 과민한 표현형을 가짐을 확인 하였다. 저해제를 처리하여 GA 합성을 감소시키면 MYB44 과발현 형질전환 식물체의 종자는 발아율이 줄어들고, 반면에 myb44 돌연변이 식물체 종자 발아율이 증가함을 확인하였다. Complementation 실험을 통해 인산화 되지 않는 MYB44 돌연변이 단백질 (MYB44AA)가 myb44 돌연변이 식물체 표현형을 회복시키지 못함을 보여 줌으로써 MYB44의 MPK에 의한 인산화가 그 기능에 필수적임을 보여주었다. 그리고 MYB44 protein은 consensus MYB44 binding site (TAACTG)이 포함된 ABI5 promoter인 ABI5-1과 ABI5-2에 결합한다는 것을 EMSA assay를 통해 확인하였다. 본 연구를 통하여 MYB44는 종자 발아의 억제자로 기능을 하며 GA에 의해서는 그 발현이 감소하며, ABA에 의해서는 MYB44 단백질이 MPK에 의하여 인산화되어 활성화되어 종자 발아를 억제할 것으로 예상된다.

Study on the effect of blue-light receptor phototropin 1 in the root of Arabidopsis plants.

Moni Akhi 울산대학교 2014 국내박사

CHAPTER I The blue-light receptor phototropin 1 suppresses lateral root growth by controlling cell elongation. We investigated the relationship between the blue light receptor phototropin 1 (phot1) and lateral root growth in Arabidopsis thaliana seedlings. Fluorescence and confocal microscopy images, as well as PHOT1 mRNA expression studies provide evidence that it is highly expressed in the elongation zone of lateral roots where auxin is accumulating. However, treatment with the auxin transport inhibitor N-1-naphthylphthalamic acid significantly reduced PHOT1 expression in this zone. In addition, PHOT1 expression was higher in darkness than in light. The total number of lateral roots was higher in the phot1 mutant than in wild-type Arabidopsis. Cells in the elongation zone of lateral roots of the phot1 mutant were longer than those of wild-type lateral roots. Further, fungal contamination or high dose NAA significantly decreased phot1 expression may be due over production of auxin in LR. Additionally, phot1 showed negative effects in phototropism and gravitropism in Arabidopsis roots. Furthermore, salinity significantly decreased LR number in phot1 mutants compared to untreated mutants and WT plants respectively, which indicates the inhibition LR formation by salt stress is independent of phot1 and salinity significantly decreased gravitropic response in phototropin mutants. These findings suggest that PHOT1 plays a role(s) in elongation of lateral roots through the control of an auxin-related signaling pathway. CHAPTER II Using Arabidopsis seedlings to teach phototropism and gravitropism in a K-12 laboratory classroom. The purpose of this study was to design a teaching method suitable for science high school students easy to learn how plants respond to stimuli or signals from their environment in order to live successfully. During their scientific inquiry procedure, high school students observed easily about the physiological responses, such as phototropism and gravitropism. The knowledge regarding phototropism and gravitropism helped student to understand how plant can grow up by using environmental resources as well as they learned about differential response of different parts of them. This teaching method enhanced students’ science-learning motivation and creativity.

에틸렌에 의한 Arabidopsis thaliana의 뿌리털 형성 시 발현되는 유전자에 관한 연구

강은옥 연세대학교 대학원 2003 국내석사

식물은 뿌리에서의 물, 양분의 흡수를 효율적으로 하기 위해 뿌리털 즉, root hair라는 특이한 표피세포를 발달, 분화시킨다. plant model 중 널리 이용되는 Arabidopsis의 root를 관찰해 보면 그 표피세포가 두 가지 types 즉 root hair cells 과 non hair cells로 나누어지는 것을 볼 수 있다. 이러한 뿌리털의 형성 및 발달 과정에는 식물 호르몬이 관여하는 것으로 알려져 왔는데 gas 형태의 plant hormone인 ethylene은 노화와 stress에 관련된 hormone으로 알려져 있을 뿐 아니라 root hair development의 positive regulator로 확인된 바 있다. 에틸렌에 의한 신호전달이 차단된 돌연변이체에선 뿌리털의 발달이 거의 일어나지 않으나 에틸렌에 의한 신호전달이 에틸렌의 유, 무와는 관계없이 지속되는 돌연변이에서는 ectopic root hair 형성이 일어남은 오래전에 알려진바 있으며 또한 ethylene 전구체인 ACC를 처리한 Arabidopsis 에서는 ectopic root hair 형성이 일어나는 반면 ethylene 형성 inhibitor인 AOA를 처리하면서 키운 Arabidopsis seedling에서는 root hair가 관찰되지 않은 점을 통해 에틸렌이 뿌리털 형성의 positive regulator임을 확인할 수 있었다. 본 실험자는 뿌리털 형성 시 발현양이 증가하거나 단백질의 합성양이 증가하게 되는 유전자를 분리함으로써 직접적으로 뿌리털의 형성에 관여하는 유전자들을 확인하고자 두 가지 실험을 수행하였다. subtractive hybridization 실험을 통해 Arabidopsis의 에틸렌 관련 돌연변이인 ein2 와 ctr1의 유전자 발현 양상을 비교하여 ctr1에서 뿌리털 형성이 과도하게 일어날 때 발현양이 증가되는 유전자들을 분리하였으며 그들의 sequence를 분석하여 발현이 증가되는 유전자의 종류를 확인할 수 있었다. 주로 세포벽의 확장이나 세포의 길이 생장 등에 관여하는 유전자들, 에틸렌에 의해 나타나는 외부 스트레스에 대한 방어체계에 관여하는 유전자들, 그리고 아직까지 그 기능이 증명되지 않은 몇 가지의 유전자들이 분리된 것을 알 수 있었다. 이들 중 일부 유전자에 대해 뿌리털 형성과 어떠한 연관성이 존재하는지를 구체적으로 연구해 나갈 계획이다. 두 번째로 에틸렌 합성 억제제인 AOA를 전처리하여 뿌리털의 형성이 억제되어있는 Arabidopsis에 에틸렌 전구체인 ACC를 가하여 뿌리털 형성을 유도한 후 그들의 protein 발현 양상의 변화를 2-dimentional electrophoresis를 수행하여 추적하였고 변화된 protein 의 amino acid sequence를 확인하여 유전자의 종류를 확인할 수 있었다. 특히 AOA 처리구에서 발현양이 매우 미미하여 측정이 어렵지만 ACC 처리 후 단백질의 발현양이 크게 증가하는 유전자로 GST gene family 중의 하나인 AtGSTF2 유전자를 확인할 수 있었다. 이들의 유전자 발현 양상을 RNA level 에서 조사해 본 결과 2-DE 결과에서 발현양의 변화가 나타나지 않던 AtGSTF8 이나 AtGSTU19 gene과는 대조적으로 ACC 처리 후 뿌리털 형성이 나타나는 시점 까지 그 발현양이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. AtGSTF2가 애기장대 유묘의 뿌리에서 특이적으로 에틸렌에 민감하게 반응함으로써 어떠한 기능을 할지는 아직 정확히 규명하기 힘들지만 몇 가지 가능성과 함께 앞으로 뿌리털 형성 시 AtGSTF2의 기능에 대한 연관성에 대해 좀더 깊은 연구가 수행되어야 하겠다. The plant hormone ethylene has been shown to play an important role in root hair development in Arabidopsis. To select many genes that are involved in root hair formation by ethylene, we performed subtractive hybridization using ctr1 and ein2 mutant. The ctr1 mutant showed up ectopic root hair formation but the ein2 mutant had very few root hairs. So, by using subtractive hybridization, we identified twenty three distinct genes which expression are induced in ctr1 mutant but decreased in ein2 mutant. With the aid of proteomic analysis, we identified three distinct glutathione S-transferase (GST) isoforms, AtGSTF2, AtGSTF8, and AtGSTU19, expressed early inroot epidermal establishment in Arabidopsis seedlings. The AtGSTF2 protein was specifically up-regulated by ethylene. A subsequent RNA expression study revealed that the AtGSTF2 gene was highly sensitive to ethylene, whereas the transcripts for AtGSTF8 and AtGSTU19 were constitutively present in new root tissue of 4-day-old seedlings. The steady-state level of AtGSTF2 mRNA was greatly reduced in the roots of ethylene-insensitive mutants, while mutation at the CTR1 locus, which confers an ectopic root hair phenotype, resulted in a markedly elevated level of AtGSTF2 transcript in young root tissue. Although the physiological function of ethylene-induced AtGSTF2 is not yet clear, there are several possibilities for its role during early root development.

Analysis of the transcriptome of OGA-treated Arabidopsis leaf by SAGE method : SAGE 방법을 이용한 OGA-처리 Arabidopsis 잎에서 발현되는 전사체의 분석

서주원 Graduate School of Ewha Womans University 1998 국내박사