cloning, Expression and Purification of Arylsulfate Sulfotransferase, α-L-Arabinosidase and β-D-Glucosidase From Intestinal Anaerodes

김보미 경희대학교 대학원 2007 국내석사

Bifidobacterium longum H-1 이 생산하는 두종류의 a-L-Arabinosidase의 클로닝, 발현 및 정제 경희대학교 대학원 약학과 미생물및 면역학 전공 석사과정 김보미 (지도교수)김동현 인삼 ginsenoside의 주요성분인 ginsenoside Rc를 대사시킬수있는 두 종류의 α-L-Arabinosidase가 사람의 장내 세균인 Bifidobacterium longum H-1 으로부터 크로닝되었다. 기존에 보고 된 Bifidobacterium longum 균주의 염기서열로부터 각각 두종류의 Primer 가 제작되었고, 이로부터 PCR 한 결과 각 효소들의 염기서열이 밝혀졌다. Sequencing 결과, 두종류의 α-L-Arabinosidase 의 염기서열은 각각 1548bp, 1569bp 임이 알려졌다. 기존에 알려진 Bifidobacterium longum 과는 각각 99%,99%의 homology 를 보였다. 이들 gene들은 발현 vector 인 pET-39b(+)에 삽입되었으며, E. coli BL21(DE3)에 형질전환되었고, 발현된 효소들은 His Bind Column Chromatography에 의해 정제되었다. 이들의 specific Activity는 각각 3.16,3.33 mmole/min/mg이었다. 이제조합효소는 p-nitraphenyl-α-L-Arabinosidase와 and ginsenoside Rb2는 대사시키지 못하였지만, p-nitraphenyl-α-L-Arabinosidase와and ginsenoside Rc를 ginsenoside Rd 로 대사시켰다

압타머 복합체 형성과 신규 리포좀 캐리어 시스템을 이용한 비타민 C의 안정성 및 피부 흡수 개선 연구

박동우 단국대학교 대학원 2021 국내석사

(국문초록) 압타머 복합체 형성과 신규 리포좀 캐리어 시스템을 이용한 비타민 C의 안정성 및 피부 흡수 개선 연구 단국대학교 대학원 약학과 제약산업 전공 박 동 우 지도교수 : 강 명 주 비타민 C (ascorbic acid, Vit C)는 피부조직에서 콜라겐 생성 및 촉진, 산화적 손상으로부터 보호하는 항산화 역할, 피부 방어기능을 강화하는 작용을 하지만 외부환경에 쉽게 분해되며 낮은 피부 흡수의 문제점이 있다. 본 연구는 Vit C/aptamer complex(complex), liposomal system이 Vit C의 안정성, 피부흡수 등에 미치는 영향을 평가하였다. 먼저, Vit C에 aptamer를 결합하여 물리적 복합체 (complex)를 형성하여 화학적 안정성을 개선하였지만, 피부 전달 또는 흡수에 미치는 영향이 보고된 바 없다. 본 연구에서는 안정성을 개선하고, 피부 투과 또는 전달을 촉진하기 위한 방안으로 Oil을 포함한 Liposome 제형을 설계하고 평가하였다. Ethanol injection method를 이용하여 Lipo-oil-some(LOS)을 제조하였으며, 조성으로는 Phospharidylcholine(PC), DPPG, cholesterol, tricaprylin을 사용하였다. PC는 20mg/ml, DPPG는 1 mg/ml, cholesterol은 2 mg/ml, tricaprylin은 10 mg/ml로 Lipo-oil-some을 제조하였으며, vit C가 약 35% 탑재되었으며, 크기는 1 ㎛ 내외이며, cryo-tem을 통하여 성상을 확인하였다. 제조된 LOS는 광안정성 평가를 통해 빛에 대한 안정성을 확인하였으며, sink condition에서 신속한 용출패턴을 나타냈다. 돼지피부에서 피부 투과 및 침적 양상을 평가한 결과 기존 복합체의 투과율인 20% 보다 낮은 10% 정도로 투과양상이 나타났으며, 복합체에 비해 유의적인 개선은 보이지 않았다. 그러므로, 피부 투과도를 개선할 수 있는 oil을 선정하는 추가 연구가 필요할 것으로 생각된다.

알츠하이머병 치료제로서 새로운 mTORC2? 단백질 상호작용 억제제 개발

김은영 단국대학교 대학원(천) 2024 국내석사

Antimicrobial and anti-inflammatory peptides of Bacillus strains isolated from Korean foods : 한국전통식품에서 분리한 바실러스 균주가 생산하는 항균, 항염 펩타이드에 관한 연구

최윤희 조선대학교 대학원 2013 국내박사

ABSTRACT Antimicrobial and anti-inflammatory peptides of Bacillus strains isolated from Korean foods Choi, Yun Hee Advisor: Prof. Jin Cheol Yoo, Ph.D. Department of Pharmacy, Graduate School of Chosun University Bacillus sp. CS61 In an attempt to isolate effective antimicrobial peptides (AMPs) from a microbial source for the treatment of multidrug-resistant (MDR) bacteria, peptide was purified from Bacillus sp. CS61 newly isolated from the traditional Korean fermented foods. CS61 AMP (ca. 1100Da) was purified to homogeneity by using sequential chromatographic steps. It was found to be stable at pH 2.0–10.0 and up to 80 ℃. The AMP activity was resistant to the proteolytic action of lipase, proteinase K and α-chymotrypsin. The effect of several chemicals on the AMP was evaluated. With an exception to EDTA, TCA and detergent, the AMP was completely sensitive to organic solvents. CS61 AMP performed antimicrobial activity against MDR bacteria such as meticillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), vancomycin-resistant S. aureus (VRSA) and vancomycin-resistant enterococci (VRE). Minimal inhibitory concentrations of CS61 AMP against MRSA, VRSA and VRE were in the range of 0.625–20μg/ml. The N-terminal amino acid sequence of CS61 AMP was A-I-N-X-D-A-A-Y-L, which differed from reported AMPs. The fourth unidentified amino acid was replaced and several peptides were synthesized. Among them, only cysteine replacement displayed antimicrobial activity. The antioxidative activities of the AMP were determined by using 2,2-diphenyl-a-picrylhydrazyl (DPPH) and reducing antioxidant power methods. The CS61 AMP has good antiradical potency against the DPPH. Scavenging effect of DPPH radicals was 77.789±1.8 at 1000μg/ml. The reducing power of CS61 AMP was increased in a concentration dependent manner. However, the DPPH scavenging effect and reducing power of ascorbic acid (control) were more effective than CS61 AMP. Bacillus sp. CS61 AMP was shown in this study to have potent inhibitory effects on lipopolysaccharide (LPS)-induced nitric oxide (NO) production in RAW 264.7 macrophages. Consistent with these findings, CS61 AMP was further shown to suppress the expression of LPS-induced inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxigenase-2 (COX-2) in a dose-dependent manner at both the protein and mRNA gene expression levels. In addition, the release of tumor necrosis factor- α (TNF-α) and interleukin-6 (IL-6), IL-1β the mRNA expression levels of these cytokines were reduced by CS61 AMP in a dose-dependent manner. These results suggest that the anti-inflammatory properties of CS61 AMP are caused by iNOS, COX-2, TNF-α, IL-6 and IL-1β in RAW 264.7. Bacillus sp. CS32 In this study, an antibacterial peptide produced by an isolated Bacillus licheniformis CS32 from traditional Korean fermented foods, was identified as antimicrobial peptide. CS32 AMP showed antimicrobial activity against MDR bacteria such as meticillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), vancomycin-resistant S. aureus (VRSA) and vancomycin-resistant enterococci (VRE). Minimal inhibitory concentrations of CS32 AMP against MRSA, VRSA and VRE were in the range 0.156–80μg/ml. The corresponding AMP was purified to homogeneity by ammonium sulfate precipitation, Sepharose CL-6B and Sephadex G50 column chromatography. Tricine Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis analysis revealed that the active peptide had an apparent molecular weight about 5697.9 Da. Complete amino acid sequence of the peptide yielded twelve amino acids from the N-terminal end (APLEIXXIFHDN), which differed from reported AMPs. The antimicrobial peptide activity was resistant to the proteolytic action of lipase, proteinase K, α-chymotrypsin and trypsin. The effect of several chemicals on the antimicrobial activity was evaluated. The antimicrobial activity was slightly decreased after its treatment with Triton X-100. Antimicrobial activity was not affected by treatment with organic solvents and EDTA. The antimicrobial activity was relatively heat resistant and also active over a wide range of pH 5-10. Such characteristics indicate that these AMPs may be potential candidate for alternative agents to control important clinical pathogens in animal diseases. The antioxidative activities of the AMP were determined by using the 2,2-diphenyl-a-picrylhydrazyl (DPPH) and reducing antioxidant power methods. The CS32 AMP has good antiradical potency against the DPPH. Scavenging effect of DPPH radicals was 56.9±0.79 at 1000μg/ml. The reducing power of CS32 AMP was increased in a concentration dependent manner. However, the DPPH scavenging effect and reducing power of ascorbic acid (control) were more effective than CS32 AMP. Bacillus sp. CS32 AMP was shown in this study to have potent inhibitory effects on lipopolysaccharide (LPS)-induced nitric oxide (NO) production in RAW 264.7 macrophages. The level of nitric oxide (NO) production in the CS32 AMP and LPS-treated RAW 264.7 cells were determined by western blotting, RT-PCR and ELISA. The cytotoxicity of the CS32 AMP and LPS was measured by an MTT assay. CS32 AMP was shown to suppress the expression of LPS-induced inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxigenase-2 (COX-2) in a dose-dependent manner at both the protein and mRNA gene expression levels. In addition, the release of tumor necrosis factor- α (TNF-α), interleukin-6 (IL-6) and IL-1β the mRNA expression levels of these cytokines were reduced by CS32 AMP in a dose-dependent manner. These results suggest that the anti-inflammatory properties of CS32 AMP are caused by iNOS, COX-2, TNF-α, IL-6 and IL-1β in RAW 264.7 cells. 국문초록 한국전통 식품에서 분리한 바실러스 균주가 생산하는 항균, 항염 펩타이드에 관한 연구 최 윤 희 지도교수: 유 진 철 조선대학교 약학대학 약학과 바실러스 속CS61 한국 전통 식품에서 분리한 바실러스 속 균주 CS61은 다약제 내성균주에 항균 효과를 보이는 펩타이드를 생산하는 것을 확인하였다. CS61 항균 펩타이드는 컬럼 크로마토 크래피를 통하여 분리정제 하여 분자량이 1100Da 정도임을 확인하였으며, 이 펩타이드는 pH2.0-10.0사이, 온도는 80℃까지 활성이 유지되었다. 또한 단백질 분해효소인 lipase, proteinase K, α-chymotrypsin에 안정하였다. 다양한 chemical에 대한 안정성을 확인한 결과 EDTA, TCA, 계면활성제를 제외한 유기용매에 의해 활성이 감소하였다. CS61 항균펩타이드의 다약제 내성균인 메티실린 저항성 황색 포도상구균(MRSA), 반코마이신 저항성 황색 포도상 구균(VRSA), 반코마이신 저항성 장알균(VRE)에 대한 최소 저해 농도값은 0.625-20μg/ml 이었다. N-말단 아미노산 염기서열 분석 결과 A-I-N-X-D-A-A-Y-L의 염기서열로 구성되어 있었으며, 네번째 자리에 읽히지 않은 아미노산을 20가지 다양한 아미노산으로 치환하여 치환체의 항균활성을 비교하였을 때 시스테인으로 치환된 치환체에서 항균 활성을 보임을 알 수 있었다. CS61 항균 펩타이드의 항산화 활성은 DPPH 라디칼 소거능과 환원력을 통해 분석하였다. 이 펩타이드의 DPPH 소거능은 1000 μg/ml 의 농도에서 77.789±1.8의 소거능을 보였으며 대조군인 아스코르브산과 비교하였을 때 거의 비슷한 수준의 활성을 나타내었다. 환원력은 대조군인 아스코르브산 보다는 낮지만 농도 의존적으로 증가하였다. Raw264.7 대식세포는 LPS에 의해 일산화 탄소의 생성이 증가하는데 CS61 항균 펩타이드를 처리하였을 때 이의 생산을 억제하는 효과를 보였다. 또한 LPS에 의해 유도되는 염증 단백질인 iNOS, COX-2 단백질의 발현을 농도 의존적으로 감소 시켰으며 RT-PCR를 통해 유전자 수준에서의 발현 또한 감소함을 확인하였다. 염증반응에 관여하는 싸이토카인인 TNF-α, IL-6, IL-1β의 발현을 ELISA를 통해 확인한 결과 농도의존적으로 감소하였고 이 싸이토카인의 유전자 수준에서의 발현 또한 감소함을 확인하였다. 바실러스 속 CS32 한국 전통식품에서 분리한 바실러스 CS32 균주는 항균펩타이드를 생산함을 확인하였다. 항생제 저항성 균주인 MRSA, VRE, VRSA에 탁월한 효과를 보였으며, 이런 병원성 균주에 대한 최소저해농도는 0.156-80 μg/ml 이었다. 항균 펩타이드는 Sepharose CL-6B, Sephadex G50 컬럼을 통해 분리하였고 Tricine SDS-PAGE와 MALDI-TOF를 통해 5697.9Da 정도 크기를 보이는 펩타이드임을 확인하였다. N-말단 염기서열 분석을 통해12개의 아미노산 서열을 분석(APLEIXXIFHDN)하였고 이 서열은 기존에 보고 되었던 것과 다른 신규한 펩타이드임을 확인하였다. 이 펩타이드는 단백질 분해효소인 lipase, proteinase K, α-chymotrypsin, Trypsin에 대해 안정하였으며, 다양한 chemical에 대해서도 안정성을 보였다. 또한 pH5.0-10.0사이에서 활성이 유지되었고 온도에도 안정하였다. CS32 항균 펩타이드의 항산화 활성을 DPPH 라디칼 소거능과 환원력을 통해 시험하였다. DPPH 라디칼 소거능 시험 결과 CS32 펩타이드는 1000 μg/ml 의 농도에서 56.9±0.79의 소거능을 보였으며 대조군인 아스코르브산과 비교하였을 때 같은 농도에서 절반정도의 활성을 나타내었다. 환원력은 대조군인 아스코르브산 보다는 낮지만 농도 의존적으로 증가하였다. Raw264.7 대식세포는 LPS에 의해 일산화 탄소의 생성이 증가하는데 CS32 항균 펩타이드를 처리하였을 때 이의 생산을 억제하는 효과를 보였다. 또한 LPS에 의해 유도되는 염증 단백질인 iNOS, COX-2 단백질의 발현을 농도 의존적으로 감소 시켰으며 RT-PCR를 통해 유전자 수준에서의 발현 또한 감소함을 확인하였다. 염증반응에 관여하는 싸이토카인인 TNF-α, IL-6, IL-1β의 발현을 ELISA를 통해 확인한 결과 농도의존적으로 감소하였고 이 싸이토카인의 유전자 수준에서의 발현 또한 감소함을 확인하였다.

Design and Synthesis of Novel Branched Nucleoside Analogues as Antiviral Agents

류련금 조선대학교 대학원 2012 국내박사

ABSTRACT Design and Synthesis of Novel Branched Nucleoside Analogues as Antiviral Agents Liu Lian-Jin Advisor: Prof. Hong Joon-Hee. Ph.D. Department of Pharmacy Graduate School of Chosun University Nucleoside analogs are a class of antiviral drugs designed to inhibit DNA/RNA synthesis in the viral life cycle. These drugs possess very similar structures to the natural nucleotides. Nucleosides are the most frequently used effective class of antiviral agents, with over 20 drugs currently approved for the treatment of viral diseases and a number of candidates in the clinical trials. Nucleoside analogs may be either purine analogs or pyrimidine analogs. In either case, the structures of the drugs closely resemble their natural nucleotide counterparts. Examples of these include zidovudine(AZT), stavudine, acyclovir, didanosine, zalcitabine, and lamivudine. The carbocyclic nucleosides possess a wide range of biological activities such as antiviral and antitumor effects, as well as carbocyclic nucleosides have greater metabolic stability against chemical or enzymatic hydrolysis. Emerging drug-resistant viral strains and drug toxicity are major problems in antiviral chemotherapy, which has lead to research for structurally modified nucleosides. Geminal substitution at the 2'-position might impose favorable steric as well as electronic effect on the interaction with virus polymerase. Based on information, focusing on the modification of the 2'-position of the potent 2'(β)-C-carbodine nucleosides, I designed and synthesized carbocyclic nucleosides 28, 31, 40, 42, 44, 45. Stimulated by interesting SAR (structure activity relationship), I synthesis of a novel class of nucleosides containing 4'-ethynyl carbocyclic nucleosides 61, 62, 63, 66 and 4'-cyclopropyl carbocyclic nucleoside 77, 78. More efficient therapeutic agents against several virus and to provide analogues for probing the conformational preferences of enzymes associated with the metabolism of nucleosides and nucleotides, I have designed and prepared a novel class of nucleosides comprising 4'-branched-5'-norcarbocyclic phosphonic acid analogues 96, 97, 112, 113, 114 and 116. Stimulated by these findings that 6'-electronegative nucleoside analogues and 5'-norcarbocyclic nucleoside phosphonates have excellent biological activities, I sought to synthesize a novel class of nucleosides comprising 6'-methylene and 6'-spirocyclopropyl 5'-norcarbocyclic phosphonic acid analogues (±)-129, (±)-130, (±)-134, (±)-135, (±)-136, 150, 151, 152α, 153 and 155 in order to search for more effective therapeutics against HIV. The synthesized nucleoside analogues were assayed for antiviral activity. The cytosine analogue 28 exhibited potent anti-HCV activity, cytosine analogue 44 weakly inhibited the replication of the replicon. Guanine analogue 66 exhibited moderate antiviral activity against HIV-1; and the thymine analogue 62 showed weak antiviral activity against HCMV. Compound 77 and 78 exhibited moderate antiviral activity against HCMV in the Davis cell without any cytotoxicity up to 100 μmol. Nucleoside phosphonic acid 97 exhibited significantly more anti-HIV activity than its parent nucleoside diethyl phosphonate 96 at concentrations up to 100 μM. Adenosine phosphonic acid 113 exhibited moderate anti-HIV activity with IC50 = 28.3 μM. Also, nucleotide analogues 112, 114 and 116 did not show anti-HIV activity nor cytotoxicity up to 100 μM. Guanine nucleoside phosphonic acid (±)-136 exhibits significant anti-HIV activity. However, nucleoside analogues (±)-129, (±)-130, (±)-134, and (±)-135 showed weak anti-HIV activity or cytotoxicity at concentrations up to 100 μM. Nucleoside phosphonic acid 155 exhibited increased anti-HIV activity compared with its parent nucleoside phosphonic acid 151. However, nucleoside analogues 150, 152α, and 153 did not show anti-HIV activity or cytotoxicity at concentrations up to 100 μM. 국문초록 Design and Synthesis of Novel Branched Nucleoside Analogues as Antiviral Agents 류 련 금 지도교수: 홍 준 희 약학과 조선대학교 대학원 뉴클레오시드 유도체는 바이러스 생활주기에서 DNA/RNA의 합성을 억제하기 위하여 디자인된 항바이러스제이다. 이러한 약물들은 천연적인 뉴클레오티드와 아주 비슷한 구조를 나타내고 있다. 뉴클레오시드는 항바이러스계중에서 최다 사용빈도를 나타내는 효과적인 약물로서 현재 20여종의 약물들이 바이러스에 의한 병을 치료하는데 사용되거나 몇몇의 임상실험 후보물질로 등극되고 있다. 뉴클레오시드 유도체는 대체로 푸린 유도체이거나 피리미딘 유도체이다. 이러한 약물의 구조는 천연적으로 존재하는 뉴클레오시드와 밀접한 공통점이 있다. 예를 들어 지도부딘, 스타부딘, 아시클로비어, 디다노신, 잘시타빈, 타미부딘 등을 포함하고 있다. 카보사이클릭 뉴클레오시드는 항바이러스, 항종양 작용과 같은 광범위한 생물학적 활성을 가지고 있을 뿐 만 아니라 카보사이클릭 뉴클레오시드는 약물이나 효소의 가수분해에 대한 대사과정에서의 높은 안정성도 가지고 있다. 새로운 약물-내성을 가지는 바이러스와 약물의 세포독성은 항 바이러스 화학치료요법에 있어서 핵심문제인데 이러한 문제를 해결하려면 구조적으로 변화된 뉴클레오시드의 연구가 필요하다. 2'-위치의 Geminal 치환은 바이러스 폴리미라아제와의 상호작용에서 입체적뿐 만 아니라 전자작용을 더욱 유리하게 할 수 있다. 이러한 정보를 토대로 2'(β)-C-카보딘 뉴클레오시드에서 2'-위치의 변경에 초점을 두고 저는 카보사이크릭 뉴크레오시드 28, 31, 40, 42, 44, 45을 디자인하고 합성하였다. 흥미 있는 SAR (구조 활성 관계)를 토대로 저는 새로운 뉴크레오시드 유도체 즉 4'-에티닐 카보사이크릭 뉴클레오시드 61, 62, 63, 66와 4'-사이클로프로필 카보사이클릭 뉴클레오시드 77, 78을 합성하였다. 여러 가지 바이러스에 더욱 유효한 치료제와 뉴클레오시드, 뉴크레오티드의 대사에 관여하는 효소의 구상을 검사하기 위한 유사체를 제공하기 위하여 저는 4'-branched-5'-nor카보사이클릭포스폰산 유도체 96, 97, 112, 113, 114와 116을 디자인하고 합성하였다. 6'-음전하 뉴클레오시드 유도체와 5'-nor카보사이클릭 뉴클레오시드 포스폰산은 좋은 생물학적 활성을 가지고 있다. 이러한 정보를 기초로하여 더욱 유력한 HIV치료제를 찾기 위하여 6'-메틸렌과 6'-sipro사이클로프로필 5'-nor카보사이클릭 포스폰산 유도체를 포함한 새로운 종류의 뉴크레오시드 유도체 (±)-129, (±)-130, (±)-134, (±)-135, (±)-136, 150, 151, 152α, 153, 155를 합성하였다. 합성한 뉴클레오시드 유도체들에 대하여 항바이러스 활성을 분석하였다. 시토신 유도체 28은 유력한 항-HCV 활성을 나타내었고 시토신 유도체 44는 레플리콘의 복제를 약하게 억제하였다. 구아닌 유도체 66은 HIV-1에 대하여 약한 항 바이러스 활성을 나타냈고 티민 유도체 62는 HCMV에 대하여 약한 항 바이러스 활성을 나타냈다. 합성물 77과 78은 Davis 세포에서 100μmol보다 높은 농도에서도 어떠한 독성도 나타내지 않았으며 HCMV에 대해 약한 항바이러스 활성을 나타냈다. 뉴클레오티드 포스폰산 97은 100μM까지의 농도에서 본체 뉴클레오시드 데실 포스폰산염 96보다 더욱 강한 항-HIV 활성을 나타냈다. 아데노신 포스폰산 113은 IC50=28.3에서 항-HIV활성을 나타냈다. 하지만 뉴클레오티드 유사체 112, 114와 116은 100μM까지의 농도에서도 항-HIV활성이나 세포독성을 나타내지 않았다. 구아닌 뉴클레오시드 포스폰산 (±)-136은 유력한 항-HIV 활성을 나타냈다. 그러나 뉴클레오시드 유도체 (±)-129, (±)-130, (±)-134와 (±)-135는 100 μM까지의 농도에서도 낮은 항-HIV 활성 혹은 세포독성을 나타냈다. 뉴클레오시드 포스폰산 155은 본체 뉴클레오시드 린산 151과 비교했을 때 항-HIV 활성은 증가한 것으로 나타냈다. 하지만 뉴클레오시드 유도체 150, 152α와 153은 100μM까지의 농도에서도 항-HIV 활성 혹은 세포독성을 나타나지 않았다.

Optimization of cationic gelatin/alginate coacervates for topical delivery of miR-497

유영운 차의과학대학교 일반대학원 2023 국내석사

[ABSTRACT IN KOREAN] miR-497의 국소 전달을 위한 양이온성 젤라틴/알긴산 코아세르베이트의 최적화 <지도교수 김 애 리> 차의과학대학교 대학원 약학과 유 영 운 최근 miRNA는 다양한 질병의 치료제로서 주목을 받고 있다. miRNA는 특정 유전자를 대상으로 하여 치료 효과를 나타낼 수 있어, 효과적인 치료제로 간주되어 왔다. 그러나 miRNA의 효과적인 세포 내 전달은 여러 가지 제약 요인으로 어려움을 겪고 있는 상황이다. 본 연구에서는 CG/SA coacervates를 이용한 효과적이고 안전한 miRNA 전달 시스템을 개발하였다. 입자 크기, 다분산 지수, 제타전위, 봉입률 등의 기준을 근거로 최적의 조성물인 LC.Coa-ED x0.5, x1, x2는 뛰어난 전달 효율과 함께 염증성 사이토카인 수준을 유의하게 감소시켰다. 이러한 결과는 coacervates가 miRNA 전달 시스템으로서 큰 잠재력을 가지고 있음을 시사한다. 그러나 당뇨병성 마우스 상처 치유 실험에서는 coacervate의 적용이 큰 효과를 나타내지 못했다. 따라서 이러한 만성 상처 치료에 대한 효과를 향상시키기 위해 epidermal growth factor (EGF)나 fibroblast growth factor (FGF)와의 조합 등 다른 치료제들과의 연구가 필요할 것으로 사료된다. 핵심 되는 말 : miR-497, 코아세르베이트, 양이온성 젤라틴, 알긴산, 에틸렌다이아민, 항염증, 상처 치유. [Abstract] Optimization of cationic gelatin/alginate coacervates for topical delivery of miR-497 Youngun Yu Department of Pharmacy The Graduate school CHA University (Directed by Professor Aeri Kim) microRNAs have gained increasing attention as potential therapeutic agents for various diseases. They possess the ability to target disease-causing genes, making them promising and specific therapeutic agents. However, effective delivery of miRNAs into cells poses several challenges, including nuclease degradation, unstable pharmacokinetic parameters, and limited cell membrane permeability. In this study, CG/SA coacervates were explored as an efficient and safe delivery system for miR-497. The optimal coacervate formulations, LC.Coa-ED x0.5, x1, and x2, demonstrated remarkable transfection efficiency and significant reduction in pro-inflammatory cytokine levels. These findings highlight the potential of coacervates as miRNA delivery systems. However, in the in vivo wound healing assay conducted on diabetic mice, the application of coacervates did not yield substantial improvement in wound closure. These results suggest that combination with other therapeutic agents such as epidermal growth factor or fibroblast growth factor may be more effective for chronic wound healing. Keywords: miR-497, Coacervates, Cationized gelatin, Sodium alginate, Ethlylenediamines, Anti-inflammation, Wound healing

Expression, Purification and Characterization of Long-chain Acyl-

박보람 영남대학교 대학원 2013 국내석사

석사학위논문 Streptomyces toxytricini의 장쇄 Acyl-CoA Carboxylase 유전자의 발현 및 이의 특성 연구 박보람 영남대학교 대학원 약학대학 약학과 (지도교수 남 두 현) 요 약 문 Acyl-CoA carcoxylase (ACCase)는 지방산과 같은 1차 대사산물, 또는 Polykeptide와 같은 2차 대사산물의 생합성 관여하는 효소이다. Streptomyces toxytricini는 lipase 저해 활성화를 가진 비만치료제로 사용하는 lipstatin을 생산하는 균주로, tetradecadienoyl CoA와 octanoyl CoA가 결합하여 lipstatin을 생합성하는 것으로 알려져 있으며, 이 때 octanoyl CoA의 활성화에 ACCase가 관여할 것으로 추정된다. ACCase는 α subunit과 β subunit로 구성되어 있으며 α subunit에는 biotin이 결합되어 활성화된 후, 이 biotin에 carboxyl기를 포집하여 β subunit인 carboxyl-transferase에 의한 acetyl-CoA 또는 propionyl-CoA와 같은 유기산 α-carbon에 carboxyl기를 도입하도록 한다. Lipstatin 생산균주인 Streptomyces toxytricini로부터 ACCase 복합체를 지령하는 유전자로 추정되는 10.6kb 와 7.4kb 크기의 유전자군이 발견되었다. 10.6kb 유전자 조각에서는 pccB, accA3 및 pccE 유전자가 발견되었으며, 7.4kb 조각에서는 accD1 및 accA1 유전자가 존재하였다. 따라서 본 연구에서는 이 두 종의 ACCase 복합체의생화학적 특성을 조사하기 위해, 상기 5개 유전자를 대장균의 발현 운반체인 pET28a(+) vector 또는 pGEx4T-3a vector에 클로닝하여 발현시키고, 재조합 단백질들을 각각 Ni2+ affinity column chromatography 또는 gluthatione Sepharose 4B를 이용한 친화성 크로마토그래피법으로 정제하였다. 정제된 ACCase complex를 대상으로 기질 특이성을 조사한 결과, AccA1/AccD1 complex는 acetyl-CoA 및 propionyl-CoA 모두 carboxylation시켰지만, AccA3/PccB complex는 propionyl-CoA 만 carboxylation시켰고, acetyl-CoA 는 carboxylation시키지 못했다. 이로부터, AccA3/PccB complex는 장쇄의 acyl-CoA를 carboxylation시키는 ACCase임을 확인할 수 있었다.

HPLC를 이용한 녹차성분의 패턴분석

金貞淑 忠南大學校 大學院 2005 국내석사

Recently researches on catechins which is polyphenol has been actively in progress inside our country as well as abroad. Remarkable medical effects are as following antioxidative, anticancer, antitumor, deterioration of cholesterol and preventive tooth decay. Moreover, their influence on tea's quality is enormous. Since the tea quality evaluation integrates organic inspection generic chemical analysis, it is difficult to perform in objectively. The purpose of this study is to decide the most suitable tea abstraction method by employing HPLC and to analyze the content of (+)-catechin, (-)-epicatechin, (-)-epigallocatechin gallate, (-)-epigallocatechin, (-)-epicatechin gallate, caffeine in green tea available for sale in domestic market. Moreover, this study attempt to develop quality management method by employing chromatogram pattern in analysis in the same condition as in content analysis. The experiment results are as follow: 1. The most suitable sample was the water obtained when abstracting it at intervals of 6 minutes at 80 ℃ 2. HPLC mobile solvent was completely separated into different components when exposing in gradient eruption A(acetonitrile) and B(0.1% acetic acid in water) with 10%A to 30%A for 25 minutes. 3. The total amount of catechins was between 4.8% to 12.06% and caffeine was between 1.76% to 3.07%. As a result of comparing catechins an caffeine according to place of cultivation, collected time, price and processing method by applying TTEST, products from Jeju contained higher amount of (-)-epicatechin, (-)-epigallocatechin gallate, (-)-epigallocatechin, and caffeine than those from Bosung. The study demonstrated that collected time was almost congruent with price and in case of parched tea and steamed tea, they had the same component in exception of caffeine (p=0.02). 4. We obtained the component content and compared to the initial amount of catechins and caffeine obtained previously. We displayed the comparison between the total amount of catechins plus caffeine and catechins only. As a result the correlativity and amount of the weighted mean resulted to be higher than those simple mean.

配位子 ethylenediamines을 함유하는 白金(Ⅱ)착체의 抗癌效果 및 신독성에 관한 연구

김영철 경희대학교 대학원 1994 국내석사

Identification of GSPT1 as a Regulator of Apoptosis Signal-regulating Kinase 1 (ASK1) : 단백질 상호 작용에 의한 Apoptosis Signal-regulating Kinase 1 (ASK1)의 조절자인 GSPT1 의 동정

Lee, Jung A Graduate School Chungnam National University 2005 국내석사

Apoptosis signal-regulating kinase 1 (ASK1), a member of mitogen-activated protein (MAP) kinase kinase kinase family, is a Ser/Thr kinase that plays a critical role in mediating apoptosis signals initiated by a variety of death stimuli, such as hydrogen peroxide and TNF-??. Due to its critical role in inducing apoptosis, ASK1 activity is tightly regulated by various mechanisms such as posttranslational modification and protein-protein interaction. In this study, to characterize the mechanism of ASK1 signal regulation, we searched for ASK1-interacting proteins using the yeast two-hybrid screening method. Several clones were found and one of them was identified as a GSPT1. The GSPT1 protein is essential for the G1 to S phase transition of cell cycle, and has function as a polypeptide chain release factor 3 (eRF3). We show that ectopically expressed GSPT1 interacts with ASK1-induced apoptotic activity. However, the interaction between two proteins is independent of hydrogen peroxide, a stimulator of ASK1, suggesting that the expression level of GSPT1 is the key factor for regulating ASK1. GSPT1 also increases the transactivation activity of cJUN that is a downstream transcription factor of the ASK1-mediated apoptotic signal transduction pathway. In vitro kinase assay data show that GSPT1 enhances ASK1 autophosphorylation and its kinase activity on MKK6. Phosphorylation of cJUN was increased with the increasing amount of GSPT1 in the presence of ASK1. Overexpression of GSPT1 inhibits the binding of ASK1 to the 14-3-3 protein, a well-known ASK1 inhibitor, while GSPT1 has no effect on the interaction between ASK1 and TRAF2, a C-terminal binding activator of ASK1. The result suggest that GSTP1 activates ASK1 by acting as a competitive inhibitor of the 14-3-3 protein. Taken together, our results provide a novel role GSPT1 in regulating ASK1-mediated apoptosis. Apoptosis signal-regulating kinase 1 (ASK1)은 mitogen-activated protein kinase kinase kinase (MAPKKK) family 에 속하는 키나아제로 Ser/Thr 키나아제이다. 이것은 사이토카인과 산소성 스트레스에 의해 유도되는 세포사멸에서 중요한 역할을 한다. ASK1 의 활성은 유전자 번역 후 과정에서 일어나는 변형과 단백질-단백질 상호 작용과 같은 다양한 기작에 의해 조절된다. 본 연구에서 우리는 ASK1 신호 조절 기작의 보다 세밀한 이해를 위해서 ASK1 과 상호 작용하는 단백질을 효모 이중 보합을 통해 동정하였고 이렇게 동정 된 단백질 중 하나가 GSPT1 이다. 현재 GSPT1 은 세포주기에서 G1 에서 S 기로 전환될 때 필수적으로 작용하는 단백질로써 polypeptide chain release factor 3 (eRF3)의 기능을 가지고 있다고 알려져 있다. 우리는 세포 내에서 GSPT1 과 ASK1 이 상호작용하고 있음을 확인하였다. 그리고 두 단백질의 상호작용은 ASK1 을 활성화 시키는 산소성 스트레스 (H2O2)에는 독립적으로 작용한다는 것을 알았다. 이것은 GSPT1 의 발현 정도가 ASK1 을 조절하는 중요한 요인임을 시사해 준다. 더 나아가 배양 세포에서 GSPT1 이 ASK1 을 활성화 시키고 Caspase signal 을 통해서 ASK1 에 의해 유도되는 세포사멸을 증가 시킨다는 것을 알았다. GSPT1 은 ASK1 에 의해 유도되는 세포사멸 신호전달 과정의 downstraem 에 있는 전사인자인 cJUN 의 활성을 증가시킨다. In vitro kinase assay 를 통해서도 GSPT1 이 ASK1 의 자기 인산화와 MKK6 의 인산화 활성을 증가시키고, ASK1 의 존재 하에 GSPT1 의 농도가 증가함에 따라 cJUN 의 인산화가 증가한다는 것을 알았다. 또한 GSPT1 의 과발현은 ASK1 의 음성 조절자인 14-3-3 단백질과 ASK1 의 상호작용을 억제함을 알았다. 그러므로 GSPT1 과 14-3-3 단백질은 ASK1 과의 상호작용에 있어 경쟁적인 관계에 있다고 말할 수 있다. 이런 연구 결과를 종합해 볼 때 GSPT1 은 ASK1 의 양성 조절자로 작용함으로써 ASK1 에 의해 유도되는 세포사멸 신호전달 기작에 대한 새로운 정보를 제시해 준다.