Waller 변성 동안 세포 외 삼인산 아데노신이 생체 밖 슈반세포에서 일어나는 탈분화와 세포증식에 미치는 영향

신연호 경희대학교 일반대학원 2014 국내석사

After nerve injury, Schwann cells proliferate and revert to a phenotype that supports nerve regeneration. Phenotype-changing process can be viewed as Schwann cell dedifferentiation. Here, we invesrigated the role of extracellular adenosine triphosphate (ATP) in Schwann cell dedifferentiation and proliferation during Wallerian degeneration. Using the several markers of Schwann cell dedifferentiation and proliferation in sciatic nerve explants, we found that extracellular ATP inhibits Schwann cell dedifferentiation and proliferation during Wallerian degeneration. Furthermore, the blockage of lysosomal exocytosis in ATP-treated sciatic explants is sufficient to induce Schwann cell dedifferentiation. Together, these findings suggest that ATP-induced lysosomal exocytosis may be involved in Schwann cell dedifferentiation.

Biomarker development for nephrotic syndrome

최영욱 경희대학교 일반대학원 2015 국내박사

Part 1 소변 단백체학을 이용한 바이오마커 연구는 신장 질환의 병태생리와 감별 진단법 개발에 활발히 이용되고 있다. 단백뇨를 특징으로 하는 신증후군을 임상에서 진단하기 위해선 조직검사가 필수적이다. 본 연구에서는 신증후군의 대표질환인 MCD, MGN, FSGS는 발병 및 손상 기전에 따라 소변 단백체의 profile이 다를 것이라 가정하고, 단백체학 분석법을 이용하여 각 신증후군 질병특이적 단백질 바이오마커를 발굴하고자 하였다. 신증후군 소변 단백체 profile 분석을 위해 신증후군 환자 12명 (MCD, MGN, FSGS 각각 4명)과 정상 대조군 4명의 소변을 사용하였다. 소변 단백질 농축을 위해 10 kda 한외여과막을 이용하였고, 농축된 소변내의 다량 존재하는 대표적인 17개의 혈장 단백질을 MARCS를 사용하여 제거한 후 in gel digestion을 통해 펩타이드를 획득하여 LC-MS/MS로 분석하여 단백질을 동정하였다. 동정된 단백질은 clustering과 t-test를 통해 바이오마커 후보 단백질을 선별하였고 후보 단백질은 western blot으로 확인하였다. 바이오마커의 검증을 위해 신증후군 환자 55명 (MCD 14명, MGN 36명, FSGS 5명) 비신증후군 환자 9명 (IgAN 9명), 정상 대조군 8명의 소변을 검증군으로 사용하여 5개의 후보 바이오마커를 ELISA를 이용하여 측정하였다. 본 연구에서는 LC-MS/MS를 활용하여 신증후군 환자의 소변에서 209개의 단백질을 동정하였다. Clustering 분석과 t-test를 통해 MCD, MGN, FSGS 특이적 발현 양상을 발견하였고, 19개의 바이오마커 후보 단백질을 선정하였다. 바이오마커 후보 단백질 중 감별 진단의 예측력이 높은 상위 5개의 단백질을 표적으로 Western blot을 통해 검증한 결과 LC-MS/MS 데이터와 일치하는 것을 확인하였다. 또한 확인 된 5개의 바이오마커를 검증군에서 ELISA 검증결과 신증후군을 질환별로 구별하는데 있어 유의적으로 높은 민감도와 특이도를 보였다. 신증후군 환자의 소변 단백체 분석은 질병 특이 바이오마커 발굴에 유용하게 활용될 수 있다. 추후, 임상 적용을 위해 위 5개의 바이오마커의 유용성에 대한 대단위 임상연구를 통한 검증이 필요할 것으로 사료된다. Part 2 원발성 막성신증은 사구체의 단백질을 자가항원으로 인식해 자가항체가 발생하여 신장이 손상되는 자가면역 질환으로 진단하기 위해선 조직검사가 필수적이다. 자가면역 항체를 대단위로 분석할 수 있는 단백질 칩이 개발되면서 다양한 자가면역질환연구에 이용되고 있다. 본 연구에서는 정상 대조군과 원발성 막성신증의 자가항체 profile이 다를 것이라 가정하고, protoarray 분석법을 이용하여 막성신증 특이적 자가항체 바이오마커를 발굴하고자 하였다. 원발성 막성신증 자가항체 profile 분석을 위해 원발성 막성신증 환자 14명과 정상 대조군 6명의 혈청을 사용하였다. 본 연구에서는 protoarray를 이용하여 정상 대조군과 원발성 막성신증군의 혈청에서 자가항체 profile을 비교하였다. Clustering 분석과 t-test를 통해 정상 대조군과 원발성 막성신증을 구별하는 특이적 양상을 발견하였고, 35개의 바이오마커 후보 자가항체를 선정하였다. 바이오마커 후보 자가항체 중 원발성 막성신증환자군에서 발현이 높은 상위 4개를 이용하여 ROC curve를 분석해 본 결과 정상 대조군과 원발성 막성신증군을 구별하는데 있어 유의적으로 높은 민감도와 특이도를 보였다. 원발성 막성신증 환자의 단백질 마이크로어레이를 이용한 자가항체 분석은 질병 특이 바이오마커 발굴에 유용하게 활용될 수 있다. 추후, 임상 적용을 위해 위 4개의 바이오마커의 유용성에 대한 대단위 임상연구를 통한 검증이 필요할 것으로 사료된다.

Non-polar fractions of Myxobacteria KYC4048 metabolites induce cell death via suppression of Wnt/β-catenin signaling in MCF-7 breast cancer cells

박주하 경희대학교 대학원 2021 국내석사

Wnt/β-catenin signaling pathway is abnormally regulated in breast cancer and inhibition of Wnt signaling could be a promising target for breast cancer chemotherapy. KYC4048 is a myxobacterial strain belonging to Myxococcus fulvus. Such myxobacteria produce a variety of bioactive secondary metabolites. In a previous study, KYC4048 metabolites were found to exhibit anticancer effects in MCF-7 breast cancer cells. However, it has not been studied which substances exhibit anti-cancer effects in KYC048 metabolites, and the molecular mechanism is nuclear. Therefore, in this study, the KYC4048 metabolites were divided into three fractions to discover substances that exhibit anti-cancer effects, and the molecular mechanism was investigated. The non-polar fractions (ethyl acetate and hexane) of KYC4048 metabolites induced cell death in MCF-7 breast cancer cells, and decreased the expression of WNT2B, p-GSK-3β and β-catenin as well as Wnt target genes (c-Myc and cyclin D1). In additionally, it was confirmed that the inhibitory effect of Wnt signaling by the hexane fraction was attenuated by using LiCl and the hexane fraction showed the most effective cell cycle arrest. We conclude that the non-polar fractions of KYC4048 metabolites exert anti-cancer effect via inhibition of Wnt/β-catenin pathway in breast cancer cells. Thus, our findings suggest that the non-polar fractions of KYC4048 metabolites can be served as a potential remedy for breast cancer. Wnt/β-catenin 신호전달 경로는 유방암에서 비정상적으로 조절되어 있으며 Wnt 신호전달을 억제하는 것은 유방암 화학요법에 유망한 표적이 될 수 있다. KYC4048은 Myxococcus fulvus에 속하는 점액세균 균주로, 점액세균은 다양한 이차 생리활성 대사산물을 생산한다. 이전 연구에서, KYC4048 대사물질이 MCF-7 유방암세포에서 항암효과가 있음을 확인하였다. 그러나 KYC4048 대사물질에서 어떤 물질이 항암효과를 나타내는지 연구된 바가 없고 분자적 메커니즘도 불분명하다. 따라서 본 연구에서는 KYC4048 대사물질에서 항암효과를 나타내는 물질을 탐색하기 위해 3개의 분획으로 나누었고, 분자적 메커니즘을 조사하였다. 비극성 분획 (ethyl acetate, hexane) 들은 WNT2B, p-GSK-3β, β-catenin 뿐만 아니라 Wnt 타겟 유전자(c-Myc, Cyclin D1)의 발현을 감소시킴으로써 MCF-7 유방암 세포에서 세포사멸을 유도하였다. 또한 LiCl을 사용하여 hexane 분획에 의한 Wnt 신호 전달 억제 효과가 약화됨을 확인하였고, hexane 분획은 가장 효과적으로 세포주기 정지를 유도하였다. 따라서 KYC4048 대사물질의 비극성 분획들은 Wnt/β-catenin 경로를 억제함으로써 항암효과를 나타내고 유방암을 위한 잠재적 치료제로 사용될 수 있음을 제시한다.

신장세포인 SV40에서 실리마린이 세포 보호적 효과를 나타냄으로써 유도하는 Heme Oxygenase-1의 발현 유도에 관한 연구

전세은 경희대학교 대학원 2020 국내석사

실리마린은 서양엉겅퀴인 Silybum marianum 이라는 식물의 씨앗에서 추출된 물질로, 플라보노이드의 한 종류이다. 실리마린에 대한 연구는 지속되어왔기 때문에 실리마린에 대한 항산화, 항 염증, 항 당뇨, 항세포자멸등의 효과가 알려져 있으며 다양한 조직에서의 연구가 진행중이다. 항산화, 항 세포 자멸 등의 효과를 가지고 있는 heme oxygenase-1 (HO-1)은 HO-1에 의한 부산물도 또한 세포보호효과를 나타낸다고 보고되어 있다. 따라서 이번 실험에서는 실리마린이 신장세포에서 HO-1을 유도하여 세포를 보호할 것이라고 가정하였고 실험 결과 실리마린은 신장세포에서 Akt/Nrf2/ARE 경로를 거쳐 HO-1의 발현을 유도하며, 프리 라디칼 소거, 세포사멸 억제를 통하여 세포 보호효과를 냄을 확인하였다. 따라서 실리마린이 신장 질환과 신장 세포의 손상에 도움을 줄 수 있을 것으로 예상된다. Silymarin is a material derived from the seed of a plant called silybum marianum and it is a type of flavonoid. Because it has been studied ongoing, its several effects like antioxidant, anti-inflammatory, anti-apoptotic are well-known. People are using it to do research in diverse tissues and organs. Heme oxygenase-1 (HO-1), known for antioxidant and anti-apoptotic is reported that not only HO-1 but also carbon monoxide and iron, which are byproducts of HO-1 have cytoprotective effects. Thus, we hypothesize that silymarin induces HO-1 expression in SV40 kidney cells to protect cell. In this study, we confirmed induction of HO-1 expression is carried out silymarin through Akt/Nrf2/ARE pathway. Also we showed silymarin has cytoprotective effects by scavenging ROS and inhibiting cell death. In conclusion, silymarin expected to help with kidney diseases and kidney cell damage.

세포사멸 유도인자의 방출을 매개로 하는 mHGTD-P 의 저산소증 신경세포 죽음에 관한 연구

조영은 경희대학교 대학원 2008 국내석사

HGTD-P is a pro-apoptotic target protein of hypoxia-inducible factor 1α (HIF-1α). It localizes to mitochondria and induces the mitochondrial permeability transition through its interaction with voltage dependent anion channels when overexpressed. However, the molecular mechanisms responsible for its induction and its downstream effector molecules required during cell death, especially in neuronal cell death by hypoxia, are largely unknown. We performed this work to elucidate the effects of the pro-apoptotic protein HGTD-P on neuronal cell death induced by hypoxia and to investigate the cell death mechanisms activated during this process. In this report, we show that mouse HGTD-P (mHGTD-P) is transcriptionally increased by hypoxia and that its overexpression triggers neuronal cell death with affected cells displaying shrunken cytoplasm and condensed pyknotic nuclei in a caspase-independent manner. In addition, suppression of endogenous mHGTD-P expression by siRNA rescues neuronal cells from hypoxic injury. Finally, we show that mHGTD-P induces the mitochondrial release of apoptosis-inducing factor into the cytoplasm. Taken together, our data suggest that mHGTD-P participates in caspase-independent hypoxic neuronal cell death. HGTD-P 는 HIF-1α 의 세포사멸 유도 목적 단백질이며, 미토콘드리아에 위치하고, 과발현시 HIF-1α 와 상호작용에 따라 전압의존 이온채널을 통해 미토콘드리아 투과성 변이를 유도한다. 그러나, 특히 저산소증에 의한 세포의 죽음에서 세포가 죽는동안 HGTD-P 의 유도와 하류의 영향 분자들이 요구되는 원인 분자 기전들은 크게 알려져 있지 않다. 이 연구에서 우리는 저산소증에 의해 유도된 신경세포의 죽음에서 세포사멸 유도 단백질인 HGTD-P 의 영향을 보았고, 이 과정동안 세포의 죽음의 기전을 연구 하였다. HGTD-P (mHGTD-P) 과발현된 세포는 자가세포사멸이 증가되었으며 세포사멸을 caspase 에 독립적 양상을 보였다. 또한 siRNA 로 내인성 mHGTD-P 의 발현을 억제하였을때는 저산소성 손상으로부터 세포를 보호하였다. mHGTD-P 는 또한 미토콘드리아에서 세포질로 apoptosis-inducing factor(AIF)의 방출을 유도하였다. 본 논문에서 mHGTD-P 는 caspase 에 독립적인 방법으로 저산소성 세포 사멸을 유도함을 보여주고 있으며, 이는 신경세포는 비신경세포와는 다른 다양한 세포사멸기전이 존재함을 시사하는 연구결과이다.

Regulation mechanisms and functional importance of induction of heme oxygenase-1 (HO-1) expression

이승은 경희대학교 대학원 2012 국내박사

Heme oxygenase-1 (HO-1) catalyzes the rate-limiting step in heme catabolism to generate ferrous iron, carbon monoxide (CO), and biliverdin. Induction of HO-1 provides an inducible defense mechanism that confers cytoprotection in response to a variety of stimuli and plays an important role in the maintenance of homeostasis and stress adaptation, whereas HO-1 deficiency exhibited anemia, endothelial cell damage, tissue iron deposition, and increased inflammatory indices. HO-1 reported that may play crucial roles in cellular protection, such as anti-inflammatory, anti-proliferative, and anti-apoptotic effects. Furthermore, HO-1 has been therapeutically implicated in various diseases including, vascular injury, acute renal injury, hypertension. Recently, several studies have suggested that HO-1 function as a potential therapeutic target in the treatment of vascular disease. HO-1 play vital roles in inhibiting platelet aggregation and smooth muscle cell proliferation in endothelial cells. These evidences indicate that HO-1 may functions as a potent therapeutic target in the vascular system against cardiovascular disease. Herein we attempt to investigate the effect of induction of HO-1 expression and molecular mechanisms for therapeutic approach for vascular disease. In human endothelial cell culture studies, as discussed in Chapter 1, we elucidated the protective effect of induction of HO-1 expression as an anti-apoptotic action, which is an adaptive response against crotonaldehyde, a highly reactive ??, ??-unsaturated aldehyde. In Chapte 2, we determined the effect of fisetin, a natural flavonoid, on HO-1 induction in the hydrogen peroxide-stimulated endothelial cells. Fisetin treatment resulted in significantly increase HO-1 expression via PKC-??-p38 MAPK-Nrf2 pathway that protects against oxidative stress. In Chapter 3, the role of induction of HO-1 expression is examined in RAW 264.7 macrophages. In this Chapter, it is demonstrated that Danshen, a traditional Chinease medicine, has protective effect in oxidative stress-stimulated macrophages through induction of HO-1 expression. Collectively, all of these biochemical studies suggest that the induction of HO-1 expression by a variety of stimuli may provide protection via several pathways in vascular systems. In conclusion, our finding support the view that induction of HO-1 can be promising therapeutic approaches for vascular disease. HO-1의 생체조절: 조절기작과 기능적 중요성 경희대학교 대학원 기초의과학과 이승은 지도교수 박용식 Heme oxygenase-1 (HO-1)은 heme의 산화분해에 의해 동일 양의 ferrous iron, carbon monoxide (CO) 그리고 biliverdin으로 전환되는 과정에서 속도조절효소로 작용한다. HO-1의 발현은 다양한 자극에 반응하는 세포보호 기능으로서의 유도성 보호기작을 제공하고 항상성 유지에서 중요한 역할을 한다. 반면에 HO-1이 결여되면 anemia, endothelial cell damage, tissue iron deposition 그리고 염증반응의 증가등이 나타나게 된다. HO-1은 이미 항염증, 항증식과 항-세포사멸등의 세포보호에서 핵심적인 역할을 한다는 것이 보고되어있다. 게다가, HO-1은 고혈압, 급성신장질환 그리고 혈관질환등의 다양한 질병에 치료적인 가능성이 대두되어왔다. 최근들어, 많은 연구에서 HO-1이 혈관관련 질환의 치료에서 가능성 있는 therapeutic target으로 적용될 수 있음을 보여주었다. HO-1은 혈관내세포에서 smooth muscle cell의 증식과 혈소판 응집의 억제에서 막중한 역할을 한다. 이러한 많은 결과들에 비추어 보아 HO-1이 심혈관계 질환에서 혈관에 작용하여 가능성 있는 therapeutic target으로 작용할 수 있음을 의미한다. 이 논문에서는 HO-1의 발현의 유도에 의한 효과와 분자적인 방법에 대한 연구와 혈관계 질환에 대한 치료적인 접근에 대해 제시하였다. Chapter 1에서 자세하게 기술되는, 사람의 혈관세포를 이용한 연구에서는 highly reactive α, β-unsaturated aldehyde인 crotonaldehyde에 대항하여 유도되는 HO-1의 발현이 항-세포사멸의 작용에 해당하는 세포보호 기작으로 작용한다는 것을 확인하였 81 다. Chapte 2에서는, natural flavonoid중의 하나로 알려진 fisetin의 과산화수소로 자극받은 혈관내피세포에서의 HO-1 발현의 유도체로서의 효과를 증명하였다. Fisetin의 처리는 세포내 산화적 스트레스에 대해 보호기작의 일환으로 PKC-δ-p38 MAPK-Nrf2 pathway를 통해 두드러진 HO-1의 발현 증가를 보여주었다. Chapter 3에서는, RAW 264.7 대식세포에서의 HO-1의 발현 유도의 역할에 대해 알아보았다. 이 Chapter에서는 중국의 전통약물로 알려진 Danshen이 혈관계 구성세포중의 하나인 대식세포에서 세포내 산화적 스트레스에 대해 HO-1의 발현 유도를 통해 보호기작을 가지는 것을 증명하였다. 그러므로 이 모든 생화학적 연구들의 결과를 보면 vascular systems에서 다양한 자극제들이 여러 경로를 통해 HO-1의 발현을 유도하고 이로써 보호기작으로 작용할 수 있음을 시사한다. 결론적으로 본 실험의 결과들은 혈관계 질환의 연구에서 HO-1의 발현 유도가 therapeutic target으로써의 가능성을 제시하였다.

Cyclophilin A regulates JNK/p38-MAPK signaling through its physical interaction with ASK1

김헌성 경희대학교 일반대학원 2015 국내박사

Cyclophilin A (CypA), a member of the immunophilin family, is predominantly localized in the cytoplasm. The peptidylprolyl isomerase (PPIase) activity of CypA has been demonstrated to be involved in diverse cellular processes, including intracellular protein trafficking, mitochondrial function, pre-mRNA processing, and maintenance of multiprotein complex stability. In this study, we have demonstrated that CypA regulates apoptosis signal-regulating kinase 1 (ASK1) through its direct binding. ASK1 is a member of MAPK kinase kinase (MAP3K) family, and selectively activates both JNK and p38 MAPK pathways. Here, we also report that CypA negatively regulates phosphorylation of ASK1 at Ser966, and that CypA reduces ASK1 and its downstream kinases of the JNK and p38 signaling. ASK1 is known to induce caspase-3 activation and apoptosis, and CypA inhibited ASK1-mediated apoptosis by decrease in caspase-3 activity under cellular stress conditions. Overall, we conclude that CypA negatively regulates ASK1 functions by its physical interaction with ASK1

글리실-tRNA-합성효소의 돌연변이에 의해 유발되는 말초신경병증의 신경병증성 통증모델에 관한 연구

이서진 경희대학교 일반대학원 2014 국내석사

Charcot-Marie-Tooth (CMT) disease is the most common inherited motor and sensory neuropathy. Previous studies have found that, according to CMT patients, neuropathic pain is an occasional symptom of CMT. However, neuropathic pain is not considered to be a significant symptom associated with CMT and, as a result, no studies have investigated the pathophysiology underlying neuropathic pain in this disorder. Thus, the first animal model of neuropathic pain was developed by our laboratory using an adenovirus vector system to study neuropathic pain in CMT. To this end, glycyl-tRNA synthetase (GARS) fusion proteins with a FLAG-tag (wild type [WT], L129P and G240R mutants) were expressed in spinal cord and dorsal root ganglion (DRG) neurons using adenovirus vectors. It is known that GARS mutants induce GARS axonopathies, including CMT type 2D (CMT2D) and distal spinal muscular atrophy type V (dSMA-V). Additionally, the morphological phenotypes of neuropathic pain in this animal model of GARS-induced pain were assessed using several possible markers of pain (Iba1, pERK1/2) or a marker of injured neurons (ATF3). These results suggest that this animal model of CMT using an adenovirus may provide information regarding CMT as well as a useful strategy for the treatment of neuropathic pain.

Melandrii Herba extract attenuates RANKL-induced osteoclast differentiation through NFATc1/c-Fos downregulation and prevents bone loss in OVX-induced postmenopausal osteoporosis rats

김민선 경희대학교 대학원 2020 국내석사

Introduction: Osteoporosis is a systemic skeletal disease characterized by reduced bone density, which leads to enhance the risk of fracture. As it is recognized as a public health problem, attention has increased worldwide. Bone homeostasis is associated with maintenance of the balance between bone resorption osteoclasts and bone formation osteoblasts. The increase of the osteoclast numbers and activity can lead to an imbalance of the bone remodeling. These results cause osteoclast-mediated bone diseases such as rheumatoid arthritis, periodontal disease, Paget's disease and osteoporosis. Bisphosphonate and hormone replacement therapy (HRT) with estrogen are one of the most widely used postmenopausal osteoporosis treatments. However, long-term treatment with bisphosphonate is unsuitable in many osteoporosis patients owing to serious side effects. Melandrii Herba (MH), "Wangbulryuhaeng” in Korean, is the dried aerial part from Melandrii Herba Rohrbach, a member of Caryophyllaceae family and has been traditionally used for gynecological conditions. However, the effect of MH on osteoclast differentiation and osteoporosis is yet to be elucidated. Methods: In vitro, RAW 264.7 cells were stimulated with receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL) to induced osteoclast differentiation. To evaluate the effect of MH on osteoclast differentiation, tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) staining, actin ring formation and bone resorption assay were conducted. Also, the RANKL-induced expression of NFATc1 and c-Fos were measured using western blot and RT-PCR. I also studied the effect of MH on osteoclast-related genes. To further investigate the anti-osteoporosis effects of MH in vivo, an OVX-induced menopausal osteoporosis rat model was used in this study. Oral administration of MH was done every morning and all animals were sacrificed at 8 weeks after OVX. Femoral head was scanned by micro-computed tomography (micro-CT). Results: TRAP staining showed that TRAP-positive multinucleated giant cells were inhibited by MH treatment. Consistent with the result of TRAP staining, MH decreased TRAP activity in the differentiation medium. MH treatment reduced the actin ring and bone area in a dose-dependent manner. MH decreased protein and mRNA levels of NFATc1 and c-Fos. MH inhibited the RANKL-induced increase of mRNA levels of osteoclast-specific genes such as matrix metallopeptidase 9 (MMP-9), cathepsin k (CTK), carbonic anhydrase 2 (CA2), tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP), ATPase Htransporting V0 Subunit D2 (ATP6v0d2), dendritic cell-specific transmembrane protein (DC-STAMP), osteoclast-associated receptor (OSCAR), c-Src and B lymphocyte-induced maturation protein-1 (Blimp-1) in a dose-dependent manner. In OVX-induced rat models, oral administration of low dose MH prevented OVX-induced bone loss and improved bone microarchitecture quality. Low dose MH group had a decreased serum levels of alkaline phosphatase (ALP). Conclusion: In summary, MH may contribute to alleviate osteoporosis-like symptoms without side effects of estrogen. These results suggest that MH may have a potential for the prevention and treatment of postmenopausal osteoporosis. Keywords: Osteoclast, RANKL, Melandrii Herba, NFATc1, c-Fos, ovariectomized ABSTRACT IN KOREAN 국문초록 王不留行 물 추출물의 RANKL 유도 파골세포 분화와 난소 절제 흰쥐 골소실에 대한 연구 김민선 경희대학교 대학원 기초한의과학과 지도교수: 이향숙 연구배경 및 목적: 골을 흡수하는 파골세포와 골을 형성하는 조골세포에 의해 유지되는 항상성이 깨지면 다양한 골 질환이 유발되는데 이 중 골다공증은 골 양이 감소하여 골절의 위험이 높아지는 전신 골격질환이다. Bisphosphate 및 hormone replacement therapy (HRT)는 골다공증 치료를 위해 가장 많이 사용되고 있지만 장기간 투여 시, 심각한 부작용이 발생하기 때문에 부작용이 적고 골다공증 예방 및 치료에 효과적인 새로운 치료제 개발이 필요한 실정이다. 왕불유행(王不留行)은 석죽과의 장구채 Melandrium firmum Rohrbach의 열매가 익었을 때의 지상부를 사용하며 여성질환에 주로 사용되어 왔지만 폐경기 골다공증에 대해서는 연구된 바가 없다. 따라서 왕불유행이 파골세포 분화 및 폐경기 골다공증 모델에 미치는 영향을 확인했다. 방법: In vitro실험에서 파골세포 유도제로 알려진 RANKL (100 ng/ml)과 왕불유행 물 추출물을 RAW 264.7 세포에 처리하여 파골세포 분화를 유도한 뒤 tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) 염색을 통하여 왕불유행이 파골세포 분화에 미치는 영향을 확인하였다. 또한, F-actin ring과 pit assay를 통하여 왕불유행이 파골세포 골격 형성 및 골 흡수에 미치는 영향을 확인하였다. 그리고, 파골세포 전사인자인 nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic-1 (NFATc1), c-Fos을 western blot과 reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)을 통하여 단백질과 유전자 발현 농도를 측정하였다. 또한 파골세포 분화관련 유전자들 중 골 흡수와 관련된 유전자인 matrix metallopeptidase 9 (MMP-9), cathepsin K (CTK), carbonic anhydrase II (CA2) 그리고 TRAP의 발현과, 골격형성관련 인자인 ATPase H+ transporting V0 Subunit D2 (ATP6v0d2), dendritic cell-specific transmembrane protein (DC-STAMP)의 발현 그리고 파골세포 분화 보조인자인 OSCAR, c-src 그리고 B lymphocyte-induced maturation protein-1 (Blimp-1)의 발현을 RT-PCR을 통해 유전자의 발현 정도를 측정하였다. In vivo실험에서, Sprague-Dawley 흰쥐의 난소를 적출하여 폐경기 골다공증 유사 모델을 이용하여 왕불유행 물 추출물을 8주간 투약 후, 대퇴골을 채취하여 micro-computed tomography (micro-CT)을 촬영했다. 골 형성지표에서 왕불유행이 미치는 영향을 확인하기 위해 혈청 내 골 형성지표인 alkaline phosphatase (ALP)를 측정했다. 결과: In vitro 에서 왕불유행 물 추출물은 다핵의 파골세포의 크기 및 숫자 그리고 활성을 억제하였으며, 파골세포 분화에 있어 필수적인 F-actin ring 형성과 osteo-coated plate에서의 골 흡수능을 억제하였다. 왕불유행 물 추출물은 파골세포 분화의 필수 전사인자인 NFATc1과 c-Fos의 단백질 및 유전자 발현을 모두 억제하였다. 또한, 왕불유행 물 추출물은 파골세포 분화 관련 유전자 중 골 흡수관련 인자인 MMP-9, CTK, CA2 그리고 TRAP의 발현을 억제하였고, 파골세포 골격형성관련 인자인 ATP6v0d2와 DC-STAMP, 파골세포 분화 보조인자인 OSCAR, c-Src 그리고 Blimp-1의 발현을 모두 억제하였다. In vivo 에서 왕불유행 저농도 투약군은 폐경기 유사 골다공증 모델에서 난소를 적출한 대조군에 비해 골밀도를 유의하게 증가시켰으며, 혈청 내 ALP의 발현 또한 난소를 적출한 대조군에 비해 왕불유행 저농도 투약군이 유의하게 억제시켰다. 결론: 왕불유행은 골다공증 유사 증상을 완화시키는데 기여할 수 있으며, 이러한 결과는 골다공증 예방 및 치료를 위한 치료제로서의 가능성을 시사한다.

마우스 모델을 이용한 심전도에 영향을 미치는 유전자 발굴

김명준 경희대학교 일반대학원 2015 국내석사

심전도는 심장의 전기 전도를 측정하고 심장의 기능 장애를 판단하기 쉬운 효과적인 방법 중 하나이다. 그래서 여러 가지 심장질환들을 진단하는데 유용하며 환자의 질환이나 상태의 진단에 결정적 혹은 중요한 보조적인 역할을 한다. 본 연구는 Genome-wide association study(GWAS)를 통해 알려진 심전도에 영향을 주는 후보유전자 4개(SLC8A1, PRDM6, PRDM16, GAREM)를 선정하여 연구를 수행하였다. 본 연구의 목적은 이들 유전자가 심전도와 연관성을 보임을 마우스모델에서 확인하고자 한다. 마우스 모델에서 심전도 측정은 invasive 와 non-invasive 한 방법이 있다. 이들 방법 중에 측정환경에 제한이 없고 짧은 시간 측정을 통해 심전도 정보를 알 수 있는 non-invasive 방법의 심전도를 선택하였다. 이 심전도 측정법을 확립시키고자 15분(N=11) 동안 심전도를 측정하였다. 이 심전도 측정결과를 이용하여 1분간, 5분간, 10분간, 15분간 측정된 평균값과 비교 분석하였다. 그 결과 각 시간대의 측정값에 통계학적 차이가 없었다. 또한 동일한 마우스에서 반복적인 심전도 측정을 통해 재현성을 확인한 결과에서도 통계학적 차이가 없었다. 이 심전도 측정법을 이용하여 후보유전자가 심전도에 영향을 주는지 확인하기 위해 siRNA in vivo delivery 실험을 하였다. 먼저 후보유전자들에 대한 siRNA를 각각 합성하고 NIH3T3 cell에서 silencing efficacy를 확인하였다. 후보유전자의 발현이 많이 감소된 siRNA를 선정하고 선정된 siRNA 50㎍ 을 Polyethylenimine으로 처리한 후 마우스 꼬리정맥에 주사하였다. 주사된 마우스 조직의 qRT-PCR을 이용하여 표적유전자의 발현 변화를 확인하였다. 그 결과 Slc8a1, Prdm6, Prdm16 유전자에서는 통계적으로 유의한 발현량의 감소가 확인되지 않았으나, Garem 유전자의 경우 유의적 차이를 보였다. Garem siRNA를 주사 후 마우스의 심전도를 측정하였다. 측정 결과 siRNA 주사 후 6시간뒤 측정한 실험군에서 대조군보다 PR 간격이 유의적으로 감소함을 확인 할 수 있었다 (P=0.010). 결론적으로 이 연구는 GWAS를 통해 발굴된 GAREM 유전자가 PR 간격을 조절한다는 실험적 증거를 제시하였다. Recording of ECG is one of the easy and effective methods of measuring the heart’s electrical conduction system and assessing cardiovascular dysfunction. It plays an important role in diagnosis of several diseases and aiding in diagnosing a patient’s condition or disease. Recently genome-wide association study about electrocardiogram traits revealed SLC8A1, PRDM6, PRDM16 and GAREM genetic loci influencing them. Therefore it demands to validate the findings and investigate the relationships using mouse model. ECGs have been obtained by invasive and non-invasive techniques from mice. The non-invasive procedures were selected for this study, because the ECG can be taken quickly and easily. The recording of ECG were conducted for 15 minutes (N=11). The analysis of measurements at 1, 5, 10, 15 minutes did not show any statistical difference. And the ECG was measured repeatedly in the same mice to check the reproducibility and there was no statistical difference found. The siRNAs against target genes were synthesized and treated for their silencing efficacy in NIH3T3 cell lines. The significant reduced expression of target genes was observed. The selected siRNAs were mixed with Polyethylenimine and then injected into mouse tail vein. The mRNA levels of target genes in the siRNA-injected mouse were determined by quantitative RT-PCR, and Garem siRNA reduced its mRNA level in kidney tissue. But Slc8a1, Prdm6 and Prdm16 siRNAs did not change mRNA levels in the analysed tissues (heart, lung, liver and kidney). In order to examine the effect of Garem gene expression related to the PR interval, the ECG traits of Garem siRNA- injected mice were measured. After Garem siRNA injection by 6hours, the PR interval was significantly reduced compare to the control group (p=0.010). This study provided an evidence that Garem plays a role in PR interval.