미세유로 장치를 이용한 단클론 항체 생산용 형질 B세포 선별 방법

최화옥 인제대학교 일반대학원 2016 국내석사

항체는 생명 과학 기초 연구 뿐 아니라 질병의 진단, 치료 등 여러 의료 목적에 사용되고 있다. 항체의 생산에는 많은 시간과 비용이 소요되며, 항원의 종류가 같은 경우라도 항원 주입 양과 시기, 항원을 주입받는 동물 종 등에 따라 생성되는 항체와 항원의 반응정도가 달라지기 때문에 항체를 이용하는 실험의 재현성과 진단, 치료의 효율에 커다란 영향을 미치게 된다. 그러므로 본 연구에서는 이러한 문제를 개선하고자 생체외에서 단클론 항체를 개발할 수 있는 새로운 방법을 구상하였다. 이를 위하여 생쥐에 항원을 주사하여 항체를 생산하는 B 세포의 활성화를 유도한 후 항체를 암호화하는 유전자를 확보하였다. 항원으로는 제브라피쉬의 사이클린 B1(Cyclin B1)과 사이클린 B2(Cyclin B2) 단백질의 특정부위의 펩티드를 이용하였다. 항체를 생산하는 세포인 형질 B세포(plasma B cell)를 분리하기 위해 마이크로 크기의 장치를 제작하는 기술인 MEMS (microelectromechanical systems) 기반의 미세유로 장치를 사용하였다. 미세유로 장치 내부에 형질 B세포 특이적 항체를 부착하여 항원-항체 반응을 통해 형질 B세포를 분리하였으며, 분리된 세포로부터 항체를 암호화하는 유전자 서열을 획득하기 위해 5′RACE (5′Rapid amplification of cDNA Ends) PCR을 수행하였다. 획득한 항체 유전자의 서열 분석을 통하여 분리한 클론이 항체를 암호화하는 유전자 서열을 포함한다는 것을 확인하였다. 이 유전자 클론을 human embryonic kidney (HEK) 293T세포에 형질 주입한 후 단클론 항체를 생산하고자 한다. 본 연구는 MEMS 기반의 미세유로 장치를 이용하여 효율적으로 특정 세포를 분리할 수 있는 방법을 구축하였으며, 또한 비교적 짧은 시간에 특정 단백질에 대한 단클론 항체 생산 가능성을 제시한다. Antibodies have been used for various medical purposes such as diagnosis and treatment of diseases as well as many biological experiments. The production of antibodies is such a time-consuming and costly process. Furthermore, efficiency of antibody reacting to a specific antigen may be variable according to the amount of antigen and timing of antigen injection. Species of animals injected with an antigen also affect the efficiency. These various factors have a significant influence on reproducibility of biological experiments, accuracy of diagnosis and efficiency of treatment. Therefore, this study is aimed to establish a new method for monoclonal antibody production. For this purpose I injected the antigens into mice to activate B cells producing specific antibodies and obtained the antibody coding genes from plasma B cells. The peptides for zebrafish Cyclin B1 and Cyclin B2 protein sequences were used as antigens. MEMS (Microelectromechanical systems) based microfluidic device was used for isolation of plasma B cell producing the antibodies. Plasma B cells were isolated using the microfluidic chip attached plasma B cell specific antibodies. 5′RACE (5′Rapid amplification of cDNA ends) PCR was carried out to obtain the antibody coding genes against zebrafish Cyclin B1 and Cyclin B2 proteins. The genes will be transfected into the HEK 293 cell line to produce antibody. This study established a specific new method for plasma B cell isolation and proposes a new technique to produce monoclonal antibody which is specific for a protein in a short time.

대전지역 대학병원에서 동정된 비예기항체의 분포와 빈도

강희정 을지대학교 보건대학원 2010 국내석사

비예기항체는 급성 및 지연성 수혈 부작용을 일으키는 원인이 되므로 수혈 전 비예기 항체 선별 및 동정검사는 매우 중요하다. 비예기항체를 증명하기 위한 검사법으로 예전에는 시험관법을 많이 이용하여 왔는데 최근에는 방법이 간편하고 온난 항체의 검출율이 높은 원주응집법을 많이 이용한다. 이에 본 연구에서는 수혈의뢰 환자들을 대상으로 최근 5년간 원주응집법으로 동정된 비예기항체의 빈도 및 분포를 알아보고 항체가 동정된 환자들의 수혈의 임상적 특성을 알아보고자 하였다. 2005년 1월부터 2009년 12월까지 DiaMed-ID System (DiaMed, Murten, Switzerland)을 이용하여 E대학병원에서 선별검사가 의뢰된 46,923건을 대상으로 검사를 시행하였고 98건을 동정하였다. 선별검사가 시행된 46,923명 중 272명(0.58%)에서 양성반응을 보였고, 98예에서 비예기항체가 동정되었다. 가장 많은 빈도로 검출된 비예기항체는 온난항체인 Rh계열로 47예(47.96%)가 동정되었고, Lewis계열과 MNSs계열이 각각 11예(11.22%)와 6예(6.12%)로 동정되었다. 또한 정확하게 동정되지 않은 비예기항체는 6예(6.12%)였다. 비예기항체 선별검사에서 양성이 나와 동정된 98명의 환자의 과거력을 조사한 결과 44예(44.90%)에서 수혈기왕력이 있었다. 비예기항체 선별검사가 음성에서 양성으로 바뀐 수혈기왕력이 있는 13예 중 anti-E가 4예(30.77%)로 가장 높은 빈도로 동정되었다. 본 연구에서 동정된 비예기항체의 빈도 및 분포는 앞으로도 비예기항체 빈도 및 분포 등의 성상에 대한 기초 자료로 이용될 수 있을 것으로 사료된다.

Characteristics of Red Blood Cell Alloimmunization Observed in Patients with Hematologic Disease

안규대 동아대학교 대학원 2018 국내석사

Introduction : Patients with hematologic diseases receive frequent transfusions of red blood cells (RBCs), platelets (PLTs), and fresh frozen plasma (FFP). These patients are more likely to develop alloimmunization due to repeated exposure to RBC antigens. Delayed hemolytic transfusion reactions may occur and it may be difficult to find suitable blood. In Korea, except for ABO and RhD, there is no test for compatibility with RBC antigens. The purpose of this study was to investigate the need for extended RBC matching in patients with hematologic diseases and history of repeated transfusions. Materials and Methods : We assessed patients who had undergone bone marrow examination at Dong-A university hospital from January 2008 to December 2012. The total number of tests was 1458 and there were 910 cases, excluding duplicated patients. There were 298 patients with no blood transfusion or no hematologic disease; these were excluded from the study. There were 29 patients who did not received an antibody screening test, and seven patients who had autoantibodies; these were excluded from the study. The total number of examined patients was 571. We retrospectively investigated the frequency and volume of transfusion of RBCs, PLTs, FFP, the diagnosis of each patients, and generation of unexpected antibodies. Results : Alloimmunization occurred in 18 out of 571 patients (3.15%). Among the identified antibodies, Rh group antibodies were most frequent detected (58.6%). The incidence of unexpected antibody was higher in patients with myelodysplastic syndrome and chronic myelomonocytic leukemia (7.69%) and aplastic anemia (6.25%). The number of RBC transfusion episodes was higher in the alloimmunized group than that in non-alloimmunized group [17.5(10.0-26.0) vs. 7.0(6.0-9.0); P=0.0018]. The RBC transfusion volume was also significantly higher in the alloimmunized group than that in non-alloimmnuized group [37.1 units (20.5-48.3) vs. 14.0 units (12.6-16.6); P=0.0020]. Also, the number of PLT transfusion episodes and transfusion volume were higher in alloimmunized group. There was no statistically significant difference in sex, age, or FFP transfusion between the two groups. There was a statistically significantly lower age (P <0.05) in patients who received more than 25 units of RBC transfusions but did not alloimmunized. Conclusions : The incidence of alloimmunization was 3.15% in patients with hematologic diseases. The number of RBC transfusion episodes and RBC transfusion volume affected the possibility of generating unexpected antibodies. The number of PLT transfusion episodes and PLT transfusion volume also affected alloimmunization. The Rh (C, c, E, e) antigen should be matched in the elderly patients who are expected to receive repeated blood transfusions. 배경 : 혈액질환이 있는 환자들은 적혈구나 혈소판 등의 혈액제제를 반복적으로 수혈 받는 경우가 많다. 이러한 환자들은 반복적인 적혈구 항원에 대한 노출로 적혈구 동종면역이 발생할 가능성이 높다. 이와 관련하여 지연성 용혈수혈 부작용 등이 발생할 수 있으며 수혈에 적합한 혈액을 찾기가 어려워 질 수도 있다. 국내에서는 ABO, RhD 외의 적혈구 항원에 대한 적합성 검사는 실시하지 않는다. 본 연구에서는 반복 수혈이 실시된 혈액질환 환자를 대상으로 extended RBC matching의 필요성을 연구해 보고자 하였다. 방법 : 2008년 1월부터 2012년 12월까지 동아대학교병원에서 골수검사를 시행한 환자를 대상으로 하였다. 총 검사 수는 1458건이었고 중복된 환자를 제외하면 910건이었다. 수혈력이 없거나 혈액질환을 가지고 있지 않은 환자는 298명이었고 조사에서 제외하였다. 또한 비예기항체검사를 하지 않은 29명과 자가항체를 가지고 있는 7명은 조사에서 제외하였다. 또한 첫 수혈 전 이미 비예기항체가 동정되었던 환자 5명도 제외하여 총 571명을 대상으로 연구를 시행하였다. 각 환자의 진단명, 동정된 비예기항체, 농축적혈구, 혈소판, 신선동결혈장의 수혈횟수와 양을 후향적으로 조사하였다. 결과 : 수혈이 이루어진 571명 중 18명에서 비예기항체가 동정되었으며 동종면역 발생율은 3.15%였다. 동정된 비예기항체중 Rh 군의 항체가 58.6%(17/29)로 가장 많았다. 질환 별로 비교하였을 때 골수이형성증후군이 7.69%(6/78), 재생불량성 빈혈이 6.25%(2/32)로 평균보다 비예기항체 발생률이 높았다. 비예기항체 발생군이 미발생군에 비해 적혈구 수혈 횟수가 더 많았고 [17.5(10.0-25.2) vs. 7.0(6.0-9.0); P=0.0016] 수혈양도 의미 있게 많았다[37.1 units (20.5-47.3) vs. 14.0 units (12.6-16.6); P=0.0020]. 또한 혈소판 수혈 횟수와 양도 비예기항체 발생군에서 의미있게 많았다. 성별이나 나이, 신선동결혈장 수혈에 대해서는 두 군간에 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다. 25단위이상의 적혈구 수혈을 받았지만 동종면역이 생기지 않았던 환자군에서 통계적으로 유의하게 나이가 적었다 (P <0.05). 결론 : 수혈이 이루어진 혈액질환 환자에서 동종면역 발생율은 3.15%로 비교적 높았다. 적혈구 수혈 횟수 및 양이 많을수록 비예기항체가 생길 가능성이 높은 것을 알 수 있었다. 또한 혈소판 수혈 횟수 및 양도 많을수록 비예기항체가 생길 가능성이 높았다. 반복수혈이 예상되는 고령의 혈액질환 환자군에서 일차적으로 Rh (C, c, E, e) 항원이 적합한 혈액을 수혈하는 것이 필요할 것으로 사료되었다.

항-혈청 알부민 항체를 이용한 새로운 형태의 이중결합항체 구조체 개발

박정호 강원대학교 대학원 2020 국내석사

오미크론 시대의 SARS-CoV-2 감염에 대한 면역학적 방어지표로서 체액면역반응 분석

임소윤 울산대학교 대학원 2023 국내석사

Introduction: Serum anti-spike IgG and neutralizing antibody against SARS-CoV-2 are accepted as immune correlates of protection (ICP) against COVID-19. However, there are limited data available on the ICP after the Omicron variant wave and the introduction of the BA.4/5 bivalent vaccine. Thus, this study aimed to analyze the antibody responses as correlates of protection in the Omicron era and to investigate the protective factor against COVID-19 amid complex immunologic status of the population. Methods: A prospective cohort of healthcare workers was enrolled at Asan Medical Center, the largest tertiary care hospital in South Korea between December 2022 and January 2023, and followed up for 5 months. Study participants had previously received a 3- or 4-dose of COVID-19 vaccine and either planned to receive a bivalent BA.4/5 vaccine or not. Blood and saliva samples were collected at 0, 1, and 3 months from the time of study enrollment, while for individuals who did not receive the bivalent vaccine, samples were collected only at 0 and 3 months. Immunological assessments were conducted using ELISA to measure variant-specific serum S1-IgG and saliva S1-IgA, and virus reduction neutralization test to measure neutralizing antibody levels. Results: A total of 482 participants were enrolled, of whom 69 (14.3%) underwent subsequent infection after study enrollment during 5-month follow-up, while 413 (85.7%) did not. Of these 482 participants, 381 (79.0%) experienced previous SARS-CoV-2 infection before, and 166 (34.4%) received the BA.4/5 bivalent booster vaccination at the study enrollment. There was a significant difference in baseline antibody levels of Wuhan-Hu-1 (Wuhan) S1-IgG, BA.5 S1-IgG, and neutralizing antibody (nAb) against BA.5 between individuals with and without subsequent infection (all P <0.001), whereas baseline saliva Wuhan S1-IgA and BA.5 S1-IgA did not show significant difference according to the subsequent infection. The infection rate showed a decreasing trend as baseline serum antibody levels increased (all P for trend <0.001), but no significant trend was observed with baseline saliva antibody levels. The optimal cutoff value for distinguishing subsequent infection was determined from receiver operative characteristic (ROC) curves as 1.36 log OD ratio for Wuhan-Hu-1 S1-IgG, 1.43 log OD ratio for BA.5 S1-IgG and 7.00 log250% neutralization dose [ND50] for neutralizing antibody against BA.5. Baseline serum Wuhan S1-IgG (adjusted hazard ratio [aHR] 0.43; P=0.02), BA.5 S1-IgG (aHR 0.32; P=0.005) and neutralizing antibody against BA.5 (aHR 0.26, P=0.045) exceeding the cutoff value, were found to be independent protective factors against subsequent SARS-CoV-2 infection in multivariable Cox regression analysis, and also hybrid immunity was a robust protective factor against subsequent infection in all analysis based on each immune marker (all P <0.01). However, saliva S1-IgA did not show a protective role against SARS-CoV-2 infection. The high antibody levels exceeding cutoff values, Wuhan S1-IgG (aHR 0.40; P=0.007), BA.5 S1-IgG (aHR 0.30; P <0.001), as well as neutralizing antibodies against BA.5 (aHR 0.15; P=0.02) and hybrid immunity (all P <0.05), were also significantly protective against subsequent infection in the 1-month subgroup analysis that reflected the antibody levels after the bivalent booster vaccination in those vaccinated. Furthermore, combining high baseline antibody levels that exceed optimal cutoff values and hybrid immunity, the sensitivity and specificity for protection from subsequent SARS-CoV-2 infection were 89.0% and 42.0% for Wuhan S1-IgG, 88.5% and 47.8% for BA.5 S1-IgG, and 87.2% and 56.3% for neutralizing antibody against BA.5, respectively, with similar positive predictive value (90.2%, 91.0% and 92.3%, respectively). Conclusions: This 5-month observational cohort study reconfirms that humoral immune responses are immune correlates of protection against SARS-CoV-2 infection in the Omicron era with the complex immune status of the population, and hybrid immunity is an independent protective factor against subsequent infection. Also, high serum antibody levels exceeding the cutoff value when combined with hybrid immunity demonstrate a significant predictive performance for protection against subsequent SARS-CoV-2 infection. 서론: SARS-CoV-2의 혈청 항 스파이크 IgG와 중화 항체는 COVID-19의 면역학적 방어지표로 인정되어 왔다. 그러나 Omicron 변이주 유행과 BA.4/5 2가 백신의 도입 이후 COVID-19의 면역학적 방어지표에 대한 데이터는 제한적이다. 따라서 본 연구는 오미크론 시대에 COVID-19에 대한 면역학적 방어지표로서 항체 반응을 분석하고, 오미크론 유행 및 여러 차례의 부스터 백신 접종 이후 복잡한 면역상태를 가지게 된 인구집단에서 COVID-19에 대한 보호인자를 조사하는 것을 목적으로 하였다. 방법: 2022년 12월부터 2023년 1월까지 한국의 2,700병상 규모의 3차 진료 병원인 서울아산병원의 의료 종사자로 구성된 코호트를 등록하여, 5개월간 추적 관찰하였다. 연구 참가자들은 이전에 코로나19 백신을 3회 또는 4회 접종한 적이 있으며, BA.4/5 2가 백신을 접종하거나 하지 않는 참여자들이었다. 연구 등록 시점부터 0, 1, 3개월째에 혈액 및 타액 샘플을 채취하였고, 2가 백신을 접종하지 않는 경우는 0, 3개월째에만 채취하였다. 면역학적 평가는 Wuhan-Hu-1 및 BA.5 스파이크 단백질 (S1)에 특이적인 혈청 IgG 및 타액의 IgA를 측정하는 ELISA와 중화 항체 수준을 측정하는 virus reduction neutralization test를 사용하여 수행되었다. 결과: 총 482명의 참가자가 코호트로 등록되었고, 이 중 69명 (14.3%)이 5개월 간의 추적 관찰 기간 동안 후속 감염이 발생했고 413명 (85.7%)은 후속감염이 없었다. 총 482명의 참가자 중 381명 (79.0%)은 이전에 SARS-CoV-2 감염 경험이 있었고, 166명 (34.4%)은 연구 등록 시 BA.4/5 2가 추가 백신을 접종 받았다. 후속 감염이 있는 사람과 없는 사람 간에 baseline 혈청 Wuhan-Hu-1 (Wuhan) S1-IgG, BA.5 S1-IgG 및 BA.5에 대한 중화항체 기저 수치에 유의미한 차이가 있었지만 (모든 P <0.001), baseline 타액 Wuhan S1-IgA 및 BA.5 S1-IgA의 기저수치는 후속감염에 따른 차이가 확인되지 않았다. Baseline 혈청 항체 수치가 올라감에 따라 해당 항체 구간의 감염률은 감소하는 경향성을 보였지만 (모든 P <0.001), 타액 항체 수치에 따라서는 이러한 경향성이 관찰되지 않았다. ROC 곡선에서 결정된 최적의 항체 cutoff 값은Wuhan-Hu-1 S1-IgG의 경우 1.36 log OD ratio, BA.5 S1-IgG의 경우 1.43 log OD ratio, BA.5에 대한 중화항체의 경우 7.00 log250% neutralizing dose [ND50]이었다. 다변량 콕스 회귀분석을 시행하였을 때, 이 연구에 사용된 세 가지 면역 마커인 Wuhan S1-IgG (조정 위험비 [aHR] 0.43; P=0.02), BA.5 S1-IgG (aHR 0.32; P=0.005), BA.5에 대한 중화항체 (aHR 0.26, P=0.045)는 ROC곡선에서 결정된 최적의 cutoff 값보다 높을 경우 후속 SARS-CoV-2 감염에 대한 독립적인 보호 인자로 밝혀졌으며 , 각 면역 마커를 기준으로 한 분석에서 하이브리드 면역은 후속 감염에 대한 강력한 보호 인자였다 (모든 P <0.01). 그러나 타액의 S1-IgA는 후속 SARS-CoV-2 감염에 대한 보호 효과를 보여주지 못하였다. 2가 백신 접종 1달 뒤의 항체수치를 반영하여 진행한 1-month subgroup 분석에서도 최적의 cutoff 값보다 높은 Wuhan S1-IgG (aHR 0.40; P=0.007), BA.5 S1-IgG (aHR 0.30; P <0.001) 그리고 BA.5에 대한 중화항체 (aHR 0.15; P=0.02) 및 하이브리드 면역(모든 P <0.05)은 후속감염에 대한 유의미한 보호 인자로 확인되었다. ROC 곡선에서 결정된 최적의 기준값 (Wuhan S1-IgG, 1.43 로그 OD ratio; BA.5 S1-IgG, 1.36 로그 OD ratio, BA.5에 대한 중화항체, 7.00 log2ND50)을 초과하는 높은 baseline 항체값과 하이브리드 면역을 결합하였을 때, SARS-CoV-2 후속 감염으로부터 보호하는 민감도와 특이도는 Wuhan S1-IgG의 경우 89.0%와 42.0%, BA.5의 경우 88.5%와 47.8%, BA.5에 대한 중화항체의 경우 87.2%와 56.3%로 나타났고, 양성 예측값은 각 항체 종류에 대해 90.2%, 91.0%, 92.3%로 비슷하였다. 결론: 결론적으로, 5개월간 의료 종사자를 추적한 전향적 코호트로 수행한 이 연구에서 체액성 면역 반응은 인구의 면역 상태가 복잡한 오미크론 시대에도 SARS-CoV-2 감염에 대한 가장 중요한 면역학적 방어지표임을 재확인하였고, 하이브리드 면역은 후속 감염으로부터 독립적인 보호 인자로 나타났다. 또한, 높은 혈청 항체 수치를 하이브리드 면역과 결합하였을 때, SARS-CoV-2 후속 감염으로부터 보호에 대해 유의미한 예측력을 보여주었다.

쇼그렌증후군 환자의 혈청을 이용한 특이적 생체지표인 IL1RL1 자가항체 발굴

전기웅 아주대학교 2022 국내석사

항- 알부민 Mutant 항체와 인간 성장 호르몬의 유전적 융합을 통한 long-acting Biobetter의 개발

강현주 강원대학교 대학원 2014 국내석사

두가지 기능을 가진 항체-effector 융합 단백질은 생물 의약의 응용에 유용하게 사용될 수 있다. 대장균에서의 periplasmic 발현의 최적화된 항체-effector 융합 단백질의 구조를 확인하기 위하여, 본 연구에서는 항 혈청 알부민에 결합하는 SL335 항체와 인간 성장 호르몬을 이용하여 다양한 항체-effector 융합 단백질 구조를 구성하였다. 이미 알려진 것과 같이, SL335의 중사슬 CH1의 233번째 아미노산인 cystein을 serine으로, 경사슬 CL의 214번째 아미노산인 cystein을 serine으로 각각 대체하여 사슬간 이황화 결합을 제거한 SL335 △ds와 SL335 의 대장균 내에서 발현 수율은 크게 다르지 않은 것을 확인 할 수 있었다. 그러나 SL335△ds 와 인간 성장 호르몬 융합 단백질 구조 중 하나인HserG/Lser은 SL335와 인간 성장 호르몬 융합 단백질 구조 중 하나인 HcysG/Lcys와 비교하였을 때 8배의 더 높은 항체 생산 수율을 보였으며, 항 인간성장호르몬 항체의 한 종류인 NYThGH와 60배 더 강한 결합 신호를 촥인 할 수 있었다. 이러한 결과들은 항체의 이황화 결합에 중요한 역할을 하는 cystein을 제거 함으로써 항체- 인간 성장호르몬 융합 단백질의 발현을 증가시킬 수 있음을 보여준다. HserG/Lser 은 SL335와 비교하였을 때 혈정 알부민 친화도가 유지되는 것을 확인 할 수 있었으며, in vitro 내에서 인간 성장호르몬의 효능도 확인 할 수 있었다. 또한rat에서의 반감기가 재조합 인간 성장호르몬 보다 69-83배 더 오래 지속되는 것을 확인 할 수 있었으며, 뇌하수체가 제거된 rat에서 같은 몰의 재조합 인간 성장호르몬을 매일 투여하였을 때와, HserG/Lser을 일주일에 한번 씩 투여하였을 때 무게 증가와 경골 길이의 증가가 비슷한 것을 확인 할 수 있었다. 따라서, 본 연구에서는 이황화 결합이 제거된 Mutant 항체를 이용함으로써 대장균 내 periplasm의 기능적인 항체-effector 융합 단백질의 발현을 촉진 시킬 수 있는 Biobetter로의 가능성을 증명하였다. Bi-functional Fab-effector fusion proteins can be useful in diverse biomedical applications. To determine an optimal Fab-effector fusion format for periplasmic expression in Escherichia coli, we constructed diverse Fab-effector fusions using SL335, a human anti-serum albumin (SA) Fab, and the human growth hormone (hGH) as a model system. Knowingly, the removal of an interchain disulfide bond in SL335, coined SL335?ds, through Cys233→Ser233 and Cys214→Ser214substitutions of the CH1 and the CL, respectively, didn’t affect an expression yield in E. coli. In the case of the Fab-hGH fusion format, however, HserG/Lser, one of SL335?s-hGH formats, showed an eight-fold higher production yield and a 60-fold stronger binding signal by NYThGH, an anti-hGH mAb, compared to HcysG/Lcys, the corresponding SL335wt-hGH format. Our results revealed that removal of the Cys residues which are responsible for an interchain disulfide bond of a Fab substantially increased the soluble expression of the Fab-hGH fusions in an additive way. HserG/Lser was found to retain an SA-binding affinity comparable to that the of parent SL335 and in vitro hGH bioactivity. Moreover, its long-acting capability was confirmed by a 69 to 83-fold longer serum half-life (t1/2) than that of the recombinant hGH in rats. In pharmacodynamic studies, a once-weekly administration of HserG/Lser produced the comparable weight gain and tibia bone growth obtained with a daily dosing of the equimolar rhGH in hypophysectomized rats. We, herein, clearly demonstrate the advantage of utilizing a Fab?s in the production of soluble and functional Fab-effector fusions in the periplasm of E coli.

間接螢光抗體法에 의한 개의 바이러스-Canine distempervirus, canine parvovirus, canine coronavirus, canine adenovirus type-2, canine parainfluenzavirus-抗體 分布 調査

윤기복 全南大學校 1995 국내석사

1992년 10월부터 1993년 6월까지 광주 및 서울지역의 동물병원에 내원하거나 사육중인 80두의 개 혈청을 채취하여 canine distempervirus (CDV), canine parvovirus (CPV), canine coronavirus (CCV), canine adenovirus 2형 (CAV -2), canine parainfluenzavirus (CPIV)등 개에서 중요한 5종의 바이러스에 대한 항체보유 유무를 미국 VMRD사의 간접 형광항체검사용 킷트를 구입하여 검사하였다. 본 실험결과 어린 자견에서 출혈성 장염과 심근염을 일으키는 CPV가 93.8% (75/80)의 항체보유율로서 가장 높게 나타나 국내 발생빈도를 가늠할 수 있었고, 그 다음으로 CDV가 83.8% (67/80), CCV가 63.8% (51/80), CPIV가 52.5% (42/80) 등으로 나타나 비교적 높은 각 병원체에 대한 노출상황을 보였으며, CAV-2형은 조사대상 바이러스중 42.5% (34/80)로서 가장 낮았으나 국내 감염이 적지 않음을 처음 확인하였다. 각 조사 바이러스별 보유항체수준은 CPV (80 - 320배이상), CDV (40 - 160배이상), CPIV (40 - 160배이상)는 각각 65.0%, 40.0%, 18.7%를 보여 이들 바이러스의 편재성을 간접적으로 알 수 있었고, CAV-2형의 경우 640배 이상이 12.5%로 나타나 이 질병에 대한 진단법 개발과 예방대책 수립이 인정되었으며, 백신이 아직 사용되고 있지 않는 CCV (40-160배이상)가 27.6%나 되어 감염노출이 지속되고 있음을 알 수 있었다. 예방접종여부에 따른 각 바이러스별 항체보유율은 1세이하에서 CDV와 CPV는 백신접종군(평균 87.6%)이 미접종군(평균 71.4%)보다 높았으나, CPIV는 미접종군(53.2%)이 접종군(50.2%)보다 약간 높게 나타나 혼합백신사용에 대한 개체별 및 각 바이러스별 항체형성차이가 있는 것으로 추정되었고, CDV와 CPIV는 2세이상에서 백신미접종군(평균 85.7%)이 백신 접종군(평균 95.5%)에 비해 항체수준이 많이 떨어져 백신재접종이 필요한 것으로 판단되었다. CAV-2형은 1세이하의 어린 자견에서는 25.9%로 낮았으나 1-2세 사이에서는 63.9%, 2세이상에서도 76.6%를 보여 향후 이 바이러스에 의한 질병발생빈도의 증가가 예상되었다. 혈변, 구토, 호흡곤란 및 유연 등의 임상증상을 보였던 개들은 모두 (평균 100.0%,) CPV에 대한 항체를 보유한 것으로 나타나 CPV의 잠정 진단에 유의한 임상증상들로 보였으나, 이들 이환견들이 CDV (평균 86.6%)와 CCV (평균 65.8%)에 대한 항체도 비교적 높게 측정되어 감별 진단을 위한 검사가 필요하였고, 그외 설사, 호흡곤란, 유연 등과 특정 바이러스와의 사이에 유의성은 찾아 볼 수 없었다. An indirect immunofluorescent antibody test was applied to survey the antibody prevalence on five canine viruses including canine distempervirus(CDV), canine parvovirus(CPV), canine coronavirus(CCV), canine adenovirus type-2(CAV-2), canine parainfluenzavirus(CPIV) in dogs. The period studied was from October 1992 to June 1993. A total of 80 dog sera was collected from veterinary clinics in Kwangju and Seoul, and examined for the presence of virus antibodies. Immunofluorescent antibodies(IFA) to all viruses were present in a high percentage of 80 sera tested. Seventy-five(93.8%) showed detectable IFA against CPV, 67(83.8%) against CDV, 51(63.8%) against CCV, 42(52.5%) against CPIV and 34(42.5%) against CAV-2. These suggested that all viruses were endemic in the communities. IFA levels against each virus were also distributed fairly irregularly. IFAs for CDV and CPV were detected more frequently with a relatively high incidence in vaccinated group less than 1 years of age. While IFAs for CPIV were detected with a slightly high incidence in nonvaccinated group. IFAs for CAV-2 were detected more frequently with growing age. In the correlation of clinical signs and antibody prevalence, dogs that showed hematochezia and vomiting had high titers in the positive sera is noteworthy, particularly for CDV and CPV. The significance between dogs those who had diarrhea, dyspnea and salivation and those viruses were obscure.

간접형광항체법에 의한 국내 계군의 세망내피증바이러스 항체조사

김지인 全南大學校 1993 국내석사

세망내피증은 체중감소, 성장지연, 빈혈로 인한 경제적 손실 뿐만 아니라 면역 억제를 일으켜 백신효과를 감소시키고 여러 질병에 대한 닭의 감염을 쉽게 일으키므로써 문제가 되는 조류질병이다. 본 연구는 세망내피증의 국내 발생양상을 파악하기 위하여 1991년 2월부터 1993년 3월까지 국내 13개 지역의 116개 계군의 닭 1,045수를 대상으로 세망내피증바이러스(reticuloendotheliosis virus, REV) 항체 보유상황을 조사하였다. 항원으로는 REV-T주를 감염시킨 계태아 섬유아세포를 사용하여 간접형광항체법으로 실험하였다. 조사 결과에 따라 지역별, 주령별, 종별 항체 분포상황을 비교하고 마렉병 백신 접종에 따른 세망내피증 발생의 유무를 확인하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 총 1,045개 닭 혈청중 양성 혈청이 174개로 16.7%의 개체가 항체를 보유하고 있었으며, 116계군중 양성 계군이 58계군으로 50.0%의 계군 양성률을 나타내었다. 2. 지역별 REV 항체조사 결과 모든 조사지역내 최소한 1개 이상의 계군 및 개체에서 REV에 노출되어 있었다. 3. 주령별 REV 항체 양성률은 1주령은 11.3%, 2주령은 8.0%였으며 3주령에서는 24.4%로 증가하였고 22주령 이상에서는 27.9%의 항체 양성률을 나타내었다. 4. 육계와 산란계의 REV 항체 양성률은 각각 15.9%와 16.0%로 종간의 차이를 보이지 않았다. 5. 마렉병 백신을 주사받은 3-8주령 계군의 REV 항체 양성률은 백신을 주사받지 않은 같은 주령의 계군에서보다 높았으나 유의성있는 차이는 인정되지 않아 조사대상 계군에서의 오염된 마렉병 백신에 의한 세망내피증 발생은 없는 것으로 나타났다. The reticuloendotheliosis virus(REV) causes immunosuppression in chickens. REV suppresses effects of vaccinations and increases the sensitivity to other diseases. Thus REV brings about economic losses associated with weight loss, anemia, and retarded growth in chicken. The present study was performed to investigate REV seropositive chickens in Korea. A total of 1,045 serum samples were taken from 116 flocks in 13 areas over a period from Feburary 1991 to March 1993. The samples were examined by indirect fluorescent antibody test using chicken embryo fibroblast cells with REV strain T as an antigen. The results were compared by area, age, and breeder: as the REV had been isolated from the Marek's disease(MD) vaccine, the results were compared by MD vaccination. The results obtained were as follows. 1. 174 serum samples of 1,045 chickens(16.7%) and 58 of 116 flocks(50.0%) were seropositive to REV. 2. REV was found to be distributed in all areas surveyed. 3. The proportions of REV positive sera by age were 11.3% in 1 week, 8.0% in 2 weeks, 24.4% in 3 weeks and 27.9% in older than 22 weeks. 4. The proportions of REV positive sera in broilers and layers were 15.9% and 16.0%, respectively. There was no noticeable difference between two breeders. 5. The proportion of REV positive sera in MD vaccinated group was higher than unvaccinated in 3-8 weeks. But the difference is not significant. Thus, we concluded that RE in investigated chicken groups was not associated with MD vaccine contaminated with REV.

혈청희석법 및 혈청흡착법으로 온난자가항체 처리 후 동정된 비예기항체

장민중 전남대학교 대학원 2012 국내석사

배경 : 한국인에서 비예기항체의 발현빈도 및 성상에 관한 많은 보고가 있었지만, 온난자가항체를 가진 환자에서 이를 처리하고 난 후 동정된 비예기항체를 분석한 보고는 드물었다. 이에 본 연구에서는 혈청희석법과 혈청흡착법(ZZAP법, PEG법)으로 온난자가항체를 처리한 후 잔존 비예기항체를 동정하고 성상을 분석하였다. 대상 및 방법 : 2009년 11월부터 2011년 7월까지 전남대학교 병원(본원, 화순)에 내원하여 수혈 전 검사를 의뢰하였던 46,016환자들 중 비예기항체 선별검사상 양성은 489명이었으며, 그 중 온난자가항체를 가진 환자는 53명이었다. 본 연구는 이 53명의 환자 중 혈청희석법과 혈청흡착법(ZZAP법 또는 PEG법)을 적용할 수 있었던 18명의 검체를 대상으로 하였다. ZZAP법과 PEG법은 AABB 의 표준법대로 하되 Rh표현형이 일치하는 타인의 적혈구를 사용하였다. 그리고 혈청희석법, 항체동정검사, 항원검사는 정 등이 보고한 방법으로 실시하였다. 추가로 일부는 (6명) RhCE 유전자 검사로 적혈구 항원형을 확인하였다. 결과 : 온난자가항체 처리 후 비예기항체 동정율은 혈청희석법이 72.2% (13/18예), 흡착법(ZZAP법 또는 PEG법)은 17.6% (3/17예)였다. 혈청희석법을 시행한 후 동정된 항체의 특이성은 autoanti-e 4예(30.8%), autoanti-C+e 4예(30.8%), anti-E 2예(15.3%), anti-C+autoanti-e 1예(7.7%), anti-C+e 1예(7.7%), autoanti-C 1예(7.7%)였다. 흡착법을 시행한 후 동정된 항체의 특이성은 anti-E 2예(66.6%), anti-C+e 1예(33.4%)였다. 동정된 비예기항체를 동종항체와 ‘항원특이성 자가항체(mimicking autoantibody)’로 구분하였는데, 흥미롭게도 혈청희석법으로 동정한 항체 중 10검체는 ‘anti-C+e 또는 anti-e의 특이성을 보이는 항원특이성 자가항체’임을 확인 할 수 있었다. 반면, 흡착법을 시행한 경우는 이러한 ‘항원특이성 자가항체’는 동정되지 않았다. 결론 : 온난자가항체가 존재할 경우 이를 처리한 후 비예기항체를 동정하였더니 온난자가항체 처리법에 따라 달랐지만, 검체의17.6~72.2%에서 비예기항체가 존재하였다. 온난자가항체를 혈청희석법에 의해 처리한 경우는 ‘anti-C+e 또는 anti-e의 특이성을 보이는 ‘항원특이성 자가항체’가 높은 비율에서 관찰되었다.