A Study on the Application of 3D Cell Culture Scaffolds and SPR Signal Amplification using Silica Nanoparticles

민기태 차의과학대학교 일반대학원 2022 국내석사

실리카 나노입자는 우수한 생체적합성과 안정성을 특징으로 한다. 또한 실리카 나노입자는 합성 조건에 따라서 입자의 크기와 기공의 크기를 조절할 수 있으며, 표면을 원하는 기능기로 쉽게 유도할 수 있다. 이러한 특징을 활용하여 다양한 분야에서 활용이 가능하다. 이 연구에서는 실리카 나노입자의 장점을 활용하여 3차원 세포 배양과 SPR 바이오센서의 민감도 향상에 적용하였다. 3차원 동적 배양은 동일한 품질의 세포를 대량 생산하기 위한 중요한 기술 중 하나이다. 그러나 동적 배양 중에 구형 지지체에 부착된 세포는 임펠러 또는 기타 지지체와의 충격 또는 전단 응력에 의해 손상되거나 제거된다는 단점이 있다. 이를 해결하기 위해서 세포가 지지체에 부착 될때 평평한 표면보다 거친 표면에서 더 부착이 잘된다는 연구 결과를 활용하였다. 폴리스티렌(PS)-비드의 평평한 표면을 나노 스케일의 거친 표면으로 만들어주기 위해서 우수한 생체적합성과 표면 작용기의 용이한 개질을 특징으로 가진 실리카 나노입자를 PS-비드의 표면에 결합시켜 3차원 동적 배양을 위한 실리카 나노입자가 결합한 PS 지지체를 제작하였다. 세포 생산 효율을 확인하기 위해서 125 mL 스피너 플라스크를 이용하여 3차원 동적 배양을 7일간 진행하였고 기존의 PS 비드보다 약 44% 더 높은 효율을 보임을 확인하였다. 이번 연구를 통해 개발된 세포 배양 지지체가 세포의 대량 배양 연구에 기여할 것으로 기대된다. 사이토카인은 면역 세포 사이의 행동을 조절하여 인체의 정상적인 면역 기능에 필수적이다. 이러한 사이토카인의 수치 변화 분석을 통해서 다양한 질병을 진단 및 예후 정보를 확인할 수 있다. 사이토카인을 정량하기 위한 기존의 대표적인 방법으로는 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)이 있다. 그러나 ELISA는 시간이 많이 걸리고 노동 집약적이며 일반적으로 표적 항체의 생물물리학적 특성에 대한 제한된 정보만 제공하며, 표지 과정에서 결합 물질의 특정 활성을 변경하여 분석 감도 및 결과의 오류를 초래할 수 있다는 한계가 있다. 비표지 기술은 이러한 분석 한계 중 많은 부분을 극복한다. 표면 플라즈몬 공명(SPR)은 결합 및 해리(kinetic), 상호작용 강도(affinity), 결합 부위(에피토프 매핑) 및 용액 내 항체의 활성 농도에 대한 실시간 정보를 제공하는 확립된 비표지 기술이다. 그러나 SPR 바이오센서는 검출한계(LOD)가 높아 매우 낮은 농도의 시료는 측정이 어렵다는 한계가 있다. 이러한 문제를 극복하기 위해서는 SPR 바이오센서의 감도 향상이 필요하다. 나노 입자를 사용한 신호 증폭은 SPR 감도를 향상시키는 가장 효과적인 방법 중 하나이다. 나노 입자는 분석 물질에 결합하여 분석 물질의 굴절률을 높이고 공명 각도의 이동을 개선하여 SPR 센서의 감도를 높여 민감도를 개선시킨다. 나노 입자 중에서도 실리카 나노입자는 굴절률이 높고 원하는 작용기로 표면을 쉽게 개질할 수 있어 원하는 표적 물질을 검출하는 SPR 바이오센서의 신호 증폭 물질로 적합하다. 본 연구에서는 Neutravidin 단백질로 개질된 실리카 나노입자를 SPR 바이오센서의 신호 증폭 입자로 제안하였고, IL-10을 사용하여 신호 증폭 효과를 확인하였다. 결과적으로, 실리카 나노입자로 인하여 굴절률이 크게 증가하였고, 0.01 ng/mL 농도의 IL-10을 검출하는 데 성공하였다. Neutravidin 개질된 실리카 나노입자는 높은 굴절률로 SPR 바이오센서의 민감도를 향상 시켰다. 이를 활용하여 IL-10 뿐만 아니라 다양한 단백질 검출에도 활용될 수 있을 것으로 기대한다. Silica nanoparticles are characterized by excellent biocompatibility and stability. In addition, silica nanoparticles can control the particle size and pore size according to the synthesis conditions, and can easily induce the surface to a desired functional group. By utilizing these characteristics, it can be used in various fields. In this study, the advantages of silica nanoparticles were applied to two fields. The cell culture efficiency was improved by fabricating scffolds for 3D cell culture, and the sensitivity of the SPR biosensor was improved by fabricating particles for signal amplification. Three-dimensional dynamic culture is one of the important techniques for mass production of cells of the same quality. However, there is a disadvantage that cells attached to the spherical scffolds during dynamic culture are damaged or removed by impact or shear stress with an impeller or other scaffolds. To solve this problem, we utilized research that cells adhere better to rough surfaces than flat surfaces when attached to scffolds. In order to make the flat surface of polystyrene (PS)-beads into a nano-scale rough surface, silica nanoparticles having excellent biocompatibility and easy modification of surface functional groups were combined with the surface of PS-beads to fabricate scffolds for three-dimensional dynamic culture. A three-dimensional dynamic culture was performed for 7 days using a 125 mL spinner flask, and it was confirmed that the efficiency was about 44% higher than that of the existing PS scaffolds. Cell culture scffolds developed through this study are expected to contribute to the study of mass culture of cells. Cytokines are essential for normal immune function in the body by regulating the actions between immune cells. Through this numerical change analysis of cytokines, it is possible to diagnose various diseases and confirm prognosis information. An existing representative method for quantifying cytokines is enzyme-binding immunosorption analysis (ELISA). However, ELISA is time-consuming, labor-intensive, and generally provides limited information on the biophysical properties of target antibodies, with limitations that it can alter the specific activity of the binding material during labeling, resulting in analytical sensitivity and results errors. Non-labeling techniques overcome many of these analysis limitations. Surface plasmon resonance (SPR) is an established non-labeling technique that provides real-time information on binding and dissociation, affinity, binding site (epitope mapping), and activity concentrations of antibodies in solution. However, SPR biosensors have a high detection limit (LOD), so it is difficult to measure samples with very low concentrations. To overcome this problem, it is necessary to improve the sensitivity of the SPR biosensor. Signal amplification using nanoparticles is one of the most effective ways to improve SPR sensitivity. Nanoparticles bind to the analyte to increase the refractive index of the analyte and improve the movement of the resonance angle to increase the sensitivity of the SPR sensor. Among nanoparticles, silica nanoparticles have a high refractive index and can easily modify the surface with a desired functional group, making them suitable as a signal amplification material for SPR biosensors that detect desired target materials. In this study, the silica nanoparticles modified with the neutravidin protein were proposed as signal amplification particles of the SPR biosensor, and the signal amplification effect was confirmed using IL-10. As a result, the refractive index was greatly increased due to the silica nanoparticles, and IL-10 with a concentration of 0.01 ng/mL was successfully detected. Neutravidin modified silica nanoparticles improved the sensitivity of the SPR biosensor due to their high refractive index. By utilizing this, it is expected that it can be used not only for IL-10 but also for detecting various proteins.

A study on methodology for trend analysis and technology forecasting using unstructured patent data and natural language processing : focused on case of biopharmaceutical field

김시우 차의과학대학교 일반대학원 2022 국내석사

4차 산업혁명 시대에서 기술예측은 과학과 경제발전을 효과적으로 연결할 수 있고 다양한 미래 상황에 대비할 수 있다. 객관적인 데이터의 평가를 통한 과학적 근거에 기반한 기술 개발 전략 및 연구개발 방향을 설정하는 것은 과학 산업분야에서 주요 이슈가 되어 왔다. 현재 대부분의 국가에서 특허 제도가 확립되어 있다. 과학 산업분야의 연구자들은 본 출원공개 제도를 통해 연구와 투자의 중복을 방지하고 효과적인 연구개발 방향을 설정할 수 있다. 특허 데이터는 전 세계적으로 연간 약 3백만 건이 출원되고 있으며 이는 빅 데이터의 성격을 가지고 있다. 특허 데이터의 종류는 정형 데이터와 비정형 데이터가 있다. 특허 데이터는 공백 또는 유망기술을 도출하는 등 기술예측을 위한 데이터 소스로 사용될 수 있다. 기술예측을 위한 다양한 특허분석 방법론이 연구되어 왔다. 출원일, 출원인, 국가 코드, IPC code, CPC code 등의 정형 데이터를 이용한 특허분석 방법론들은 과학 산업의 첨단 기술을 분석하고 의미 있는 연구개발 방향을 제시하기 어렵다는 한계점이 존재한다. 또한, 특허 분석 결과는 산업 분야의 실질적인 니즈와 간극이 존재한다. 이를 극복하기 위해, 제목, 초록, 청구항 등 비정형 특허 데이터를 적극적으로 활용할 수 있는 방법론이 요구된다. 그러나 비정형 특허 데이터는 거대한 텍스트 코퍼스 형태로 존재하기 때문에 활용하기가 쉽지 않다. 이 비정형 특허 데이터를 분석하기 위해 자연어 처리 기법을 이용한 특허 분석 방법론이 제안되고 있다. 딥러닝 기반의 자연어 처리 기법은 기계 학습을 위한 훈련 데이터 세트가 필요하다. 그러나 이 훈련 데이터 세트를 준비하는 것은 어렵고 제공되고 있는 데이터 세트도 제한적이다. 본 연구에서는 산업분야의 실질적인 니즈와의 간극을 최소화하고 비정형 특허 데이터를 체계적으로 분석하기 위한 두 가지 특허 분석 방법론을 제안하였다. 제안된 방법론들을 검증하기 위해, 바이오의약품 분야에 적용하였다. 바이오의약품 분야는 신물질 발굴부터 신약개발까지 높은 투자가치와 고액의 자금과 장기투자가 가능한 지식기반 산업이다. 방법론 적용 결과, 바이오의약품 분야의 특허 데이터를 기반으로 동향 분석이 가능하였고, 공백 및 유망기술을 도출할 수 있었다. In the era of 4th industrial revolution, technology forecasting can effectively link science and economic development and prepare for various future situations. Establishing directions for R&D management and strategy for the development of technology based on scientific evidence through the evaluation of objective data has been a major issue in the scientific industry. Patent systems are now established in most countries. Researchers in the scientific industry can prevent overlapping R&D research and investment and set effective R&D directions through this application disclosure system. Patent data are filed about 3 million annually worldwide, and it has the characteristics of big data. There are two types of patent data: structured data and unstructured data. Patent data can be used as a data source for technology forecasting such as deducing vacant or promising technologies. Various patent analysis methodologies have been studied for technology forecasting. Patent analysis methodology using structured data such as application date, applicant, country code, IPC code and CPC code has limitations in that it is difficult to analyze advanced technologies in the scientific industry and suggest a meaningful R&D direction. Also, results of patent analysis have gaps with the practical needs of the industry. To overcome this, methodoloeis that can actively utilize unstructured patent data such as title, abstract, and claims is required. However, it is not easy to utilize unstructured patent data due to exist in the form of a big text corpus. Patent analysis methodologies using natural language processing techniques have been proposed to analyze unstructured patent data. Natural language processing techniques based on deep learning requires a training data set for machine learning. However, it is difficult to prepare this training data set and the provided data set is also limited. In this study, we proposed two patent analysis methodologies to minimize the gap with practical needs in the industrial field and systematically analyze unstructured patent data. To verify the proposed methodologies, we applied them to the field of biopharmaceuticals. The biopharmaceutical field is a knowledge-based industry with high investment value and a large amount of money and long-term investment from the discovery of new substances to the development of new drugs. As a result of applying methodologies, based on patent data in the field of biopharmaceuticals, trends analysis was possible and vacant and promising technologies could be deduced.

서방형 3차원 지지체를 이용한 줄기세포 대량배양공정 및 바이오리엑터 시스템 개발

김지광 차의과대학교 일반대학원 2021 국내석사

줄기세포는 자가 복제가 가능하며 다중 분화능력이 존재하기 때문에 손상된 세포의 치료제로 새로운 가능성을 제시하였다. 현재 줄기세포를 이용하여 319건의 임상 2/3상 시험이 진행 중이며, 긍정적인 치료효과를 보이고, 의약품 품목 허가가 증가하고 있다. 하지만 줄기세포 치료제 생산 시 많은 세포 수가 필요하여 생산단가가 비싸 상용화 단계는 아직 이르다. 본 연구는 바이오리엑터와 마이크로캐리어를 이용한 최적화 공정 개발을 통해 생산의 효율성을 증가시켜 비용 절감의 효과를 가지는 기반 기술을 개발하였다. 소규모에서 초기 주입조건, 배양 교반 조건, 배지 교체 및 추가 마이크로캐리어 주입조건 실험을 통해 증식력이 뛰어난 최적화 공정 조건을 확립하였다. 그 후 바이오리엑터를 이용하여 확립된 공정조건으로 배양을 진행하였다. 결과적으로 5 L 규모에서 배양 9일차에 목표 세포 수인 1 × 109 세포를 확보하였으며, 연속 회수 시스템을 통해 회수율을 50% 이하에서 70% 이상으로 향상시켰다. 본 연구는 줄기세포 치료제 생산에 있어서 경제적이고 자동화된 공정을 제시하였으며, 추후 줄기세포 치료제 상용화 연구의 초석을 마련하였다.

(The) study on Anti-Neuroinflammatory activities of Lycopi Herba extract in BV-2 Microglial Cell

최상규 건국대학교 대학원 2021 국내석사

만약 신경염증이 조절되지 않은 면 알츠하이머 같은 퇴행성 신경 질환의 원인이 되는 신경퇴화, 인지장애, 조직손상을 일으킬 수 있고 기억력에도 영향을 끼친다. 코로나 바이러스로부터 야기되는 사이토 카인 폭풍도 신경염증과 기억력에 연관된다. 소교세포는 중추신경계의 면역세포로 활성화되면 신경세포를 손상시키는 신경독소를 생성한다 또한 손상된 신경세포는 다시 소교세포를 활성화시켜 이 순환이 조절되지 않으면 계속해서 염증이 일어나게 된다. 택란은 예전부터 민간 약으로 쓰여왔으며 최근의 연구에서는 혈관염증 효능과 항산화 효능을 가진것으로 밝혀졌다. 그러나 신경염증에 관한 효능은 밝혀지지 않아 이번 연구를 진행하게 되었다. 택란은 LPS로 자극된 BV-2 소교세포에서 산화질소 생성을 억제하고 iNOS와 COX-2의 발현을 단백질,RNA 레벨 모두에서 감소시켰고, pro-inflammatory cytokine인 IL-6와 TNF-α의 생성도 억제하였다. 더불어 LPS로 인한 MAPKs마커인 p38과 NF-kB마커인IkB-α의 인산화도 감소시켜 항 신경염증 활성을 가진 것을 보여주었다. 또한 scopolamine 동물 모델에서 택란은 기억력 완화 효능을 보여주었는데 water maze 행동실험에서 scopolamine처리군은 물에서 탈출하는데 더 많은 시간이 걸렸으며 택란 처리군은 시간을 많이 단축시켰다. 게다가 쥐의 해마 단백질을 채취 기억력 관련 마커인 p-CREB과 BDNF에 미치는 영향을 확인하였고 택란 처리군에서 두 마커 단백질의 생성이 모두 증가됨을 확인하였다. 반대로 신경염증 마커인 iNOS와 COX-2의 발현을 억제하는 것도 확인하였다. 마지막으로 우리는 택란의 single compound 세 가지를 선택하여 산화질소 생성에의 효능과 세포독성을 확인하였고 세 가지 모두 10μM 농도까지는 독성을 보이지 않음과 택란의 산화질소 생성 억제 효능은 아마 Luteolin이 나타낸 것이라는 결과를 확인하였다. 이 결과들은 택란을 신경염증 치료와 기억력 개선에 응용 가능할 것을 보여주며 택란의 single compound중 신경염증에 효능을 보이는 성분을 찾아내면 치료제로 개발도 가능함을 보여주었다. If neuroinflammation wasn’t controlled, it can cause neurodegeneration, cognitive impairment and tissue damage which cause in various neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s disease. Also it affects memory. COVID-19 induced cytokine storm also related neuroinflammation and memory. Microglia are CNS immune cell. When microglia activated it produce neurotoxic factors and neurotoxic factors damage neuron. In addition, damaged neuron activate microglia. If this roof isn’t controlled, Reactive microgliosis occur and induce inflammation continuously. Lycopus lucidus Turcz (Lycopi Herba :LH) has been used for centuries as an oriental traditional medicine. Recent LH studies show LH can inhibit vascular inflammation and has antioxidant activity. (Yun Jung et al. Vascular Pharmacology 48 (2008) 38–46: Yue-hong et al. Food Chemistry 183 (2015) 91–100) However, the anti-neuroinflammatory action of LH has not been well examined. LH showed anti-neruroinflammatory activity in reducing NO production of LPS stimulated BV-2 microglia, attenuating iNOS and COX-2 expression in LPS-stimulated BV-2 microglia both protein and RNA levels. (Western blot and RT-PCR) Also LH inhibited the production of pro-inflammatory cytokines (IL-6 and TNF-α) and suppressed LPS-induced phosphorylation of p38 which is MAPKs marker and IkB-α in BV-2 microglia. In addition, LH exhibited memory alleviating activity in scopolamine animal model. In water maze, scopolamine treated group mice took more time to escape in the water. However, LH treated group mice took less time. Also mice’s hippocampus protein used to check memory related marker p-CREB and BDNF. p-CREB and BDNF expression raise up in LH treated group and neuroinflammation marker iNOS and COX-2 production reduced. Finally, we choose three single compound of LH and checked their effect of NO production and cell cytotoxicity. Anti NO production activity of LH may come from Luteolin and all compounds didn’t show cell cytotoxicity till 10μM. These results showed we can apply Lycopi Herba to anti-neuroinflammation and alleviating memory. Also, if we find out LH’s single compound which has anti-neuroinflammation activity we can develop drug for neuroinflammation.

Inhibition effect of Lycopi herba ethanol extract on melanin synthesis via suppression of MITF expression

고은애 건국대학교 대학원 2021 국내석사

Melanogenesis is a biological process of the synthesis of melanin pigments and it occurred in melanocytes, which are specialized melanin-producing cells. Melanin is regulated by tyrosinase key an enzyme of production. It plays an important role in skin protection from ultraviolet (UV) light and gives hair or eye colors include skin. However, the overproduction of melanin causes various skin diseases, such as melasma, reckless, sunspot. A previous study verified that L. Herba has antioxidant, anti-diabetic nephropathy, anti-allergic effects. In this study, we investigated the effects of L. Herba extract on anti-melanin production and its mechanisms in B16F1 mouse melanoma cells. The results verified that L. Herba could suppress melanin synthesis-related enzymes, such as tyrosinase but it had not to effect on tyrosinase-related protein 1(TRP-1) and tyrosinase-related protein 2 (TRP-2). L. Herba also suppressed microphthalmia-associated transcription factor (MITF) via protein kinase A (PKA)/cAMP-response binding protein (CREB) signaling pathway. L. Herba strongly suppressed the microphthalmia-associated transcription factor (MITF) as a master regulator of melanin production. These results indicate that L. Herba has an anti-melanogenic effect and could use a whitening agent. 멜라닌 생합성 과정은 멜라닌 색소의 생물학적 합성 과정이고 이는 멜라닌을 생성하는 특수화된 세포인 멜라닌생성세포에서 일어난다. 멜라닌은 생성에 주된 역할을 하는 효소인 tyrosinase에 의해 조절된다. 멜라닌은 자외선(UV)으로부터 피부를 보호하며, 피부를 포함한 머리카락, 눈의 색을 결정하는 중요한 역할을 수행한다. 그러나, 과도하게 생성된 멜라닌은 기미, 주근깨, 흑점과 같은 피부질환을 유발하게 된다. 본 연구에서는, 택란 에탄올 추출물의 멜라닌 생성 억제 효능과 그 기작을 B16F1 mouse melanoma 세포에서 확인하였다. 연구의 결과를 통하여 택란추출물이 멜라닌 합성에 관련이 있는 tyrosinase의 발현을 농도의존적으로 억제하는 효능을 확인하였다. 또한, 택란 추출물이 tyrosinase-related protein 1 (TRP-1), tyrosinase-related protein 2 (TRP-2)에는 영향을 미치지 않지만 protein kinase A (PKA)/cAMP-response binding protein (CREB)의 신호 전달 과정을 통해 microphthalmia-associated transcription factor (MITF)의 발현을 유의적으로 억제하는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통하여 택란 추출물은 미백제품 또는 첨가제로 이용될 수 있을 것으로 사료된다.

(The) neuroprotective effect of GPR4 inhibition through attenuation of caspase mediated apoptotic cell death in neurotoxin induced in vitro and in vivo model of Parkinson's disease

Ezazul Haque, Md 건국대학교 대학원 2021 국내박사

미토콘드리아 전달을 이용한 자연 살해 세포의 활성 향상

김성훈 차의과학대학교 일반대학원 2021 국내석사

자연 살해(NK, natural killer) 세포는 암을 방어하기 위한 선천성 면역세포이다. 기존 항암제의 한계를 극복한 NK 세포치료제는 고활성 NK 세포의 대량 확보를 통해 항암치료로 사용할 수 있다. 최근 암 조직 내에서 NK 세포의 미토콘드리아 손상으로 인한 암세포 살상 효과의 저하가 보고되었다. 따라서 본 연구는 외래 미토콘드리아 전달이 NK 세포의 살상 효과를 강화하는지 검증하고자 하였다. 세포에서 분리한 미토콘드리아를 NK-92MI에 전달하여, 에너지 생성 능력의 변화를 분석하였다. 또한, 외래 미토콘드리아 전달에 따른 증식과 세포독성 능력의 변화를 확인하였다. 외래 미토콘드리아가 전달된 NK-92MI의 ATP 생성능이 농도에 비례하여 최대 76% 증가하였다. NK-92MI의 증식은 농도 비례하여 최대 113% 증가하였으며, 암세포 K562의 살상 효과가 최대 104% 증가하였다. 요약하면, 외래 미토콘드리아 전달은 에너지 생성을 향상시켜 NK 세포의 증식과 세포독성 능력을 강화하였다. 이는 미토콘드리아 전달이 항암면역세포치료제 효과를 강화시키는 방법으로 응용될 수 있음을 보여주었다.

Neuroendocrine signaling mechanisms in stress-induced hair loss : The roles of Corticotropin releasing hormone (CRH) and Substance P (SP) in human hair follicles and its cells

남유진 차의과학대학교 대학원 2017 국내석사

최근, 탈모를 포함한 피부 질환들이 스트레스 호르몬 또는 신경내분비 신호에 의해 일어난다는 보고들이 증가되고 있는 추세이다. 대표적인 스트레스 호르몬인 Corticotropin-releasing hormone (CRH)은 시상하부-뇌하수체-부신피질 축 (HPA axis)을 통해 중심적인 스트레스 반응을 규제하는 중요한 역할을 하고 있다. 뿐만 아니라 Substance P (SP) 또한 신체의 스트레스 반응을 매개한다. 이전의 보고에 따르면 CRH 또는 SP는 모낭 내부에서 세포 사멸은 증가시키고, 증식은 억제시킴으로써 모낭의 길이 성장을 억제시킨다는 연구 결과가 있다. 이처럼 스트레스성 탈모에서 CRH 또는 SP의 중요성에 대해서는 많이 보고되고 있지만 세포 수준에서의 자세한 작용기전에 대한 연구는 아직까지 보고된 바 없다. 따라서 본 연구에서는 CRH 또는 SP가 인체 모낭과 그것의 주요 구성 세포에 미치는 영향을 알아보고 천연물로부터 얻어진 물질이 CRH의 영향으로부터 어떻게 보호하는지 연구하고 스트레스성 탈모 개선 소재로써의 효능을 평가하고자 하였다. CRH와 SP 모두 인체 모낭 조직의 성장을 억제시키고 퇴행기로의 전이를 촉진시켰다. 인체 모낭의 중요한 구성 세포인 모유두세포 (dermal papilla cell, DPC)에서의 영향을 보았을 때, CRH는 세포의 증식을 억제시키고 성장기 관련 마커들의 발현을 감소시켰다. 흥미롭게도, CRH에 의해 POMC, ACTH, cortisol 수치가 증가하는 것을 발견함으로써 모유두세포 단독으로도 충분한 HPA axis가 존재한다는 가능성을 확인하였다. 백두옹 (Pulsatilla chinensis Regel)으로부터 분리된 CRH 수용체 길항제는 CRH에 의한 손상들을 모낭과 모유두세포에서 모두 회복시켜주는 것이 관찰되었다. 또한, SP도 모유두세포의 성장기 관련 마커들의 발현을 조절하였고, 특히, 외모근초세포 (Outer root sheath cell)의 세포 사멸을 유도하였다. 놀랍게도, CRH와 SP는 서로의 수용체 발현을 자극시키는 현상이 관찰되었다. 이러한 결과들을 종합해볼 때, CRH와 SP는 스트레스성 탈모에서 중요한 역할을 하는 인자로 여겨지며, 따라서 각각의 수용체의 길항제는 스트레스성 탈모 치료를 위한 개선소재로써의 사용이 가능할 것으로 생각된다. There is a growing interest in the relationship between stress hormones, neuroendocrine signaling, and skin diseases, including hair loss. Corticotropin-releasing hormone (CRH) plays an essential role in regulation of central and local stress responses along the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis. Substance P (SP) is also an important mediator of an acute local and systemic stress responses. Previous study showed CRH or SP inhibited hair growth and induced regression phase (catagen) through regulation of proliferation and apoptosis in hair organ culture system. However, it is not well understood how CRH and SP act on the cells in hair follicle. The aim of this study is to investigate the effect of CRH and SP on human hair follicles and its cells. In addition, this study is concerned with searching for a CRH receptor antagonist from a library of natural compounds. Both CRH and SP inhibited hair elongation and induced early catagen transition in ex vivo hair organ culture model. In cultured human dermal papilla cells (DPC), CRH suppressed the proliferation and down-regulated the levels of hair growth-related cytokines. A fully functional HPA axis was demonstrated in cultured hDPCs based on the finding that CRH induced POMC, ACTH, and cortisol expression. CRH receptor antagonists, isolated from Pulsatilla chinensis Regel, restored the CRH-induced modulations in hDPCs. SP modulated the expression of the hair growth-related cytokines in hDPCs, and induced apoptosis in human outer root sheath (ORS) cells. Interestingly, expression of CRH receptors (CRHRs) were increased by SP treatment in cultured hDPCs. Likewise, treatment of CRH induced the expression of NK1, a SP receptor, indicating hormonal and neurogenic stresses may act synergistically to induce hair loss. These results indicated that both CRH and SP play important role in stress-induced hair loss. Thus, CRH receptor antagonist and/or NK1 antagonist could be a clinical approach for the stress-induced hair loss treatment.

과일 유래 세포외소포체의 외인성 피부노화 개선 효과

황진우 차의과학대학교 일반대학원 2023 국내석사

피부는 신체 중에서 가장 많은 비중을 차지하는 인체 기관이며, 자외선, 미 세먼지, 독성물질 등 해로운 외부 스트레스가 체내로 들어오는 것을 막아주 는 역할을 한다. 하지만 이러한 외부 스트레스로부터 우리 몸을 보호하는 과정에서 외인성 노화가 발생하게 되고, 발생한 외인성 노화는 피부의 기능을 약화시킬 뿐만 아니라, 검버섯, 피부암 등의 다양한 피부질환까지 유발하게 된다. 이러한 문 제점을 사전에 막기 위해 피부노화 전 단계에서 피부를 관리하는 것에 대한 중요성이 지속적으로 부각되어 왔고, 외인성 스트레스로 인한 노화를 방지할 수 있는 피부재생 효능을 지닌 다양한 소재들에 대한 많은 연구들이 진행되 고 있다. 그중에는 식물과 같은 천연물 유래 추출물을 이용한 연구 개발도 진행되고 있으나, 천연물 유래 성분이 피부 진피층까지 흡수되지 못하고, 성 분 자체의 불안정성으로 인한 한계점으로 인해 천연물이 지닌 수많은 장점 에도 불구하고 여전히 활용도가 떨어지고 있는 것이 사실이다. 최근 이러한 문제점들을 개선할 수 있는 방안으로 안정성은 물론이고 피부 침투력/흡수력까지 높일 수 있는 세포외 소포체 (Extracellular Vesicles, EVs)를 전달체로서 활용하는 것이 각광을 받고 있다. 세포외소포체는 세포 간 통신을 위해 세포로부터 방출되는 나노 크기의 소포체로 체내의 다양한 장벽을 원활하게 통과할 수 있는 장점이 있으며, 이중 지질 막 구조를 통해 내부의 RNA, 단백질을 포함한 다양한 유효 물질을 안정적으로 보관/보호할 - viii - 수 있다는 장점을 지닌다. 이러한 장점을 지닌 세포외 소포체를 대량 생산하여 활용하기 위한 노력들 이 계속되고 있고, 대량의 생산력을 위해 다양한 인간 세포 및 조직으로부터 세포외 소포체를 얻고자 하는 시도가 이루어지고 있으나, 세포가 분비하는 세포외 소포체의 생산률은 여전히 매우 낮은 편 (고효율의 생산 프로토콜을 확립하더라도 세포외 소포체를 생산할 수 있는 모세포/모조직의 수요가 불 충분함)이며 생산한 세포외 소포체의 활용에 있어서도 안전성/안정성에 대 한 우려가 여전히 존재하고 있다. 이를 개선하기 위해 최근에는 새로운 방법 으로서 식물/과일 유래 세포외 소포체를 활용하는 연구가 활발히 진행 중인 데, 과일유래 세포외 소포체는 배양과정 없이 대량 생산이 가능하며 활용도 에 있어서도 과일/식물로부터 추출하였기에 보다 안전하다는 장점을 지닌다. 이에 우리는 실제로 과일 유래 세포외 소포체가 동물 유래 세포외 소포체를 대체하여 피부 노화 치료제/예방제로 사용할 수 있는지 확인하기 위하여 피 부재생 및 항노화 효능을 검증하였다. 과일 유래 세포외 소포체의 효능 검증을 위해 과일 유래 세포외 소포체를 분 리하고, 그 특성을 분석하였으며, 과일 유래 세포외 소포체 내에 존재하는 miRNA를 분석하여 피부 재생 효능을 나타낼 수 있을지 분석하였다. 또한 과일 유래 세포외 소포체가 실제로 세포 내부로 흡수되어 유효 인자들을 전 달할 수 있는지 검증하고, 마지막으로 miRNA 분석 결과를 실험적 방법을 통해 검증하였다. 연구 결과들을 토대로, 과일 유래 세포외 소포체의 피부 재생 치료제로서의 가능성을 확인할 수 있었고, 과일 유래 세포외 소포체 분리 방법 확립부터 효능 평가 시스템 구축 및 효능 검증 결과 확인을 통해 우리가 개발한 과일 유래 세포외 소포체가 추후 동물 유래 세포외 소포체 기반 치료제 시장을 대- ix - 신할 수 있는 새로운 세포외 소포체 대체체로서의 마중물이 될 수 있을 것으 로 기대한다. The skin is the largest organ of the body and has three layers, the epidermis, the dermis and the subcutaneous layer. The skin is exposed daily to internal and external stressors including micro-organisms, radiation and chemicals. External stressors lead to aged phenotype with wrinkling, sagging, thinning of the epidermis, dry skin, and reduced barrier integrity as well as cause skin diseases such as skin cancer. Therefore, it is important to protect of skin from stressors in the pre-aging stage. Many studies report that the effect of natural phytochemicals is capable of reducing skin aging or wrinkling. Plant extracts rich in phytochemicals, such as flavonoids, phenolic acids, saponins, and alkaloids are being investigated in the development of anti-skin-aging products due to their potential to promote cell proliferation and - 64 - collagen synthesis. However, phytochemicals have limitations in that they do not penetrate into the dermal layer of the skin and are unstable. Recently, extracellular vesicles (EVs) are considered one of the most attractive approaches for anti-skin-aging. EVs are nano-sized vesicles released from cells for cell-to-cell communication, and have the advantage of passing through various barriers in the body. In addition, the extracellular endoplasmic reticulum can stably protect various effective substances including RNA and protein inside through the double lipid membrane structure. Despite their promising potential, the application of EVs for skin-anti-aging is still limited due to insufficient amounts of EV isolation from mammalian cells or human body fluids. Fruit-derived EVs have the opportunity of separating from large volumes and, drive cell-cell communication, even between different organisms and species. The purpose and hypothesis of this study are to verify whether fruit-derived EVs replace mammalian cell-derived EVs to have effects on skin regeneration and anti-aging. To verify the hypothesis, the following procedure was carried out. 1) Fruit-derived EVs were isolated and their characteristics were analyzed, and 2) miRNAs present in fruit-derived EVs were identified and examined for the effect of skin regeneration. 3) In addition, we verified that fruit-derived EVs could actually deliver their biomolecules into target cells. 4) Finally, based on the miRNA analysis results, experimental verification for the effect of skin-anti-aging was performed in in-vitro. In this study, the possibility of fruit-derived EVs as a therapeutic source of skin regeneration was evidenced, and fruit-derived EVs are expected that it will become a new platform to lead the EV-based treatment market in the future

Corticotropin releasing hormone에 의한 인체 모낭 손상에서 산화 스트레스의 역할

남유진 차의과학대학교 일반대학원 2020 국내박사

스트레스는 탈모와 같은 피부질환의 주요 원인으로 알려져 있다. 스트레스에 대한 호르몬 반응은 corticotropin releasing hormone (CRH), adrenocorticotropic hormone (ACTH), cortisol 과 같은 호르몬으로 구성된 시상하부-뇌하수체-부신피질 축 (HPA axis)으로 인해 일어난다. 뿐만 아니라 다양한 스트레스 환경으로 생성된 활성산소종 (ROS)의 과축적은 세포의 사멸 혹은 노화를 유도한다. 대표적인 스트레스 호르몬인 CRH는 모발의 성장을 억제하고 탈모를 유도한다는 보고가 많이 있지만 세포 수준에서의 작용기전은 명확하지 않다. 따라서 본 연구에서는 CRH에 의해 유도된 인체 모낭 손상에서 산화스트레스의 역할을 알아보고 인체 모낭과 그것의 구성세포에서 스트레스 환경으로 인한 항산화 방어 체계 변화에 대해서 평가하고자 하였다. 또한 백두옹 (Pulsatilla chinensis)으로부터 분리된 CRH 수용체 길항제의 보호효과에 대하여 알아보았다. 그 결과, 모낭의 구성 세포인 모유두세포 (dermal papilla cell, DPC)와 외모근초세포 (outer root sheath cells, ORSCs)에서 CRH와 CRH 수용체가 발현되며 CRH에 대해 반응하였다. CRH는 활성산소종의 과축적을 유도하며 G2/M기의 세포주기 억류 (cell cycle arrest)를 통하여 모유두세포의 증식을 억제시켰다. 또한 CRH가 처리된 모유두세포에서 성장기 관련 마커들의 발현을 감소시켰다. 흥미롭게도 CRH에 의해 POMC, ACTH, cortisol의 수치가 증가되며 이는 CRH 수용체 길항제에 의해 회복되었다. 게다가, 세포내에서 산화손상을 조절해주는 transcription factor인 Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (Nrf2)와 그것의 downstream인 Heme oxygenase 1 (HO1), NAD(P)H dehydrogenase quinone 1 (NQO1)의 발현이 CRH를 처리하였을 때 증가되었다. 백두옹으로부터 분리된 CRH 수용체의 길항제는 모낭과 모유두세포에서 위와 같은 CRH에 의한 변화를 회복시켰다. 이러한 결과들을 종합해볼 때, 모유두세포에 완전한 HPA axis가 존재하고 스트레스 환경에서 CRH는 모낭과 모유두세포에 산화손상을 일으키며 직접적으로 영향을 미친다. 또한 CRH 수용체의 길항제는 스트레스성 탈모 치료를 위한 개선소재로써 사용이 가능할 것으로 생각된다. Stress is an important cause of skin disease including hair loss. The hormonal response to stress is due to the HPA axis, which comprises hormones such as corticotropin releasing hormone (CRH), adrenocorticotropic hormone (ACTH), and cortisol. In addition, hyperaccumulation of reactive oxygen species (ROS) produced by various stress environments is known to induce apoptosis or aging of cells. Accumulated reports have shown that CRH, a crucial stress hormone, inhibits hair growth and induces hair loss. However, the underlying mechanisms are still unclear. The aim of this study was to examine the role of oxidative stress in CRH-induced hair follicle damage and identified the changes of antioxidant defense system in stress environments on human hair follicle and its cells. Also, the protective effect of CRH receptor antagonists from Pulsatilla chinensis (P. chinensis) was investigated on human hair follicles and human dermal papilla cells (DPCs) in vitro. As a result, hair follicle cells, both human DPCs and human outer root sheath cells (ORSCs), expressed CRH and its receptors and responded to CRH. CRH inhibited the proliferation of human DPCs through at G2/M phase and induced the accumulation of ROS. Anagen-related marker levels were downregulated in CRH-treated human DPCs. Interestingly, increases in proopiomelanocortin (POMC), ACTH, and cortisol were induced by CRH in human DPCs, and antagonists for the CRH receptor blocked the effects of this hormone. Moreover, Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (Nrf2), cellular oxidant regulator, expression levels were increased by CRH treatment in cultured human DPCs. And also, both Hemeoxygenase 1 (HO1) and NAD(P)Hdehydrogenase 1 (NQO1) expression levels were upregulated. Remarkably, CRH receptor antagonists isolated from P. chinensis reversed these CRH-induced modulations in both ex vivo hair follicles and cultured human DPCs. The results of this study showed that a fully functional HPA axis exists in human DPCs and that CRH induce oxidative damages in human DPCs. Also, CRH directly affects human DPCs as well as human hair follicles under stress conditions. Additionally, P. chinensis effectively blocks CRH receptor function and that saponin derivatives from P. chinensis could be a pharmaceutical and cosmetic approach to treat stress-induced hair loss.