나선신경절세포의 세포자멸사에서 Fas-Fas ligand의 발현 특성 : 신경세포 특이적 Fas ligand의 발현

구태우 동아대학교 대학원 2011 국내박사

서론: Glutamate는 내이 유모세포와 제 1형 나선신경절세포 사이의 시냅스에 작용하는 흥분성 신경전달물질이다. 다양한 이독성 자극은 내이 유모세포에서 glutamate의 과분비를 유도하며, 이는 나선신경절세포의 자기사멸을 유발한다고 알려져 있다. 그러나 이러한 자기사멸에 관여하는 다양한 물질 중에서 자기사멸의 중요한 매개체로 알려진 Fas ligand가 나선신경절세포의 자기사멸에 관여하는지 연구된 바가 적다. 저자는 배양된 나선신경절세포에 glutamate 처치를 통한 자기사멸과정에서 Fas-Fas ligand의 발현을 알아보고자 본 연구를 수행하였다. 대상 및 방법: 생후 3-5일된 12마리 guinea pig 24귀를 이용하였다. guinea pig의 와우를 완전히 노출시킨 후 나선신경절 조직을 얻었다. 5 일간 배양 후, 농도에 따라 10 mM, 25 mM, 50 mM의 glutamate를 처치하였다. glutamate 처치 24시간과 48시간 후에 나선신경절세포를 면역현광염색을 시행하여 공초점현미경으로 Fas와 Fas ligand 발현강도를 형태학적으로 관측하였다. glutamate의 농도와 시간에 따라 세포사 정도를 측정하였다. 나선신경절세포와 나선신경절세포가 아닌 세포의 Fas 및 Fas ligand 발현 강도를 관찰하고 세포사하지 않은 나선신경절세포와 자기사멸 중인 나선신경절세포 간의 Fas 및 Fas ligand의 발현을 관찰하였다. 결과: 신경성장인자들이 포함된 배지 속에서 나선신경절세포가 잘 배양되었으며 핵이 응축되거나 분리되고 신경돌기가 소실되는 자기사멸세포를 관측할 수 있었다. 하지만 glutamate 투여 군에서는 glutamate 농도가 증가할수록, 그리고 24시간보다 48시간에서 나선신경절세포의 자기사멸이 증가하였다. Fas는 대조군과 glutamate 투여군에서 glutamate 농도 및 시간과 관계없이 발현강도가 비슷하였다. 하지만, Fas ligand는 자기사멸하는 신경세포에서만 선택적으로 강하게 발현되었고 glutamate의 농도가 증가할수록, 그리고 24시간 보다 48시간에서 발현 강도가 증가 하였다. 결론: 본 연구를 통하여 나선신경절세포에서 중요한 신경전달물질인 glutamate의 증가로 인해 Fas-Fas ligand signaling pathway가 선택적으로 활성화되고, 이는 나선신경절세포의 자기사멸에 연관되어 있을 것으로 추정하였다.

Direction-selective retinal ganglion cells: Analysis of glutamate receptor synaptic pattern and calretinin content : 방향특이성 망막 신경절세포: 글루타메이트 수용체의 시냅스 패턴 분석과 calretinin 함유

권오주 경북대학교 대학원 2015 국내박사

이 연구의 목적은 토끼 망막에서 방향특이성 망막 신경절세포의 방향 선호도에 따른 방향 이방성을 확인하는 것이다. 방향특이성의 기작을 이해하기 위해 방향특이성 망막 신경절세포에서 글루타메이트 수용체의 시냅스 분포를 조사였다. 칼슘결합단백질인 calretinin은 칼슘 조절 센서 혹은 칼슘 수송의 기능을 세포내에서 담당한다. 본 연구에서는 방향특이성 망막 신경절세포와 calretinin의 관계에 대해서도 조사하였다. 방향특이성 망막 신경절세포에서 kainate와 NMDA 수용체의 소단위들의 분포양상을 표준면역세포화학방법을 사용하여 분석하였다. 방향특이성 망막 신경절 세포 찾기 위해 살아있는 세포에 Lucifer yellow를 주입하여 세포의 형태적 특징을 확인하였다. Calretinin을 포함하는 망막 신경절세포를 찾기 위해서 표준면역세포화학법 과정을 먼저 거친 다음 지방 친화성 염색약인 DiI를 전리요법으로 주입하였다. 수상돌기, kinesin II, 수용체 소단위 이들 3개를 합친 이미지와 calretinin을 포함하는 신경절세포의 면적, 수상돌기 패턴 및 층 위치의 이미지를 얻기 위해서 공초점현미경을 사용하였다. 방향특이성 망막 신경절세포의 ON과 OFF층 수상돌기에서 시냅스 분포도를 분석한 결과 Kainate와 NMDA 수용체의 소단위들의 비대칭의 증거는 어디에서도 확인할 수 없었다. 토끼 망막 신경절세포에서 calretinin을 포함하는 10개 형태적으로 다른 세포 타입을 발견하였다. 그들 중 CR7은 ON-OFF 방향특이성 망막신경절 세포로 확인되었다. 이 결과는 방향특이성이 신경회로가 양극세포에서 신경절세포로 향하는 구심성 방향으로 놓여 있음을 나타내는 것이다. 또한 calretinin이 토끼 망막에 방향특이성 망막 신경절세포와 관련이 있음을 확인하였다. 이 연구의 결과로 방향특이성 망막 신경절세포를 더욱 잘 이해할 수 있을 것으로 사료된다.

Effects of Sympathectomy on the apoptosis of rat retinal ganglion cells

김태형 경상대학교 대학원 2009 국내박사

교감신경계는 자율신경계의 한 부분으로 Norepinphrine이 주요한 신경전달물질로 알려져 있다. 눈에서는 망막 및 맥락막의 혈관이 위목교감신경절에서 뻗어나온 교감신경계의 신경지배를 받는 것으로 알려져 있다. 이는 교감신경계가 맥락막 및 망막의 혈관계의 조절에 중요한 역할을 할 것이라고 추측할 수 있으며, 연령관련황반변성이나 당뇨병성 망막증등의 질환에서 교감신경계의 자극이 장기간 사라지게 되면 비정상적인 혈관의 증식이 발생할 수 있다고 예상할 수 있다. 또한, 이전 연구결과에 따르면 교감신경계의 단절이 말초조직에서 세포의 사멸을 유발하며, 교감신경계의 재형성이 세포 자멸사를 억제하는 효과가 있는 것으로 보고된 바 있다. 이에 본 연구에서는 교감신경의 신경지배 단절시 쥐의 망막신경절세포의 자멸사가 유발되는 지 알아 보고자 하였다. 쥐의 눈으로 연결되어 있는 교감신경 지배를 차단하기 위하여 오른쪽 위목교감신경절 절제술을 시행하여 오른쪽 눈으로 연결되어 있는 교감신경의 신경지배를 단절시켰다. 망막의 손상정도는 FluoroGold를 superior colliculus에 주입한 후 4-7일째 망막을 채취하여 채취된 망막전체를 슬라이드 위에 고정한 후 FluoroGold 신경표지자로 표시되는 살아있는 망막신경절세포의 개수를 측정하여 확인하였다. 세포사의 유발여부는 TUNEL 분석을 이용하였으며, BDNF (Brain-derived neurotrophic factor)와 아드레날린 수용체의 발현의 확인을 위하여 면역조직염색화학법과 Western blot 분석을 이용하였다. 교감신경절 절제술을 시행한 후 2주와 4주째, 살아있는 망막신경절세포의 수는 대조군에 비해 교감신경절제술을 시행한 쪽에서 의미있게 감소하였으며, TUNEL 양성반응을 보이는 망막신경절세포 또한 교감신경을 절제한 쪽에서 발견됨을 확인하였다. 또한 교감신경이 절제된 쪽의 망막에서 BDNF 단백질의 발현이 증가되며 베타-1 아드레날린 수용체가 감소됨을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 교감신경절제술이 망막에서 세포자멸사를 유발하여 망막신경절세포의 수를 감소시킬 것으로 생각된다.

척수 후근 신경절세포의 T-type 칼슘통로에 미치는 Capsaicin의 효과

김주섭 中央大學校 2003 국내박사

척수 후근 신경절세포를 단일세포로 분리하여 이 중 중간크기의 세포만을 사용하여 칼슘전류를 기록하였다. 이들 세포는 T-type 칼슘전류의 발현 양상에 따라 3군으로 구분할 수 있었다. 첫번 째는 T-type 칼슘전류가 뚜렷하게 나타나는 군 (type I)과 T-type이 존재하지만 HVA 칼슘전류에 비해 아주 미비하게 나타나는 군 (type II), T-type 칼슘전류가 전혀 존재하지 않는 군 (type III)이다. 이중 T-type 칼슘전류를 보이는 군에서는 capsaicin (CAP) 투여에 의해 non-selective cation 통로 활성화가 보이지 않았으며 (CAP insensitive 세포) T-type 칼슘전류를 관찰할 수 없는 군에서만 CAP 투여에 의해 일시적으로 활성화 되는 내향전류를 관찰할 수 있었다 (CAP sensitive 세포). CAP의 칼슘전류에 특히 T-type 칼슘전류에 대한 직접적인 효과를 관찰하기 위해 CAP insensitive 세포 중에서 뚜렷한 T-type 칼슘전류를 보이는 신경절 세포들을 사용하였다. 이들 세포에서 관찰되는 T-type 칼슘전류는 칼슘을 바리움으로 대체할 경우 그 크기가 감소하였다. T-type 칼슘통로 억제제로 알려진 징크 및 니켈, 코발트이온에 의해서도 몇 십 μM 이하의 농도에서 차단되었다. CAP의 투여는 T-type 칼슘전류의 크기를 농도-의존적으로 감소 시켰다. 또한 비활성화 시정수를 감소시켰으며 항정 상태 비활성화 곡선은 왼쪽으로 이동시켰다. CAP 감수체의 길항제로 알려진 capsazepine의 경우도 역시 T-type 칼슘전류를 차단하였다. 본 연구의 결과를 종합하면 중간 크기 척수 후근 신경절 세포에서CAP 감수체는 T-type 칼슘통로가 있는 세포에는 존재하지 않으며 이들 세포에 있는 T-type 칼슘통로는 α1H와 α1G아형이 복합적으로 구성되어 있고 전자의 발현이 좀 더 우세하게 나타난다고 본다. 이들에 대한 CAP의 효과는 CAP이 T-type 칼슘통로에 직접적으로 작용하여 억제작용을 나타내는 것으로 사료된다.

박쥐 망막의 조직화학적 분석

전영기 경북대학교 대학원 2008 국내박사

Many people think that bats are blind and it has been known that bats use acoustic orientations more than visual abilities to catch a prey and monitor their surroundings. Nevertheless, bats clearly have eyes. And so, these studies are intended to help to provide fundamental knowledge for the better understanding of the unique behavioral aspects of bat flight maneuverability by investigating and analyzing various neurons of outer nuclear layer, inner nuclear layer and ganglion cell layer of bat (the greater horseshoe bat, Rhinolophus ferrumequinum) for the first time. At first, the quantitative analysis of cone and rod photoreceptors was made. The average cone density was 9,535 cells/mm2, giving the average number of cones of 33,538 cells per retina. The average rod density was 368,891 cells/mm2, giving the average number of rods of 1,303,517 cells. On average, rods were 97.49%, and cones were 2.51% of all the photoreceptors. Rod: cone ratios ranged from 33.85:1 centrally to 42.26:1 peripherally, with a mean ratio of 38.96:1. The average regularity index of the cone mosaic in bat retina was 3.04. The present results confirm that the greater horseshoe bat retina to be strongly rod-dominated. Second, the investigation of parvalbumin-immunoreactive amacrine cells of inner nuclear layer in bat retina through immunocytochemistry, quantitative analysis, and confocal microscopy was made in detail. For the first time in a bat (the greater horseshoe bat, Rhinolophus ferrumequinum), it was identified that parvalbumin immunoreactivity is present in ganglion cell and inner nuclear layers. The regular distribution of parvalbumin-immunoreactive neurons, the inner marginal location of their cell bodies in the inner nuclear layer, and the distinctive bilaminar morphologies of their dendritic arbors in the inner plexiform layer suggested that these parvalbumin-immunoreactive cells were AⅡ amacrine cells. The average number of parvalbumin-immunoreactive amacrine cells was 11,033 cells per retina (n=3), and the mean density was 3,208 cells/mm2. The average regularity index of the parvalbumin-immunoreactive cell mosaic was 3.31. These results indicate that parvalbumin antibodies can be used to label AⅡ amacrine cells selectively in bats. Finally, in this study, the parvalbumin-immunoreactive neurons in the ganglion cell layer of the retina of a bat, Rhinolophus ferrumequinum, and the distribution pattern of the labeled neurons were identified. Parvalbumin immunoreactivity was found in numerous cell bodies in the ganglion cell layer. Quantitative analysis showed that these cells had medium to large-sized somas. The soma diameter of the parvalbumin-immunoreactive cells in the ganglion cell layer ranged from 12.35 to 19.12 μm (n=166). As the fibers in the nerve fiber layer were also stained, the majority of parvalbumin-immunoreactive cells in the ganglion cell layer must be medium to large-sized retinal ganglion cells. The mean nearest neighbor distance of the parvalbumin-immunoreactive cells in the ganglion cell layer of the bat retina ranged from 59.57 to 62.45μm and the average regularity index was 2.95 ± 0.3 (n=4). The present results demonstrate that parvalbumin is expressed in medium to large-sized retinal ganglion cells in bat retina, and they have a well-organized distributional pattern with regular mosaics. From the above studies, the rod-dominated retina with the existence of AII amacrine cells suggests that the greater horseshoe bat retina may have functional scotopic property of vision. Besides, the existence of cone cells suggests that the bat retina may have functional photopic property of vision, too. Also, as AII cells are critically involved in both rod- and cone-driven signals by sending a vertical flow of information within the On- and Off- layers, the existence of AII amacrine cells suggests that bat retina has versatile synaptic connectivity and diverse functional physiology for vision. And, retinal ganglion cells collect visual information in the eyes and finally send it to the brain for visual perception. Studies on the expression and cellular distribution of neurochemical substances in retinal ganglion cells are the basic information to understand a specific function of retinal ganglion cells. And so the immunocytochemical evidence of retinal ganglion cells expressing a specific protein in a microbat retina must be important. Through these studies of bat retina, we are sure that microchiroptera not only rely on echolocation but also have functional eyes to help flight maneuverability and that these data are applicable to a better understanding of the unsolved issue of a bat vision.

쥐 신경절세포주에서 α-2 아드레날린수용체 효현약물의 신경보호효과

안재홍 연세대학교 대학원 2005 국내박사

(연구배경) Endoplasmic reticulum(ER) stress에 의한 세포자멸사(apoptosis)는 알쯔하이머병을 포함한 여러 퇴행성신경질환의 병인으로 주목받고 있다. 녹내장에서 발생하는 망막신경절세포의 세포자멸사도 퇴행성신경질환과 공통된 병리현상이 발견됨에 따라 망막신경절세포의 세포자멸사에도 ER stress가 관여할 가능성이 있다. 본 연구에서는 현재 사용되고 있는 녹내장 약물 중 망막신경절세포에서 신경보호효과가 있는 것으로 알려진 α-2 아드레날린수용체 효현약물인 brimonidine이 ER stress에 의해 유도된 망막신경절세포주의 세포자멸사를 억제할 수 있는지 알아보고 그 기전을 알아보고자 하였다. (대상 및 방법) Thapsigargin 1 μM을 transformed rat retinal ganglion cell line(RGC-5 세포)에 처리하여 ER stress를 유도하였다. Thapsigargin 처리 1시간 전에 brimonidine(25 μM - 1000 μM)과 betaxolol(25 μM - 1000 μM)을 전 처치한 후 24시간 뒤에 LDH 분석과 TUNEL 염색을 시행하여 이 약물들이 thapsigargin에 의한 RGC-5 세포의 세포자멸사를 억제할 수 있는지 알아보았으며, brimonidine(100 μM) 사용 유무에 따른 caspase 12와 caspase 3, 그리고 PARP에 대한 western blot을 시행하였다. 또한, caspase 3 특이적 억제제인 z-DEVD-fmk 1 μM 처리 유무에 따라 thapsigargin을 처리한 RGC-5 세포에서 caspase 12와 caspase 3, 그리고 PARP의 발현양상을 western blot을 시행하여 확인하였다.(결과) LDH 분석 결과 thapsigargin은 RGC-5 세포에서 세포사를 유발하였으며 세포사는 brimonidine에 의해 억제되었으나 betaxolol에 의해서는 억제되지 않았다. TUNEL 염색 결과 thapsigargin을 단독 처리한 경우와 betaxolol을 전 처치 한 경우에서는 다수의 TUNEL(+) 세포가 관찰되었으나 brimonidine을 전 처치한 경우에서는 TUNEL(+) 세포의 숫자가 감소되는 것을 확인하였다. Western blot을 시행한 결과 RGC-5 세포 내에 분절화 되지 않은 caspase 12와 caspase 3, 그리고 PARP가 관찰되었으며 thapsigargin에 의해 caspase 12와 caspase 3, 그리고 PARP의 분절화가 일어나는 것이 관찰되었다. Brimonidine은 thapsigargin에 의한 caspase 12와 PARP의 분절화를 억제하는 것이 확인되었으며, caspase 3 억제제인 z-DEVD-fmk는 thapsigargin에 의해 유도된 PARP의 분절화를 억제하였으나 caspase 12의 분절화는 억제하지 못하였다. (결론) RGC-5 세포에서 thapsigargin에 의해 세포의 세포자멸사가 유발됨을 알 수 있으며 brimonidine에 의해 세포자멸사가 억제됨을 확인하였다. Thapsigargin에 의한 RGC-5 세포의 세포자멸사는 caspase 3와 caspase 12의 활성화가 관계되며 caspase 3의 활성화와 관계없이 capsase 12가 활성화됨을 알 수 있었다. Brimonidine은 caspase 12와 caspase 3의 활성화를 억제하여 thapsigargin에 의한 RGC-5 세포의 세포자멸사 억제에 기여하는 것으로 생각된다. (Purpose) Endoplasmic reticulum(ER) stress induced apoptosis contributes to the pathogenesis of various neurodegenerative diseases including Alzheimer''s disease. ER stress induced neurodegeneration may participate in the apoptosis of retinal ganglion cells in glaucoma, because glaucoma meets the criteria for a neurodegenerative disease. Brimonidine, an α-2 adrenergic receptor agonist, has the potential to protect neurons in glaucoma and other neurodegenerative diseases. The objective of this study is to ascertain whether brimonidine protects retinal ganglion cells from ER stress in vitro, and if so, to determine the mechanisms of the neuroprotective effects of the brimonidine in cultured transformed rat retinal ganglion cell lines (RGC-5 cells). (Materials and methods) ER stress was induced by 1 μM of thapsigargin in cultured RGC-5 cells. A series of brimonidine(25 μM - 1000 μM), betaxolol(25 μM - 1000 μM) or vehicle solutions were administered to the RGC-5 cells 1 hour before the administration of thapsigargin (1 μM) for 24 hours. The rate and the type of RGC-5 cell death were evaluated using LDH assay and TUNEL staining. The western blot analysis to caspase 3, caspase 12, and PARP was performed in thapsigargin treated RGC-5 cells in the presence or absence of brimonidine(100 μM) or z-DEVD-fmk(1 μM), a specific caspase 3 inhibitor. (Results) The thapsigargin-induced death of RGC-5 cells was significantly inhibited by brimonidine but not by betaxolol. Thapsigargin increased the number of TUNEL(+) cells, which was inhibited by brimonidine but not by betaxolol. The western blot analysis confirmed that thapsigargin promoted cleavage of caspase 3, caspase 12 and PARP. The analysis also confirmed that brimonidine could inhibit the thapsigargin-induced activation of caspase 12 and caspase 3 in RGC-5 cells. The thapsigargin-induced cleavage of caspase 12 in RGC-5 cells occurred even if the activation of caspase 3 was blocked by z-DEVD-fmk, a specific caspase 3 inhibitor. (Conclusion) ER stress induced by thapsigargin caused the apoptosis of RGC-5 cells, and the thapsigargin-induced apoptosis of RGC-5 cells was blocked by brimonidine. The activation of caspase 12 and caspase 3 may contribute to the thapsigargin-induced apoptosis in RGC-5 cells. The activation of caspase 12 was thought to be uninfluenced by the activation of caspase 3. Brimonidine can inhibit the activation of caspase 12 and caspase 3 in the thapsigargin-treated RGC-5 cells, which may participate in the mechanisms involved in the neuroprotective effects of brimonidine in ER stress-induced apoptosis in retinal ganglion cells.

산화스트레스에 의한 망막신경절 세포의 세포사에서 허혈전처치의 보호효과 및 열충격단백질과의 연관

이승혁 연세대학교 대학원 2008 국내박사

Glaucoma, characterized by axonal loss of the optic nerve and apoptosis of retinal ganglion cells, is a major cause of blindness worldwide. Although various risk factors including increased intraocular pressure, optic nerve ischemia and oxidative stress have been identified, the precise etiologic nature of the disease remains elusive. Ischemic preconditioning seems to be an adaptive process for cell survival against a sustained ischemic insult following an initial brief ischemia. The aim of the present study was to determine the existence of such a protective process in retinal ganglion cells in an in vitro model of glaucoma and to find any relevance with expression of heat shock proteins (Hsp). A retinal ganglion cell line was put through oxidative stress with hydrogen peroxide and the effects were analyzed through lactic dehydrogenase (LDH) assay, western blot and real time RT-PCR. Cellular protective effects of ischemic preconditioning were shown to be greatest after eight hours of preconditioning. Hsp expression was found to increase immediately after ischemic preconditioning and remained at maximal elevation at two hours after insult from when expression was found to decrease. Hsp27 showed the most increase. The expression of Bcl-2 and Bcl-XL mRNA, believed to influence cell survival, increased dramatically immediately after insult then slowly declined. Bad and Bax mRNA expression, thought to determine cellular apoptosis, showed negligible change. Western blot analysis for protein expression demonstrated an immediate increase of Bcl-2 which was maintained for twenty four hours, while the expression of Bcl-XL failed to show any demonstrable change and Bad decreased. In conclusion, oxidative stress to retinal ganglion cells seems to possess a protective quality through ischemic preconditioning, which seems at least in part to be associated with Hsp27 expression after exposure to such stress. Such cellular protection mechanisms seem to apply at the level of the retinal ganglion cell in vitro and this study can serve as a basis for further investigations into the association of ischemic preconditioning and increased expression of Hsp27. 녹내장은 전 세계적인 실명의 주요원인으로 시신경을 구성하는 축삭손상과 망막신경절세포의 자멸사가 특징이다. 원인으로는 안압상승, 시신경허혈, 산화스트레스 등의 여러 가지가 작용 할 것으로 생각되나 그 정확한 발생기전은 밝혀져 있지 않다. 허혈전처치는 세포생존에 밀접한 연관이 있으며 일시적 허혈 후 세포가 갖는 일종의 적응반응이며 녹내장에서의 시신경손상을 억제하는 세포보호작용이 있는지와 망막신경절세포의 실험관 모델에서 열충격단백질과의 연관성을 알아보기 위해 H2O2를 산화스트레스로 가한 후 LDH assay 와 Western blot, real time RT-PCR을 이용하여 관찰하였다. 허혈전처치의 세포보호효과는 약 8시간의 허혈전처치가 가장 컸으며 열충격단백질의 발현도 허혈전처치 직후부터 관찰되어 2시간 후까지 증가하다가 감소하였고 그 중에 Hsp27이 가장 높은 상승곡선을 보였다. 세포생존에 관계되는 Bcl-2와 Bcl-XL의 mRNA 발현도 허혈전처치 직후부터 크게 증가한 후 서서히 감소하였고 세포사에 관여하는 Bad, Bax는 거의 변화가 없었다. Western blot 상의 단백질발현은 Bcl-2가 허혈전처치 직후부터 증가하여 약 24시간까지 유지되었고 Bcl-XL는 별다른 변화가 없었으며 Bad는 감소하였다. 이의 결과를 종합해보면 망막신경절세포는 산화스트레스를 받았을 때 허혈전처치에 의해 세포보호효과를 가질 수 있으며 이는 열충격단백질 특히 Hsp27의 발현과 연관됨을 알 수 있었다. 이러한 세포보호작용은 생체 내가 아닌 망막신경절세포 단독으로도 관찰되어 향후 어떤 기전으로 허혈전처치와 Hsp27이 연관되는지에 대한 추후연구의 밑바탕이 될 수 있을 것으로 보인다.

가토의 녹내장 모델에서 국소적 안구 표면냉각의 망막신경절세포 손상에 대한 보호 효과

최철명 연세대학교 대학원 2000 국내박사

목적 : 가토에서 국소적 안구 표면냉각이 망막 온도 변화에 미치는 영향과 안압을 상승시킨 가역적 급성녹내장 모델에서 망막신경절세포 손상에 대한 안구 표면냉각의 신경보호효과를 알아 보고자 하였다. 방법 : 국소적 안구 표면냉각이 망막온도변화에 미치는 영향을 보기 위하여 백색가토의 양안에 thermocouple probe 를 모양체 평면부를 통해 삽입하여 망막 표면에 위치시켰다. 한쪽 눈은 평형염액(Balanced salt solution)수액병에 26G 주사침을 연결한 후 전방천자를 하여 안압을 상승시켰고(고안압안), 반대 안은 안압을 상승시키지 않았다(정상안압안). 양안 안구 표면에 얼음을 대어 국소냉각 시키면서 망막온도를 1 시간동안 측정하였다. 고안압으로 야기된 망막신경절세포 손상에 대한 저체온의 보호효과를 보고자 양안 안압을 동일한 방법으로 상승시킨 후 한쪽 눈은 1 시간 동안 냉각을 시키고(냉각안), 다른 쪽은 냉각을 시키지않았다(비냉각안). 실험 후 24, 48, 72 시간째에 안구를 적출하고 각막천공기를 이용해 직경 7mm 크기의 원형 망막조직을 얻어 TUNEL(Tdt-mediated fluorescein-dUDP nick-end labeling) 염색을 하고 형광현미경 하에서 TUNEL 양성 세포수를 측정하였다. 시신경 상부 망막조직 hematoxylin-eosin stain 을 시행하고 광학현미경으로 정상 망막신경절세포수를 관찰하였다. 결과 : 실험 전 망막온도의 평균은 정상안압안이 38.7℃, 고안압안이 38.5℃였으며(p>0.05) 1 시간 동안 냉각시킨 후 망막 온도는 정상안압안과 고안압안이 각각 37.3℃, 32.7℃로 고안압안에서 온도감소 효과가 유의하게 컸다(p<0.05). 안압을 상승시킨 녹내장 모델에서 평균 TUNEL 양성세포수는 비냉각안과 냉각안에서 각각 24 시간째 83.7, 32.3(p<0.05), 48 시간째 194.8, 81.0(p<0.05), 72 시간째 359.9, 89.9(개, p<0.05)로 비냉각안에 비해 냉각안에서 통계학적으로 의의있게 적었다. 그러나 정상망막신경절 세포수는 비냉각안과 냉각안에서 각각 24 시간째 3.1, 3.6(p>0.05), 48 시간째 2.8, 3.4(p>0.05), 72 시간째 2.4, 3.3(p<0.05)로 72 시간째에만 유의한 차이를 보였다. 결론 : 안구의 국소냉각은 고안압 상태에서는 망막온도를 유의하게 하강 시켜 경도의 저체온 (망막 저온) 상태를 유도할 수 있었으며, 또한 가역적으로 고안압를 유도한 급성 녹내장 모델에서 안구의 국소적 표면 냉각으로 망막 신경절세포손상을 줄일 수 있었다. Purpose : The objects of this study are to determine the influence of local ocular surface cooling on the temperature of retina surface and to access the neuroprotective effect of hypothermia on retinal ganglion cell death in a transient acute glaucoma model of a rabbit. Methods : To determine the influence of local cooling we inserted thermocouple probes through the pars plana of albino rabbit eyes and tips were placed at the retinal surface. The intraocular pressure(IOP) of one eye in each rabbit was elevated by anterior chamber paracentesis with a 26G needle connected to a balanced salt solution(high IOP eye) and no IOP elevation to the other eye(normal IOP eye). Both eyes of each rabbits were cooled locally by direct contact of ice to the corneal surface and retinal temperature of both eyes were monitored for 1 hour. With the result of above study, we examined the neuroprotective effect of hypothermia from acute IOP elevation. IOP of both eyes were elevated with the same procedure as above. One eye in each rabbit was cooled locally(Cooling eye) and the other eye was not cooled(Noncooling eye). The procedure lasted 1 hour and eyes were enucleated after 24, 48 and 72 hours. To obtain equal amount of retina area we used a 7mm trephine to punch out the retina specimen. Specimens were flat mounted and TUNEL(Tdt-mediated fluorescein-dUDP nick-end labeling) was performed. The results were examined with fluorescent microscope. We also performed Hematoxylin-Eosin stain and retinal ganglion cell count was done under light microscope. Results : Initial retinal temperature of normal and high IOP eye was 38.7℃ and 38.5℃, respectively(p>0.05). After 1 hour of local cooling the mean retinal temperature of normal and high IOP eye decreased to 37.3℃ and 32.7℃, respectively(p<0.05). In the glaucoma model with high IOP the cooling eye showed significantly lower positive TUNEL counts. Positive tunnel count of noncooling and cooling eye were 83.7, 32.3 at 24 hours(p<0.05),194.8, 81.0 at 48 hours(p<0.05), and 359.9, 89.9 at 72 hours(p<0.05), respectively. Normal retinal ganglion cell count per high power field in noncooling and cooling eye were 3.1, 3.6 at 24 hours(p>0.05), 2.8, 3,4 at 48 hours(p>0.05), 2.4, 3.3 at 72 hours(p<0.05), respectively. Normal retinal ganglion cell count was significantly higher in the cooling eye at 72hr.Conclusion : Local cooling of the eye can effectively lower the retinal surface temperature to the mild hypothermic range in conditions of high IOP. Mild hypothermia induced by topical cooling reduces ganglion cell deaths in acute glaucoma model with transient IOP elevation.

원발성개방각과 정상안압 녹내장의 진단에서 스펙트럼 도메인 빛간섭단층촬영을 이용한 황반주위 신경절세포-내망상층 두께 측정의 유용성

정현호 전남대학교 대학원 2013 국내석사

목적: 원발성개방각 녹내장과 정상안압 녹내장의 진단에서 스펙트럼 도메인 빛간섭단층촬영을 통한 황반주위 신경절세포-내망상층의 두께 측정의 유용성을 알아보고자 하였다. 대상 및 방법: 원발성개방각 녹내장으로 진단된 환자 중 초기 43명 43안, 중기 20명 20안과 정상안압 녹내장으로 진단된 환자 중 초기 60명 60안, 중기 27명 27안을 대상으로 하였다. 스펙트럼 도메인 빛간섭단층촬영을 시행하여 황반주위 신경절세포-내망상층의 두께와 유두주위 망막신경섬유층의 두께를 측정하였다. 황반주위 신경절세포-내망상층의 두께는 전체평균, 최소, 상측, 상비측, 상이측, 하측, 하비측, 하이측으로 구분하였고, 유두주위 망막신경섬유층의 두께는 전체평균, 상측, 하측, 비측, 이측으로 구분하였다. 원발성개방각 녹내장과 정상안압 녹내장에서 진행 정도에 따른 차이를 비교 분석하고자 하였다. 결과: 원발성개방각 녹내장에서 황반주위 신경절세포-내망상층의 두께는 녹내장의 진행에 따라 하비측을 제외한 모든 측정부위에서 유의하게 감소하였고, 유두주위 망막신경섬유층의 두께는 이측과 비측을 제외한 모든 측정부위에서 유의한 감소를 보였다. 정상안압 녹내장에서 황반주위 신경절세포-내망상층의 두께는 평균, 최소, 그리고 하이측에서 유의한 감소를 보였고, 유두주위 망막신경섬유층의 두께는 평균과 하측에서만 유의한 감소를 보였다. 진단력 비교시 녹내장의 종류와 진행 정도에 상관없이 황반주위 신경절세포-내망상층에서는 최소 두께 값이, 유두주위 망막신경섬유층에서는 평균 두께 값이 가장 높은 진단력을 보였으며, 두 값 사이에 통계학적으로 유의한 차이는 보이지 않았다 (초기 원발성개방각 녹내장: 0.774, 0.841 (P = 0.161), 중기 원발성개방각 녹내장: 0.959, 0.983 (P = 0.607), 초기 정상안압 녹내장: 0.855, 0.877 (P = 0.642), 중기 정상안압 녹내장: 0.946, 0.956 (P = 0.814)). 결론: 스펙트럼 도메인 빛간섭단층촬영을 이용한 황반주위 신경절세포-내망상층의 두께 측정은 원발성개방각 녹내장과 정상안압 녹내장 모두에서 유두주위 망막신경섬유층 두께 측정과 유사한 진단력을 보여 녹내장 진단시 유용한 지표임을 알 수 있었고, 황반주위 신경절세포-내망상층의 두께의 지표 중 최소값이 가장 높은 진단력이 있음을 알 수 있었다.

아데노바이러스 벡터를 이용한 열충격단백질 72 (heat shock protein 72; HSP72) 유전자의 인간 섬유주세포 및 쥐 망막신경절세포에의 주입 및 발현

박성철 성균관대학교 대학원 2007 국내석사

목적: 열충격단백질 (heat shock protein; HSP)은 외부 자극에 대한 방어 기능을 수행하는 단백질로서, 특히 HSP72는 안압 상승 시 망막신경절세포의 소멸 (apoptosis)을 감소시킨다고 알려져 있다. 이러한 HSP72를 외부로부터 직접 공급하기 위한 방법으로, HSP72 유전자를 포함하고 있는 아데노바이러스 벡터를 제작하고 이를 이용하여 인간 섬유주세포 및 쥐 망막신경절세포에 HSP72 유전자를 주입, 발현시키고자 하였다. 대상 및 방법: HeLa세포에서 전체 RNA를 추출한 후 역전사-중합효소연쇄반응을 통해 HSP72의 cDNA를 얻었다. HSP72 유전자의 cDNA를 pShuttle-CMV 벡터에 삽입한 후 pAdEasy-1 벡터와 재조합 과정을 거쳐 HSP72 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터를 제작하였다. 제작된 아데노바이러스 벡터를 이용하여 HSP72 유전자를 in vitro 환경의 인간 섬유주세포와 in vivo 환경의 쥐 망막신경절세포에 주입한 후 Western blot, 세포면역염색 및 조직면역염색을 통해 그 발현을 알아보았다. 결과: HSP72 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터를 감염시킨 인간 섬유주세포에 대한 Western blot에서 분자량 72kDa 정도의 단일 밴드가 관찰 되었고, 세포면역염색에서 HSP72의 존재를 나타내는 형광이 섬유주세포의 세포질에 나타났다. 또한 이 재조합 아데노바이러스 벡터를 쥐 안구의 유리체강 내 주사한 후 실시한 조직면역염색에서 HSP72의 발현을 의미하는 발색 반응이 망막신경절세포에 나타났다. 결론: HSP72 유전자를 지닌 아데노바이러스 벡터를 이용하여 인간 섬유주세포 및 쥐 망막신경절세포에 직접 HSP72 유전자를 주입하여 HSP72를 발현시킬 수 있었다. 이는 간접적인 방법으로 HSP72의 발현을 증가시킨 지금까지의 다른 연구들에서와 달리 HSP72 고유의 기능을 알아 보는 향후 연구에 있어서 중요한 역할을 담당할 것이다.