비스페놀 A 의 생쥐 태자 염색체이상 유발에 관한 연구

성민정 한양대학교 대학원 2007 국내석사

주변 환경에 존재하는 내분비계 장애물질들은 동식물의 생체 내에 존재하는 정상 호르몬의 수용체와 결합하여 호르몬의 생성을 억제 혹은 증가시킴으로써 다양한 이상을 초래하는 것으로 알려져 있다. 사람에서도 생식기관의 발달 및 생식기능 장애, 성장장애, 기형, 암 등 각종 질환을 유발하는 것으로 알려져 있으며, 이러한 내분비계 독성물질에 대한 독성영향 연구는 이미 많은 연구에서 증명된 바 있다. 내분비계 장애 추정물질로 알려진 비스페놀 A [BPA, 2,2-bis (4-hydroxyphenyl)propane] 는 에폭시 수지, 폴리에스테르-스티렌, 폴리카보네이트의 단위물질로, 음식물 용기, 젖병, 페인트, 접착제, 치과용 sealant, 상수관, 항산화제 등에 광범위하게 사용되고 있다. 비스페놀 A 는 용기의 세척 및 살균과정에서 녹아 나와 음식물에 스며들어 인체에 흡수될 수 있다. 비스페놀 A 의 estrogenic effect에 대해서는 이미 1930년대부터 알려져 있으며, 최근 들어 생식세포에서 염색체 이상과 관련된 보고들이 발표되고 있다. 생식세포의 염색체 이상과 내분비계 장애 추정물질 노출과의 상관성은 실험동물과 사람 세포주를 이용한 연구들에서 보고되어 왔다. 그러나 실제 사람에 대한 발암성 여부나 내분비 장애물질 여부에 대해서는 여전히 많은 논란이 되고 있으며, 염색체 이상을 가진 생식세포들이 실제 수정에 관여하여 이수체 (aneuploid) 를 갖는 태자를 생성하는지 여부는 아직 확인된 바가 없다. 따라서 본 연구에서는 비스페놀 A 를 음용수를 통해서 생쥐에 투여한 후 교배시켜 생성된 태자의 염색체를 분석함으로써 실제 이수체 생쥐가 생성될 수 있는지를 확인하였다. 또한 자손 1세대와 2세대에서 이수체를 갖는 태자의 생성빈도를 비교함으로써, 비스페놀 A 가 성체에서 노출될 경우와 배 발생시기부터 지속적으로 노출될 경우에 있어서 어떤 차이가 있는지를 알아보았다. 대조군과 비스페놀 A 투여군 과의 체중비교 결과, 자손 1세대에서 비스페놀 A 투여군의 체중이 약간 증가하였으나 통계적으로 유의한 수준은 아니었다. 암컷 한 마리 당 임신율은 대조군 보다 비스페놀 A 투여군이 더 높았고, 유산율은 비스페놀 A 투여군에서 약간 감소되는 경향을 보였다. 그러나 비스페놀 A 투여군만 비교했을 경우 유산율이 처리농도 증가와 비례하는 것을 확인할 수 있었다. 사람의 경우 일반적으로 염색체 수적이상을 가진 태아는 착상하지 못하거나 임신초기에 유산된다. 본 연구에서 임신 12일 이후까지 생존하여 적출한 태자 중 형태학적 기형이나 발달미숙인 태자는 관찰되지 않았으며, 따라서 염색체 이상을 가진 태자는 초기에 유산되었을 것으로 생각 되어진다. 이수체 염색체의 출현빈도는 대조군과 비스페놀 A 투여군 간에 유의한 차이를 나타내지 않았다. 또한 염색체의 구조적 이상이나 chromosome gain, 삼배수체 (triploid) 가 관찰되지 않은 것으로 보아, 중기염색체 상에서 관찰된 한 두 개의 loss 는 개체의 염색체 이상에 의한 것이 아니라 슬라이드 제작과정 중에 일어나는 random loss 일 것으로 생각된다. 결론적으로, 일상환경에서의 저농도의 비스페놀 A 노출은 생식세포의 염색체 이상을 통한 이수체 염색체를 갖는 태자형성에 거의 영향을 미치지 않을 것으로 사료된다. 또한 인체에 대한 유해여부를 확인하기 위해서는 농도를 더욱 세분화하여 더 정밀한 연구가 필요할 것이다 Environmental endocrine-disrupting chemicals (EDCs) have been known to interfere with the endocrine system of human body in various ways such as mimicking a natural hormone, inhibition or stimulation of hormone production, and binding to a hormone receptor. The effect of EDCs on development of reproductive organ, reproductive ability, delayed growth, malformation and cancer have also demonstrated. Bisphenol A (BPA), known as an endocrine disruptor, is a monomer of epoxy resin and polycarbonate plastic used in water and food containers and baby bottles. BPA is also widely used in paints, adhesives, dental sealants and composite, and antioxidants. BPA has been known to leach from plastics which are cleaned with strong detergents or used to contain acidic or high-temperature liquids. Estrogenic effect of BPA has been known since 1930s. However, it is still controversial whether BPA is a carcinogen or an endocrine disruptor. Recently, the effects of BPA on chromosomal aberrations in germ cells were studied using experimental animals and human cell lines. However, whether germ cells with a chromosome aberration produce aneuploidy gametes and fetuses with an abnormal chromosome constitution has not been confirmed yet. In this study, chromosome analyses of fetuses produced from BPA exposed mice were carried out. Mice were continuously exposed to BPA from one week before mating in parental generation to embryonic/fetal life in second filial generation at 500, 1000, and 2000 ng/ml of drinking water. Body weight was increased in BPA-treated groups, but there was no statistical significance. BPA-treated mice exhibited higher pregnancy rate than control and abortion rate tended to decrease in BPA-treated groups. In BPA-treated groups the abortion rate was increased in dose-dependent manner. No significant difference was observed in aneuploidy levels between control and BPA-treated groups. Also, there was neither structural aberration nor chromosome gain as well as triploid. Thus, one or two losses observed on metaphase chromosomes are considered random losses occur during slide preparation instead of individual chromosomal abnormalities. In conclusion, low-dose exposure of BPA may not affect the formation of aneuploidy gametes. For understanding whether BPA is harmful to humans, more detailed studies should be conducted.

Regulation of neurogenin1 by phospholipase D1 via mTOR in H19-7 cells

구준본 한양대학교 대학원 2007 국내석사

Phospholipase D (PLD)는 포유류 세포에서 다양한 생리학적 신호전달에 관여하는 인지질 분해효소로서 인지질 말단의 diester 결합을 가수분해하여 인지질을 Phospahtidic acid (PA) 와 free choline 으로 전환시킨다. PLD 에 의해 생성된 PA 또한 그 자체로 세포의 증식, 분화, 세포생존 등의 다양한 생리학적 신호전달에 관여한다. 본 연구에서는 PLD1 이 신경발생에 있어서 중요한 역할을 하는 basic helix-loop-helix (bHLH) family 전사인자인 neurogenin1 (Ngn1) 의 활성을 mammalian target of rapamycin (mTOR) 을 경유하여 조절함으로서 H19-7 세포주의 신경발생을 조절한다는 것을 규명하고자 한다. 본 실험실에서 선행된 연구에서 PLD1의 활성이 신경줄기세포의 분화에 중요한 역할을 한다는 것을 보고한 바 있다. 또한 PLD1 발현 억제 유전자인 dominant negative mutant PLD1 (DN-PLD1) 을 tranfection 시키면 basic fibroblast growth factor (bFGF) 에 의해 유도된 H19-7 세포주의 신경발생이 억제 됨을 통해 신경발생에 있어서 PLD1의 발현과 활성이 중요하다는 것을 확인하였다. PLD1의 활성이 신경분화가 일어나게 되면 발현되는 신경분화 전사인자인 Ngn1의 발현에 영향을 주는지 확인하기 위해 DN-PLD1을 transfection 시켰으며, Ngn1의 발현 정도를 확인한 결과 bFGF 에 의해 PLD1의 활성이 증가하면 Ngn1의 발현이 증갛였고, PLD1의 활성이 억제 되면 Ngn1의 발현 역시 억제됨을 확인하였다. 이는 통해 Ngn1의 발현이 PLD1에 의해서 조절된다는 것을 밝혀냈다. PLD 의 대사산물인 PA는 mTOR 를 직접적으로 activation 시키는데, mTOR 역시 포유류 세포에서 다양한 생리학적 신호전달에 관여한다. PLD1 에 의한 Ngn1의 발현 조절에 있어서 mTOR 이 관여하는지 확인하기 위해 PLD1-siRNA를 transfection 시켜 PLD1을 knock down 시킨 후 mTOR 과 Ngn1 의 발현을 확인하였다. 그 결과, PLD1의 활성이 증가하면 mTOR 와 Ngn1 의 발현 이 증가하였으며, PLD1이 억제되면 mTOR 와 Ngn1 이는 함께 억제되었다. 이는 PLD1에 의한 Ngn1의 조절에 있어서 PLD1의 하위에서 mTOR 가 관여한다는 것을 암시한다. PLD1이 mTOR 을 경유하여 Ngn1 을 조절한다면 mTOR 을 억제 시키면 Ngn1의 발현도 억제 될 것이며 신경분화 역시 억제 될 것이다. 이를 확인하고자, mTOR inhibitor 인 rapamycin 으로 mTOR 을 block 시킨 후 bFGF 를 처리하였다. 그 결과, 신경 발생의 형태학적 변화도 관찰되지 않았으며, Ngn1의 발현 역시 완벽히 억제됨을 확인하였다. 본 연구에서 확인한 결과들을 통하여 PLD1의 발현과 활성이 bFGF에 의해 유도된 해마 신경 세포주 유래의 H19-7 cells 의 신경 분화에서 중요한 역할을 하며, PLD1은 mTOR 을 경유하여 신경발생에 있어서 중요한 역할을 하는 Neurogenin1을 조절함으로써 신경 분화에서 중요한 역할을 한다고 사료된다. Phospholipase D (PLD) catalyzes the hydrolysys of phospholipids, mainly phosphatidylcoline (PC), resulting in formation of phosphatidic acid (PA). PA has been associated with many aspects of mammalian physiology, which include cell proliferation, survival, transformation, progression and differentiation. Recently, PA has been identified as a mitogenic activator of mTOR signaling pathway. PA binds to mTOR to promote various signals. We previously verified that PLD1 activity is upregulated during neuronal differentiation induced by basic fibroblast growth factor (bFGF) treatment in rat neuronal hippocampal progenitor cell line, H19-7 cells. Subsequently, we investigated the role of PLD in neuronal differentiation, specifically activation of neurogenin1 (Ngn1), bHLH family which plays critical role in regulation of neural stem cell differentiation. To figure out the effect of PLD1 on Ngn1 through mTOR signal, we treated natural PA to H19-7 cells under differentiation condition. Natural PA treatment upregulated mTOR and Ngn1 expressions. Furthermore, inhibition of PLD1 activity by PLD1 siRNA showed that expressions of mTOR and Ngn1 were completely inhibited. However, mTOR and Ngn1 expression levels were upregulated when PLD1 activity was increased by bFGF in H19-7 cells. To further confirm the role of PLD1 on Ngn1 through mTOR, we treated rapamycin to inhibit mTOR signal. Treatment of rapamycin showed completely inhibited Ngn1 expression and neurogenic morphological change. These results suggest that PLD1 regulate Ngn1 through mTOR signaling pathway during neuronal differentiation in H19-7 cell. This is important evidence that PLD1 regulates neuronal differentiation by producing PA to promote mTOR signaling and stimulate neurogenin1

마우스 배아줄기세포 신경분화의 유전자 발현 데이터에 대한 Eigengene 기반의 유전자 군집분석

양정은 한양대학교 대학원 2008 국내석사

Although at least one hundred thousand genes had been predicted in human being, the human genome project has reported only twenty five to thirty thousand genes, so far. Many reports from that and other research suggest that in order to express the life phenomena in highly complicated lives, not only genes but also their relationships, so called genetic network, play essential roles. According to evolution of lives, genetic network has become differentiated to modularized form. The functional module of genetic network means a tightly related group of genes isolated in genetic network and may carry out a specified biological function. The aim of this research is to develop the efficient algorithm to identify a functional module through cluster analysis of gene expression data. Many clustering algorithms have been applied to analyze gene expression data, such as hierarchical clustering (Eisen et al., 1998), K-mean clustering (Herwig et al., 1999), and self-organizing maps (SOM) (Tamayo et al., 1999). Usually most of them assort the genes according to their similarities or dissimilarities between their expression profiles, but they are not suitable for identifying functional modules because of no consideration of relationships between genes. A clustering framework, which had been developed by our lab (Han, 2007; Kim, 2007), was modified and applied to gene expression profile of nervous differentiation with cDNA microarray experiments. It takes advantage of SVD (singular value decomposition) that detects biologically meaningful gene expression patterns and dominant eigengene of each cluster can represent coherent pattern clearly. The advanced clustering processes (1) begin with modified K-means that constructs subsets of genes on dominant common expression pattern according to similarities between expression profiles of genes. (2) And then, these subsets of genes are iteratively concentrated, through refinement algorithm, to subsets including genes showing tightly coherent expression pattern. (3) Through the enrichment of clusters, missed genes were included in clusters through estimation of covariance to each cluster. As the results, a number of 134 clusters were obtained from the expression data of 6,331 genes, and biological function of each cluster was predicted as a module with Gene Ontology (GO). Especially, genes related to neurogenesis were significantly gathered in cluster 1 and 2. The Cluster 1 showed increased expression pattern and included Notch1, Ncdn, Unc5b and so on. The other side, the Cluster 2 revealed down-regulated pattern and included, Nrp2, Hey1, Zfhx3 and so on. The investigation of biological functions about each cluster indicated that this clustering framework is useful tool for analysis of gene expression data and identification of functional module of genes. Human genome project가 완성 단계에 이르면서 대부분의 생명과학자들의 기대와는 달리 이만 오천에서 삼만 개의 유전자만을 확인할 수 있었다. 그러므로 고도로 진화된 생명체에서는 유전자뿐만 아니라 유전자 사이의 관계 즉, 유전자 네트워크가 생명현상을 발현함에 있어 핵심적 역할을 수행함을 암시한다. 유전자 네트워크는 진화의 과정에서 특정 생명현상을 수행하는 부분이 모듈화 되었으며, 유전자 모듈은 생명현상과 연관되는 유전자들의 기능적 단위체로 고려할 수 있다. 따라서, 유전자의 군집화는 유전자 모듈을 추적하여야 한다. 현재까지 개발된 군집화 알고리즘은 Hierarchical Clustering, KMeans Clustering, 및 SOM 등 여러 가지가 있지만, 유전자의 기능적 모듈화보다는 발 현패턴에 의존하여 유전자를 군집화한다. 본 연구에서는 기존의 K-means 알고리즘에, singular value decomposition (SVD)의 패턴추출기법을 적용하여, 유전자의 기능적인 패턴을 분석하고 군집화하는 방법을 개발 및 개량 구현하였다. 이 군집화 알고리즘을 요약하면 다음과 같다. 1) 먼저, SVD를 수행하여, 고유유전자 (Eigengenes)를 추출하고, 이 고유유전자를 기준으로 K-means를 수행한다. 이 과정 을 통하여 발현패턴을 기준으로 유사하게 발현하는 유전자들의 군집들을 빠른 수행시간 에 생성하게 한다. 2) 이전 과정에서 생성된 군집내의 유전자들 중에 군집과 연관성이 적은 유전자를 순차적으로 제거함으로써 군집의 집중도를 증가시킨다. 3) 마지막 enrichment 과정 으로, K-means 과정에서 놓친 유전자를 포함시키고 또한 복합적 과 정에 관여하는 유전자를 군집에 포함시키는 overlapping 군집화를 수행한다. 마우스의 배아줄기세포의 신경분화과정에 Day 1,2,3,6,12,15에 관찰한 유전자 발현 데이터에 본 연구에서 개발 및 개량된 군집화 프로그램을 적용하여 본 결과, 6,331개의 유전자를 134개의 군집으로 분리할 수 있었다. 각 군집의 생물학적 기능의 연관성을 Gene Ontology (GO)의 생물학적 기능과 생화학적 기능에 대해서 군집의 분포를 관찰한 결과 발현 패턴 유사성뿐만 아니라, 생물학적 및 생화학적 기능에 따라 군집화 됨을 알 수 있었다. 본 연구의 결과는 이러한 군집분석기법이 유전자 발현 데이터의 분석에서 동일한 생물 학적 기능의 발현과 관련된 유전자들을 분리 할 수 있을 것으로 추정되며, 생명체 시스 템의 기저를 형성하는 유전자 네트워크의 기본 모듈로써의 유전자 군집을 파악할 수 있 을 것이다.

생쥐 태아에서 간 줄기세포의 분리 및 배양

김소희 한양대학교 대학원 2010 국내석사

간(liver)은 물질대사 과정에서 생성되는 독성물질이나 외부에서 유입되는 독성을 분해하여 해독 기능을 수행하는 장기로, 신진 대사의 중추적인 역할을 수행한다. 이러한 간세포의 물질대사 특성을 이용하여, 신약개발 시 질환모델 동물의 간에서 약물대사와 약물의 간독성을 검증하거나, 인간의 간세포(hepatocyte)를 연구대상으로 간암에 대한 병리학적 연구가 오랫동안 진행되어 왔다. 그러나 현재까지 알려진 배양방법으로 간세포는 체외에서 장기적으로 배양이 불가능하고, 체외에서 간세포를 배양할 경우 간세포 고유의 특성이 상실된다. 따라서 이런 단점을 극복하기 위한 대안으로 간세포로서의 특성을 지니며 장기간 배양이 가능한 간 줄기세포 활용의 중요성이 부각되어 있으며, 간 줄기세포의 분리 및 배양방법의 확립으로 이러한 문제점을 극복하려는 시도가 이루어지고 있다. 간 줄기세포(hepatic stem cell)의 특성을 유지하며 장기간 배양 가능한 조건을 찾기 위하여 ICR 생쥐 간을 이용하여 간 줄기세포의 분리 및 배양 실험을 실시하였다. 생쥐 태아의 발생 단계별 간 줄기세포의 증식과 분화양상을 분석하기 위하여 임신 E11.5, E12.5, E15.5 시기의 태아와 출생 1일, 성체 간 조직을 헤마톡실린과 에오신 염색을 통하여 세포의 형태변화와 RT-PCR을 통한 표지 유전자 발현을 비교분석한 후 다량의 간 줄기세포를 확보할 수 있는 E12.5일 생쥐 태아의 간을 배양에 이용하였다. 간 줄기세포의 초기배양은 Berry와 Friend (1969)가 이용한 방법과 Seglen (1972)가 이용한 간세포 일차배양 방법을 변용하여 시행하였다. 임신 후 12.5일된 ICR strain 생쥐의 태아에서 간을 분리하여 세절(mincing)한 후 0.025% collagenase를 처리하여 세포를 분리하였다. 분리된 태아의 간세포는 collagen type Ⅰ이 표면에 처리된 배양접시에서 HGF, EGF, bFGF를 포함된 배양액에 부유시켜 37℃, 7% CO2의 배양기에서 배양을 시작하였으며, 24시간 후 배양접시에 부착된 세포를 선택적으로 분리하여 배양하였다. 연속적인 계대배양 과정에서 간 줄기세포의 특징을 분석하였다. 배양한 간 줄기세포의 형태는 난원형태로 확인되었으며, 78일 동안 총 계대배양 13번을 거치며 32회 분열하였다. 배양된 세포에서는 줄기세포 표지인자인 Oct4, Nanog, Sox2가 발현되었으며, 간 줄기세포 표지자인 AFP가 강하게 발현되었으나, 상대적으로 간세포 표지자인 HNF4α는 발현율이 감소하였다. 세포의 세포면역화학적 염색 결과, 계대배양을 거치며 간 줄기세포에서 미분화 및 간 줄기세포 표지자인 AFP와 Oct4, Nanog, Sox2의 발현율이 감소하였으며 상대적으로 HNF4α와 albumin은 증가되는 양상을 보였다. 본 연구에서는 생쥐의 태아에서 추출된 간 줄기세포는 collagen type Ⅰ이 표면에 처리된 배양접시와 HGF, EGF, bFGF를 조합한 배양액에서 간 줄기세포 고유의 특성을 유지하며 간세포에 비하여 장기적으로 배양이 가능함을 확인하였으며, 이러한 생쥐 간 줄기세포의 배양방법은 인간의 간 줄기세포의 확립과 대량생산에 적합한 배양방법을 개발하는데 중요한 기초자료로 사용될 수 있을 것이다.

원종양 유전자 및 Hox 유전자 레트로바이러스 cDNA 유전자군 합성

김의 한양대학교 대학원 2010 국내석사

유전자의 기능을 연구에는 다양한 방법들이 사용된다. 이러한 방법 중 매우 유력한 방법 중의 하나는 cDNA Library 를 이용하는 방법이다. 즉 세포집단에 cDNA Library 를 전달하고 다양한 방법으로 특정 형질을 지닌 세포군을 분리한 다음, 세포에 어떠한 유전자들이 전달되어 있는가를 규명하는 역유전학적 실험방법(reverse genetics)이 자주 사용되어 왔다. 이는 이미 다양한 연구에서 사용되어 왔던 방법이지만 기존의 방법에는 몇 가지 문제점들이 존재한다. 첫째, 일반적인 cDNA Library 를 사용하는 경우 유전자 전달의 효율이 극히 낮아 실험실에서 배양중인 세포주를 대상으로 한 실험에만 제한적으로 적용이 가능하다는 점과, 둘째, 일반적으로 상업적으로 차용이 가능한 cDNA Library 들은 유전자의 숫자가 지나치게 방대하여 정밀하고 재현 가능한 유전자 검색이 불가능하다는 점이다. 이러한 문제점들을 해결하여 세포주에서 뿐 아니라 생체 정상세포를 대상으로 한 다양한 실험환경에서의 유전자 기능 검색을 가능하게 하기 위하여 본 실험실에서는 Kinase, Phosphatase, Proto-oncogene, Hox 유전자군의 retroviral cDNA 를 합성하고 있으며 본 논문은 이러한 장기 project 에서 proto-oncogene cDNA Library 를 확충하기 위한 작업에 관한 내용을 담고 있다. 전체적으로 54 개의 새로운 proto-oncogene retroviral cDNA clone 의 합성에 성공하였으며, 기존의 cDNA Clone 과 함께 전체적으로 134 개의 clone 이 완성되어 조직적인 cDNA 검색이 가능한 단계에 이르도록하였다. 이러한 clone 들은 앞으로 생체 세포를 대상으로 한 백혈병유발 유전자의 검색, 항암제 내성, 방사선 내성 등에 관련된 유전자 검색에 사용될 예정이다.

급성 림프모세포성 백혈병의 유전자네트워크 구축

김민정 한양대학교 대학원 2010 국내박사

암세포는 유핵 세포가 개체 수준의 시스템에 의한 통제에서 벗어나, 암세포 자체의 생존에 대해서만 최적화된 상태 중 하나이다. 일반론적인 측면에서 시스템은 구성 요소의 개별적 속성들의 집합이 아닌 시스템 자체의 고유 속성을 발현하는 바, 시스템으로써 암의 속성인 표현형은 유전자의 개별적 속성의 단순 집합체가 아닌 생체시스템으로서 암이 발현하는 고유의 속성이라 할 수 있다. 이와 같은 관점에서 암 고유의 표현형이 발생하는 기전을 이해하기 위하여, 본 연구에서는 급성 림프모세포성 백혈병(Acute Lymphoblastic Leukemia, ALL)의 유전자네트워크(genetic network)를 추론하였다. National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 Gene Expression Omnibus(GEO)에 등재된 성인 ALL 환자 30명의 전 RNA 표본에 대한 마이크로어레이 실험데이터(GSE5314)로부터 14개의 유전체모듈(genomic module)을 분리하였다. 유전체모듈은 내부적으로 조밀한 유전자 발현 정보의 교환 통로를 가짐으로써 von Neumann 엔트로피(entropy)가 최소화되며, 외부적으로 다른 모듈과 최소한의 통로(minimal cut)로 연결된 유전자의 군집이다. 각 모듈에 대해, 외부로부터 정보를 전달하는 통로를 구성하는 principal gene을 탐색함으로써 모듈간네트워크(intermodular network)를 구축하였으며, 각 모듈 내의 유전자 간 정보의 가간섭성(coherent information)을 계산함으로써 모듈내네트워크(intramodular network)를 구축하였다. 14개의 모듈 중 3번 모듈은 ALL의 모듈간네트워크에서 중추적 역할을 하는 것으로 파악되었다. 모듈간네트워크의 계층에서 최상위에 위치하는 3번 모듈에는 pre-B 세포의 분화에 필수적인 역할을 수행하는 것으로 알려진 유전자인 PAX5를 포함하여 B 세포의 발달과정과 밀접한 연관을 갖는 다수의 유전자들이 한 구역(block)에서 조밀한 네트워크를 구성하며, 이에 관련된 정보를 5번과 6번 모듈로 전달하고 있음을 알 수 있었다. 또한, 3번 모듈의 유전자네트워크에서 PAX5를 포함하는 B 세포 특이적인 구역 이외의 다른 두 개의 구역은 각각 T 세포와 myeloid lineage에 대한 특이성을 보이며, TCL1A와 MPO와 같이 ALL의 유전자 발현과 유의한 상관관계가 보고된 유전자가 함께 포함되었다. 이는 ALL의 백혈병모세포에서 B 세포 이외의 세포 분화에 대한 정보의 분산과 발현이 B 세포의 성장과 분화에 비정상적인 교란으로 작용할 수 있음을 암시한다. 특히, BLNK는 B 세포 분화에 필수적임에도 불구하고, B 세포에 특이적으로 나타나는 구역에 포함되거나 영향을 미치지 않으며, T 세포 특이적인 구역에서 정보를 전달하는 역할을 수행하고 있다. 3번 모듈에 B 세포 특이적인 구역의 정보를 받는 5번과 6번 모듈은 각각 세포의 증식과 분화를 담당하는 모듈로 추정되었다. 이들 모듈은 3번 모듈이 이들을 억제함으로써, 증식과 분화 모두가 저하된 것으로 추정된다. 이상의 결과는 정상적인 B 세포로의 분화 능력이 저하된 ALL 고유의 속성을 발현하는 시스템을 반영하는 유전자네트워크가 구축되었음을 제시한다.

Bacteroides fragilis enterotoxin으로 자극한 장상피세포에서 Lipocalin-2의 활성에 관한 연구

유도영 한양대학교 대학원 2011 국내석사

Bacteroides fragilis 장내에서 정상 균 무리로 알려져 있다. 이들 중 각종 염증반응을 일으키는 enterotoxigenic B. fragilis (ETBF)이 보고 되고 있다. 이 세균에서 분비하는 독소인 B. fragilis enterotoxin (BFT)는 장점막에서 각종 염증반응을 일으킨다. 예를 들어 BFT를 장상피세포에 자극하면 친염증성 사이토카인인 Interleukin-8 (IL-8)과 antimicrobial factor인 Human beta defensin-2 (hBD-2)의 발현을 증가하는 것을 연구한 바 있다. 박테리아 침입 시 숙주세포에서는 Liopocalin-2 (LCN-2)를 분비하여 박테리아의의 철분 획득을 방해하여 선천성 면역반응에 기여한다. 따라서 enterotoxigenic B. fragilis 가 침입할 시에 인체장상피세포에서 LCN-2의 정확한 신호전달과정의 규명으로 인하여, 장내의 염증에 관련된 질병에서 인체 장상피세포의 면역병리기전 규명에 큰 역할을 할 것으로 기대된다. 본 연구에서는 BFT의 자극에 의한 장상피세포에서 antimicrobial peptide인 LCN-2의 발현 및 염증조절과 그에 따른 신호 경로를 추적하였다. 그 결과 BFT 자극을 받은 HT-29 장상피세포에서 LCN-2가 발현되었고 NF-κB 와 AP-1의 활성 또한 증가하였다. 한편 dominant negative IκBα plasmid를 포함하는 retrovirus를 transfection 시킨 HT-29 장상피세포에서는 BFT 자극에 의해 LCN-2 유전자 발현은 증가하였지만, AP-1 활성 억제제를 전처리 하였을 때는 LCN-2 유전자 발현이 감소하였다. 또한 BFT 자극을 가한 HT-29 장상피세포에서 IκB kinase (IKK) 활성이 증가하였고, 특이적인 억제제를 처리한 결과 LCN-2의 발현이 감소하였다. 따라서 IKK가 antimicrobial peptide인 LCN-2의 발현에 밀접한 연관 관계가 있음을 알 수 있었다. 결론적으로, ETBF가 생성하는 BFT는 장상피세포를 자극하여 LCN-2의 유전자 발현을 증가시키고, 그 기전으로 IKK를 통한 AP-1의 신호전달 경로가 관여할 가능성을 확인하였다.

급성 전골수성 백혈병 HL-60 세포주의 분화에 미치는 PRC1 유전자의 역할에 관한 연구

조성신 한양대학교 대학원 2010 국내석사

본 연구에서는 급성전골수성백혈병에서 유래한 HL-60 세포주에서 Polycomb 유전자 중 Polycomb Repressive Complex 1(PRC1) 의 구성요소인 PCGF2 유전자의 역할을 살펴보았다. HL-60 세포주에 all-trans retinoic acid(ATRA)를 처리하면 과립구로의 분화를 유도할 수 있는데, 분화유도 시 PCGF2의 발현이 감소하는 것을 관찰하였다. 인위적으로 PCGF2 유전자의 침묵을 유발하였을 때 세포주기의 G1기에 머무는 세포의 비율이 높아지고 과립구로의 분화가 유도되는 것을 확인하였다. 과립구로의 분화유도는 세포주기의 변화에 있어 세포주기의 G1기에 작용하는 싸이클린의존적인산화효소(cyclin-dependent kinase)에 대한 억제자인 CDKN1A/p21WAF1과 CDKN1B/p27KIP1의 발현을 증가시켰으며, 세포의 형태가 변하고, 분화표지유전자인 IGTAM/CD11B와 CD38의 발현이 증가하며 Nitro Blue Tetrazolium(NBT)에 의해 염색되는 세포의 수도 증가하는 것으로 알 수 있었다. 한편, ATRA로 분화를 유도했을 때 발현이 증가되지만 Polycomb에 의해 발현이 억제될 가능성이 있는 HOX 유전자로서 HOXA7을 선별한 후, 인위적인 HOXA7의 과발현으로 세포의 분화가 촉진되는 것을 확인하였다. PCGF2 유전자의 인위적인 침묵으로 HOXA7 유전자의 발현이 증가하였으나, HOXA7의 과발현에도 불구하고 PCGF2의 발현이 불변한 결과로부터 PCGF2 하위에 HOXA7 유전자가 존재함을 추정 할 수 있었다. 또한 PCGF2 유전자의 인위적인 침묵으로 염색질에 결합하는 HOXA7의 promoter부위와 결합하는 PCGF2 단백량이 감소된 사실로 보아 Pcgf2 단백질의 직접적인 결합을 통해 HOXA7 유전자의 발현이 억제되는 기전을 설명할 수 있었다. 결론적으로 HL-60 세포주의 분화과정에서 PRC1 의 구성요소인 PCGF2가 중심적인 역할을 수행하며, 그 기전으로서 Pcgf2 단백질에 의해 억제되었던 HOXA7 유전자의 발현이 PCGF2 단백량의 감소로 인해 해제됨을 제시할 수 있었다.

유전자 발현 프로파일의 행렬 분해를 이용한 유전자 발현 조절 망 추정

김혜영 한양대학교 대학원 2007 국내박사

유전자 발현 조절 망(gene regulatory network)은 유전자의 발현을 조절하여 생명현상을 관장하는 정보의 흐름을 매개하는 휘발성 구조를 의미한다. 유전자의 발현은 유전자 또는 유전자 모듈 사이의 논리와 연결 강도에 의해 적절한 시점에 적절한 수준으로 조절되어야 한다. 유전자 발현 조절 망은 생명현상의 핵심적 역할을 수행하며 생명체의 진화를 비롯하여 종 간 혹은 개체 간 차이를 발현시킬 뿐만 아니라 각종 질환의 병태생리를 설명할 수 있을 것으로 기대된다. 그러나 최근 개발된 high-throughput 실험으로부터 얻은 다량의 유전자 발현 데이터를 사용하더라도 유전자 발현 조절 망을 파악하기에는 여전히 양적 · 질적으로 정보가 부족하다. 따라서 실제 유전자 발현 조절 망에 가장 근접한 모델을 개발하고, 이러한 모델에 준하여 유전자 발현 조절 망의 각 부분에 접근하는 방식이 필요하다. 본 연구에서는 분화하는 마우스 배아줄기세포의 유전자 발현 조절 망을 추정하고자 유전자 군집 및 유전자 군집 간 조절 정보의 전달 통로를 추적하였다. 총 8,947 유전자의 시간 별 발현 데이터가 사용되었으며, 이는 마우스 배아줄기세포의 분화 유도 후 6 시점에서 수집하였다. 유전자의 군집은 RnE (refinement and enrichment) 군집화 방법을 이용하여 유전자 발현의 진동 위상 (oscillatory phase) 별로 잘 분류된 171개의 유전자 군집을 확보하였다. RnE 군집화 방법은 k-means 군집화 방법 및 특이값 분해(SVD, sigular value decomposition)의 장점을 계승한 것으로, 특정 환경에서 일시적으로 발현되는 기능적 단위체로서 작동하는 유전자의 모듈(module)을 획득하기 위해 고안되었다. 또한 각 유전자 군집의 발현을 주도하는 eigengene 행렬을 추출하여 이를 두 개의 행렬, 즉 유전자 발현 행렬 및 가중 계수 (weight coefficient) 행렬로 분해하였다. 가중 계수의 유의성 검증을 통해 171개 유전자 군집의 제 일 eigengene을 주로 구성하는 34개 유전자, 즉 유전자 군집을 조절하는 데 주도적인 역할을 하는 유전자(principal gene)를 발견하였다( < 1.0E-9). 이러한 결과를 종합하여 34개의 principal gene을 거쳐 전달되는 유전자 발현 조절 망을 추정하였다. 또한 유전자 발현 조절 망에 깊이 우선 탐색(DFS, depth first search)을 적용하여 유전자 발현 조절의 계층적 구조를 발견하였다. 본 연구의 결과로 도출된 principal gene 및 유전자 발현 조절 망의 생물학적 의미를 분석한 결과, 실제 생물학적 현상과 근접함을 보여주었다. Principal gene을 포함하고 있는 유전자 군집은 마우스 배아줄기세포의 특성의 발현을 주도하는 것으로 밝혀졌으며, 이는 지금까지 알려진 줄기세포의 특성 발현에 대한 연구와 상당히 일치한다. 따라서 본 논문에서 제시한 방법은 포유동물의 세포에서 유전자 발현의 조절 관계를 이해하는 데 기여할 것이다. The gene regulatory network represents a volatile structure that mediates the flow of information controlling and regulating life. This network is believed to play a key role in life, to lead the evolution of life and the difference between individuals or species, and to explain the pathophysiology of diseases. It is assumed that the expression of genes can be controlled and regulated at the proper time by some logic and connection strength between genes or modules of genes. Because high-throughput data is still insufficient to understand the gene regulatory network, it is necessary to develop a model reflecting the real gene regulatory network and to approach each part of the gene regulatory network based on the model. In this study, a gene regulatory network of differentiating mouse embryonic stem (ES) cells was inferred by obtaining both clusters of genes and channels transmitting regulatory information between the clusters as nodes and edges of the network, respectively. A time-series gene expression dataset of 8,947 genes of mouse ES cells were obtained from cDNA microarray experiments at six points of time after induction of neuronal differentiation. Clusters of genes were obtained by using the refinement and enrichment (RnE) algorithm that adopts the advantages of both k-means and Singular Value Decomposition (SVD). The RnE algorithm was devised for obtaining modules of genes, which operate as functional units temporarily appearing under a certain momentary condition of the biological system. It clustered genes into 171 clusters having strong concentratedness in their expression patterns and a distinct range of oscillatory phases. The eigengenes of each cluster were factorized into two matrices, the gene expression profile matrix and the weight coefficient matrix. By using the significance testing of the weight coefficients, 34 genes that mainly comprise the first eigengenes of the 171 clusters were identified ( < 1.0E-9). Such genes, defined as the principal genes, were considered to be crucial in regulating the clusters. By putting the results together, a gene regulatory network was inferred, which transmits regulatory information between clusters mediated by the 34 principal genes. In addition, hierarchical structures of cluster regulation were discovered by applying Depth First Search (DFS) to the network. The analysis of biological significance of the principal genes and the cluster network supports the feasibility of the algorithms. The clusters that include the principal genes are understood to drive the manifestation of the phenotypes, e.g., the neuronal differentiation of mouse ES cells. This is in concord with our knowledge of the phenotypes of stem cells. The proposed methods will contribute to our understanding of gene regulatory relationships in mammalian cells.

유전자 프로그래밍에 의한 유전자 조절 네트워크의 선형 모델의 추론

김보경 한양대학교 대학원 2007 국내석사

생명체는 세포 내·외부의 환경적 혹은 생리적 자극에 대한 정보를 처리하여 적응적으로 반응한다. 이와 같은 정보의 처리와 반응은 유전체 수준에서도 일어나는데, 이는 외부의 자극을 반영하는 다수의 조절인자가 유전자의 발현을 변화시키고, 변화된 유전자의 발현 정도는 전사인자의 형태로 전환되어 다수의 다른 유전자에 조절적 기능을 수행함으로써 진행된다. 따라서, 유전자 발현의 변화는 세포내의 정보전달 기능의 세포내의 정보전달 기능의 수행과 밀접하게 관련된다고 할 수 있다. 최근, 마이크로 어레이 기술이 개발됨에 따라, 유전자의 발현을 대단위로 동시에 측정할 수 있게 되었고, 이를 통해 집적된 대단위 데이터로부터 생물학적 정보를 추출하기 위한 다양한 컴퓨터 계산 기술이 발달하였다. 특히 유전자 조절 네트워크의 규명이 생명 현상의 근본적인 이해를 위한 핵심적 문제로 조명됨에 따라, 유전자 발현 데이터를 이용한 유전자 조절 네트워크의 추론은 중요하게 되었다. 본 연구에서는 선형 모델과 유전자 프로그래밍을 이용하여 cDNA 마이크로 어레이 데이터로부터 유전자 조절 네트워크를 추정하고자 하였다. 유전자 프로그래밍은 다수의 개체로 구성된 개체군을 생성하고, 적합도가 높은 개체를 진화시킴으로써 최적화된 개체를 구하는 알고리즘이다. 유전자 조절 네트워크를 개체로 표현하고, 개체로 표현된 유전자 조절 네트워크에서 예측된 유전자 발현 데이터와 실제 특정된 마이크로 어레이 발현 데이터 간의 오차 값을 적합도로 평가하였다. 적합도가 높게 나타난 개체는 유전연산자에 의해 돌연변이, 유전교차 혹은 복제되어 세대를 반복하며 진화되었다. 유전자 조절 네트워크를 추정하는 과정은 다음과 같이 진행 되었다. 1. 생쥐의 ESell을 뉴런으로 분화시킴에 따라 cDNA 마이크로 어레이 실험을 실시하였고, 이를 통해 획득된 10368개의 유전자 발현데이터는 K-mean clustering 기법을 이용하여 200개의 집단으로 군집화되었다. 분화단계에 따라 발현 양상이 급격히 변화하는 유전자 군집에 속하는 유전자 39개와 전사 인자에 해당하는 444개의 유전자를 대상으로 유전자 조절 네트워크를 구축하였다. 2. 유전자 프로그래밍에서 유전자 네트워크는 네트워크 모티프 구조와 유전자간 조합에 의한 나무 구조로 표현되었다. 선형 모델을 기반으로 한 적합도 평가에 따라 유전 연산자를 적용함으로써 유전자 네트워크는 세대를 따라 진화되었다. 3. 선형모델을 기반으로 한 유전자 프로그래밍 기법을 이용해 최종적으로 추정된 유전자 네트워크는 다수의 유전자와, 방향성과 크기 정보가 포함된 유전자간 조절 관계로 표현되었다. 결과로 최고의 적합도를 가진 유전자 조절 네트워크에서 평가된 유전자 발현 프로파일은 실제 마이크로 어레이 데이터와 매우 유사한 양상으로 나타났다. 그러므로, 본 연구에서 제안한 선형 모델 기반의 유전자 프로그래밍 알고리즘은 대단위 유전자 발현 데이터로부터 정량적인 유전자 조절 네트워크를 추정에 효과적으로 적용될 수 있다. 또한 본 연구에서 추정된 유전자 조절 네트워크를 기반으로 생물학적인 검증 실험과 이를 통한 네트워크 모델의 수정을 반복함으로써, 생명 현상을 예측할 수 있는 'in silico' 모델 구현 연구를 진행할 수 있을 것이다. Living cells regulate gene expression in response to environmental and physiological changes through a diversity of transcription factors. The gene expression has evolved to perform information processing functions. In recent years, the developed micro-array technology allows gene expression levels to be measured for the whole genome at simultaneously. While the amount of gene expression data has been increasing rapidly, the required computational techniques to analyze such data is still in development. Particularly, estimating the regulatory relationships between the transcription factors and genes from gene expression data is becoming a difficult task. Here, we describe a method to infer gene regulatory network, including the regulatory relationship, from the high-throughput gene expression data. In order to reconstruct the gene regulatory network, we use the network motifs as the blocks of it. It is a pattern or small graph that occurs more often at some statistically significant level in the true network as gene regulatory network module by syntax-tree based genetic programming. The estimated network motifs mean a direct relationship between mRNA levels of transcription factors (TFs) genes and their target genes. The fitness function of each syntax-tree uses the linear model. As genetic programming infers the best syntax-tree with fitness score, syntax-tree is direct mapping onto a network structure. This method was applied to cDNA microarray gene expression data, which were obtained from the differentiating mouse embryonic stem cells to neurons. In this study, we can reconstruct the subnetwork related neuronal cell differentiation and stem cell proliferation.