콩과 청국장의 항산화효과 및 항산화 원인물질에 관한 연구

류승희 인제대학교 대학원 2001 국내박사

여러 가지 생리활성물질을 함유하고 있는 것으로 밝혀지고 있는 콩은 우리의 식생활에서 매우 중요하게 이용되고 있다. 콩에 함유되어있는 생리 기능성 물질들은 이소플라본, 식이섬유, 피틴산, 트립신 저해제, 사포닌, 콩 단백질과 그 가수분해 펩타이드, 식물성 스테롤과 페놀 화합물 등이며 특히 이소플라본에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 제니스테인의 항산화작용에 관한 연구도 상당히 이루어져 있으나 최근 보고들에 따르면 제니스테인이 항산화활성을 나타내지 않는다는 상반된 결과들도 보고되고 있다. 따라서 본 연구에서는 콩 및 청국장의 항산화효과를 in vitro와 in vivo 에서 조사하고 주요 항산화 물질을 규명하고자 하였다. 콩 발효제품인 된장, 청국장, 간장의 항산화효과를 linoleic acid emulsion계를 이용하여 측정한 결과 콩 발효제품들은 강한 항산화효과를 나타내었고 특히 청국장의 항산화효과가 큰 것으로 나타났다. 5종의 균주로 청국장을 제조하여 항산화효과를 비교한 결과 모든 청국장에서 강한 항산화효과를 나타내었는데 특히 30℃에서 짚을 넣어 만든 청국장에서 분리한 bacillus circulans K-1 균주로 조제한 청국장의 항산화 효과가 가장 큰 것으로 나타났다. 콩 및 청국장 식이의 항산화효과 및 활성산소종 생성 억제효과를 흰쥐를 이용하여 연구한 결과 콩과 청국장 섭취군 모두 지질과산화 생성 및 superoxide anion 라디칼 생성을 유의적으로 억제하였고 노화의 지표인 리포퓨신 생성도 유의적으로 억제하였으며 특히 청국장의 효과가 더 우수하였다. 콩 및 청국장에서 항산화효과의 활성 물질을 탐색하기 위해 콩과 청국장을 탈지시킨 후 메탄올로 추출하고 용매의 극성에 따라 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올, 물층으로 순차분획한 후 총 페놀함량을 측정한 결과 콩은 에틸아세테이트층에서 총페놀 함량이 가장 높았고 청국장은 디클로로메탄과 에틸아세테이트층에서 총 페놀함량이 높았다. 콩의 이소플라본은 대부분이 배당체의 형태로 에틸아세테이트층에 존재하였고 청국장의 이소플라본은 배당체와 aglycone의 형태로 디클로로메탄층과 에틸아세테이트층에 존재하였다. 콩의 phenolic acids는 에틸아세테이트층에, 청국장은 디클로로메탄층과 에틸아세테이트층에서 발견되었다. 용매 순차분획물의 항산화효과를 DPPH법으로 측정한 결과 이소플라본 및 phenolic acids의 함량이 높은 분획물과 항산화효과가 큰 획분이 일치하였다. 이상의 결과 이소플라본과 phenolic acids가 콩의 항산화 주요 원인물질임이 밝혀졌다. 콩 및 청국장속의 이소플라본 및 phenolic acids 함량을 측정한 결과 콩에는 daidzein이 49mg%, genistein은 61mg% 함유되어 있었고 청국장에는 daidzein 44mg%, genistein은 72mg% 함유되어 있었다. Phenolic acid 함량은 콩과 청국장에서 유사하여 salicylic acid(99mg%), syringic acid(41mg%), ferulic acid(28mg%), p-coumaric acid (13mg%), vanillic acid (13mg%) 등의 순으로 많이 함유되어 있었다. 콩에 비해 청국장의 phenolic acids는 유리상태로 존재하는 것이 많아 콩의 발효 과정 중 콩에 함유되어 있는 phenolic acid들이 배당체의 형태에서 aglycone으로 변화됨을 알 수 있었다. 유리 아미노산 함량은 콩이 4mg/g인 반면 청국장은 11mg/g 농도로 높게 나타났으며 비슷한 이소플라본 및 phenolic acids 함량에도 불구하고 청국장의 항산화효과가 더 높았던 것은 청국장 발효시 생성된 유리 아미노산 및 펩타이드들이 항산화작용에 관여한 것으로 보인다. 콩에 함유된 이소플라본 및 phenolic acids의 표준품을 이용하여 DPPH법, FRAP법, TEAC법의 3가지 항산화효과 측정방법에 따른 항산화활성을 측정한 결과 TEAC 에서는 genistein의 효과가 가장 높았고 DPPH나 FRAP의 경우는 gentisic acid, syringic acid, ferulic acid 등의 phenolic acids의 활성이 높게 나타났고 isoflavones의 효과는 매우 낮게 나타났다. 국산 대두 13종의 이소플라본 및 phenolic acid 함량을 새로 개발한 동시 분석법으로 측정한 결과 콩의 총이소플라본 함량은 65mg%~110mg% 내외였으며 신팔달, 단원콩, 진품콩, 알찬콩의 순으로 그 함량이 높았고 보광콩 및 장엽콩에서 낮았다. Phenolic acids는 gentisic acid(n.d.~62.6mg%), syringic acid(9.6~22.4mg%), ferulic acid(6.9-22.6mg%)의 순으로 콩에 따라 그 함량의 차이가 상당히 많았다. 콩의 항 산화효과 측정 방법으로 DPPH법, ERAP법, TEAC법을 이용하여 측정하였을 때 모든 방법에서 알칼리 가수분해물의 항산화효과가 가장 높았고, 다음은 산가수분해물, 80% 메탄올 추출물의 순이었다. Phenolic acids 중 syringic acid, vanillic acid, ferulic acid 및 p-coumaric acid의 함량은 DPPH법과 FRAF법으로 측정된 항산화효과와 높은 상관관계를 나타내었고 genistein과 daidzein의 함량은 TEAC법으로 측정한 항산화효과와 높은 상관관계를 나타내었다. 콩 속에 함유되어있는 이소플라본과 phenolic acid 함량을 기준으로 하여 항산화효과를 측정한 결과 TEAC법에서는 genistein>daidzein>salicylic acid의 순으로 높은 효과를 나타내었고 DPPH법에서는 syringic acid와 ferulic acid의 항산화효과가 가장 높았다. LDL 산화억제효과는 genistein에서 가장 높았으며 chlorogenic acid, ferulic, syringic의 순이였고 vanillic, p-coumaric, salicylic, daidzein은 LDL 산화억제에 대해서는 효과가 없었다. ESR spectroscopy를 이용하여 실험방법에 따라 항산화효과에 있어서 가장 차이를 보였던 genistein의 DMPO-OH radical 소거능을 측정한 결과 0.46~4.6mM 농도에서 농도의존적으로 라디칼을 소거하였다. 이상의 결과로 콩 및 청국장의 섭취는 생체에서 항산화효과를 나타내었고 발효과정을 거치는 청국장의 항산화/항노화 효과가 더 우수하였다. 콩과 청국장의 가장 중요한 항산화 물질은 genistein과 syringic acid, ferulic acid였고 청국장 발효시 생성 되는 유리 아미노산과 펩타이드 등도 항산화효과에 기여할 것으로 여겨진다. Soybeans have been considered a very important foods in Korea and contain various components with physiological activities. Well-known phytochemicals in soybean are isoflavones, dietary fiber, phytic acid, trypsin inhibitors, saponins, protein, peptides, phytosterol, and phenolic compounds. In particular, there are many reports of isoflavones on physiological activity and antioxidative activity, but they have inverted results. The aim of the work described here was to investigate antioxidative activities of soybean and chongkukjang in vitro and in vivo, and to identify the main components of antioxidative activity. The antioxidative activities of fermented soybean products, which were included doeqiang, chongkukjang, and soy sauce, were determined to be the lipid peroxidation on the linoleic acid emulsion system. The results showed that soybean products had strong antioxidative activity, and chongkukjang had the strongest activity. When soybean were fermented by different types of microbe, all of them had antioxidative acitivity and the strongest chongkukjang was fermented bacillus circulans K-l, which was identified as chongkukjang made with straw at 30℃. To investigate the antioxidative effects of soybean and chongkukjang, male S.D. rats(n=24) were fed the diet containing yellow soybean, chongkukjang, and casein for 8 weeks. Soybean and chongkukjang feeding showed the preventive effect on lipid oxidation, and lowered the content of superoxide anion radical and hydroxyl radical, significantly. Soybean and chongkukjang feeding effectively inhibit the lipofuscin formation, the indicator of aging, in heart and eye, and the chongkukjang group showed the strongest activity. To investigate the main antioxidative components in soybean and chongkukjang, methanol extracts of soybean and chongkukjang were fractionated by hexane, dichloromethane, ethylacetate, butanol and water, according to their polarity. Most of the phenol compounds exist in the ethylacetate fraction of soybean, and are widely distributed in all fractions of chongkukjang. Genistein and daidzein dominantly exist in the ethylacetate fraction of soybean as glucosides, in contrast, isoflavones of chongkukjang exist in dichloromethane and ethylacetate fraction as glucosides and aglycones. When the DPPH radical scavenging ability in those fractions was measured, the ethylacetate fraction of soybean containing 62% of phenol and 84% of isoflavones showed the strongest free radical scavenging effect. Strong antioxidative activity of chongkukjang appeared in the dichloromethane and ethylacetate fractions, which can be explained by the fact that the phenol(54%) and the isoflavones(91%) contents were high in those fractions. The contents of isoflavones(genistein, daidzein) and phenolic acids were measured. The genistein content in soybean was 61mg%, and mostly existed in glucosides, but, it was 71mg% in chongkukjang, where it mainly existed in free form. The major phenolic acids were salicylic acid(99mg%) > syringic acid(41mg%) > ferulic acid(28mg%) > p-coumaric acid(13mg%), vanillic acid(13mg%) in soybean and chongkukjang, and the contents were similar to each other. The contents of free amino acids were 4mg/g in soybean and 11mg/g in chongkukjang. In the fermenting process of soybean, proteins and glucoside components like isoflavones and phenolic acids are hydrolysed into aglycones or free amino acids and peptides, which showed an excellent antioxidative effect. Antioxidative activities of standards of isoflavones and phenolic acids in soybean were measured by DPPH assay, FRAP assay, and TEAC assay. The antioxidative activity of genistein measured by DPPH assay was higher than others. Activities of the gentisic acid, syringic acid and ferulic acid were effective in FRAP assay and DPPH assay, otherwise activities of isoflavones were very low. The contents of isoflavones and phenolic acids of different types of soybean were analyzed using a newly developed HPLC method. The contents of total isoflavones in soybean were 65-110mg% and sinpaldal #2, danwon, jinpum, alchan were higher than bokwang and jangyup. The contents of gentisic acid(n.d.-62.6mg%), syringic acid(9.6-22.4mg%), and ferulic acid(6.9-22.6mg) were high. The alkali-hydrolysates showed the strongest antioxidative activity using DPPH, FRAP, and TEAC assay, and next to acid-hydrolysates and 80% methanol extracts, The contents of syringic acid, vanillic acid, ferulic acid and p-coumaric acid in soybean correlated the antioxidative activities of soybean measured by DPPH and FBAP assay, otherwise the contents of genistein and daidzein correlated the activity measured by TEAC assay. In comparison of antioxidative acitivity of compounds containing soybean, genistein, daidzein, and salicylic acid had strong antioxidative acitivity on TEAC assay. Syringic acid and ferulic acid had strong antioxidative acitivity on DPPH assay. On inhibition of LDL oxidation, the most effective materials were genistein followed by chlorogenic acid, ferulic acid, and syringic acid, but no effect showed on vanillic acid, p-coumaric acid, salicylic acid, and daidzein. DMPO-OH radical scavenging activity of genistein was measured using ESR spectroscopy, and dose-dependant activity existed at 0.46-4.6mM. In conclusion, feeding of soybean and chongkukjang exhibit the antioxidative activity in vivo, and chongkukjang which has undergone fermentation has the strongest antioxidative/antiaging effect. The most important components in soybean and chongkukjang, which showed the antioxidative activity, were genistein, syringic acid, and ferulic acid.

환경시료에 대한 개구리 올챙이의 최기형성 및 유전독성 평가 연구

윤경미 인제대학교 2009 국내석사

환경오염의 원인이 되는 화학물질들 중, 발암성, 유전독성 또는 발생독성/최기형성을 유발하는 다양한 물질들이 환경 매질 내 존재한다. 특히 공단이나 산업폐수 처리장으로부터 배출되는 방류수 속의 오염물질은 수 환경뿐만 아니라, 퇴적토 환경까지 악 영향을 미칠 가능성이 있다. 양서류를 비롯한 다양한 생물종이 환경독성물질 노출 시 민감한 생체 반응을 나타낸다. 그러므로 양서류 등 화학물질 노출에 대한 감수성이 높은 생물 종을 환경 독성 평가에 활용하고 있다. 양서류의 대표 시험종은 Xenopus laevis(X. laevis)이며, 독성시험기법으로는 최기형성 평가를 위한 FETAX 및 유전독성 평가 목적인 Comet assay등이 있다. 본 연구에서는 FETAX와 X. laevis Comet assay 기법을 이용하여 대량생산화학물질(High Product Volume; HPV) 5종을 대상으로 환경 유해성을 평가하였다. 한편, FETAX와 Comet assay의 시험 결과를 환경 유해성 자료로서의 활용이 가능한가를 검토하였다. 또한, 실제로 HPV 물질의 배출이 예상되는 산업공단 인근 하천의 퇴적토를 채취하여 동일 시험을 수행함으로써 두 기법의 현장 적용가능성을 판단하고자 하였다. HPV 물질 5종(Benzene, Ethylbenzene, Formaldehyde, Styrene, Tetrachloroethylene)에 대한 시험 결과, Formaldehyde와 Tetrachloroethylene이 최기형성 물질로 판단되어졌으며, Formaldehyde, Stylene 및 Tetrachloroethylene은 유전독성을 유발하는 것으로 관측되었다. 또한, Formaldehyde를 제외한 4가지 물질들은 올챙이 성장저해를 유발 시켰다. 두 기법의 관측종말점(endpoint)간의 상호 연관성을 조사한 결과, Benzene과 Formaldehyde의 경우, Comet assay 관측종말점인 TEM의 값이 클수록 FETAX의 mortality와 malformation 수준이 높아지는 상관성을 보였다. 그러나 Tetrachloroethylene의 경우, TEM(Tail Extent Moment)과 malfomation과의 상관성은 존재하나, TEM과 mortality와의 상관성은 낮은 것으로 나타났다. 이러한 결과는 두 가지 시험 기법에서 획득된 결과가 상호 보완적인 환경 유해성 정보로서 활용이 가능함을 보여주고 있다. 또한, 현장에서 채취된 퇴적토의 시험 결과, 인근 산업공단에서 HPV 물질이 배출될 것으로 예상되는 조사정점(S site)의 mortality, malformation 및 TEM 수준이 상대적으로 배출량이 적은 정점(R site)의 값보다 높게 나타났다. 이 같은 결과는 FETAX와 Comet assay가 화학물질에 의한 현장 오염도 평가에 적용될 수 있음을 시사해준다. 결론적으로, FETAX와 Comet assay를 이용하여 HPV 물질뿐만 아니라, 화학물질로 오염된 하천 퇴적토의 환경독성 평가가 가능하며, 두 가지 기법에 의한 시험 결과는 해당 물질의 환경 유해성 자료로서 활용이 가능하다고 사료된다. There exist various substances in the environment to cause cancers, genotoxicity, developmental toxicity and/or teratogenicity among toxic chemicals resulting in environmental pollutions. Especially, pollutants in the discharged water released from industrial complexes or places to process the industrial waste water have possibilities to adversely affect not only aquatic environment but also sediment/soils. Various species of creatures including amphibians show their sensitive reaction upon any exposure to environmentally toxic substances. Consequently, species of creatures with their high sensitivity to the chemical exposure including amphibians are utilized in evaluating the environmental toxicity. Representative species of amphibians for tests are Xenopus laevis (X. laevis) and the testing techniques for toxicity include FETAX for the teratogenicity evaluation, Comet assay for the genotoxicity evaluation, etc. This study carried out the environmental toxicity evaluation for five types of high product volume: HPV) using FETAX and X. Laevis Comet assay. On the other hand, the study reviewed whether or not the test results of both FETAX and Comet assay can be utilized as materials for the environmental toxicity. In addition, it attempted to make decisions on the applicability to the site for both techniques by performing the same tests with collecting sediments from rivers around the industrial complexes where HPV substances are expected to be discharged in reality. As a result of tests for five types of HPV substances (benzene, ethylbenzene, formaldehyde, styrene and tetrachloroethylene), both formaldehyde and tetrachloroethylene are thought to be substances to form teratogenicity while formaldehyde, stylene and tetrachloroethylene are observed as triggering the genotoxicity. In addition, four substances excluding formaldehyde triggered the growth inhibition for tadpoles. As a result of investigating the mutual correlations between the endpoint of two techniques, both benzene and formaldehyde showed correlations with higher levels of mortality and malformation along with higher values of TEM as the endpoint of Comet assay. However, tetrachloroethylene had the existence of correlation between TEM (Tail Extent Moment) and malformation, but it showed low correlation between TEM and mortality. Such results show us that results obtained from two testing techniques can be used as information for the environmental toxicity in a mutually supplementing way. In addition, as a result of tests for sediments collected from study area, mortality, malformation and TEM levels of S site where HPV substances were expected to be discharged from the neighboring industrial complexes showed higher values than R site with relatively smaller discharging amount. Such results imply that both FETAX and Comet assay can be applied to evaluations for the degree of pollution by chemicals at the site. As a result, it is possible to use FETAX and Comet assay in evaluating environmental toxicity for sediments in rivers polluted with chemicals as well as HPV substances, and the testing results from those two techniques are thought to have possibilities to be utilized as materials for the environmental toxicity for those substances.

Efficacy of anti-oxidant therapy to improve DNA damage level measured by the Comet assay

구형석 차의과학대학교 대학원 2018 국내석사

Objective: DNA damage increases according to aging due to the increased oxidative stress during whole life-span. Anti-oxidant therapy which fully supplements micronutrients and vitamins might improve the degree of oxidant DNA damage. We investigated the effect of anti-oxidant therapy on decreasing the degree of oxidative DNA damage in Comet assay. Material: 41 healthy participants who underwent anti-oxidant therapy during a period ranging from October 2010 to March 2012 were enrolled in CHAUM hospital. Methods: Based on the clinical laboratory data of the subjects, including the degree of oxidative DNA damage, on the Comet assay, they were given anti-oxidant therapies with intravenous nutritional therapy including multivitamin and multi-micronutrients. At 12 months after therapy, we analyzed changes in the degree of oxidative DNA damage and age related parameters. Results: All the parameters in Comet assay significantly decreased at 12 months after treatments. The tail length decreased from 55.20 ± 13.42μm at baseline to 47.63 ± 5.05μm at a follow-up (P=0.003). The tail DNA percentage also decreased from 15.65 ± 5.03% to 13.12 ±1.99% (P=0.004). The tail moment decreased from 9.44 ± 4.50 to 6.44 ± 1.24 (P<0.001). Conclusions: The anti-oxidant therapy was effective in improving the degree of DNA damage on the Comet assay. The degree of DNA damage is an indicator of several diseases, therefore anti-oxidant therapy might play a key role in maintaining healthy life in the ageing individuals. 연구배경 및 목적: 인간의 나이가 증가 할수록 체내 산화스트레스는 증가 및 축척 되고, 노화에 의존적인 DNA 손상은 지속적으로 진행되며 체내에 쌓이게 된다. 산화 스트레스의 주원인은 활성산소 생성과 항산화 과정의 손상으로 볼 수 있다. 참가자를 대상으로 처치 전 Comet assay를 통하여 개별의 DNA 손상 정도와 여러 호르몬을 측정 한 다음, 항산화 치료를 시행한 후에 DNA 손상 정도와 호르몬 수치의 변화를 보는 것이다. 연구대상 및 방법: 2010년 10월부터 2012년 3월까지 차움검진센터에 등록된 41명을 대상으로 초기 검사 후 정형화된 항산화 치료를 시행하였다. 치료 전과 후 각각의 Comet assay로 측정된 DNA손상 정도, 몸무게, 체질량 지수 및 insulin, IGF-1, DHEA-S, FSH, LH, Estradiol, testosterone, cortisol를 측정하였고 이들의 12개월 치료 후 변화를 관찰하였다. 각각 군에 대하여 치료 전 후 변수를 비교하기 위해 paired t-test(Wilcoxon signed rank test) 사용하였다. 연구 결과: 치료 전에 비해 치료 후 모든 참여군의 Comet assay 변수가 유의한 차이를 보였으며, tail length와 tail DNA percentage는 각각 55.20 ± 13.42μm에서 47.63 ± 5.05μm (P=0.003) 와 15.65 ± 5.03% 에서13.12 ±1.99% (P=0.004)로 감소하였고, tail moment 역시 9.44 ± 4.50 에서 6.44 ± 1.24으로 감소하였다. (P<0.001) 결론: 본 연구에서 시행된 항산화 치료는 Comet assay로 측정된 DNA 손상 정도를 감소시키는 것을 관찰 할 수 있었다. Comet assay로 측정된 DNA 손상 정도가 실제 노화진행을 직접적으로 반영한다고 보긴 어렵지만, 본 연구의 결과로 인하여 특정 항산화 치료가 Comet assay로 측정된 DNA손상의 회복에 긍정적 효과를 낼 수 있을 것으로 기대된다.

Evaluation of cigarette smoke-induced cytogenotoxicity using in vitro assays

이정은 성균관대학교 일반대학원 2015 국내석사

Since in vitro testing methods provide valuable information for cyto-genotoxicity of cigarette, regulatory authorities recommend submitting the toxicity data obtained by various in vitro methods. In vitro toxicity testing methods such as NRU assay, AMES and MN test for regulation of cigarette smoke-induced toxicity were recommended in Health Canada. Although these assays were also suggested both in OECD and CORESTA guidelines, there are different experimental conditions from guidelines for evaluating cyto-genotoxicity of cigarette smoke samples. Therefore, the aim of this study is to assess cyto-genotoxicity of cigarette smoke with established test methods. In this study, we used cigarette smoke samples obtained from reference cigarette (3R4F) and two commercial cigarettes (“Tonino Lamborghini” and “This Wild”) produced in Korea. In cytotoxicity test, we compared the sensitivity different cell types including BALB/c 3T3, CHO-K1 and A549 calculating LC50 values for cigarette smoke samples derived from reference cigarette 3R4F). Then, the most sensitive assay for suitable cells was determined by three cytotoxicity assays including NRU, MTT and WST-1 assay. Ultimately, cytotoxicity of commercial cigarettes was evaluated by using determined cell line and assay. In genotoxicity tests including Ames test, MN test and comet assay, experimental condition was optimized such as metabolic activation, exposure time and concentration of cytochalasin B, using cigarette smoke condensate obtained from 3R4F.Then, genotoxicity of commercial cigarettes was evaluated quantifying their genotoxicity. The results showed that the BALB/c 3T3 cells had slightly higher sensitivity compared to the other cell lines and NRU assay was the most suitable for BALB/c 3T3 cells in cytotoxicity test of cigarette. The LC50 value of 3R4F was the lowest among three cigarette smoke samples when using NRU assay on BALB/c 3T3 cells. In genotoxicity assays, exposure time was established for 24 h in Ames test and 3h in comet assay and MN test with metabolic activation. In particular, the concentration of cytochalasin B was determined to 0.75 μg/ml in MN test. All three cigarette smoke condensates induced genotoxicity in dose-dependent manner and the genotoxicity of 3R4F was the most potent among three cigarette smoke condensates.

Comet assay를 이용한 환경오염 물질의 유전독성 모니터링 연구

박선영 서울시립대학교 2005 국내석사

본 연구에서는 다양한 환경 유해물질들의 유전 독성을 평가하기 위해 동물 세포주 및 생태 지표종에서의 comet assay를 이용한 DNA 손상 측정 기법을 정립하고, 대표적인 발암물질인 benzo[a]pyrene을 처리한 인간 간암 세포주에서의 DNA 손상의 기전을 살펴보고자 하였다. 동물 세포주에서 전통적인 산화적 스트레스의 생체 지표인 항산화 효소의 측정을 수행한 결과, 환경 유해 물질로 인한 catalase 및 GPx의 활성의 증가 또는 감소를 관찰할 수는 있었으나, 변화의 정도가 너무 작거나, 경향성이 낮았다. 그에 비해 comet assay를 이용한 DNA 손상의 측정은 유해 물질 처리에 따른 변화가 관찰하기 쉽고, 비교적 민감하게 나타나고 보이고 있다. 동물 세포주 및 생태 지표 생물종에서 처리 물질 대부분이 처리농도에 비례하는 DNA 손상을 보였고, 유의성도 상당히 높았다. DNA의 손상의 기전을 관찰하기 위해 HepG2 세포에 benzo[a]pyrene을 처리하여 본 결과, 산화적 스트레스의 지표인 catalase와 MDA, NF-kB의 활성은 유의하게 증가하였고, DNA 손상 역시 높게 관찰되었으나, apoptosis는 나타나지 않아, comet assay로 관찰할 수 있는 DNA 손상 수준이 낮은 것으로 생각된다. 환경 시료인 하수 처리장 유입수과 목재 열분해 산물인 bio-oil에서 유전독성을 관찰한 결과를 살펴보면 하수 처리장 유입수의 경우, 세포 독성은 낮은 편이지만, DNA 손상이 관찰되었고, bio-oil 경우, 높은 세포 독성을 보였으나, 높은 휘발성으로 세포 처리 시간이 비교적 짧아 DNA 손상은 크게 나타나지 않았다. Comet assay는 인체 및 생태의 유전 독성을 확인하는데 유용한 기법으로 활용될 수 있을 것이다. 주요어 - 세포 독성; 유전독성; Comet assay; 환경모니터링 Effects of various environmental pollutants were evaluated on DNA damage, lipid peroxidation, transcription factor induction and antioxidant enzyme activity in human cell lines and biomonitoring species, Daphnia and Chironomus. Focuses were given on screening of cytotoxic and genotoxic properties of environmental pollutants through cell viability test and Comet assay, respectively. DNA damage was more sensitive endpoint than antioxidant enzyme activities. Benzo[a]pyrene induced DNA damage, and P53 induction was concomitantly observed however, these phenomenon were not related to apoptosis. Sewage treatment plant influent water seems to possess genotoxic property, whereas pyrolysis product possess cytotoxic property. Taken into account of overall results, cytotoxic and genotoxic tests seem to be useful tools in rapid screening of hazardous properties of environmental samples. Keywords- cytotoxicity; genotoxicity; Comet assay; environmental monitoring

Tris(2-butoxyethyl) phosphate의 내분비계 장애작용에 관한 연구

강현규 창원대학교 2021 국내석사

Tris(2-butoxyethyl) phosphate(TBOEP) is organophosphorous flame retardants(OPFRs) and is widely used as a substitute of polybrominated diphenyl ethers(PBDEs). TBOEP is contaminated in ubiquitous environments and is most consistently detected in human urine, serum and breast milk. Also TBOEP has been found to cause endocrine disrupting effects of aquatic animals and in vitro test. However, limited information is available about the endocrine disrupting effects of TBOEP. This study performed the in vivo Uterotrophic and Hershberger assays and in vitro E-screen assay proposed by the OECD. And MTT assay was performed to compare the cytotoxicity between mouse fibroblast cells(NIH-3T3) and mouse Leydig cells(TM3) to investigate endocrine disrupting effects of TBOEP. For Uterotrophic assay, the ovariectomized female SD rats were orally received to TBOEP in a corn oil(10 ml/kg/day) at dose of 40, 200, or 1000 mg/kg/day and subcutaneously received 17β-estradiol(E2, 10 μg/kg/day) as positive controls for 3 days. For Hershberger assay, the castrated male SD rats were orally received to TBOEP in a corn oil(10 ml/kg/day) at same dose of Uterotrophic assay and orally received flutamide(3 mg/kg/day) as positive controls for 10 days. Also, all castrated male SD rats subcutaneously received testosterone(0.4 mg/kg/day). For E-screen assay, MCF-7 cells(human breast cancer) were cultured and treated with TBOEP(1 nM ~ 100 μM) and E2(1 nM) for 144 h, respectively. In the Uterotrophic assay and Hershberger assay, TBOEP caused neither a significant increase of wieghts in wet and blotted uterus nor a significant decrease of weights in androgen-dependent tissue including glans penis, ventral prostate, seminal vesicles, cowper’s gland and levator ani-bulbocavernosus. In the E-screen assay, 10 nM of TBOEP significantly increased cell proliferation, but were not dose dependent relationship. In the MTT assay, TBOEP significantly reduced NIH-3T3 and TM3 cells viability in a concentration-dependent manner and the LC50 values were recorded as 258.9 μM and 259.3 μM, respectively. From the results above, it was shown that TBOEP could be a safer alternative to PBDEs as a flame retardants.

Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) assay에서 다양한 특수염색법에 따른 조직병리학적 평가

정미경 계명대학교 대학원 2019 국내석사

The BCOP assay, an alternative eye irritation test, calculate the In vitro irritancy score (IVIS) using the opacity and permeability of the bovine cornea after application of test substance. If the IVIS is less than 3, it is classified as a non-irritant, and exceeds 55, it is classified as a severe irritant. However, the irritant classification of IVIS > 3, ≤ 55 is not clear. To overcome this limit, histopathological evaluation was recommended. However, in various studies, only H&E staining was applied or the limited observation result of corneal epithelium was showed. In this study, histopathological evaluation was performed to predict and classify the irritation of test substance in BCOP assay. To analyze the corneal lesions according to corneal structure and special staining methods, various special staining methods of H&E, MT and PAS staining were performed. The 9 test substances used in the BCOP assay were listed in OECD test guide line 437 and UN GHS classification system. The cornea was removed from the eye ball of slaughter cattle, and the initial opacity was measured after post-incubation at 32℃ for 1 hour. The MEM medium was then removed and the test substance was treated to the corneal epithelium and incubated at 32℃. The incubated cornea was washed with MEM medium and the final of opacity was measured. Fluorescein sodium solution was treated of corneal epithelium and incubated at 32℃. After incubation, MEM in the lower chamber was divided into 96 well plate and measured the absorbance (490 nm), and calculated the permeability. The corneal tissues were classified according to the IVIS classification criteria presented in OECD test guideline 437 after BCOP assay, and three special staining methods were carried out for histopathological evaluation. Histopathological evaluation of non-irritant substance as IVIS ≤3, in all special staining methods, was showed stable corneal structure without damage. In unpredictable irritant substances (IVIS >3, ≤55), the swelling around corneal epithelial cell was observed at H&E staining, and loose collagen bundle of stroma was confirmed with MT staining. In PAS staining, bleaching in the corneal epithelium and a basement membrane with reduced visibility compared to non-irritant substance were shown. The cornea of no. 3 which has the highest IVIS showed increased severe swelling in whole cornea and condensation in the basal cell layer using H&E staining. The loose collagen bundles and vacuolation around the keratocyte were also examined by MT staining. Bleaching of corneal epithelial layer, reduction in clarification and thickness of basement membrane were confirmed by PAS staining. And we set the criteria and grade about histopathological evaluation based on the above results. The stepwise analysis for irritation of the test substance was carried out through the histopathological evaluation. From this analysis result, we confirmed that the range of irritation in cornea was increased in accordance with the irritation degree of test substance. 안 자극 대체시험법인 BCOP assay 는 도축 된 소 각막에 시험물질 적용 후 혼탁도와 투과를 측정하여 안 자극 지수인 In vitro irritancy score (IVIS) 을 산출한다. 산출된 IVIS가 3 이하인 경우 비자극, 55 초과 시 강한 자극으로 분류하지만 IVIS >3, ≤55 의 시험물질에 대한 자극분류가 명확하지 않다는 한계를 가진다. 이러한 한계를 보완하기 위해 BCOP assay 종료 후 추가적으로 각막의 조직병리학적 평가가 수행되고 있다. 그러나 다수의 연구에서는 H&E 염색만을 적용하거나, 각막 상피에 국한된 관찰결과를 보였다. 본 연구에서는 BCOP assay 후 시험물질의 자극 예측 및 평가를 위해 조직병리학적 평가를 시행하였다. 각막의 구조 및 특수염색법에 따른 각막 병변 분석을 위해 각막 조직 내 H&E 염색, MT 염색 및 PAS 염색을 적용하였다. BCOP assay에 사용된 시험물질로는 OECD test guideline 437과 UN GHS 분류 시스템에 제시 된 9종의 물질을 선정하였다. 도축 된 소의 안구에서 각막만을 분리한 뒤 32℃에서 1시간 전배양 후 초기 혼탁도를 측정하였다. 이후 시험물질은 각막 상피에 적용하여 32℃ 에서 배양하였다. 배양 종료 후 MEM을 사용하여 세척한 뒤 후기 혼탁도를 측정하였다. Fluorescein sodium 용액은 각막 상피 적용 후 32℃에서 배양 후 하단 챔버의 MEM은 96 well plate에 분주한 뒤 흡광도 (490 nm)를 측정하여 투과도를 계산하였다. 실험 종료 후 각막 조직은 OECD test guideline 437에 제시 된 IVIS 기준에 따라 분류하였으며, 세 가지 특수 염색 후 조직병리학적 평가를 진행하였다. IVIS 3 이하인 비 자극물질의 조직병리학적 관찰 시 모든 특수 염색에서 각막의 손상은 확인되지 않았으며 안정적인 형태를 보였다. 자극 예측불가(IVIS >3, ≤55) 시험물질에서 H&E 염색을 통해 각막 상피층 내 핵 주위의 부종이 관찰되었으며, MT 염색에서 각막 기질 내 collagen bundle이 늘어지는 양상이 확인되었다. PAS 염색 각막의 상피층 내 표백화가 관찰되었으며, 비 자극 물질 대비 선명도가 감소 된 기저막을 확인되었다. 강 자극 물질 중 가장 높은 IVIS (236.9)를 보인 3번의 각막의 경우, 각막전체부종 심화 및 기저 세포층 내 핵 응축의 증가가 관찰되었다. MT 염색에서 collagen bundle 늘어짐 및 keratocyte 주위 공포의 증가를 보였다. 또한 PAS 염색에서 각막 상피층의 표백화 및 basement membrane 선명도와 두께의 감소를 확인하였다. 위 결과를 바탕으로 조직병리학적 평가를 위한 기준 및 등급을 설정하였다. 다양한 특수염색법을 이용한 조직병리학적 평가를 통해 시험물질에 대한 자극의 단계적인 분석이 진행되었으며, 자극이 증가할수록 각막의 하위 구조까지 자극 범위가 확대되는 것을 확인하였다. 본 연구 결과는 BCOP assay 에서 시험물질의 자극예측 및 분류에 대한 정보를 제공할 것이라 판단되며, 추후 시험법의 개선 및 안 점막자극 대체시험법의 발전에 기여할 것으로 기대된다.

Cell-based assay detecting compounds with estrogen receptor dimerization activity

Huiwon Seo 동국대학교 일반대학원 2024 국내박사

에스트로겐은 스테로이드 호르몬 그룹에 속하는 대표적 여성 호르몬으로 여성의 2차 성징의 다양한 측면을 조절한다. 세포 성장, 생식 및 발달과 같은 생리적 기능은 두 가지 하위 유형의 에스트로겐 수용체인 알파와 베타에 의해 매개된다. 에스트로겐 수용체는 세포질에서 에스트로겐과 결합하여 에스트로겐 반응 요소와 상호작용하는 복합체를 형성하고 리간드 유도 전사 인자로 작용하여 궁극적으로 인체 내 다양한 생리학적 기능을 조절한다. 에스트로겐성 내분비계 장애물질은 인체 에스트로겐과 유사한 특성을 지니며 식품, 화장품, 농약, 포장재 등 다양한 경로를 통해 유입될 수 있다. 에스트로겐성 내분비계 장애물질은 에스트로겐 수용체와의 상호작용을 통해 에스트로겐 신호 전달 경로를 방해하여 호르몬 시스템을 교란시킬 수 있다. 반면, 일부 의학적 측면에서는 호르몬 불균형으로 인한 다양한 질병의 발생과 진행을 조절하는 의약품으로 사용할 수 있다는 양면성을 지닌다. 현재, 경제협력개발기구(OECD)에서는 에스트로겐성 내분비계 장애물질을 평가할 수 있는 공인된 체외 시험법으로 에스트로겐 수용체 알파 결합 시험법(TG 493)과 에스트로겐 수용체 전사활성 시험법(TG 455)을 제공하고 있다. 전체 세포 수준에서의 에스트로겐 신호 전달 경로와 특정 에스트로겐 수용체와의 상호작용을 명확히 규명하기 위해서는 초기 수용체와의 결합과 DNA 전사 활성화 사이의 추가적인 메커니즘 기반의 분석법이 필요하다. 따라서, 결합과 전사반응 사이의 에스트로겐 수용체 이합체화 활성을 평가할 수 있는 새로운 분석법을 개발하는 것이 본 연구의 목표이다. 제 2 장에서는 생물발광 공명에너지 전달(Bioluminescence Resonance Energy Transfer, BRET) 기술을 기반으로 에스트로겐 수용체 알파 이합체화 시험법을 개발했다. BRET 시스템을 구현하기 위해 인체 에스트로겐 수용체 알파가 생물발광 에너지 공여체 및 형광 에너지 수용체와 융합된 재조합 벡터 4종을 제작했다. 4개의 벡터 조합 중 공여체와 수용체가 1:1 비율로 에스트로겐 수용체 알파의 N말단에 융합되었을 때 가장 높은 유도 배수 값이 도출되어 최적의 조합임을 확인했다. 이를 인간 배아 신장 293(human embryonic kidney 293, HEK293) 세포에 형질감염시켜 영구 안정화 세포주를 확립했다. 대표적 에스트로겐 유사체인 17β-Estradiol(E2)와의 농도 의존적 반응을 확인함으로써 영구 안정화 세포주를 검증했다. 제 3장에서는 2장과 유사한 방법론에 따라 BRET 기반 에스트로겐 수용체 베타 이합체화 시험법을 개발했다. 에스트로겐 수용체 베타의 경우, 재조합 벡터 4종의 조합 중 공여체와 수용체가 1:1 비율로 에스트로겐 수용체 베타의 C말단에 융합되었을 때 최적의 조합임을 확인했으며, 영구 안정화 세포주를 구축했다. 제 4장에서는 개발한 BRET 기반 에스트로겐 수용체 알파 및 베타 이합체화 시험법을 확립 및 검증했다. 전처리 시간에 따른 E2와의 이합체화 활성 평가를 통해 에스트로겐 수용체 알파는 48시간, 베타는 24시간 전처리 조건에서 가장 높은 이합체화를 매개하는 것을 확인했다. 개발한 시험법의 정확성을 입증하기 위해, Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM)에서 제시하고 있는 72종의 물질에 대하여 에스트로겐 수용체 알파와의 이합체화 활성을 측정했다. 양성대조군 물질 1 nM E2에 의해 유도된 반응의 35% 이상인 양성 물질은 51종이었다. ICCVAM 보고서의 통합 분석 결과와 비교하여 개발한 시험법은 정확도 77.8%, 민감도 74.5%, 특이도 85.7%를 나타냈다. 추가로 27종 물질에 대한 에스트로겐 수용체 알파 이합체화 활성을 평가한 결과, 23종 물질이 이합체화를 매개했다. 에스트로겐 수용체 베타는 57종 물질을 선정하여 평가한 결과, 36종 물질이 이합체화를 매개하여 양성 물질로 판정됐다. 에스트로겐 수용체 베타 이합체화 시험법은 현재 공인된 체외 시험법이 뒷받침되지 않아 결과 비교가 불가능했으나, 해당 시험법의 정확성은 에스트로겐 수용체 알파 이합체화 시험법의 입증된 정확성을 기반으로 그 신뢰성을 확인했다. 제 5장에서는 이전에 에스트로겐 수용체 알파 및 베타 이합체화 활성에 대해 평가된 57종 화학물질에 대하여 에스트로겐 수용체 전사활성 시험법(TG 455)을 이용하여 전사활성을 평가했다. 57종 물질 중 39종 물질이 양성대조군 물질에 의해 유도된 반응의 20% 이상인 전사 활성을 보여 작용제였다. 반면, 양성대조군 물질에 의해 유도된 반응의 20% 이상의 활성을 저해하는 길항제 물질은 10종이었다. 이어서, 4장에서 연구한 57종 물질의 수용체 알파와 베타 이합체화 활성 결과 및 공인시험법인 결합 시험법(TG 493)의 결과와 비교했다. 이를 통해 57종 물질에 대한 에스트로겐 활성을 제공했고, 신호 전달 경로를 식별할 수 있었다. 결론적으로, 본 연구를 통해 개발한 BRET 기반 에스트로겐 수용체 알파 및 베타 이합체화 시험법은 에스트로겐성 내분비계 장애물질을 평가하는데 유용한 고처리량 스크리닝 방법임을 확인했다. 또한, 결합, 이합체화 및 전사활성화 반응 사이의 복잡한 상호작용을 명확하게 규명하여 세포 에스트로겐 신호 전달 경로 내에서 특정 에스트로겐 수용체 결합 및 기능을 찾아낼 수 있는 수단임을 시사한다. Estrogens are a group of steroid hormones that represent the predominant female sex hormones. Their primary function is to regulate various aspects of female secondary sexual characteristics, including the development of breasts, the maintenance of the endometrium, and the regulation of the menstrual cycle. Estrogens also play essential roles in physiological processes such as cell growth, reproduction, and development. These functions are mediated through two subtypes of estrogen receptors (ERs), known as ER alpha (ERα) and ER beta (ERβ). Estrogen binds to and forms a dimerization with the ER in the cytoplasm, and the formed dimerization moves into the nucleus and binds to estrogen response elements (EREs) on DNA to activate transcription. Estrogenic endocrine disruptors share similarities with human estrogen and can enter the body through various routes, including food, cosmetics, pesticides, and packaging materials. These disruptors can interfere with the hormonal system by interacting with the estrogen signaling pathway through their interaction with estrogen receptors. However, in some medical contexts, compounds with estrogenic properties can be employed as treatments to manage the development and progression of certain diseases resulting from hormonal imbalances. Estrogen-related in vitro test methods currently certified by the Organization for Economic Co-operation and Development (OECD) include an ERα binding assay (test guideline [TG] No. 493) and ER transactivation assay (TG No. 455). Further mechanism-based high-throughput analysis between nascent receptor binding and DNA transactivation are needed to characterize whole cell-level signaling pathways and ER-mediated interactions. Therefore, in this study, a new assay was developed to evaluate whether receptor dimerization is mediated, which is a step between binding and transcription. In Chapter 2, an ERα dimerization assay was developed using bioluminescence resonance energy transfer (BRET) technology. To implement the BRET system, four recombinant vectors were created, where human ERα was fused with a bioluminescent energy donor and a fluorescent energy acceptor. Among the four possible combinations, it was confirmed that the optimal combination was when the donor and acceptor were fused to the N terminus of the ERα. This was transfected into human embryonic kidney 293 (HEK293) cells to construct a cell line. A permanently stabilized cell line was constructed by confirming the concentration-dependent response with 17β-Estradiol (E2), a representative estrogen analogue. In Chapter 3, a BRET-based ERβ dimerization assay was also developed, following a similar methodology to Chapter 2. In the case of ERβ, among the four combinations of recombinant vectors, the optimal combination was when the donor and acceptor were fused to the C terminus of ERβ. This construct was then transfected to create a stable cell line for further experimentation. In Chapter 4, the BRET-based ERα and ERβ dimerization assays that were previously developed were established and validated. Through an assessment of the reaction with E2 with varying preconditioning times, it was observed that the highest dimerization reaction occurred when ERα was pre-conditioned for 48 hours, and ERβ was pre-conditioned for 24 hours. To demonstrate the accuracy of the developed assay, the dimerization activity of ERα was measured for 72 chemicals suggested by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM). There were 51 positive chemicals that accounted for more than 35% of the response induced by the positive control 1 nM E2. When compared to the integrated analysis results presented in the ICCVAM report, the developed assay demonstrated an accuracy of 77.8%, a sensitivity of 74.5%, and a specificity of 85.7%. Furthermore, when evaluating ERα dimerization activity for 27 chemicals with the potential to disrupt the endocrine system, it was found that 23 of these chemicals mediated dimerization. As for the evaluation of 57 different types of chemicals for ERβ, 36 of them were determined to be positive by virtue of their ability to mediate dimerization. It's important to note that, as of now, there is no officially certified in vitro assay available for ERβ dimerization, making it impossible to directly compare results. However, confidence in the accuracy of this assay is bolstered by the demonstrated precision of the ERα dimerization assay. Finally, in Chapter 5, the transcriptional activity of the 57 chemicals, which were previously evaluated for both ERα and ERβ dimerization activities, was assessed using the ER transactivation assay (TG No. 455). Of the 57 chemicals, 39 chemicals were agonists, showing transcriptional activity greater than 20% of the response induced by the positive control. On the other hand, there were 10 types of antagonist substances that inhibited more than 20% of the activity of the reaction induced by the positive control. Based on these results, the results of the ERα and ERβ dimerization activities of the 57 chemicals studied in Chapter 4 were compared with the results of the ERα binding assay (TG No. 493), a certified assay. Through this, estrogenic activity was provided for 57 chemicals, and signal transduction pathways were identified. Consequently, BRET-based ER dimerization assays are suitable as high-throughput screening methods to evaluate the estrogenic endocrine disrupting activity of chemicals. Moreover, these assays shed light on the intricate interplay between binding, dimerization, and transactivation responses, offering a means to pinpoint specific ER binding and functions within cellular estrogen signaling pathways.

Multiplex Colorimetric Diagnosis for Point of Care Test Using Encoded Microparticle

정윤진 서울대학교 대학원 2019 국내박사

In this dissertation, a multiplex colorimetric diagnosis platform using encoded microparticles is proposed. Multiple target biomolecules can be detected by an office scanner as a concept of point of care tests within low-resource settings. The encoded microparticles guarantee high multiplexing capacity up to millions. Detection using gold nanoparticles in platform was demonstrated with assay results according to the color change of the encoded microparticles. Realizing scanner-based multiplex assay, this platform’s novelty lies in fabrication of the encoded particles with two materials and introduction of a signal enhancement step to the multiplex bead-based assay using deposition of gold for higher sensitivity. The encoded microparticles, in which the engraved codes indicate the types of target molecules, are prepared to capture target. The design of the particles including the size and the materials were determined, to analyze the assay results with images taken by scanners. Also, the high-throughput fabrication methods have been developed to guarantee that more than 1000 particles can be fabricated in less than 3 minutes. The encoded particles with a single code are coated by silica and chemically conjugated to one type of capture molecules. This pairing guarantees the code to indicate the type of target molecules in multiplexing assay. The encoded microparticles targeting various molecules are pooled and reacted to samples with target molecules. After capturing targets on the multiple types of encoded particles, the particles conjugated with targets react with detection molecules. The detection molecules include gold nanoparticles to change the levels of target molecules into color signals. If the signal is too weak, a signal enhancement step is introduced using gold deposition to the seed gold nanoparticles with targets. After the whole colorimetric assay, the reacted particles are imaged using an office scanner, from which the code and the assay results are analyzed using image processing. The size of the microparticles was considered according to the proper resolution of the scanners. To be applied to various situations, two types of particles have been developed and utilized. 900μm particles with 2.5 million kinds of character codes and 300μm particles with 70-256 kinds of binary codes are developed to be scanned with 1200 and 4800 dpi respectively. As a proof of concept to show a wide range of applications, proteins and genes are detected. Using 4-plex assay, multiple sclerosis autoimmune disease patients are classified from healthy people with p<0.0001 in an unpaired t-test. Using 3-plex assay, bacterial meningitis genes are detected within 1000 molecules. This scanner-based assay platform can expand the clinical impacts of the multiplex assay. This platform can be applied to various circumstances where high-resource settings have not been set. With operators and scanners, the platform can be applied to multiplex assay in high multiplexing capacity and high throughput. 본 학위 논문에서는 동시다발적으로 단백질이나 유전물질을 색변화를 통해 진단할 수 있는 플랫폼을 개발하였다. 본 플랫폼은 최종적으로 오피스 스캐너로 분석할 수 있기에 고가의 장비 없이 환자와 보다 가까운 곳에서 활용될 수 있는 기술이다. 코드화된 미세입자를 통해 한 샘플에서 동시에 여러 가지 진단을 가능하게 하였으며, 금 나노입자를 통해 분석 결과가 색 변화로 나타나 스캐너로 검출할 수 있도록 하였다. 해당 기술을 구현하기 위하여 미세입자를 두 가지 물질로 구성되도록 제작하였고 빠르게 대용량으로 제작하는 기술 역시 개발하였다. 또한 색변화로 적은 양의 물질을 검출할 수 있도록 신호 증폭 기술을 입자 기반 진단 기술에 적용하였다. 본 플랫폼을 개발하기 위해서 우선 표적 생체물질을 잡을 수 있는 코드화된 미세입자를 제작하였다. 스캐너로도 분석에 충분한 이미지를 얻을 수 있도록 크기와 물질 등의 디자인이 고려되었다. 본 미세입자를 3분 이내에 1 000 개 이상 제작할 수 있는 방법 역시 개발하였다. 제작된 코드화된 미세입자는 표적 생체물질만을 붙잡을 수 있도록 실리카 코팅된 후 화학적으로 포획분자가 코드 별로 다르게 부착된다. 여러 물질을 표적하는 코드화된 미세입자들은 함께 섞인 뒤에 표적물질이 있는 샘플과 동시다발적으로 반응한다. 표적물질을 반응 시킨 후에는 표적물질의 존재를 색변화로 나타낼 수 있도록 미세입자에 부착된 표적물질에만 골드 나노파티클이 붙게 된다. 신호가 약한 경우 골드 나노파티클의 크기를 키우는 반응을 통해 신호를 증폭시켜 확인한다. 반응이 모두 끝난 이후 미세입자들은 스캐너로 관측이 되고, 이미지 처리를 통해 코드와 표적물질의 양에 따라 변화된 색변화를 분석한다. 코드는 표적 물질의 종류를 나타내고, 색변화는 표적물질의 존재 정도에 비례하여 나타난다. 미세입자의 크기는 스캐너의 해상도에 직접적으로 연관이 있으므로 1 200 dpi 에서 분석이 가능한 900μm 미세입자와 4 800 dpi 에서 분석이 가능한 300μm 미세입자를 개발하였다. 각 입자는 문자코드를 활용하여 250만 개 이상의 코드를 가질 수 있고, 2진법의 코드를 활용하여 70 에서 256 개의 코드를 가질 수 있도록 개발되었다. 본 플랫폼이 다양한 진단 상황에 적용될 수 있음을 보이기 위하여, 환자 샘플에서 자가면역질환 관련 항체를 검출하는 실험과 적은 양의 박테리아 뇌수막염 관련 유전체를 검출하는 실험을 진행하였다. 4 종류의 동시다발적 분석을 통해 자가면역 질환 환자와 건강한 사람을 비쌍체 t 검정에서 p<0.0001 로 구분할 수 있었으며, 3 종류의 동시다발적 분석을 통해 박테리아 뇌수막염 관련 유전체를 1 000 개까지 검출해낼 수 있었다. 본 플랫폼을 통해 동시다발적 진단 기술의 의료 혜택을 보다 널리 확장시킬 수 있을 것으로 기대된다. 본 플랫폼은 고가의 장비들이 구축되지 않은 환경에서도 스캐너만 있다면 구현될 수 있으며 많은 수의 표적 물질을 동시에 확인할 수 있고 병렬적으로 많은 샘플을 진단할 수 있도록 개발되었기 때문이다.

Characterization of microsomal prostaglandin E₂synthase-1 (mPGES-1) and identification of inhibitory compounds using a novel coupled enzyme assay system. : 프로스타글란딘 E₂합성효소의 특성과 두 효소 에세이 시스템을 이용한 활성 억제 물질의 확인

최경아 국민대학교 일반대학원 2010 국내석사