A Study on the Application of 3D Cell Culture Scaffolds and SPR Signal Amplification using Silica Nanoparticles

민기태 차의과학대학교 일반대학원 2022 국내석사

실리카 나노입자는 우수한 생체적합성과 안정성을 특징으로 한다. 또한 실리카 나노입자는 합성 조건에 따라서 입자의 크기와 기공의 크기를 조절할 수 있으며, 표면을 원하는 기능기로 쉽게 유도할 수 있다. 이러한 특징을 활용하여 다양한 분야에서 활용이 가능하다. 이 연구에서는 실리카 나노입자의 장점을 활용하여 3차원 세포 배양과 SPR 바이오센서의 민감도 향상에 적용하였다. 3차원 동적 배양은 동일한 품질의 세포를 대량 생산하기 위한 중요한 기술 중 하나이다. 그러나 동적 배양 중에 구형 지지체에 부착된 세포는 임펠러 또는 기타 지지체와의 충격 또는 전단 응력에 의해 손상되거나 제거된다는 단점이 있다. 이를 해결하기 위해서 세포가 지지체에 부착 될때 평평한 표면보다 거친 표면에서 더 부착이 잘된다는 연구 결과를 활용하였다. 폴리스티렌(PS)-비드의 평평한 표면을 나노 스케일의 거친 표면으로 만들어주기 위해서 우수한 생체적합성과 표면 작용기의 용이한 개질을 특징으로 가진 실리카 나노입자를 PS-비드의 표면에 결합시켜 3차원 동적 배양을 위한 실리카 나노입자가 결합한 PS 지지체를 제작하였다. 세포 생산 효율을 확인하기 위해서 125 mL 스피너 플라스크를 이용하여 3차원 동적 배양을 7일간 진행하였고 기존의 PS 비드보다 약 44% 더 높은 효율을 보임을 확인하였다. 이번 연구를 통해 개발된 세포 배양 지지체가 세포의 대량 배양 연구에 기여할 것으로 기대된다. 사이토카인은 면역 세포 사이의 행동을 조절하여 인체의 정상적인 면역 기능에 필수적이다. 이러한 사이토카인의 수치 변화 분석을 통해서 다양한 질병을 진단 및 예후 정보를 확인할 수 있다. 사이토카인을 정량하기 위한 기존의 대표적인 방법으로는 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)이 있다. 그러나 ELISA는 시간이 많이 걸리고 노동 집약적이며 일반적으로 표적 항체의 생물물리학적 특성에 대한 제한된 정보만 제공하며, 표지 과정에서 결합 물질의 특정 활성을 변경하여 분석 감도 및 결과의 오류를 초래할 수 있다는 한계가 있다. 비표지 기술은 이러한 분석 한계 중 많은 부분을 극복한다. 표면 플라즈몬 공명(SPR)은 결합 및 해리(kinetic), 상호작용 강도(affinity), 결합 부위(에피토프 매핑) 및 용액 내 항체의 활성 농도에 대한 실시간 정보를 제공하는 확립된 비표지 기술이다. 그러나 SPR 바이오센서는 검출한계(LOD)가 높아 매우 낮은 농도의 시료는 측정이 어렵다는 한계가 있다. 이러한 문제를 극복하기 위해서는 SPR 바이오센서의 감도 향상이 필요하다. 나노 입자를 사용한 신호 증폭은 SPR 감도를 향상시키는 가장 효과적인 방법 중 하나이다. 나노 입자는 분석 물질에 결합하여 분석 물질의 굴절률을 높이고 공명 각도의 이동을 개선하여 SPR 센서의 감도를 높여 민감도를 개선시킨다. 나노 입자 중에서도 실리카 나노입자는 굴절률이 높고 원하는 작용기로 표면을 쉽게 개질할 수 있어 원하는 표적 물질을 검출하는 SPR 바이오센서의 신호 증폭 물질로 적합하다. 본 연구에서는 Neutravidin 단백질로 개질된 실리카 나노입자를 SPR 바이오센서의 신호 증폭 입자로 제안하였고, IL-10을 사용하여 신호 증폭 효과를 확인하였다. 결과적으로, 실리카 나노입자로 인하여 굴절률이 크게 증가하였고, 0.01 ng/mL 농도의 IL-10을 검출하는 데 성공하였다. Neutravidin 개질된 실리카 나노입자는 높은 굴절률로 SPR 바이오센서의 민감도를 향상 시켰다. 이를 활용하여 IL-10 뿐만 아니라 다양한 단백질 검출에도 활용될 수 있을 것으로 기대한다. Silica nanoparticles are characterized by excellent biocompatibility and stability. In addition, silica nanoparticles can control the particle size and pore size according to the synthesis conditions, and can easily induce the surface to a desired functional group. By utilizing these characteristics, it can be used in various fields. In this study, the advantages of silica nanoparticles were applied to two fields. The cell culture efficiency was improved by fabricating scffolds for 3D cell culture, and the sensitivity of the SPR biosensor was improved by fabricating particles for signal amplification. Three-dimensional dynamic culture is one of the important techniques for mass production of cells of the same quality. However, there is a disadvantage that cells attached to the spherical scffolds during dynamic culture are damaged or removed by impact or shear stress with an impeller or other scaffolds. To solve this problem, we utilized research that cells adhere better to rough surfaces than flat surfaces when attached to scffolds. In order to make the flat surface of polystyrene (PS)-beads into a nano-scale rough surface, silica nanoparticles having excellent biocompatibility and easy modification of surface functional groups were combined with the surface of PS-beads to fabricate scffolds for three-dimensional dynamic culture. A three-dimensional dynamic culture was performed for 7 days using a 125 mL spinner flask, and it was confirmed that the efficiency was about 44% higher than that of the existing PS scaffolds. Cell culture scffolds developed through this study are expected to contribute to the study of mass culture of cells. Cytokines are essential for normal immune function in the body by regulating the actions between immune cells. Through this numerical change analysis of cytokines, it is possible to diagnose various diseases and confirm prognosis information. An existing representative method for quantifying cytokines is enzyme-binding immunosorption analysis (ELISA). However, ELISA is time-consuming, labor-intensive, and generally provides limited information on the biophysical properties of target antibodies, with limitations that it can alter the specific activity of the binding material during labeling, resulting in analytical sensitivity and results errors. Non-labeling techniques overcome many of these analysis limitations. Surface plasmon resonance (SPR) is an established non-labeling technique that provides real-time information on binding and dissociation, affinity, binding site (epitope mapping), and activity concentrations of antibodies in solution. However, SPR biosensors have a high detection limit (LOD), so it is difficult to measure samples with very low concentrations. To overcome this problem, it is necessary to improve the sensitivity of the SPR biosensor. Signal amplification using nanoparticles is one of the most effective ways to improve SPR sensitivity. Nanoparticles bind to the analyte to increase the refractive index of the analyte and improve the movement of the resonance angle to increase the sensitivity of the SPR sensor. Among nanoparticles, silica nanoparticles have a high refractive index and can easily modify the surface with a desired functional group, making them suitable as a signal amplification material for SPR biosensors that detect desired target materials. In this study, the silica nanoparticles modified with the neutravidin protein were proposed as signal amplification particles of the SPR biosensor, and the signal amplification effect was confirmed using IL-10. As a result, the refractive index was greatly increased due to the silica nanoparticles, and IL-10 with a concentration of 0.01 ng/mL was successfully detected. Neutravidin modified silica nanoparticles improved the sensitivity of the SPR biosensor due to their high refractive index. By utilizing this, it is expected that it can be used not only for IL-10 but also for detecting various proteins.

Quantification arsenic (III) in aqueous media using a novel hybrid platform comprised of porous silica particles and a gold thin film

곽호정 차의과학대학교 대학원 2017 국내석사

비소에 의한 수자원의 오염은 인간을 비롯한 유기체에 심각한 중독현상을 야기 시킬 수 있기 때문에 그 해결방안에 대해 연구가 계속 되고 있다 특히 수용액상의 비소를 분석기법은 전통적인 기술에 의해 발전이 계속되고 있지만 화학적 반응에 의한 샘플의 손상과 분석스펙트럼 간섭 현상으로 실시간 모니터링에 한계가 있다. 이 연구에서는 실시간 모니터링이 가능하고, 높은 민감도를 갖는 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 분석기법 기반으로 비소이온 정량화를 위한 분석기술을 개발하였다. 비소이온과 리셉터의 특이적 결합을 극대화하고 민감도를 향상시키기 위하여 다공성 실리카 입자로 혼성 자기조립 단분자층을 금 박막 위에 형성시켜 SPR 신호 변화를 검출하였다. 방사형 다공성 실리카 입자는 내부에서 외부로 면적이 커지는 방사형의 구조로 이루어져 있으며, 비표면적이 넓기 때문에 수용체 역할로 이용되는 아민기의 개질화가 효율적으로 이루어졌다. 그 결과 1.0 ng/mL 수준의 낮은 검출 하한 (LOD)을 얻었으며, 이는 미국 환경 보호국 (EPA) 기준의 약 80배 이상으로 민감함을 알 수 있었다. 10 ng/mL 에서 600 ng/mL의 농도 범위에서 일정한 기울기 검량선을 얻을 수 있었으며, 비소이온과 같은 다른 음이온들을 대상으로 한 선택성 시험에서도 비소이온에 대해 높은 선택도를 갖는 점을 확인 하였다. 이 분석기법은 간단하고 신속한 정량 분석을 가능하게 하여 바이오-의료 분야에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 판단된다. The use of novel radially porous silica particles and gold thin film hybrid-based spectroscopy for the sensitive and anion-selective detection of As(III) is described. The method is based on the selective formation of electrostatic complexes between As(III) and an amine functionality on the porous silica particles and the effect of this on changes in the surface plasmon resonance (SPR) profiles of the gold thin film. Since silica particles have radially oriented mesopores, the sizes of which gradually increase from the center to the outer surface of the particle, they provide very large surface area, and permit target analytes to easily access active receptors within the pores. Thus, the amine-functionalized silica particles contain much higher concentration As(III) receptors than conventional porous nanoparticles or a flat surface, which results in a lower detection limit. In addition, due to the surface properties of silica as a dielectric spacing layer, it allows the sensing platform to be more sensitive and stable. The SPR properties of the resulting selectively formed complexes are altered, leading to significant changes in SPR reflectance (∆R) near the SPR angle. The limit of detection of the method was determined to be 1.0 nM, which is ca. 80 times more sensitive than the U.S. EPA regulation level (10 ng/L ≈ 130nM). The response is essentially linear in the concentration range of 10–600 nM on a semi-log scale. The method also shows good selectivity for As(III) in the presence of H2PO4-, SO42-, NO3- and Cl- and is feasible for use in the analysis of tap water; therefore, it would be applicable for use in environmental and biological monitoring.

새로운 기공 형태를 갖는 실리카 나노입자를 이용한 약물전달시스템 개발

김지나 차의과학대학교 대학원 2017 국내석사

약물전달시스템은 몸의 질환치료를 위해 약물을 효율적으로 전달하여 약물의 부작용을 줄이고 약물에 대한 효능 및 효과를 극대화 할 수 있도록 기존의 약물이나 새로운 약물의 제형을 설계하고 약물치료를 최적화하기 위한 기술이다. 특히 다량의 약물을 반복적으로 투여하지 않고 약효를 나타낼 수 있는 약물의 농도를 유지하기 위하여 다양한 약물이 함유된 나노 약물전달체의 개발이 이루어지고 있다. 지금까지 고분자 나노 입자, 지질 나노 입자, 리포좀 나노 입자, 키토산 나노입자 등의 유기재료와 다양한 무기 미립자 등이 나노 약물전달체로 이용되어 왔다. 이 중 에서도 무기 나노 입자는 다양한 기공 구조와 표면의 기능기 유도가 용이하여 많은 연구가 진행되고 있다. 그러나 종래에 개발된 기존의 무기 나노입자를 이용한 약물전달체는 2차원의 기공구조로 인하여 약물 담지율에 한계가 있었다. 본 연구에서는 방사형의 3차원 입체기공을 갖는 새로운 실리카 나노 입자를 개발하여 많은 양의 약물을 나노 입자 내에 담지하고 약물 방출을 제어할 수 있는 약물전달체를 개발하였다. 그 결과 방사형의 새로운 실리카 나노 입자의 합성과 제어에 성공하였다. 개발된 방사형 실리카 나노 입자의 컨셉 증명(proof-of-concept)을 위하여 저분자 약물로서 덱사메타손과 이부프로펜을 선정하였다. 약물 담지의 최적화 조건을 분석한 결과 pH 2 조건에서 최대의 담지효율을 보였다. 이부프로펜은 방사형 실리카 나노 입자의 양 대비 약물의 담지율을 약 270%로 담지 하였으며, 이는 기존에 보고된 연구결과(50~95%)에 비해 최대 3 배 이상 담지 효율이 향상되었음을 확인하였다. 본 연구에서 개발한 이부프로펜을 담지한 방사형 실리카 나노 입자의 효율적인 방출제어를 위하여 당류 고분자 종류인 아가로오스 겔을 이용하여 약물이 담지 된 방사형 실리카 나노 입자를 캡슐화 하였다. 그 결과 아가로오스 겔의 두께 조절을 통해 약물 방출 속도가 제어됨을 확인하였다. 또한 이부프로펜이 담지 된 방사형 실리카 나노 입자를 pH 2 ~ 12에서 방출 프로파일을 분석한 결과 pH 의 환경 변화에 따라 방출제어가 가능함을 확인하였다. 본 연구에서 개발된 방사형 실리카 나노 입자의 세포독성 여부를 판단하기 위하여 높은 농도(100μg/mL)의 방사형 실리카 나노 입자를 섬유아세포에 노출시켰을 때 세포의 성장에 영향이 없었으며 독성도 없는 것으로 관찰되었으며, 방출 후 2주가 지난 후에 in-vitro 에서 방사형 실리카 나노 입자의 자연분해도 진행됨을 육안상 확인하였다. 최종적으로 방사형 실리카 나노 입자의 생체 내 응용 가능성과 효능을 평가하기 위하여 퇴행성관절염 마우스 모델에 적용시킨 결과, 약물(덱사메타손)이 담지 된 방사형 실리카 나노 입자를 투여한 그룹에서 2주까지 치료 효능이 지속되고 있음을 확인하였다. 본 연구에서 개발한 방사형 실리카 나노 입자를 이용한 약물전달시스템 기술은 약물의 장기 약효 지속제형으로의 개발과 약물의 서방형 방출제어 시스템에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 판단된다.

새로운 다공성 나노 입자의 제조 및 나노 약물 전달 시스템에의 적용

유수연 차의과학대학교 일반대학원 2020 국내석사

약물 전달 시스템(drug delivery system)은 약물의 제형을 설계하여 체내에서의 약물 분대 및 손실을 최소화하고, 약물 전달 제어를 통해 약물의 부작용을 감소시키며 치료 효능을 극대화 하는 기술이다. 종래의 약물 투여 형태는 표적 부위로의 약물 전달 속도를 제어할 수 없다. 결과적으로 표적 세포에 필요한 양을 초과하는 치료 용량을 투여하여야 하며, 다량의 약물 투여는 심각한 부작용을 초래할 수 있다. 따라서 치료 범위의 농도를 오랜 기간 동안 유지하고 필요에 따라 작용 부위로 전달할 수 있는 약물 전달체를 필요로 한다. 약물 전달체는 주로 나노 단위의 소재를 이용하여 많은 연구가 진행되었다. 나노 소재는 체내의 체류시간의 증가 및 촉매 반응을 통한 특정 약물 흡착 및 방출 제어 능력이 뛰어나 전달체로써 훌륭한 이점을 지니고 있기 때문이다. 주로 리포좀, 덴드리머, 마이셀 등의 유기 나노입자와 실리카, 탄소, 자성 등의 무기 나노입자로 구성된다. 우리는 무기나노입자 중 실리카 나노입자를 개발하여 약물 전달 시스템에 적용하였다. 이 실리카 나노입자는 열린 3차원 기공 구조로 넓은 표면적을 지니고 있어 특정 약물에 대한 높은 담지 효율을 얻을 수 있다. 본 연구에서는 세 가지 결과를 도출하였다. 첫째는 열린 기공 구조를 지닌 실리카 나노입자 내로 이부프로펜을 담지하여 기존의 2차원 기공 구조를 지닌 실리카 나노입자와의 담지 효율과 비교하였다. 기존 실리카 나노입자는 약 80%의 담지 효율을 보였으나, 3차원 기공의 실리카 나노입자는 약 280%로 약 3배 이상의 담지 효율을 보였다. 둘째는 실리카 나노입자 내로 cytochrome c를 담지하여 단백질 전달 가능성을 확인하였다. 약 40%의 담지 효율을 보였으며, 이후 담지된 단백질은 2일에 걸쳐 약 40%까지 방출하였다. 셋째는 실리카 나노입자를 금 기판에 코팅하여 패치 형태의 고효율의 약물 전달 시스템를 개발하고자 하였다. 패치 형태의 전달체는 약 800%의 담지 효율을 보였으며, 실리카 나노입자 단독으로 사용한 담지 결과(약 280%) 대비 약 3배 이상의 효율을 보였다. 이와 같이 다량의 물질 담지 및 pH에 따른 방출 제어가 가능한 새로운 실리카 나노입자를 제조하였으며. 이를 활용하여 패치 형태의 고효율 약물 전달 시스템을 개발하였다. 적은 양의 입자를 이용하여 다량의 약물을 적재함으로써 소량의 입자로 적정량의 약물 전달을 가능하게 할 것으로 기대한다. 또한 전달 목적에 따라 합리적으로 적용 가능한 전달 시스템 생산의 경로를 열 수 있을 것으로 예상한다.

A study on methodology for trend analysis and technology forecasting using unstructured patent data and natural language processing : focused on case of biopharmaceutical field

김시우 차의과학대학교 일반대학원 2022 국내석사

4차 산업혁명 시대에서 기술예측은 과학과 경제발전을 효과적으로 연결할 수 있고 다양한 미래 상황에 대비할 수 있다. 객관적인 데이터의 평가를 통한 과학적 근거에 기반한 기술 개발 전략 및 연구개발 방향을 설정하는 것은 과학 산업분야에서 주요 이슈가 되어 왔다. 현재 대부분의 국가에서 특허 제도가 확립되어 있다. 과학 산업분야의 연구자들은 본 출원공개 제도를 통해 연구와 투자의 중복을 방지하고 효과적인 연구개발 방향을 설정할 수 있다. 특허 데이터는 전 세계적으로 연간 약 3백만 건이 출원되고 있으며 이는 빅 데이터의 성격을 가지고 있다. 특허 데이터의 종류는 정형 데이터와 비정형 데이터가 있다. 특허 데이터는 공백 또는 유망기술을 도출하는 등 기술예측을 위한 데이터 소스로 사용될 수 있다. 기술예측을 위한 다양한 특허분석 방법론이 연구되어 왔다. 출원일, 출원인, 국가 코드, IPC code, CPC code 등의 정형 데이터를 이용한 특허분석 방법론들은 과학 산업의 첨단 기술을 분석하고 의미 있는 연구개발 방향을 제시하기 어렵다는 한계점이 존재한다. 또한, 특허 분석 결과는 산업 분야의 실질적인 니즈와 간극이 존재한다. 이를 극복하기 위해, 제목, 초록, 청구항 등 비정형 특허 데이터를 적극적으로 활용할 수 있는 방법론이 요구된다. 그러나 비정형 특허 데이터는 거대한 텍스트 코퍼스 형태로 존재하기 때문에 활용하기가 쉽지 않다. 이 비정형 특허 데이터를 분석하기 위해 자연어 처리 기법을 이용한 특허 분석 방법론이 제안되고 있다. 딥러닝 기반의 자연어 처리 기법은 기계 학습을 위한 훈련 데이터 세트가 필요하다. 그러나 이 훈련 데이터 세트를 준비하는 것은 어렵고 제공되고 있는 데이터 세트도 제한적이다. 본 연구에서는 산업분야의 실질적인 니즈와의 간극을 최소화하고 비정형 특허 데이터를 체계적으로 분석하기 위한 두 가지 특허 분석 방법론을 제안하였다. 제안된 방법론들을 검증하기 위해, 바이오의약품 분야에 적용하였다. 바이오의약품 분야는 신물질 발굴부터 신약개발까지 높은 투자가치와 고액의 자금과 장기투자가 가능한 지식기반 산업이다. 방법론 적용 결과, 바이오의약품 분야의 특허 데이터를 기반으로 동향 분석이 가능하였고, 공백 및 유망기술을 도출할 수 있었다. In the era of 4th industrial revolution, technology forecasting can effectively link science and economic development and prepare for various future situations. Establishing directions for R&D management and strategy for the development of technology based on scientific evidence through the evaluation of objective data has been a major issue in the scientific industry. Patent systems are now established in most countries. Researchers in the scientific industry can prevent overlapping R&D research and investment and set effective R&D directions through this application disclosure system. Patent data are filed about 3 million annually worldwide, and it has the characteristics of big data. There are two types of patent data: structured data and unstructured data. Patent data can be used as a data source for technology forecasting such as deducing vacant or promising technologies. Various patent analysis methodologies have been studied for technology forecasting. Patent analysis methodology using structured data such as application date, applicant, country code, IPC code and CPC code has limitations in that it is difficult to analyze advanced technologies in the scientific industry and suggest a meaningful R&D direction. Also, results of patent analysis have gaps with the practical needs of the industry. To overcome this, methodoloeis that can actively utilize unstructured patent data such as title, abstract, and claims is required. However, it is not easy to utilize unstructured patent data due to exist in the form of a big text corpus. Patent analysis methodologies using natural language processing techniques have been proposed to analyze unstructured patent data. Natural language processing techniques based on deep learning requires a training data set for machine learning. However, it is difficult to prepare this training data set and the provided data set is also limited. In this study, we proposed two patent analysis methodologies to minimize the gap with practical needs in the industrial field and systematically analyze unstructured patent data. To verify the proposed methodologies, we applied them to the field of biopharmaceuticals. The biopharmaceutical field is a knowledge-based industry with high investment value and a large amount of money and long-term investment from the discovery of new substances to the development of new drugs. As a result of applying methodologies, based on patent data in the field of biopharmaceuticals, trends analysis was possible and vacant and promising technologies could be deduced.