기내 검정법을 이용한 국내 과수 화상병 방제제 선발 연구

이민수 강원대학교 일반대학원 2018 국내석사

Enterobacteriaceae에 속하는 Erwinia amylovora라는 세균에 의해 발생하는 식물세균병인 화상병은 2015년 이전에는 국내에서 발병이 보고되지 않았고 금지병해충으로 지정되어있다. E. amylovora는 장미과 식물을 기주로 삼으며 사과, 배 등 과수에 큰 피해를 주며 보통 감염된 기주는 5년 내에 나무 전체가 고사하게 된다. 국내에서는 2015년 천안, 안성의 사과 과수원에서 최초로 발생하였다. 2015년 발병 이후 농촌진흥청에서는 감염의심 나무는 즉시 매몰하고 감염 확진 시 과수원 전체와 감염 된 나무의 반경 100m이내 기주식물 매몰, 발견지점 반경 2km 이내 약제살포, 발견지점 반경 5km 이내 주기적 예찰을 실시한다. 예방 방법으로는 배나무는 3월 하순부터 4월 상순, 사과는 4월 상순에 동제 화합물 살포를 하고 병 발생 지역은 개화기에 항생제를 살포하도록 권장하고 있다. 그러나 국내에 발병된 적이 없었던 병이므로 사전 연구가 이루어지지 않아 적절한 방제약제 선정 및 방제체계가 확립되어 있지 않다. 외국의 경우 화상병을 방제하기 위하여 항생제인 streptomycin을 많이 사용하였는데 저항성을 가지는 화상병원세균 균주가 발생함에 따라 대체 항생제와 생물학적 제제를 이용한 방제를 많이 이용한다. 따라서 본 연구는 이러한 방제 방법과 다른 식물세균병에 대하여 등록되어있는 살세균제와 생물학적 제제를 활용하여 국내 화상병에 적용하기에 적절한지 검증하고 외국의 사례와 같이 streptomycin과 대체 항생제에 대해 저항성 유전자 또는 저항성 획득이 가능한지 검정하였다. 먼저 화상병 방제 후보 방제제들의 최소억제농도(MIC)를 통하여 oxytetracycline, streptomycin, sxytetracycline+streptomycin, kasugamycin, oxolinic acid와 동제 화합물인 tribasic copper sulfate와 생물학적 제제인 Bye-mycin®, Blossom protect®와 신규 길항미생물 DF49, DF52를 효과적인 화상병방제 후보 방제제로 선별되었다. in planta 실험에서는 화상병원세균의 기주인 사과의 꽃, 신초, 유과를 이용하여 각 후보 방제제들의 화상병 억제 효과와 적절한 처리시기를 제시 하고자 하였다. 그 결과 꽃에서는 항생제와 copper hydroxide가 효과가 좋았고 Blossom protect®는 효과가 있지만 항생제나 copper hydroxide보다는 효과가 떨어졌고 신초와 유과에서는 항생제와 tribasic copper sulfate가 효과적이고 생물학적 제제의 경우 효과를 보이지 않았다. 또한 미국의 화상병원세균과 같이 항생제에 대하여 저항성을 가지는지 확인하였다. Streptomycin에 대한 저항성의 경우 streptomycin을 불활성화 시키며 접합에 의하여 이동 가능한 strA-strB라는 저항성 유전자와 streptomycin의 작용부위인 ribosome의 구성성분인 12s protein을 암호화 하고 있는 rpsL에 돌연변이가 생길 경우 저항성을 가지게 되는데 두 유전자를 검정한 결과 국내 화상병원세균은 strA-strB를 가지지 않고 rpsL에 돌연변이는 발생하지 않아 streptomycin에 대하여 저항성을 가지지 않았다. 화상병원세균과 동일 서식처를 가지는 부생균이 strA-strB를 가질 경우 접합에 의해 화상병원세균이 streptomycin에 대하여 저항성을 획득 할 수 있으므로 사과 신초에서 분리된 부생균에 대하여 strA-strB를 검정하였고 그 결과 strA-strB를 가지고 있지 않았다. 기존 연구에 의하면 매개충에 의해 화상병이 전반 된다고 알려져 있지만 확인 결과 매개충들의 표면에는 발병 가능한 정도의 화상병원세균은 검출되지 않았다. 마지막으로 효과적인 항생제와 동제 화합물이 화분 매개충에 대하여 부정적 영향에 대하여 검정하였다. 접촉독성, 경구독성 및 활동성에 대한 부작용이 없는 것을 확인하였다. Fire blight, caused by the enterobacterial pathogen Erwinia amylovora, is a major disease of rosaceous plants include apple and pear. Fire blight has been not reported in Korea until 2015 but apple orchard in Anseong and Cheonan was occurred fire blight in early May 2015. Because fire blight was not exist in Korea, suitable control agent and control system was not established. In Rural Development Administration(RDA), the suspect tree is buried immediately and when suspected tree confirmed fire blight the entire orchard and host plant within 100 m are buried, sprayed within 2 ㎞ radius of disease occur site, and periodically monitored within 5 ㎞ radius of disease occur site. RDA proposes to treat copper compounds in late March to early April on apple, early April on pear and antibiotics in blossoming season on orchard which confirmed to fire blight. In other countries where streptomycin resistant E. amylovora occur, alternative antibiotics and biological agent are uesd to control. This study was performed to test whether Korea control system is suitable for Korea fire blight and to confirm whether E. amylovora has a resistance gene for streptomycin or other antibiotics. MIC was tested to screen oxytetracycline, steptomycin, oxytetracycline+streptomycin, kasugamycin, oxolinic acid, tribasic copper sulfate, Bye-mycin®, Blossom protect™, DF49 and DF52 as effective fire blight control agent, and in planta test have suggested appropriate application period for each agents. Antibiotics and tribasic copper sulfate were effective in controlling fire blight from so we confirmed same gene in E. amylovora which isolated in Korea. Epiphyte bacteria which isolated on apple shoots has no transposable resistance gene. Surface of the insect vectors was no detectable E. amylovora Finally, effective control agents were not have side effects on pollinators.

Functional characterization of interactor and suppressor of Arabidopsis thaliana RING Zinc Finger 1 (AtRZF1) in abiotic stress response

민지희 전남대학교 대학원 2019 국내박사

비생물학적 스트레스 반응에서 단백질 유비퀴틴화는 세포 내 다양한 과정을 조절하는 중요한 단백질 번역 후 조절 과정 중의 하나이다. 애기장대 식물체에서 E3 ubiquitin ligase AtRZF1은 가뭄 민감성을 증가시킨다고 보고된 바 있다. 비생물학적 스트레스 반응에서 AtRZF1의 기능을 심도 있게 살펴보기 위해서 yeast two hybrid screen 및 T-DNA tagging mutagenesis를 이용, AtRZF1의 상호결합인자와 억제인자를 분리하였다. Yeast two-hybrid screen 결과, AtRZF1 상호결합인자 AtRZF1-Associtaed Protein 1 (AtRAP1)을 분리할 수 있었으며, AtRAP1은 ubiquitin-associated (UBA) 도메인을 포함하고 있었고, 세포 내 핵에 위치함을 알 수 있었다. AtRAP1 전사 발현은 앱시스산과 비생물학적 스트레스에 의해 유도 증가됨을 알 수 있었고, 유식물체 발달 과정에서 atrap1 RNAi 형질전환 식물체들은 야생형 보다 삼투스트레스에서 덜 민감한 반응을 보였다. 반면에, AtRAP1 과발현 형질전환체들은 삼투스트레스에 대해 과민감 반응으로 나타났으며, 이러한 결과로 인하여 AtRAP1은 수분 결핍 신호 전달경로를 음성적으로 조절함을 알 수 있었다. AtRAP1 과발현 및 atrap1 RNAi 형질전환체들간의 스트레스 혹은 프롤린 대사 관련 유전자들의 전사 발현은 서로 다른 양상으로 나타났으며, 생화학적 연구 결과, AtRAP1은 Ub chain과 결합하였고 동시에 유비퀴틴화 된 AtRZF1 단백질의 양을 증가시킴을 알 수 있었다. 이중 형질전환 식물체로부터 유전학적 연구 결과, E3 ubiquitin ligase AtRZF1은 AtRAP1에 상위유전자임을 알 수 있었다. AtRZF1-AtRAP1 상호결합에 의한 건조 신호전달경로 기작은 유비퀴틴화 따른 프롤린 대사와 건조스트레스 반응을 조절하는 새로운 경로임을 밝혀냈다. 더불어 AtRAP1과 상동단백질인 AtRAP2 단백질의 특성에 대해 실험한 결과, AtRAP2 단백질도 UBA 도메인을 포함하고 있었으며, AtRAP1단백질과 달리 세포질에 위치함을 알 수 있었다. AtRAP2 유전자의 전사 발현은 앱시스산, 삼투, 염해, 및 산화스트레스에 대해 강하게 유도 증가됨을 알 수 있었고, 이러한 스트레스들에 의해 AtRAP2 promoter-GUS 형질전화체의 주근, 잎 및 유관속 조직에서 GUS 발현을 강하게 유도함을 알 수 있었다. AtRAP2 과발현 형질전환체는 삼투스트레스 내성이 감소되었으며, 반면에 atrap2 RNAi 형질전환체는 내성이 증가하였다. 더군다나 atrap1/atrap2 이중 RNAi형질전환체들은 각 유전자의 single RNAi 형질전환체보다 내성이 더 증가함을 알 수 있었다. 이러한 결과들로 보아 AtRAP1과 AtRAP2는 같은 삼투스트레스 반응 경로에서 작용함을 나타낸다. 유비퀴틴 결합 분석 결과, AtRAP2는 소수성 결합을 통해 Ub chain과 결합함을 알 수 있었고, pull down assay를 통해 AtRAP2 단백질 또한 AtRZF1과 결합 함을 알 수 있었다. AtRAP2와 AtRZF1 간의 유전학적 상호관계를 알아보기 위하여, atrzf1 돌연변이체에 AtRAP2 유전자를 과발현 시킨AtRAP2-OX/atrzf1 식물체에 삼투스트레스를 처리한 결과, 유식물체들은 삼투-내성 생리적 표현을 나타내었다. 이러한 결과들은 수분 결핍 스트레스 신호전달에서 E3 ubiquitin ligase AtRZF1은 AtRAP2에 상위유전자임을 알 수 있었고, 이러한 결과들을 토대로, AtRZF1-AtRAP2 경로 기작 또한 유비퀴틴화 따른 삼투스트레스 반응을 조절하는 새로운 경로임을 밝혀냈다. 프롤린 대사 조절은 환경스트레스 반응, 식물 발달 및 생장에 중요하다고 보고되어 있으나, 비생물학적 및 생물학적 스트레스 반응에 대한 프롤린 기작은 자세히 밝혀지지 않았다. atrzf1 돌연변이체를 이용, T-DNA tagging mutagenesis를 통해 atrzf1의 억제인자 proline content alterative 31 (pca31)를 분리하였다. 가뭄스트레스 조건에서 생리적 실험 결과, pca31 돌연변이체는 atrzf1의 가뭄 내성 및 프롤린 축적 표현형을 억제함을 알 수 있었고 genomic DNA TAIL-PCR을 통해 pca31 돌연변이체의 T-DNA 삽입 위치는 At2g22620 유전자 promoter 부분임을 알 수 있었다. At2g22620 유전자는 세포벽 효소인 Rhamnogalacturonan lyase 1 (RGlyase1)을 암호화하며 GFP 단백질을 이용, RGlyase1 단백질은 세포벽에 위치함을 알 수 있었다. 삼투스트레스 조건에서 complementary line들의 표현형 분석 결과, pca31 돌연변이체 표현형과 유사하였으며, 즉 atrzf1 돌연변이체의 At2g22620 유전자 전사 발현의 감소는 atrzf1의 가뭄 내성 표현형을 억제함을 알 수 있었다. RGlyase1 유전자의 전사 발현 양상은 앱시스산, 삼투, 염해, 및 산화스트레스에 대해 유도 증가됨을 알 수 있었으며, 이러한 스트레스들은 RGlyase1 promoter-GUS 형질전화체의 뿌리와 정단분열 조직에서 GUS 발현을 유도함을 알 수 있었다. RGlyase1 과발현 형질전환체는 삼투스트레스 내성이 증가 되였으며, 반면에 rglyase1 RNAi 형질전환체는 내성이 감소하였다. 또한, 효소 활성 실험 결과, RGlyase1 단백질은 rhamnogalacturonan lyase 활성이 있음을 확인할 수 있었다. 세포벽 효소의 하나인 RGlyase1이 생물학적 스트레스에 미치는 영향을 조사하기 위해 Botrytis cinerea (B. cinerea)를 이용, 야생형, atrzf1 및 pca31 식물체에 접종한 결과, pca31 돌연변이체는 병 저항성이 나타난 반면, 야생형 식물체와 atrzf1 돌연변이체는 감수성 병징을 보였다. 이러한 결과들은 비생물학적 및 생물학적 스트레스 반응에서 RGlyase1은 프롤린 대사 및 세포벽 반응 조절을 통한 AtRZF1의 억제인자임을 제시한다. Ubiquitination is one of the most frequently occurring post-translational modification and is essential for regulating diverse cellular processes in plants during abiotic stress response. Mutation in E3 ubiquitin (Ub) ligase Arabidopsis thaliana Ring Zinc Finger 1 (AtRZF1) enhances drought stress tolerance by increasing the proline accumulation in Arabidopsis. To further investigate the function of AtRZF1 in abiotic stress response, I isolated an interactor and a suppressor of AtRZF1 using yeast two hybrid screen and T-DNA tagging mutagenesis, respectively. First, I characterized AtRZF1-Associated Protein 1 (AtRAP1), which contains ubiquitin-associated (UBA) domain and interacts with AtRZF1. The AtRAP1-Green Fluorescent Protein fusion protein (AtRAP1-GFP) was observed exclusively in the nuclei of the root cells in the transgenic seedlings. The expression of AtRAP1 was strongly induced by abscisic acid (ABA) and abiotic stresses compared to the wild-type (WT). The atrap1 RNAi transgenic plants were less sensitive to osmotic stress than WT, whereas the AtRAP1-overexpressing transgenic lines were more hypersensitive during early seedling development, indicating that AtRAP1 negatively regulates water deficit stress signaling. The expression levels of the stress- or proline metabolism-related genes were altered in both AtRAP1-overexpressing and atrap1 RNAi transgenic lines. Biochemical studies revealed that AtRAP1 interacted with Ub chains and increased the amount of ubiquitinated AtRZF1. Moreover, genetic studies showed that the atrzf1 mutation could rescue the osmotic sensitive phenotype of AtRAP1-overexpressing plants, suggesting that the E3 Ub ligase AtRZF1 is epistatic to AtRAP1 in water deficit stress signaling. Taken together, our findings provide a new insight into the AtRZF1-AtRAP1 pathway which controls proline metabolism and drought response in Arabidopsis. Second, AtRAP2, which is highly homologous to AtRAP1 and contains a UBA domain, was characterized. AtRAP2 is localized in the cytosol of the root cells in the transgenic seedlings expressing GFP-fused AtRAP2 (AtRAP2-GFP). Expression level of AtRAP2 was strongly induced by ABA, and osmotic, salt and oxidative stresses. AtRAP2 promoter-β-glucuronidase (GUS) construct revealed substantial gene expression in the primary root, leaves, and leaf vascular system, in which GUS activity was induced by ABA, and osmotic and oxidative stresses. Overexpression of AtRAP2 decreased tolerance to osmotic stress, whereas atrap2 RNAi exhibited insensitive phenotype to osmotic stress. Moreover, the atrap1/atrap2 RNAi double transgenic plants were more insensitive to osmotic stress than each single RNAi plant, indicating that AtRAP1 and AtRAP2 are agonistic. Biochemical studies with ubiquitin binding assay implied that AtRAP2 binds to ubiquitin chains via hydrophobic interaction. Since correlation between AtRAP1 and E3 ubiquitin ligase AtRZF1 was studied, pull down assay was conducted with AtRAP2 and AtRZF1 protein, indicating that AtRAP2 interacted with AtRZF1. Furthermore, genetic studies with AtRAP2 and AtRZF1 were performed, showing that atrzf1 mutation could rescue the osmotic-sensitive phenotype of AtRAP2-overexpressing plants, suggesting that E3 ubiquitin ligase AtRZF1 is epistatic to AtRAP2 in water deficit stress signaling. Taken together, our findings provide a new insight into the AtRZF1-AtRAP2 pathway which controls dehydration stress response in Arabidopsis. Proline metabolism is important for environmental responses, plant development and growth. However, the mechanism of proline in abiotic and biotic stress processes still remain to be elucidated. Using the atrzf1 mutant as a parental line for T-DNA tagging mutagenesis, I identified a suppressor of atrzf1 mutant, designated as proline content alterative 31 (pca31). The pca31 suppressed insensitivity of atrzf1 to water deficit stress during germination and early seedling growth. In addition, proline content in pca31 was lower than that of atrzf1 under drought stress condition. By the Thermal Asymmetric Interlaced (TAIL)-PCR, it was found that T-DNA of pca31 was inserted into the promoter region of At2g22620 gene, which encodes a cell wall enzyme Rhamnogalacturonan lyase 1 (RGlyase1). The complementary lines showed sensitive phenotype similar to pca31 mutant under osmotic stress condition. RGlyase1-GFP is localized in the cell wall of the root cells of the transgenic seedlings. Expression level of RGlyase1 was strongly induced by ABA, and osmotic, salt and oxidative stresses. Additionally, RGlyase1 promoter-β-glucuronidase (GUS) construct revealed substantial gene expression in the root tissues and apical meristem, in which GUS activity was induced by ABA, and osmotic and oxidative stresses. Overexpression of RGlyase1 increased tolerance to osmotic stress, whereas rglyase1 RNAi displayed sensitive phenotype to osmotic stress. Furthermore, enzymatic assay indicated that RGlyase1 has rhamnogalacturonan lyase activity. Under biotic stress condition, pca31 was insusceptible to Botrytis cinerea (B. cinerea) by producing less ROS compared to WT and atrzf1. Taken together, these findings prove that pca31 acts as a suppressor of atrzf1 in the abiotic and biotic stress responses by regulating proline and cell wall metabolisms.

Functional regulation of E3 ubiquitin ligase AtRZF1 (Arabidopsis thaliana Ring Zinc Finger 1) to sulfate metabolism and brassinosteroid signaling controlled plant growth and abiotic stress response

누엔반띤 전남대학교 대학원 2020 국내박사

유비퀴틴화는 진핵 생물 세포 내 다양한 양상을 조절하기 위해 가장 주된 번역 후 단백질 변형 조절 과정 중 하나이다. 또한 식물에서, 유비퀴틴화는 비생물학적 스트레스의 방어 시스템에 있어서 중요한 하나의 과정이다. 유비퀴틴화 경로에서 여러 효소 집단 중 E3 ligase는 target 단백질과 ubiquitin을 결합시키는 필수적인 역할을 한다. E3 ubiquitin ligase인 Arabidopsis thaliana ring zinc finger (atrzf1) 돌연변이체는 프롤린 (Pro) 축적의 증가를 조절함으로써, 가뭄 스트레스 내성을 증가시킨다. 비생물학적 스트레스 반응에 대한 E3 ubiquitin ligase AtRZF1 단백질과 Pro metabolism 간의 상호작용을 심도 있게 살펴보기 위해서, atrzf1 돌연변이체를 모본으로 이용, T-DNA tagging mutagenesis를 통해 pca (proline content alterative) double mutants들을 제작하였다. 가뭄 스트레스 조건하에서, pca 돌연변이체들은 atrzf1과 비교하여 Pro 함량이 다른 식물체들을 선별하였다. 그 중에서, 일부 pca 돌연변이체들은 atrzf1의 억제 인자로 나타났으며, 또 다른 pca 돌연변이체들은 다양한 비생물학적 스트레스 조건하에서, atrzf1 돌연변이체의 내성을 더욱 더 증가시키는 것을 알 수 있었다. AtRZF1 and AHL (Arabidopsis Halotolerance 2-like) 유전자가 돌연변이 된 2중 돌연변이체인 pca17 돌연변이체를 연구하였다. pca17 돌연변이체는 AHL의 Pro 대사 조절을 통해 atrzf1 돌연변이체가 가지고 있는 가뭄, 산화, 또는 ABA 스트레스에 대한 내성 기전을 억제시켰다. 고농도의 당 조건하에서pca17은 아데노신 모노포스페이트 (AMP)와 시스테인 (Cys) 함량을 감소시킴으로써, 당에 대해 민감한 표현형을 보였다. 물 처리 및 당 처리 조건하에서 모두 pca17의 AMP와 Cys의 함량은 야생형과 atrzf1 돌연변이체 보다 적게 나타났다. 또한 당 조건하에서, 황 대사와 연관된 주요 유전자들의 발현 양상을 조사한 결과, 야생형과 atrzf1와 비교하였을 떄, ahl RNAi형질전환 식물체와 pca17에서 보다 현저하게 낮았다. 뿐만 아니라 당 조건하에서 AHL-과발현 형질전환체의 표현형은 야생형 보다 더 민감함 반응을 보였다. 종자 발아율, 자엽 녹색화율, 뿌리 신장과 생체 중량 등 생리적 실험들을 수행한 결과, 야생형과 비교하였을 떄, ahl RNAi형질전환체에서 더 민감한 반응을 나타내었다. 흥미롭게도 당 처리 동안 AMP와 Cys을 처리한다면 pca17과 ahl RNAi 형질전환체들의 표현형은 atrzf1과 야생형 식물체와 유사하였다. 즉, 이러한 결과들은 애기장대에서 AHL 은 황 대사를 조절함으로써 당 반응을 조절한다는 것을 나타낸다. 두번째로, atrzf1에 T-DNA가 삽입된 2중 돌연변이체 proline alterative 41 (pca41, atrzf1의 enhancer) 의 기능을 연구하였다. pca41은 비생물학적 스트레스 조건하에서 atrzf1 돌연변이체 보다 덜 민감한 표현형을 지닌다. pca41은 가뭄스트레스 처리시 atrzf1 및 야생형 보다 Pro 함량이 더 높다. pca41의TAIL-PCR 결과를 통해 T-DNA가 삽입된 부분은 브라시노스테로이드 신호전달 조절 단백질인BEH3 (BES1/BZF1 homolog 3)를 암호화하는 것을 알 수 있었다. 삼투 및 ABA 스트레스 조건 하에서 생리적 실험 결과, pca41과 beh3 의 종자 발아율 및 자엽 녹색화 백분율은 atrzf1 돌연변이체 및 야생형 식물체와 비교했을 때 상대적으로 더 높음을 알 수 있었다. 반면 BEH3 과발현 형질전환체에서는 야생형과 비교 했을 때, 이러한 생리적 지표들이 감소되었다. 또한 ABA 및 mannitol 처리 후, BEH3 promoter-GUS 형질전환체 모든 조직에서 상당히 높게 GUS 발현이 나타났다. 또한 가뭄 스트레스 조건하에, ROS 항산화 효소들의 활성은 야생형 및 BEH3 과발현 형질전환체 보다 pca41, atrzf1 및 beh3돌연변이체에서 훨씬 많이 유도 되었으며, 이러한 결과는 BEH3와 AtRZF1 단백질들이 ROS- scavenging 경로를 통해 탈수 반응을 조절함을 알 수 있었다. 정상적인 광 생장 반응에서, beh3 돌연변이체와 BEH3 과발현 형질전환체의 광 형태 표현형은 야생형과 유사함을 보아, BEH3는 광 조건에서 BR 신호전달 반응과는 관련이 없음을 나타낸다. 그러나, 암 반응 생장 조건은 야생형 보다 pca41, atrzf1, beh3 돌연변이체의 더욱 더 긴 하배축 신장을 유도하지만, BEH3 과발현 형질전환체에서는 야생형과 비교했을 때 더욱 짧은 하배축 신장을 보였다. 그러나 암 반응 조건에서 BR active형태인 24-epibrassinolide(eBL)을 처리하였을 때, BEH3과발현 형질전환체의 하배축 신장의 결함을 회복시킬 수 있었다. 또한 암 반응 조건에서, 세포 내 BR 함량은 야생형과 비교했을 때 atrzf1, pca41, beh3 돌연변이체에서는 높았지만, BEH3 과발현 형질전환체에서는 낮은 레벨로 존재하였다. 이러한 결과들은 암 반응 조건에서 BEH3 및 AtRZF1 모두 BR 생합성 조절에 직접적으로 또는 간접적으로 관여한다는 것을 나타낸다. 또한 광 조건에서 자란 GFP-형질전환 식물체에eBL, ABA 및 mannitol을 처리하였을 때, GFP-BEH3 형광 신호는 핵에서 강하게 나타났으며, 이러한 결과는 비생물학적 스트레스 조건에서 BEH3의 탈인산화의 형태가 필요함을 알 수 있었다. 흥미롭게도 암 반응 조건에서 GFP-BEH3 형광 신호는 핵보다 세포질에서 강하게 보였으며, 이는 BEH3의 인산화 형태가 암 반응 생장에 더 필요함을 알 수 있었다. 암 반응 조건에서, 외부적으로eBL, ABA 및 mannitol을 처리 한다면, GFP-BEH3형관 신호가 핵에서 강하게 나타나는 것은 BR 또는 비생물학적 스트레스 조건일 때, BEH3단백질은 인산화 형태로 유지함을 알 수 있었다. 게다가 BEH3는 AtRZF1 단백질과 상호 작용하며 분자 수준에서는 서로 간에 공동 상호 조절함을 알 수 있었다. 이러한 결과들을 볼 때, AtRZF1 및 BEH3단백질들은 유비퀴틴화와 BR-신호전달 cross talk를 통해 수분 스트레스 반응을 조절함을 나타낸다. Ubiquitination is one of the most principal regulatory processes lasting in post-translational modification to regulate diverse cellular aspects of eukaryotic cells. In plants, ubiquitination, also, is an important process of abiotic stress defense system. As the most heterogeneous class of enzymes participated in ubiquitination pathway, E3 ligase plays a fundamental role in conjugating target protein with ubiquitin. Deconstruction of E3 ubiquitin ligase in Arabidopsis thaliana ring zinc finger (atrzf1) mutant could modulate the increasing of proline (Pro) accumulation leading to enhance drought stress tolerance. To further functional investigate the interplaying between E3 ubiquitin ligase AtRZF1 and Pro metabolism during abiotic stress response; we generated pca (proline content alterative) double mutants by tagging T-DNA in atrzf1line background. The obtained pca mutants exhibited Pro contents differently from atrzf1 parental line under drought stress condition. Among them, some pca mutants showed as suppressor, while others showed as enhancer of insensitivity of their parental atrzf1 traits under various abiotic stress conditions. First, we investigated pca17, a suppressor double-mutant in which both AtRZF1 and AHL (Arabidopsis Halotolerance 2-like) are mutated. The responsible insensitivity of atrzf1 mutant to drought, oxidative, or ABA stresses was suppressed in pca17 mutant caused by the regulating Pro metabolism of AHL in an AtRZF1-dependent manner. Here again, I discovered that pca17 possess a glucose (Glc)-sensitive response phenotype caused by reducing both adenosine monophosphate (AMP) and cysteine (Cys) productions under high Glc concentration condition. AMP and Cys contents of pca17 were lower than those of WT and atrzf1 in both water- and Glc- treated. Additionally, under Glc condition, the expression levels of several key sulfate metabolism-related genes were significantly lower in ahl RNAi lines and pca17 than those in WT, atrzf1 and AHL-overexpressing plants. Furthermore, phenotypes of AHL-overexpressing transgenic lines displayed hyper-insensitive than WT under Glc condition. While ahl RNAi lines showed the response sensitivity than WT including several parameters base on seed germination rate, cotyledon greening percentage, root elongation, and fresh weight analysis. E3 ubiquitin ligase AtRZF1 was found to regulate BEH3 expression at molecular level under normal and Glc condition. Interestingly, the pca17 and ahl RNAi phenotype in exogenous AMP and/or Cys during Glc treatment were similar to atrzf1 and WT phenotype, respectively. Taken together, my results indicate that AHL regulates Glc response by modulating sulfate metabolism in Arabidopsis. Second, I characterized function of an Arabidopsis intergenic enhancer double mutant named proline alterative 41 (pca41) which tagged T-DNA in atrzf1 parental line. The pca41 possesses an insensitive phenotype that stronger than atrzf1 under abiotic stress conditions. The Pro content of pca41 was higher than that both of atrzf1 and WT follow drought stress treatment. Thermal Asymmetric Interlaced (TAIL)-PCR analysis of pca41 showed that T-DNA was inserted at site of gene encoded for BEH3 (BES1/BZR1 homolog 3), a Brassinosteroid (BR) signaling regulatory protein. Under ABA and osmotic stresses, physiological parameters including germination rate and cotyledon greening percentage of pca41 and beh3 were higher than those of atrzf1 and WT, respectively. Conversely, these indexes were significantly declined in the BEH3 overexpressing (BEH3-OE) transgenic lines in comparison to WT. Additionally, BEH3 promoter--glucuronidase (GUS) construct revealed of high expression substantial gene in whole seedling plant following ABA and mannitol treatment. Besides, reactive oxygen species (ROS) antioxidant enzyme activities were significantly higher induction in pca41, atrzf1, and beh3 than those in WT and BEH3-OE plants during drought stress suggesting BEH3 and AtRZF1 regulate dehydration response through a ROS-scavenging mediated pathway. Morphological phenotype of beh3 mutant and BEH3-OE was similar to that of WT under normal light-grown indicates BEH3 is not relevant to BR-signaling response in light condition. However, darkness growth condition induced much longer hypocotyl of pca41, atrzf1, and beh3 mutants than that of WT but BEH3-OE lines were dramatically shorter in comparison to WT. Exogenous application of 24-epibrassinolide (eBL), a BR active form, was able to rescue BR-induced hypocotyl elongation defects of BEH3-OE transgenic line in darkness. Moreover, endogenous BR levels were greater in atrzf1, pca41, and beh3 mutants but significantly lower in BEH3-OE transgenic lines than in WT under darkness condition. These results indicate that both BEH3 and AtRZF1 are directly or indirectly involved in the regulation of BR biosynthesis under darkness. Additionally, GFP-BEH3 fluorescence signal appeared strongly in nucleus of roots of light-grown GFP-transgenic plants especially after exogenous application of eBL, ABA or mannitol indicating a de-phosphorylated form of BEH3 was required for abiotic stress response. Interestingly, GFP-BEH3 signal appeared robustness in cytosol than nucleus in root cells of GFP-transgenic plants in darkness revealed that BEH3-phosphorylated form was required for regulation of dark-grown plant. Similarly, exogenous application of eBL, ABA or mannitol recruited GFP signal enhancer in nucleus of GFP-BEH3 transgenic plants under darkness suggested the regulation of BEH3 phosphorylation caused by BR or abiotic stress conditions. Additionally, BEH3 and AtRZF1 were found to co-regulate each other at molecular level. Altogether, our results suggest that AtRZF1 and BEH3 might play an important role in osmotic stress response via ubiquitination and BR-signaling cross-talk.

Colletotrichum orbiculare에 대한 길항세균 Pseudomonas aureofaciens YC4963의 분리 동정 및 항생물질의 정제와 구조 분석

채희정 慶尙大學校 大學院 2004 국내석사

A bacterial strain YC4963 with antifungal activity against Colletotrichum orbiculare, a causal organism of cucumber anthracnose was isolated from the rhizosphere soil of Siegesbeckia pubescens Makino in Korea. Based on physiological and biochemical characteristics and 16S ribosomal DNA sequence analysis, the bacterial strain was identified as Pseudomonas aureofaciens. The bacteria also inhibited mycelial growth of several plant fungal pathogens such as Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum and Rhizoctonia solani on PDA and 0.1 TSA media. The antibiotic activity was found from the culture filtrate of M523 media and the active compounds were quantitatively bound to XAD adsorber resin. The antibiotic compound inhibited the growth of C. orbiculare at 1% on PDA but it had no activity to Pythium ultimum and Rhizoctonia solani which was reported to be sensitive to phenazine antibiotics. The chemical data from various chromatographic procedures showed that the active fraction consisted of phenazine derivatives and the active compounds was identified as phenazine 1-carboxylic acid.

몇 가지 식물 병원균에 길항적인 토착 점액세균의 생물학적 방제

김성택 선문대학교 일반대학원 2011 국내석사

Botrytis cinerea, Colletotrichum acutatum, Phytophthora capsici, Pyricularia grisea에 대한 3 가지 점액세균(KYC 1126, 1136, 2001)의 항진균 활성을 비교 평가한 결과, 공시한 3가지 bacteriolytic 점액세균 중 KYC 1126이 이들의 균사 생장 및 포자 발아를 완벽히 저해하였다. PDCY 고체배지에서 KYC 1126의 분비 산물은 살진균 활성을 보였으나 KYC 1126의 배양여액은 C. acutatum 원형질체가 정상적인 균사로 회복하는 데에는 영향을 미치지 않았다. 고추 탄저병과 역병에 대한 KYC 1126의 생물 검정은 2009년과 2010년에 걸쳐 포장 및 온실에서 실시하였다. 온실 폿트에서 고추 열매에 KYC 1126의 배양여액을 처리하고 1일 후, 탄저균을 접종한 결과, 무처리가 74%까지 발병하였지만 KYC 1126은 29% 발병하여 방제가는 60%이상이었다. 공시한 살균제의 방제가는 42%였으며, 이는 KYC 1126의 방제가보다 10%~35% 낮았다. 2010년에 고추탄저병 실험 포장에서 자연적인 병은 46%까지 발생하였는데, KYC 1126의 방제가는 41%였고 살균제는 63%였다. 점액세균의 포장 방제가는 살균제보다 다소 낮았지만 좋은 생물 방제력을 보였다. 한편, 온실 폿트에서 고추 역병의 방제 효능은 엽권과 근권에서 평가하였는데 특히, 엽권에서 KYC 1126 방제가는 84%로 좋은 방제력을 보였다. 다양한 생리활성물질을 분비하고 주위 미생물을 포획하는 Bacteriolytic 점액세균의 대량 발효가 확립된다면 우수한 길항능력을 보인 KYC 1126은 생물 농약으로 활용이 가능할 것이다. 점액세균은행으로부터 분양받은 455가지 점액세균의 배양추출물을 스크리닝하여 Botrytis cinerea, Pyricularia grisea, Colletotrichum acutatum, Penicillium sp.의 균사 생장과 포자 발아 저해로 항진균 활성을 평가하고 생물 검정을 수행하였다. 총 455가지 균주 중 318균주가 cellulolytic 점액세균(Sorangium cellulosum)이었고 137균주는 bacteriolytic 점액세균(Myxococcus sp., Corallococcus sp., Stigmatella sp., Ctstobacter sp.)이었다. 4가지 식물병원균 중 B. cinerea의 항진균 활성이 가장 많은 균주를 차지하였는데, 이 균주들은 모두 cellulolytic 점액세균이었다. B. cinerea에 의한 저장성 잿빛곰팡이병 방제를 위해 강한 항진균 활성을 보였던 KYC 3130, 3247, 3248, 3270을 선발하여 이들의 배양여액을 토마토, 방울토마토, 딸기, 키위의 열매에 처리하여 생물 검정하였다. 4가지 과실에서 잿빛곰팡이병은 84%~98%까지 높게 발생하였지만, KYC 3270은 5%~21%까지의 낮은 발병률을 보였고 방제가는 79%~95%까지 대단히 높았다. 이러한 방제가는 살균제로 등록된 fludioxonil보다 다소 높았고 6~8 반복의 시험 결과, 표준 오차는 ±2.5%~±10.2%로 매우 안정된 생물 방제력을 보여주었다. KYC 3270은 생물학적 방제가 가능한 전도유망한 소재이다.

Effects of soybean endophytes on plant abiotic stress

서지윤 전남대학교 2023 국내석사

기후변화는 각종 작물의 재배한계선을 북상시키는 등 식물 생태계에 큰 영향을 미치고 있다. 최근 전 세계에는 가뭄과 홍수, 해수면 상승 등 자연재해가 발생하여 작물의 수확량이 급감하는 사례가 늘고 있으며 이미 기후변화에 따른 식량위기가 시작됐다는 경고도 나오고 있다. 5대 주요 작물(쌀, 밀, 옥수수, 보리, 대두) 중에 하나인 대두는 순식용으로 소비되어 인류의 단백질 공급원이 되기도 하고, 식품가공을 주로 하는 가공 원료로 쓰이기도 하며, 대두박의 형태로 가축의 배합사료로 사용된다. 식물내생균(endophyte)는 식물조직내 살고 있으며, 기주 식물(host plant)에 위해를 가하지 않는 미생물이다. 내생균은 숙주식물로부터 광합성 산물을 흡수할 뿐만 아니라 이차대사산물을 분비함으로써 식물에게 다양한 이득을 제공하는 상리공생관계로 알려져 있다. 이러한 상호작용의 종류에는 환경조건이나 식물과 내생균의 관계에 따른 비생물학적 요인(abiotic stress)과 생물학적 요인(biotic stress)들에 의해서 결정이 되어진다. 본 연구에서는 대두에서 분리한 내생균을 이용한 비생물학적(abiotic stress) 스트레스 완화 기작에 관한 연구이다. 우선 대두식물와 대두식물이 자란 토양에서의 다양한 미생물 배지를 통한 내생균을 순수 분리하였고, 세균은 16S rRNA 영역과 진균은 ITS영역의 염기서열 분석으로 미생물 동정을 수행하였다. 그 결과 Flavobacterium 속에 해당하는 균주들이 대두식물 조직(내생균)과 토양시료 등에서 다수 발견이 되었다. 본 연구에서 식물조직안에서 발견된 4개 균주들 Flavobacterium sp. PN4, Flavobacterium sp. BB8, Flavobacterium sp. AG3, 그리고 Flavobacterium sp. AG4에 의한 비생물학적 환경스트레스(저온, 염해, 가뭄)에 대한 작용기작연구를 수행하였다. 먼저, 분리된 4개의 균주들의 식물생장효과가 있는지 확인하기 위해 모델 식물인 애기장대(Arabidopsis thaliana) 식물과 내생균의 공동배양을 통하여 식물생장효과(잎 무게, 잎의 수, 뿌리길이, 뿌리 무게, 엽록소)를 확인하였다. 뿌리길이를 제외한 잎 무게, 잎의 수, 뿌리 무게, 엽록소 함량이 대조군에 대해서 현저히 상승되었음을 확인할 수 있었다. 또한 이러한 결과는 균주 PN4 보다 BB8, AG3, and AG4에서 그 효과가 두드러짐을 확인하였다. 이러한 결과를 바탕으로 저온(cold, 15oC), 염해(100mM NaCl), 가뭄(0.5~4% PEG)에서 내생균의 효과를 관찰하였다. 그 결과 4개의 균주는 저온, 염해, 가뭄 모든 환경스트레스에서 유사한 결과를 나타내었다. 특히 PN4 균주는 다른 3개의 균주(BB8, AG3, AG4)에 비해 세균의 색소(pigment)에 차이가 있음을 관찰하였고, 이러한 사실을 바탕으로 세균의 전장유전체(whole-genome sequencing) 시퀀싱을 수행하였고 유전체로부터 카로티노이드(carotenoid) 생산 클러스터(cluster)를 확인할 수 있었다. 또한 HPLC 분석을 통하여 4개의 균주는 β-carotene과 zeaxanthin을 생성함을 확인하였다. 특히, PN4균주는 다른 3개의 균주 (BB8, AG3, AG4) 보다 β-carotene과 Zeaxanthin의 생성량이 10배 가량 감소되어 있음을 정량적으로 확인하였다. 이러한 결과는 BB8, AG3 그리고 AG4가 생산하는 β-carotene과 Zeaxanthin 생산량이 식물의 비생물학적 스트레스 완화효과와 관련이 있음을 확인할 수 있었다. 추가적으로 해당 균주 처리 후 식물에서의 항산화능을 확인하였고, 특히 3개의 균주(BB8, AG3, AG4) 처리 후 식물에서의 항산화능(CAT, APX, POD)이 대조군에 비해 현저히 증가되어 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 대두식물에서 분리한 내생균 PN4, BB8, AG3 그리고 AG4는 β-carotene과 Zeaxanthin의 생산을 통하여 식물의 비생물학적 스트레스를 완화시켜줌을 확인할 수 있었다. 본 연구를 통하여 기후변화 대응 생태복원 기술연구 뿐만 아니라 작물생산성 증대를 위한 친환경 바이오소재로 활용 가능할 것이다. The predominant signs of climate change are elevated mean surface temperature, ice melting, sea level rise, and extreme weather events. As a result of these rapid global alterations, crops are increasingly facing abiotic stresses. Chilling, drought, and salinity are major abiotic stresses that cause changes in physiological, biochemical, and molecular processes in plants, resulting in significant productivity losses in crops. Climate change has already affected food security in many parts of the world. To increase agricultural production, chemicals have been used; however, the excessive use of such chemicals has become a severe threat to human health and the environment. An alternative, environmentally friendly approach is to use beneficial microorganisms to increase crop yield under abiotic stress conditions. These microbes enhance plant growth through various mechanisms such as phytohormone production, ACC deaminase, phosphate solubilization, siderophore production, antioxidant defense system, and other metabolites in plants. This research aims to improve the effect of plant growth-promoting bacteria (PGPB) on plants under the abiotic stresses associated with global climate change. First, endophytes were isolated and identified from soybean (Glycine max L.cv. Gwangan) and soil where soybean grew. It was found that the major genus of soybean endophytes was Flavobacterium. The discovered Flavobacterium isolates were named PN4, BB8, AG3, and AG4. Research was performed to characterize plant growth-promoting effects under abiotic stress (chilling, salinity, drought) conditions. To confirm the plant growth effect under general conditions, PN4, BB8, AG3, and AG4 were applied to Arabidopsis thaliana. The growth promotion effect was confirmed in the root length, the weight of the root, the number of leaves, leaf weight, and chlorophyll contents. The effects of BB8, AG3, and AG4 were more prominent than those of PN4. Subsequently, the experiment was conducted under abiotic stresses such as chilling (15oC), salinity (100 mM NaCl), and drought (0.5-4% PEG). The growth-promoting effect of the tested endophytes was confirmed under all abiotic stress conditions. Notably, strain PN4 had a different pigment compared with strains BB8, AG3, and AG4. Based on this finding, whole-genome sequencing of the bacteria was conducted, and strains PN4, BB8, AG3, and AG4 were found to contain carotenoid-producing clusters. Furthermore HPLC analysis confirmed that strains PN4, BB8, AG3, and AG4 produced β-carotene and zeaxanthin. Notably, strain PN4 produced 10 times less β-carotene and zeaxanthin compared with strains BB8, AG3, and AG4. This means the production of β-carotene and zeaxanthin by strains PN4, BB8, AG3, and AG4 was related to improving the abiotic stress of plants. After the treatment of Flavobacterium spp., it was discovered that the strains PN4, BB8, AG3, and AG4 showed antioxidant activity in the plant. Among the treatment of Flavobacterium spp., the antioxidant activities (CAT, APX, POD) of strains BB8, AG3, and AG4 were significantly increased compared with those of the control. These results showed that the endophytes PN4, BB8, AG3, and AG4 isolated from soybean plants improved the abiotic stress of plants through the production of β-carotene and zeaxanthin. This study demonstrates that it will be possible to use strains PN4, BB8, AG3, and AG4 as an eco-friendly biostimulant to increase crop productivity as well as conduct research on ecological restoration technology in response to climate change.

Colletotrichum gloesporioides에 대한 길항세균 Lysobacter sp. YC5194의 분리·동정 및 생산된 항생물질의 특성

김루미 경상대학교 2005 국내석사

A bacterial strain YC5194 that showed antifungal activity against Colletotrichum gloeosporioides was isolated from the rhizosphere soil of pepper root collected at Jinju. The strain inhibited the growth of mycelia and the formation of appressorium of C. gloeosporioides. Mycelial growth of the plant fungal pathogens such as Fusarium oxysporum, Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani, Botryosphaeria dothidea was also inhibited by this isolate. Identification of the isolate was conducted using biochemical and molecular biological characterization. Cells of the strain were gram-negative, rod-shaped and facultatively anaerobes and grow at 15℃ to 37℃. The bacterial strain YC5194 was identified as a new species of Lysobacter based on its physiological, biochemical characteristics and 16S rDNA sequences. The antibiotic compound in culture media was extracted by butanol partitioning and purified by RP-18 chromatography and preparative HPLC. The purified antibiotic compound appears to be a novel compound and stable at high temperatures and all pH conditions.

Trichoderma harzianum YC459에 의한 오이 잿빛공팡이병의 생물학적 방제

이선국 경상대학교 대학원 2002 국내석사

본 실험실에서 분리한 T. harzianum YC459를 이용하여 B. cinerea에 의해 발생되는 잿빛곰팡이병에 대한 방제와 미생물농약으로 개발하기 위한 제제화 방법에 대하여 조사하였다. 오이 유묘의 엽면에 각각 10⁴, 10^5, 10^6, 10^7의 포자 농도로 처리한 결과 10⁴, 10^7에서 방제효과가 80%이상으로 나타났으며, 토양처리에서는 1g, 2g, 4g, 8g 처리한 것 중 1g 처리한 것이 발병율 14%로 약 75%의 방제가를 보였다. 잔류기간에 따른 방제효과 또한 5일 이상 지속되는 것을 관찰할 수 있었으며, 기존에 사용되고 있는 화학살균제와 동일한 발병억제효과를 보였다. 엽면처리와 토양처리 할 경우 발병율이 각각 31%와 25%이었으나 동시에 처리 할 경우 발병율은 14.3%로 현저하게 감소하였다. 이 결과로 볼 때 유묘 재배시 엽면과 토양처리를 통해 병방제 상승작용이 나타났으며, 길항미생물과 기주식물간의 상호작용이 있는 것으로 추정하였다. T. harzianum YC459를 제제 하기 위하여 여러가지 배지를 이용하여 포자를 대량생산한 결과 배지 중 톱밥+B+C의 조성에서 가장 많은 1.97×10^10/g 정도의 포자가 형성되어 최종배지로 선택하였다. T. harzianum YC459의 제제화는 포자 안정성을 위하여 보조제로 talc와 zeolite를 사용한 결과 talc제제가 방제효과면에서 zeolite제제보다 좋았다. T. harzianum YC459의 보관상 안정성을 알아보기 위해 실온과 고온에서 포자밀도변화를 기간별로 조사한 결과 실온에서는 52주 동안 5×10^11/g 정도로 유지되었으며, 62주 후부터 서서히 감소하기 시작하였다. 그러나, 고온에서의 밀도변화는 포자 원제나 talc제제 모두 3일 동안 밀도변화가 없었지만 5일 이후부터 급격히 감소하였다. 위의 실험을 통해 T. harzianum YC459를 엽면과 토양에 함께 처리할 경우 병방제에 상승효과가 있으며 이것이 기주식물과 길항미생물간의 어떤 상호작용이 있을 것으로 생각하고 northern blot analysis를 통하여 chitinase gene와 catalase gene의 발현 양상을 조사하였다. T. harzianum YC459만 처리하고 병원균을 접종하지 않은 무처리구에서는 72시간 동안 미미한 변화만 보였고 토양처리, 엽면처리, 토양+엽면처리에서는 6시간 이후부터 chitinase gene이 발현되기 시작하여 72시간까지 유지되었다. B. cinerea만 처리한 대조구에서는 6시간째부터 서서히 발현되기 시작하여 72시간까지 발현된 양상을 보였으며, T. harzianum YC459처리 후 24시간 뒤 B. cinerea를 처리한 구에서는 0시간째부터 chitinase gene이 발현됨을 관찰하였다. Catalase gene의 발현은 약간의 변화는 있었지만 결과에 영향을 미치지 못했다. 실험의 결과를 바탕으로 본 실험실에서 분리된 T. harzianum YC459는 B. cinerea에 의해 발생되는 잿빛곰팡이병의 방제효과가 높은 것으로 나타났으며, 기주식물에 저항성을 유도한다는 것을 확인하였다. 또한 미생물농약으로서의 개발 가능성을 보여주었다. Trichoderma harzianum YC459, isolated from saw dust compost, was found to be effective against Botrytis cinerea under commercial conditions on greenhouse crops. It hes been marketed in Korea for the control of gray mold on greenhouse tomatoes, strawberry, cucumber and hot pepper. In greenhouse experiments, the efficacy of T. harzianum YC459 was significantly better than that of the fungicide, procymidone. The formula with the conidial populations from 10^5 to 10^8 cfu/g dw had the mean control value of 70% in cucumber pot tests. Mixing of one to eight grams T. harzianum YC459 (10^9 cfu/g dw) granules with one liter nursery container soil mix at seeding time produced synergistic effects in the control of gray mold with leaf spraying of wettable powder. Survival of conidia in the formula was good enough (10^10 cfu/g dw) until one year after preparation at room temperature. T. harzianum YC459 applied as a soil treatment to container soil mix induced resistance against Botrytis cinerea on cucumber plant. The application of one gram T. harzianum YC459 granule formula (10^10 cfu/g dw) to sites spatially separated from the B. cinerea inoculation resulted in a 50% reduction of gray mold symptoms by a delay or suppression of spreading lesion formation. Compared to untreated control, cucumber leaves treated with T. harzianum YC459 in soil exhibited expression of chitinase gene by northern blot analysis. Our results showed that the T. harzianum YC459 may be a potent inducer of resistance.

청국장 발효균의 선별 및 선별균으로 제조한 청국장의 품질 특성

이은주 嶺南大學校 2004 국내박사

Chitinase를 생산하는 균주, Serratia sp. C-1의 생물학적 방제에 관련한 유전자의 특성

이진희 전남대학교 대학원 2013 국내석사

Serratia sp. C-1은 배지 상에서 다양한 식물병원성 곰팡이와 세균의 성장을 저해하는 항균 활성 능력을 보였으며 특이적으로 P. capsici, Xanthomonas 속에 대해서 강한 항균활성을 보였다. 유묘 생물검정에서도 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 밀 잎 녹병, 고추탄저병에 대해 효과적인 방제능력을 보였으며, 벼 잎집무늬마름병과 고추탄저병에 대해서는 90%가 넘는 효과적인 방제능력을 보였으며 미생물 농약인 Serenade에 비교해서 더 높은 방제율을 나타내었다. C-1은 또한 아직 알려지지 않은 volatile을 생성하여 식물의 생장을 촉진하였으며, 토마토에서 잿빛 곰팡이 병에 대한 유도 저항성을 유도하는 능력이 있었다. 항균활성에 관련한 유전자 분석은 transposon 돌연변이 방법에 의해 3개의 항균활성 돌연변이 주와 5개의 항 세균 활성 돌연변이 주가 선발되었다. Tn5 flanking 염기서열 분석 결과, 편모 형성에 관련 fliK, 지방산 합성에 관련된 fabD와 shikimic acid 회로에 관련된 aroA 효소가 항균활성에 관여함을 밝혔다. 이러한 결과를 토대로, C-1은 식물병원균의 생장을 억제하는 항균활성과 방제능력을 가지며 식물체에 영향을 주어 식물생장을 촉진할 뿐만 아니라 유도저항성을 획득할 수 있게 하며, 식물 병원균의 생장을 억제하는 항 곰팡이 활성에 fliK, fabD가 관여하며 항 세균활성에는 aroA가 관여하는 것을 밝혔다.